הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שימוש בפינצטה אופטית ליצירת ספרואידים היברידיים

1.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67422

⸱

30 במאי 2025

 ,  , 
1Department of Clinical and Experimental Pathology, Institute of General and Experimental Pathology, Wrocław Medical University, 2Department of Optics and Photonics, Faculty of Fundamental Problems of Technology, Wrocław University of Science and Technology

במאמר זה

סיכום

במאמר זה, אנו מציעים פרוטוקול לייצור ספרואידים היברידיים באמצעות פינצטה אופטית. שיטה זו מאפשרת שליטה מדויקת בשלבים המוקדמים של תהליך היווצרות הכדורים, דבר שאינו ניתן להשגה בשיטות אחרות.

תקציר

תרבית תאים דו-ממדית (2D) היא עדיין בין המודלים הנפוצים ביותר במחקר סרטן פרה-קליני. עם זאת, נראה כי המודלים התלת-ממדיים ( 3D) במבחנה מעריכים את הסביבה in vivo בצורה מדויקת יותר, כולל מורפולוגיה אדריכלית רלוונטית יותר, מיקרו-סביבה ותגובות לתרופות.

לכידה אופטית משתמשת בקרן לייזר ממוקדת אחת או יותר כדי לתפעל באופן לא פולשני את המיקום, התנועה, האינטראקציה והדינמיקה של מבנים בקנה מידה ננומטרי ומיקרו. פינצטה אופטית (OT) מצאה יישומים רבים בביולוגיה של התא; עם זאת, הפוטנציאל שלהם בחקר הסרטן עדיין לא מוערך. במאמר זה, אנו ממליצים על פרוטוקול לא פולשני להיווצרות ספרואידים של תאי לימפומה-סטרומה עם שימוש בפינצטה אופטית. שיטה זו לא רק בונה את הספרואידים ההיברידיים דה נובו , אלא גם מאפשרת לשלוט במספר התאים המחוברים ובזמן היווצרות ההדבקה, ומספקת מקור מידע חשוב להנדסת רקמות. יתר על כן, OT מאפשר לחקור את השלבים המוקדמים של היווצרות ספרואידים היברידיים, שלא ניתן להשיג בטכניקות בתפזורת סטנדרטיות. חשוב לציין, ניתן להשתמש במודל המתואר כדי לחקור את השינויים המינימליים בהידבקות הנגרמת על ידי תרופות אנטי-סרטניות. ניתן ליישם פרוטוקול זה בקלות על סוגי תאים אחרים.

מבוא

מודלים תאיים תלת מימדיים (תלת מימדיים) מאיצים את חקר הסרטן מכיוון שהם דומים יותר לרקמת הגידול במספר תכונות תפקודיות ומבניות. אלה כוללים, בין היתר, ייצור מטריצה חוץ-תאית, אינטראקציה בין תאים, שמירה על שיפועי תזונה וחמצן, ותגובות דומות לטיפולים 1,2,3,4. לאחרונה, כדי לשקף טוב יותר את תנאי in vivo, פותחו מודלים תלת מימדיים הטרוגניים מתקדמים הכוללים סוגי תאים שונים 5,6,7.

לימפומה שאינה הודג'קין של תאי B (B-NHL) היא קבוצה הטרוגנית של ממאירויות שמקורן בלימפוציטים מסוג B, מרכיבים אינטגרליים של מערכת החיסון8. מאופיין במגוון רחב של מצגות קליניות ומאפיינים היסטולוגיים, B-NHL מקיף ספקטרום של הפרעות, החל מצורות עצלות עם מהלך קליני ממושך ועד גרסאות אגרסיביות המתקדמות במהירות 9,10. הפתוגנזה של B-NHL וממאירות המטולוגיות אחרות קשורה לעתים קרובות להשפעה של מיקרו-סביבת הגידול 11,12. לדוגמה, תאי לימפומה מתפשטים לעתים קרובות למח העצם, מה שעלול לגרום לסיבוכים מסכני חיים13. תאי סטרומה מזנכימליים (MSCs), שהם מרכיבי המפתח של נישת מח העצם, הוכרו כמשפיעים על צמיחת הגידול והתקדמותו14, בעיקר באמצעות אינטראקציות ישירות בין תאיםלתאים 15,16,17; לפיכך, יש צורך דחוף לפתח מודלים המאפשרים לימוד אינטראקציות כאלה. קבענו בעבר כי MSCs, כאשר הם מתורבתים במשותף על הידרוג'לים של אגרוז עם תאי לימפומה, מצטברים בעצמם לספרואידים רב-תאיים, כאשר תאי סטרומה יוצרים את הליבה ומוקפים באופן אחיד בתאי לימפומה18. במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול לייצור מודל תלת מימדי היברידי של לימפומה-סטרומה באמצעות פינצטה אופטית.

