מאמר שיטה

הקמת מודל עכבר עם רגישות יתר לשיעול באמצעות שאיפת חומצת לימון

DOI:

10.3791/67462

⸱

10 בינואר 2025

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Respiratory Disease, The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou Medical University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר פיתוח של מודל עכבר עם רגישות יתר לשיעול, שיכול לשמש מודל אידיאלי לחקר מנגנוני השיעול הכרוני.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיעול הוא אחד התסמינים השכיחים ביותר של מחלות נשימה רבות. שיעול כרוני משפיע באופן משמעותי על איכות החיים ומטיל נטל כלכלי ניכר. רגישות מוגברת לשיעול היא סימן היכר פתופיזיולוגי של שיעול כרוני. נצפה כי רגישות יתר לשיעול קשורה לדלקת בדרכי הנשימה, עיצוב מחדש של עצבים תחושתיים בדרכי הנשימה ושינויים במערכת העצבים המרכזית. עם זאת, המנגנונים המולקולריים המדויקים נותרו לא ברורים ודורשים הבהרה נוספת באמצעות מודלים מתאימים של בעלי חיים. מחקרים קודמים השתמשו בשרקנים כמודלים לחקר שיעול, אך מודלים אלה מציגים מספר מגבלות ניסיוניות, כולל עלויות גבוהות, מחסור בכלים טרנסגניים ומחסור בריאגנטים מסחריים. בנוסף, שרקנים בדרך כלל מפגינים סובלנות סביבתית ירודה ותמותה גבוהה כאשר הם נחשפים לגירויים. לעומת זאת, עכברים קטנים יותר, קלים יותר לתחזוקה, חסכוניים יותר וניתנים למניפולציה גנטית, מה שהופך אותם למתאימים יותר לחקירות מכניסטיות. במחקר זה, ביססנו מודל עכבר עם רגישות יתר לשיעול באמצעות שאיפה מתמשכת של חומצת לימון (CA). מודל זה פשוט לתפעול ומניב תוצאות הניתנות לשחזור, מה שהופך אותו לכלי רב ערך למחקרים נוספים על המנגנונים והטיפולים החדשים הפוטנציאליים לשיעול כרוני.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיעול הוא רפלקס הגנתי חיוני המסייע בפינוי הפרשות נשימה או חומרים זרים מדרכי הנשימה. עם זאת, זהו גם אחד התסמינים השכיחים ביותר של מחלות נשימה רבות, ולעתים קרובות גורם לחולים לפנות לטיפול רפואי1. שיעול כרוני, המוגדר כשיעול מתמשך הנמשך יותר מ-8 שבועות אצל מבוגרים, משפיע באופן משמעותי על איכות החיים, וגורם לבעיות כמו בריחת שתן, נדודי שינה, ריפלוקס וחוויות לא נעימות אחרות, יחד עם נטל כלכלי משמעותי 2,3,4. הדעה הרווחת היא שרגישות מוגברת לשיעול היא סימן היכר פתופיזיולוגי של שיעול כרוני, שבו רמות נמוכות של גירויים תרמיים, מכניים וכימיים עלולות לעורר שיעול5. רגישות יתר לשיעול קשורה לדלקת בדרכי הנשימה6, עיצוב מחדש של עצבי תחושת דרכי הנשימה7 ושינויים במערכת העצבים המרכזית8, אם כי המנגנונים המולקולריים המדויקים נותרים לא ברורים ודורשים הבהרה נוספת באמצעות מודלים מתאימים של בעלי חיים.

בעלי חיים שונים, כולל שרקנים, חתולים, ארנבות, כלבים וחזירים, שימשו לחקר מנגנוני השיעול9. שרקנים הוכרו באופן מסורתי כמודל המתאים ביותר לחקר מנגנוני שיעול ויעילותן של תרופות נוגדות שיעול 9,10,11,12. עם זאת, למודלים אלה יש מספר מגבלות ניסיוניות, כולל עלויות גבוהות, מחסור בכלים טרנסגניים ומחסור בריאגנטים מסחריים. בנוסף, שרקנים מפגינים לעתים קרובות סובלנות סביבתית ירודה ותמותה גבוהה כאשר הם נחשפים לגירויים. לעומת זאת, עכברים קטנים יותר, קלים יותר לתחזוקה, חסכוניים יותר וניתנים למניפולציה גנטית, מה שהופך אותם למתאימים יותר לחקירות מכניסטיות. מחקרים קודמים על מודלים של שיעול התמקדו בעיקר בשיעול הנגרם על ידי דלקת בדרכי הנשימה, המשמש בעיקר להערכת היעילות של תרופות נוגדות שיעול ומנגנונים היקפיים13,14. כיום חסרים מודלים של בעלי חיים לרגישות יתר לשיעול.