לפני למעלה מ-35 שנה דיווח אשקין לראשונה על תופעה של לכידה אופטית לא פולשנית של וירוסים וחיידקים באמצעות קרן לייזר ממוקדת19. כיום, לפינצטה אופטית (OT) יש השפעה דינמית הולכת וגוברת בתחום הביו-רפואי, כולל מחקר ביולוגיה של התא 20,21,22,23. OT איפשר לחקור לא רק את התכונות הפיזיקו-מכניות של תא בודד 24,25,26 אלא גם את האינטראקציות הישירות בין תא לתא ברמת תא בודד, ועוד סידור ומבנה תאים דו-ממדיים ותלת-ממדיים 27,28,29. טכניקת הלכידה האופטית מבוססת על כוחות אופטיים בסדר גודל של כמה פיקונוטון המופעלים כקרינה אלקטרומגנטית (פוטונים), המשנה את התנע שלה כאשר היא מקיימת אינטראקציה עם חומר30. כתוצאה מכך, על ידי שימוש בקרן לייזר אחת או יותר, מפעילים עשויים לתפעל באופן סלקטיבי מיקומים, תנועה ודינמיקה של עצמים בקנה מידה מיקרו וננומטרי20. בפועל, טכניקת הלכידה האופטית מאפשרת לכידה סלקטיבית ולא הרסנית של תאים חיים, הצבתם במגע עם פני השטח של תא או מולקולה אחרת והפעלת תהליך ההדבקה31. באמצעות הפונקציות לעיל, ניסינו תחילה למקם אופטית תא לימפומה בודד על שכבה אחת של תאי סטרומה כדי לחקור את תכונות ההדבקה שלו. לאחר מכן, המשכנו להעריך את יכולתם של פינצטה אופטית ליצור מחדש פיזית ספרואיד רב-תאי במצב זמן אמת33. כדי להשיג זאת, תאי לימפומה בודדים נלכדו בזה אחר זה וחוברו לספרואיד סטרומלי תלת מימדי שהוכן בעבר. ישימות נוספת של לכידה אופטית הייתה למדוד את זמן ההדבקה המינימלי של תאים-תאים ולהעריך את השינויים הזעירים בהדבקה כתוצאה מהטיפול האנטי-סרטני34,35. למרות שמודלים תלת מימדיים נמצאים בשימוש נרחב בחקר הסרטן, חקר השלבים המוקדמים של היווצרות הכדורים נותר מאתגר. זה נובע בעיקר מהזמינות המוגבלת של שיטות המאפשרות לגעת בעולם המיקרו בדיוק גבוה ובהשפעה זעיר פולשנית בו זמנית. לעומת זאת, הפוטנציאל המלא של OT עדיין לא הושג במסגרת הסידור והמבנה התאי בממד השלישי. לפיכך, במאמר זה, זרימת עבודה משולבת ליצירת מבנה לימפומה תלת מימדית באמצעות טכניקות תלת מימד סטנדרטיות ומניפולציות בפינצטה אופטית מתוארת צעד אחר צעד. חשוב לציין, ניתן להתאים את הפרוטוקול בקלות לשימוש עם סוגי תאים אחרים בעלי חשיבות בממאירות המטופתולוגית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. ייצור מיקרו-תבניות על בסיס ג'ל אגרוז

הערה: טכניקות אספטיות נכונות חיוניות בעת טיפול בכל תרביות התאים. כל הריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה מפורטים בטבלת החומרים. הכינו שלושה ג'לים עם MSCs לניסוי יחיד כפי שמוצג באיור 1A.

figure-protocol-1
איור 1: הכנת ספרואידים של תאי סטרומה מזנכימליים (MSC). (A) איור המתאר את השלב להכנת תבניות המיקרו של האגרוז. (B) זריעה של תאי סטרומה מזנכימליים (MSCs), וגידול ספרואידים מזנכימליים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

  1. התחל בהכנת תבניות המיקרו של האגרוז. שטפו את צלחת הפטרי התלת-ממדית של המיקרו-תבנית (ראו טבלת חומרים) במים נטולי יונים (3x) והניחו מתחת למנורת ה-UV למשך 30 דקות לביצוע עיקור.
  2. ראשית, הכינו תמיסת אגרוז 2%. מדוד 1 גרם של אבקת אגרוז סטרילית טהורה באיכות גבוהה (ראה טבלת חומרים) והנח אותה בצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל. הוסף 50 מ"ל של תמיסת נתרן כלורי סטרילית 0.9% (ראה טבלת חומרים) לאגרוז וערבב היטב. הברג את מכסה הצינור החרוטי עד שהוא מאובטח אך עדיין רופף.
  3. השתמש בתנור המיקרוגל כדי להרתיח ולהמיס לחלוטין את אבקת האגרוז. הפסק לחמם במיקרוגל כל 10 שניות וסובב בזהירות את הצינור החרוטי כדי להבטיח שהאגרוז יתמוסס. הימנע מיצירת בועות בזמן ערבוב או פיפטינג אגרוז. מצננים את האגרוז לכ-70 מעלות צלזיוס.
    הערה: ודא שאין שאריות של אבקה שקופה לא מומסת.
    זהירות: אגרוז מותך חם במיוחד ועלול לגרום לכוויות עור חמורות.
  4. עבדו בארון הזרימה הלמינרי בטכניקות אספטיות. הכן הידרוג'לים על ידי מילוי תבניות מיקרו מעוקרות בעבר ב -500 מיקרוליטר אגרוז. שאפו החוצה את כל הבועות שעלולות להילכד בתכונות הקטנות של המיקרו-תבנית באמצעות פיפטה.
  5. לאחר 15 דקות של דגירה בטמפרטורת החדר, כאשר האגרוז התמצק, הסר בזהירות את הג'לים ממיקרו-תבניות לצלחת סטרילית של 6 בארות. אל תפגע במבנה הג'ל. לפני שתמשיך לשלב הבא, בדוק במיקרוסקופ אם המיקרו-תבניות הוכנו כהלכה וודא שהקצוות שלמים. בדוק אם יש פערים שדרכם המדיום יכול לדלוף.
  6. הוסף מספיק 1x Phosphate Buffer Saline (PBS) כדי לכסות לחלוטין את המיקרו-תבניות לפני הנחת הצלחת מתחת למנורת UV למשך 30 דקות לעיקור.
    הערה: ניתן לאחסן את תבניות המיקרו של האגרוז לפני השימוש עד שבועיים בצינור חרוטי מכוסה ב-1x PBS בתנאי מקרר (4 מעלות צלזיוס).
  7. לפני השימוש במיקרו-תבניות לייצור ספרואידים, יש לאזן את הג'ל על ידי כיסויו לחלוטין במדיום RPMI (4.0 מ"ל/באר לצלחת של 6 בארות) ולדגור למשך 15 דקות לפחות.

2. הכנת ספרואידים של תאי סטרומה מזנכימליים (MSCs)

  1. תרבית קו תאי HS-5 (ראה טבלת חומרים), קו תאי סטרומה מזנכימלי אנושי, במדיום תרבית RPMI 1640 בתוספת 10% סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (ראה טבלת חומרים) במצב סטנדרטי, מה שמבטיח החלפת מדיום כל 48 שעות.
  2. כאשר תאי HS-5 הם כ-90% מתלכדים, בצע מעבר תאים באופן הבא:
    1. הסר את אמצעי התרבות באמצעות פיפטה סרולוגית.
    2. שטפו תאים על ידי הוספת PBS 1x ומערבולת ושאיפה כדי להסיר את כל המדיה שנותרה.
    3. נתק תאים מתחתית בקבוק התרבית על ידי הוספת 2 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA (ראה טבלת חומרים) לבקבוק תרבית התאים ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס כדי להקל על ניתוק התאים.
    4. עצור את הטריפסיניזציה על ידי הוספת 2 מ"ל של מדיום תרבית שלם.
    5. בעזרת פיפטה של 5 מ"ל, השעו בעדינות את התאים והעבירו אותם לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
    6. צנטריפוגה את מתלה התא ב -300 x גרם למשך 7 דקות. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש תאים ב -1 מ"ל של מדיום תרבית טרי.
    7. קח 10 מיקרוליטר מכדור התא והעביר אותו לצינור של 0.5 מ"ל. לאחר מכן, הוסיפו 10 מיקרוליטר של תמיסת טריפן כחולה של 0.4% (ראו טבלת חומרים) וספרו את התאים במונה תאים אוטומטי (ראו טבלת חומרים).
    8. בהתבסס על צפיפות התאים שהתקבלה לעיל, יש לדלל תאים ל-2 x 105 תאים/מ"ל של מדיום.
  3. הסר את מדיום תרבית התאים ממיקרו-תבנית האגרוז.
  4. זרעו בזהירות 190 מיקרוליטר של תרחיף תאים שהוזכר לעיל (שלב 2.2.8) לתוך תא הזריעה של המיקרו-עובש של האגרוז. באר אחת תכיל כ-150 תאים (38.000 תאים/ג'ל).
  5. דגירה של תאים במיקרו-תבנית אגרוז באינקובטור (5% CO2, 37 מעלות צלזיוס, אווירה לחה) למשך 30 דקות עד שהתאים מתיישבים בתחתית הג'ל. לאחר 30 דקות, הוציאו את הצלחת המכילה מיקרו-עובש מהחממה, והוסיפו לאט לאט מדיום נוסף לחלק החיצוני של הג'לים, ומכסים אותם לחלוטין (למשל, 4.0 מ"ל/באר לצלחת 6 בארות).
    הערה: אין להוסיף את המדיום ישירות על מיקרו-תבנית הג'ל אגרוז, אלא לתוך צלחת התרבות, הימנע מפגיעה בספרואידים הטריים שנוצרו.
  6. מניחים את הג'ל באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה של 5% CO2 למשך 72 שעות עד שנוצרים ספרואידים אחידים. (איור 1B).
    הערה: מומלץ לצפות בהיווצרות הכדור במשך 3 הימים הבאים תחת מיקרוסקופ הפוך. באופן כללי, תאי סטרומה מזנכימליים מתחילים ליצור ספרואידים תוך 24 שעות, אך תהליך זה עשוי להיות מהיר או איטי יותר עם מעברי תאים וצפיפות שונים. לאחר 72 שעות של דגירה על מיקרו-עובש אגרוז, תאי סטרומה מזנכימליים יוצרים ספרואידים אחידים יחסית; עם זאת, ראוי לציין שהם עשויים להשתנות בגודלם ובצורתם למרות שהם מודגרים בתנאים זהים. יש להחליף את המדיום כאשר הוא משתנה מצבע סגול-אדום לצהוב.