בתגובה, אנו מציגים שיטה לביסוס מודל עכברי של רגישות יתר לשיעול באמצעות שאיפה מתמשכת של חומצת לימון (CA). מודל זה פשוט יותר, קל יותר לבנייה ואפשרי יותר בהשוואה למודלים אחרים של בעלי חיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הליכי הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של חיות מעבדה של בית החולים המסונף הראשון של האוניברסיטה הרפואית גואנגג'ואו (20230656). במחקר זה נעשה שימוש בעכברי C57BL/6 זכרים בוגרים ללא פתוגן ספציפי, בגילאי 8-10 שבועות ובמשקל 20-25 גרם. פרטי הריאגנטים והציוד המשמשים מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת ריאגנטים כימיים

  1. הכנת תמיסת חומצת לימון (CA).
    1. להערכת שיעול, הכינו תמיסה של 0.4 M על ידי המסת 3.84 גרם אבקת חומצת לימון במי מלח רגילים לנפח סופי של 50 מ"ל.
    2. לטיפול בבעלי חיים, הכינו תמיסה של 0.1 M על ידי המסת 9.6 גרם אבקת חומצת לימון במי מלח רגילים לנפח סופי של 500 מ"ל.
  2. הכנת תמיסת קפסאיצין
    1. יש להמיס 30.5 מ"ג של אבקת קפסאיצין ב-PBS המכיל 10% אתנול ו-10% טווין-80 כדי ליצור תמיסת מלאי של 10 מ"מ.
    2. יש לדלל את תמיסת המלאי ביחס של 1:100 במי מלח רגילים כדי ליצור תמיסת עבודה של 100 מיקרומטר.
  3. הכנת תמיסת מתכולין
    1. ממיסים 100 מ"ג אבקת מתכולין ב-PBS לנפח סופי של 2 מ"ל כדי ליצור תמיסה של 50 מ"ג/מ"ל.
    2. יש לדלל תמיסה זו עם PBS כדי לקבל ריכוזים של 25 מ"ג/מ"ל, 12.5 מ"ג/מ"ל, 6.25 מ"ג/מ"ל ו-3.125 מ"ג/מ"ל.

2. הכנת בעלי חיים

  1. תנאי דיור
    1. עכברי בית בכלובים עם גישה חופשית למזון ומים, נשמרים בטמפרטורה של 22 ± 1 מעלות צלזיוס עם מחזור אור/חושך סטנדרטי של 12 שעות. מניפולציות ניסיוניות בוצעו לאחר שבוע של הסתגלות לסביבת האכילה.
  2. התאקלמות
    1. אפשר לעכברים להתאקלם בסביבת ההאכלה במשך שבוע לפני ביצוע מניפולציות ניסיוניות.

3. פיתוח המודל

  1. הקצאה קבוצתית
    1. חלקו את העכברים באופן אקראי לקבוצת מודל וקבוצת ביקורת, עם 8 עכברים בכל קבוצה.
  2. הגדרת חשיפה
    1. הנח את העכברים בשני תאים עצמאיים (כפי שמוצג באיור 1), כל אחד מחובר לנבולייזר קולי.
    2. חשוף את קבוצת המודל לתרסיס חומצת לימון (CA) של 0.1 M ואת קבוצת הביקורת לתרסיס של 0.9% תמיסת מלח (NS) רגילה בקצב אטומיזציה של 3 מ"ל/דקה למשך שעתיים ביום במשך שבועיים (כפי שמוצג באיור 2). החזירו את העכברים לכלובים שלהם לאחר כל חשיפה.
  3. הערכת רגישות לשיעול
    1. לאחר החשיפה האחרונה, העריכו את הרגישות לשיעול על ידי הערכת שיעול רפלקסיבי (מאותגר עם NS, CA (0.4 M) וקפסאיצין (100 מיקרומטר)) ושיעול ספונטני (ללא כל אתגר).
      הערה: כדי לעקוב אחר שינויים דינמיים ברגישות לשיעול במהלך פיתוח המודל, הערך את הרגישות לשיעול בימים 0, 3, 7 ו-10 באמצעות אתגר CA (0.4 M).