3. תרבית תאי לימפומה והכנה ללכידה אופטית

הערה: קווי תאים המטולוגיים, כולל תאי לימפומה, גדלים צפים בחופשיות באמצעי התרבות בצלוחיות המיועדות לתרבית תרחיף ללא כל חיבור לצלחת התרבות או לכלי. כדי לשמור על תכונות תא אופטימליות, מומלץ להתחיל בהכנת הדגימה לא לפני 30 דקות לפני הליך הרכבת הספרואידים ההיברידיים באמצעות הפינצטה האופטית. חשוב לציין, הפרוטוקול המתואר בסעיף זה מיועד לקו תאי הלימפומה האנושית Ri-1, אך פרוטוקול דומה חל על קווי תאי סרטן המטולוגיים אחרים.

  1. תרבית קו תאי לימפומה Ri-1 (ראה טבלת חומרים) במדיום RPMI 1640 בתוספת 10% FBS ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין.
  2. שמור את תאי הלימפומה בחממה בתנאי תרבית סטנדרטיים, כולל 37 מעלות צלזיוס ואוויר לח עם 5% CO2. שמור על תרביות בין 3-5 x 105 תאים/מ"ל בשלב הלוגריתמי על ידי מעבר כל 2-3 ימים.
  3. אוספים את התאים ומעבירים את התרחיף לצינור פוליסטירן של 15 מ"ל. צנטריפוגה של התאים ב-300 x גרם למשך 7 דקות בטמפרטורת החדר לקבלת כדור תא. הסר את הסופרנטנט והוסף 10 מ"ל של מדיום טרי, פיפטה בעדינות עד לקבלת תרחיף הומוגני.
  4. שאפו 10 מיקרוליטר של תרחיף תאים לתוך צינור צנטריפוגה חדש והוסיפו 10 מיקרוליטר טריפן כחול. פיפטה את המתלה היטב לפני העברת 10 מיקרוליטר לתא הספירה כדי לקבוע את צפיפות התא והכדאיות (בדרך כלל גבוהה מ-95%).
  5. יש לדלל את תרחיף התאים כדי להגיע לצפיפות סופית של 1 x 104 תאים/מ"ל. שמור על תאי לימפומה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד למניפולציות אופטיות.

4. הגדרת מערכת הפינצטה האופטית

הערה: הפרוטוקול שלהלן פותח במיוחד עבור הפינצטה האופטית36 הבנויה-במיוחד (איור 2A). עם זאת, ניתן להשתמש בבדיקה זו עם מערכות לכידה אחרות הזמינות מסחרית. ללא קשר לסוג הציוד הזמין, השלבים הבסיסיים להכנת המערכת (למשל, הפעלת תוכנת הלייזר והמחשב, הרכבת הדגימה ובדיקת האפשרות להזיז את התא במלכודת אופטית), נשארים זהים. כל הניסויים בוצעו בטמפרטורת החדר, כלומר 25 מעלות צלזיוס.

figure-protocol-2
איור 2: סכמטית הממחישה את מנגנון העבודה של יצירת ספרואידים היברידיים על ידי פינצטה אופטית. (A) מערך פינצטה אופטית מתוכננת-במיוחד. (B) תהליך הצמדת תאי לימפומה בודדים לפני השטח של ספרואיד MSCs. תא לימפומה בודד נלכד אופטית והוצמד לפני השטח של ספרואיד סטרומלי עד שנוצר חיבור יציב. תהליך זה נמשך עד שכל פני השטח של הספרואיד הסטרומלי כוסו בתאי לימפומה. (C) תמונה מייצגת של צביעה אימונוהיסטוכימית של החלק הספרואיד ההיברידי התקבלה באמצעות נוגדן חד-שבטי נגד CD20 של עכבר כנגד CD20. הצביעה החיסונית בוצעה באמצעות נוגדן אנטי-אנושי חד-שבטי של עכבר כנגד CD20 על אוטו-צביעה (ראה טבלת חומרים), בהתאם להוראות היצרן. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

  1. הפעל את מקור האור של המיקרוסקופ.
  2. הרכיבו זכוכית מגן בטוחה בלייזר.
  3. הפעל את הלייזר והגדר את הכוח כדי להשיג קשיחות מלכודת של כ-50 pN/μm במערכת הפינצטה האופטית. לפני שתמשיך, המתן 10 דקות, ואפשר לקרן הלייזר להתייצב.
    הערה: במערכת הבנויה בהתאמה אישית, מושגת קשיחות מלכודת נתונה עבור הספק לייזר של 100 mW בכניסה למטרת המיקרוסקופ הנמדדת עבור חרוז פוליסטירן של 3 מיקרומטר. הפולשניות המינימלית שלו על תאי לימפומה אושרה בעבר32,33, תוך שמירה על היכולת לתפעל תאים חיים.
  4. בינתיים, הפעל את תוכנת המחשב. בחלון התוכנה תופיע תמונה של דגימת המיקרוסקופ. השתמשו בסמנים הגלויים על המסך כדי להזיז את ההשמנה האופטית בכיוון הרצוי.
  5. לאחר שהמערכת מוכנה, הוסף 30 מיקרוליטר של מים נטולי יונים למרכז המטרה התחתונה.
    הערה: המערכת הבנויה בהתאמה אישית משתמשת במטרת טבילה במים; עם זאת, מדיית הטבילה עשויה להשתנות בהתאם להגדרת המשתמש.
  6. מניחים צלחת תרבית תאים בגודל 35 מ"מ (ראה טבלת חומרים) עם תחתית זכוכית על במת המיקרוסקופ. ייצב את המנה עם המחזיקים.
  7. הרם את המטרה באמצעות בורג המיקרוסקופ המיקרומטרי עד שחרוז המים נוגע בתחתית הזכוכית של הכלי.
  8. בעזרת בורג המיקרומטר, כוונן בעדינות את השלב המיקרוסקופי עד שרואים את קרן הלייזר ממוקדת בחדות לנקודה בהירה אחת על המסך. תמונה של דגימת המיקרוסקופ תופיע בחלון התוכנה. השתמשו בסמנים הגלויים על המסך כדי להזיז את ההשמנה האופטית לכל כיוון רצוי.
  9. הוסף 100 מיקרוליטר של תרחיף תאי לימפומה שהוכן בעבר (ראה נקודה 3.5) למרכז צלחת תחתית הזכוכית. תן להם לשקוע לתחתית הכלי למשך כ -5 דקות.
  10. בעזרת תנועות שלב המיקרוסקופ, מצא תא לימפומה צף. אפשר למלכודת האופטית לפגוע בדגימה על ידי לחיצה על סמן המלכודת על המסך. נסה להעביר את התא למיקום הרצוי. תא, כדי להיות שימושי למניפולציה, צריך להיות מסוגל לנוע בקלות בכיוון הנתון.
    הערה: לפי התצפית שלנו, בין 5 ל -10% מתאי הלימפומה שנוספו לצלחת הזכוכית יתחברו לצמיתות לתחתית לאחר תקופת הדגירה. אחוז זה יגדל עם משך המניפולציה ועשוי להגיע ל -30% לאחר 60 דקות. עם זאת, למרות הפסדים אלה, מספר התאים שנוספו בתחילה לצלחת יאפשר הן כיול יעיל של המערכת והן כיסוי של הספרואיד בתאי לימפומה.

5. יצירת ספרואידים היברידיים באמצעות פינצטה אופטית

  1. הסר בזהירות ספרואיד סטרומלי בודד מבאר תבנית האגרוז בעזרת קצה פיפטה (100-1000 מיקרוליטר) והניח אותו על צלחת תחתית זכוכית מיקרוסקופית 35 מ"מ.
  2. הוסף 2 מ"ל של מדיום תרבית RPMI ודגירה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתנאים סטנדרטיים. במהלך תקופה זו, הכדור יידבק בעדינות לזכוכית, מה שמונע תנועה במהלך המניפולציה.
  3. מניחים את המנה המכילה את הכדור על במת המיקרוסקופ ומייצבים את המנה על הבמה המיקרוסקופית בעזרת המחזיקים.
  4. הוסף בזהירות 100 מיקרוליטר של תמיסת תאי לימפומה בצפיפות סופית של 1 x 104 תאים/מ"ל (שלב 3.5). תן להם לשקוע לתחתית הכלי למשך כ -5 דקות.
  5. בעזרת תנועות שלב המיקרוסקופ, מצא תא לימפומה צף. אפשר למלכודת האופטית לפגוע בתא שנבחר על ידי לחיצה על סמן המלכודת על המסך. לאחר שהתא לכוד וניתן להזזה, הזז את שלב המיקרוסקופ כדי להעביר את התא למגע עם פני השטח הסטרומליים.
  6. התחל בהצמדת תא הלימפומה לפני השטח של הספרואיד הסטרומלי למשך 10 שניות. לאחר מכן, בדוק אם התא מחובר לצמיתות בשלושה ניסיונות חוזרים ונשנים לנתק את תא הלימפומה באמצעות הפינצטה האופטית.
  7. אם המגע הסלולרי נשבר, חבר את תא הלימפומה למשטח הכדורי פעם נוספת באמצעות המלכודת האופטית; עם זאת, הפעם לפרק זמן ארוך יותר, כ -20 שניות.
    הערה: חיוני לקבוע מרווחי זמן ספציפיים ללכידה של תא בודד עבור כל שורת תא בנפרד. במניפולציות ראשוניות, נקבע כי תאי לימפומה של קו תאי Ri-1 מציגים תכונת הדבקה חזקה לספרואידים סטרומליים, הנצמדים בעיקר תוך 10-20 שניות לפני השטח שלו. לפיכך, מרווחי זמן המגע הספציפיים ללכידת תא Ri-1 בודד היו 10, 20 ו-30 שניות. בשל האופי הגוזל זמן של ההליך, מומלץ להשתמש בקווי תאים עם זמן הידבקות מינימלי של לא יותר מ-30 שניות להיווצרות ספרואידים עם פינצטה אופטית.
  8. חזור על ההליך עם תאי לימפומה שלאחר מכן עד שכל פני השטח של הספרואיד הסטרומלי מכוסים בתאי לימפומה.
  9. כדי לכסות באופן אחיד את המשטח הזמין של הספרואיד הסטרומלי בתאי לימפומה, יש צורך לשנות את מיקום המלכודת האופטית בנפח הדגימה המיקרוסקופית. על ידי שינוי מישור ההדמיה באמצעות בורג המיקרוסקופ המיקרומטרי, ניתן לשנות את מיקום המלכודת האופטית, המאפשרת תנועה עמוקה יותר של העצמים הלכודים בדגימה.
  10. כדי לייצג טוב יותר את הספרואיד שנוצר באופן ספונטני, יש לכסות את ליבת תאי הסטרומה ב-2-3 שכבות של תאי לימפומה.
  11. העבירו את צלחת הזכוכית המכילה את הספרואיד לחממה למשך שעה אחת של דגירה בתנאים סטנדרטיים.
    הערה: ספרואיד היברידי עשוי להיות מתורבת לטווח ארוך ב-20 מיקרוליטר של מדיום RPMI בטיפה תלויה.

6. קביעת כדאיות הכדור

  1. העריכו את הכדאיות של ספרואיד תאים באמצעות ערכת צביעה חיה/מתה (ראה טבלת חומרים). הסר בעדינות את מדיום התרבות ושטוף ישירות את הכדור עם 100 מיקרוליטר של 1x PBS.
  2. דגרו את הספרואיד ב-100 מיקרוליטר של תמיסת PBS 1x המכילה 1 מיקרומטר של סידן-AM, ו-2 מיקרומטר של אתידיום הומודימר-1 למשך 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
  3. התבונן בספרואידים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (ראה טבלת חומרים) וצלם את התמונות (ראה טבלת חומרים).
    הערה: אין צורך לשטוף את הכדור לאחר הצביעה. רמות הקרינה ברקע נמוכות מטבען בבדיקה זו מכיוון שהצבעים כמעט ולא פלואורסצנטיים לפני אינטראקציה עם תאים.
  4. באמצעות תוכנית ImageJ (ראה טבלת חומרים), קבע את כדאיות הכדור על ידי חישוב היחס בין האזור המוכתם בירוק (תאים חיים) לשטח הכולל הצבוע באדום (תאים מתים) וירוק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

התוצאות הקודמות שלנו הראו שתאי סטרומה מזנכימליים שגודלו עם תאי לימפומה מהווים את הליבה הסטרומלית ההומוגנית שאליה מתחברים תאי סרטן באופן אחיד18. במחקר זה, הנדסנו בהצלחה את הספרואיד ההיברידי האנושי המורכב מתאי סטרומה מזנכימליים ותאי לימפומה באמצעות פינצטה אופטית מותאמת אישית. איור 2B מציג ספרואיד מייצג במיקרוסקופ שדה בהיר, חלק חיוני ממערכת הפינצטה האופטית. בתורו, איור 2C מציג את הצביעה האימונוהיסטוכימית של הספרואיד ההיברידי עם נוגדן

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במחקר זה, הספרואידים ההיברידיים של ליבת סטרומה מזנכימלית ותאי לימפומה הונדסו בזמן אמת באמצעות פינצטה אופטית. טכנולוגיות חדשות מבוססות לייזר, כולל מערכות לכידה, זמינות כעת מסחרית והופכות פופולריות יותר ויותר. עם זאת, עד כה, רוב הפינצטה האופטית ממשיכה להיות מכשירים שנבנו בהתאמה אישית; לפיכך, כיול, נהלי הפעלה וגיאומטריות ניסיוניות יכולים להשתנות בין מעבדות38,39. פרוטוקול זה מתאר את המידע הבסיסי הדרוש להקמת מערכת הפינצטה האופטית, הן ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

המחברים אסירי תודה לניקולס צ'רניק, שעריכתו הקפדנית שיפרה משמעותית את בהירות המחקר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
&מיקרו;-צלחת 35 מ"מ, תחתית זכוכית גבוההIBIDI81158
12-256 מיקרו-תבנית תלת מימד PetriDish Microtissues Inc., RI, ארה"ב12-256TR
3 ומיקרו; m מיקרוספירות פוליסטירןPolysciences17134-15
נוגדן נגד CD20 (שיבוט L26)מונהIS604
, EVENanoEntekEVE/ EVE-MC
Autostainer Link 48DakoD09634
מצלמה אולימפוסU-TV0.63XC
CelCulture CO2 חממתEsco Technologies, Inc.CCL
EVENanoEntekNE-EVS
HS-5ATCCCRL-3611
קו תאים Ri-1 DSMZ ACC 585
סרום בקר עובריGibcoA5256701
מיקרוסקופ פלואורסצנטי תוכנית OlympusBX43
ImageJהמכונים הלאומיים לבריאות, מרילנד, ארה"
ב מיקרוסקופ הפוךOlympusIX73
ערכת ריאגנטים חיים/מתים תרמו פישר סיינטיפיקL3224
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)ג'יבקו15140122
פוספט בופר מלח, pH 7.4ג'יבקו10010023
RPMI 1640 תמיסת11875093ג'יבקו
סיגמא-אולדריץ'7647-14-5
תמיסת נתרן כלוריד 0.9%, סטריליתריאגנטים של ITW, סוכני S.R.L., S.R.L.A1671
תמיסת טריפאן כחולה, 0.4%גיבקו15250061
אנזים TrypLE Express (1X), ללא פנול אדוםGibco12604013
טריפסין-EDTA (0.05%), פנול אדוםGibco25300096
UltraPure AgaroseInvitrogen
הגדרת פינצטה אופטית>
מראות דיכרואיותThorlabsDMSP805R
מצלמה דיגיטליתMikrotron GmbHMC1362
Galvano-mirror XY מערכת סריקהThorlabsGVS002
מיקרוסקופ הפוך אולימפוסIX71
1ThorlabsAC254-050-B-ML
עדשה 2ThorlabsAC508-200-B-ML
Nd:YAG 1064 ננומטרלייזר לייזר קוונטיונטוס
תאים אוטומטי Dako שקופיות ספירת תאים , קו תאים נתרן כלוריד בינונית <16500500 עדשת

מקורות

  1. Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. Could 3D models of cancer enhance drug screening. Biomaterials. 232, 119744(2020).
  2. Fontoura, J. C., et al. Comparison of 2D and 3D cell culture models for cell growth, gene expression and drug resistance. Mater Sci Eng. C. 107, 110264(2020).
  3. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Arch Med Sci. 14 (4), 910-919 (2018).
  4. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology (Bethesda). 32 (4), 266-277 (2017).
  5. Barbosa, M. A. G., Xavier, C. P. R., Pereira, R. F., Petrikaitė, V., Vasconcelos, M. H. 3D cell culture models as recapitulators of the tumor microenvironment for the screening of anti-cancer drugs. Cancers (Basel). 14 (1), 190(2021).
  6. Jubelin, C., et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell Biosci. 12, 155(2022).
  7. Pape, J., Emberton, M., Cheema, U. 3D cancer models: the need for a complex stroma, compartmentalization and stiffness. Front Bioeng Biotechnol. 9, 660502(2021).
  8. Singh, R., et al. Non-Hodgkin's lymphoma: A review. J Family Med Prim Care. 9 (4), 1834-1840 (2020).
  9. Campo, E., et al. The International consensus classification of mature lymphoid neoplasms: a report from the clinical advisory committee. Blood. 140 (11), Erratum in: Blood. 141 (4), 437 (2023). 1229-1253 (2022).
  10. Swerdlow, S. H., et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).
  11. Ng, W. L., Ansell, S. M., Mondello, P. Insights into the tumor microenvironment of B cell lymphoma. J Exp Clin Cancer Res. 41, 362(2022).
  12. Mancini, S. J. C., et al. Deciphering tumor niches: lessons from solid and hematological malignancies. Front Immunol. 12, 766275(2021).
  13. Zhang, Q. Y., Foucar, K. marrow involvement by Hodgkin and non-Hodgkin lymphomas. Hematol. Oncol Clin North Am. 23 (4), 873-902 (2009).
  14. Gao, Q., et al. marrow mesenchymal stromal cells: Identification, classification, and differentiation. Front Cell Dev Biol. 9, 787118(2022).
  15. Lwin, T., et al. Lymphoma cell adhesion-induced expression of B cell-activating factor of the TNF family in bone marrow stromal cells protects non-Hodgkin's B lymphoma cells from apoptosis. Leukemia. 23 (1), 170-177 (2009).
  16. Kumar, A., Bhattacharyya, J., Jaganathan, B. G. Adhesion to stromal cells mediates imatinib resistance in chronic myeloid leukemia through ERK and BMP signaling pathways. Sci Rep. 7 (1), 9535(2017).
  17. Cuiffo, B. G., Karnoub, A. E. Mesenchymal stem cells in tumor development: emerging roles and concepts. Cell Adh Migr. 6 (3), 220-230 (2012).
  18. Duś-Szachniewicz, K., Gdesz-Birula, K., Rymkiewicz, G. Development and characterization of 3D hybrid spheroids for the investigation of the crosstalk between B-Cell non-Hodgkin lymphomas and mesenchymal stromal cells. OncoTargets Ther. 15, 683-697 (2022).
  19. Ashkin, A., Dziedzic, J. M. Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria. Science. 235, 1517-1520 (1987).
  20. Spyratou, E. Advanced biophotonics techniques: The role of optical tweezers for cells and molecules manipulation associated with cancer. Front Phys. 10, 247-285 (2022).
  21. Choudhary, D., Mossa, A., Jadhav, M., Cecconi, C. Bio-molecular applications of recent developments in optical tweezers. Biomolecules. 9 (1), 23(2019).
  22. Nussenzveig, H. M. Cell membrane biophysics with optical tweezers. Eur Biophys J. 47 (5), 499-514 (2018).
  23. Zhang, X., Ma, L., Zhang, Y. High-resolution optical tweezers for single-molecule manipulation. Yale J Biol Med. 86 (3), 367-383 (2013).
  24. Li, X., et al. Optical tweezers study of membrane fluidity in small cell lung cancer cells. Opt Express. 29 (8), 11976-11986 (2021).
  25. Wullkopf, L., et al. Cancer cell's ability to mechanically adjust to extracellular matrix stiffness correlates with their invasive potential. Mol Biol Cell. 29, 2378-2385 (2018).
  26. Yousafzai, M. S., et al. Effect of neighboring cells on cell stiffness measured by optical tweezers indentation. J Biomed Opt. 21 (5), 57004(2016).
  27. Gupta, S. K., et al. Quantification of cell-matrix interaction in 3D using optical tweezers. Multi-Scale Extracellular Matrix Mechanics and Mechanobiology. Studies in Mechanobiology, Tissue Engineering and Biomaterials. Zhang, Y. , Springer. Berlin/Heidelberg, Germany. 283-310 (2020).
  28. Ma, Z., et al. Laser patterning for the study of MSC cardiogenic differentiation at the single-cell level. Light Sci Appl. 2, 68(2013).
  29. Kirkham, G. R., et al. Precision assembly of complex cellular microenvironments using holographic optical tweezers. Sci Rep. 5, 8577(2015).
  30. Pesce, G., et al. Optical tweezers: theory and practice. Eur Phys J Plus. 135, 949(2020).
  31. Avsievicha, T., Zhua, R., Popovb, A., Bykova, A., Meglinski, I. The advancement of blood cell research by optical tweezers. Rev Phys. 5, 100043(2020).
  32. Duś-Szachniewicz, K., et al. Physiological hypoxia (physioxia) impairs the early adhesion of single lymphoma cell to marrow stromal cell and extracellular matrix. Optical tweezers study. Int J Mol Sci. 19, 1880(2018).
  33. Duś-Szachniewicz, K., Gdesz-Birula, K., Nowosielska, E., Ziółkowski, P., Drobczyński, S. Formation of lymphoma hybrid spheroids and drug testing in real time with the use of fluorescence optical tweezers. Cells. 11 (13), 2113(2022).
  34. Hu, S., Gou, X., Han, H., Leung, A. Y., Sun, D. Manipulating cell adhesions with optical tweezers for study of cell-to-cell interactions. J Biomed Nanotechnol. 9 (2), 281-285 (2013).
  35. Johansen, P., Fenaroli, F., Evensen, L., Griffiths, G., Koster, G. Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish. Nat Commun. 7, 10974(2016).
  36. Drobczyński, S., Duś-Szachniewicz, K. Real-time force measurement in double wavelength optical tweezers. J Opt Soc AmB. 34, 38-43 (2017).
  37. Pavlasova, G., Mraz, M. The regulation and function of CD20: an "enigma" of B-cell biology and targeted therapy. Haematologica. 105 (6), 1494-1506 (2020).
  38. Gieseler, J., et al. Optical tweezers- from calibration to applications: a tutorial. Adv Opt Mater. 13, 74-241 (2021).
  39. Bustamante, C. J., Chemla, Y. R., Liu, S., Wang, M. D. Optical tweezers in single-molecule biophysics. Nat Rev Methods Primers. 1, 25(2021).
  40. Mitrakas, A. G., et al. Applications and advances of multicellular tumor spheroids: Challenges in their development and analysis. Int J Mol Sci. 24 (8), 6949(2023).
  41. Malm, M., et al. Evolution from adherent to suspension: systems biology of HEK293 cell line development. Sci Rep. 10, 18996(2020).
  42. Ling, Y., et al. A cell-laden microfluidic hydrogel. Lab on a Chip. 7 (6), 756-762 (2007).
  43. Azizipour, N., Avazpour, R., Sawan, M., Ajji, A., Rosenzweig, H. Surface optimization and design adaptation toward spheroid formation on-chip. Sensors. 22 (9), 3191(2022).
  44. Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells. Cells. 8 (12), 1620(2019).
  45. Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase. Cancer Cell Int. 21, 152(2021).
  46. Feng, Q., Li, D., Li, Q., Cao, X., Dong, H. Microgel assembly: Fabrication, characteristics, and application in tissue engineering and regenerative medicine. Bioact Mater. 9, 105-119 (2021).
  47. Volpe, G., et al. Roadmap for optical tweezers. J Phys Photonics. 5, 022501(2023).
  48. Pradhan, M., Pathak, S., Mathur, D., Ladiwala, U. Optically trapping tumor cells to assess differentiation and prognosis of cancers. Biomed Opt Express. 7, 943(2016).
  49. Duś-Szachniewicz, K., et al. Differentiation of single lymphoma primary cells and normal B-cells based on their adhesion to mesenchymal stromal cells in optical tweezers. Sci Rep. 9, 9885(2019).
  50. Gdesz-Birula, K., Drobczyński, S., Sarat, K., Duś-Szachniewicz, K. Sonidegib Inhibits the adhesion of acute myeloid leukemia to the bone marrow in hypoxia: An optical tweezer study. Biomedicines. 13, 578(2025).
  51. Matheson, A. B., et al. Optical tweezers with integrated multiplane microscopy (OpTIMuM): A new tool for 3D microrheology. Sci Rep. 11, 5614(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

תרבית תאים בתלת-ממדתאי לימפומהספרואידים סטרומלייםלכידה אופטיתהיצמדות תאיםמיקרוסקופיה פלואורסצנטיתמיקרו-תבנית אגרוזהנדסת רקמות
שימוש בפינצטה אופטית ליצירת ספרואידים היברידיים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.