4. הערכת רגישות לשיעול

  1. הכנת מכשירים
    1. השתמש במערכת פלתיסמוגרפיה לא פולשנית של כל הגוף (WBP) כדי למדוד רגישות לשיעול. חבר את התאים, מתמרי הזרימה, זרימת ההטיה ורכיבים אחרים בהתאם למדריך היישום (ראה טבלת חומרים).
    2. בצע תהליך כיול כדי להבטיח מדידות מדויקות על ידי לחיצה על כפתור הכיול . מסך סטטוס יציג את ההתקדמות, וברגע ששורת המצב תגיע ל-100%, הכיול הושלם.
  2. זיהוי שיעול
    1. צור מחקר שיעול לעכברים והגדר את הפרמטרים לדקה אחת של התאקלמות, 10 דקות של זמן תגובה ו-10 דקות של אספקת תמיסה כימית.
    2. הנח את העכברים המודעים לתאים בודדים, וודא שיש רק עכבר אחד בכל תא.
      הערה: ודא שהעכבר נמצא לחלוטין בתוך החדר לפני סגירת המכסה כדי למנוע נזק לזנב ולאצבעות שלו.
    3. הוסף 1 מ"ל של התמיסות הכימיות (NS, CA או קפסאיצין) לנבולייזר.
      הערה: מספר אירועי השיעול - כל אחד מורכב משלושה שלבים: שאיפה דחיסה וגירוש15 (כפי שמוצג באיור 3) - יירשם עם תחילת המחקר. לאחר 10 דקות של הקלטה, זיהוי השיעול יושלם. נקה את החדר לאחר זיהוי כל בעל חיים כדי למנוע זיהום צולב.

5. מדידת תגובתיות יתר של דרכי הנשימה (AHR).

  1. הכנת מכשירים
    1. הכן מכשירים כמתואר בשלב 4.1.
  2. מדידת AHR
    1. צור מחקר מינון-תגובה לעכברים, הגדרת סוגי המדידה, הפרמטרים ורצף המשימות: דקה אחת להתאקלמות, 30 שניות למתן תמיסת מתכולין, 3 דקות לזמן תגובה ודקה אחת להתאוששות.
    2. הנח את העכברים המודעים לתאים בודדים, וודא שיש רק עכבר אחד בכל תא.
    3. הוסף 50 מיקרוליטר של התמיסות הכימיות (PBS או מתכולין) לנבולייזר והתחל את המחקר.
    4. רשום את הערך של Penh, אינדיקטור להתכווצות הסימפונות, בתגובה לריכוזים שונים של מתכולין (0 מ"ג/מ"ל, 3.125 מ"ג/מ"ל, 6.25 מ"ג/מ"ל, 12.5 מ"ג/מ"ל, 25 מ"ג/מ"ל, 50 מ"ג/מ"ל).

6. אוסף שטיפת הסימפונות

  1. להקריב
    1. להקריב את העכברים באמצעות הרדמה יתר עם נתרן פנטוברביטל (50 מ"ג/ק"ג) הניתן באמצעות הזרקה תוך צפקית (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד).
  2. איסוף דוגמאות
    1. אסוף דם מהסינוס האורביטלי של העכבר לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל, ואז הנח את הצינור על קרח. צנטריפוגה בדם ב-3000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השתמש בפיפטה כדי לאסוף את הסופרנטנט, לחתוך אותו ולאחסן אותו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
    2. אסוף נוזל שטיפת סימפונות (BALF) על ידי פתיחת בית החזה כדי לחשוף את קנה הנשימה, החדרת מחט שוכנת 22 גרם לקנה הנשימה, ולאחר מכן שטיפה שלוש פעמים עם 0.5 מ"ל PBS מקורר מראש ואיסוף הנוזל.
    3. לאחר האיסוף, צנטריפוגה את ה-BALF ב-500 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. אוספים את הסופרנטנט, מחסנים אותו ומאחסנים אותו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. השעו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של PBS והכינו מריחות תאים לניתוח נוסף.
    4. אסוף רקמות ריאה על ידי פתיחת בית החזה כדי לחשוף את הריאות, הסרת רקמות הריאה והנחתן בבקבוקונים קריוגניים. אחסן את הבקבוקונים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למחקרים עתידיים.

7. RT-PCR כמותי

  1. חלץ את סך ה-RNA מרקמת הריאה באמצעות מגיב TRIzol. בצע סינתזת cDNA באמצעות ערכת סינתזת cDNA גדיל ראשון, בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
  2. לבצע PCR במערכת זיהוי PCR כמותית בזמן אמת באמצעות פלואורסצנטיות ירוקה SYBR. לנרמל את הכימות של ביטוי mRNA יחסי של SP ו-CGRP לביטוי של β-Actin9.

8. ניתוח סטטיסטי

  1. הצג נתונים כממוצע ± SEM. השתמש במבחן t כדי להשוות נתונים בין שתי קבוצות, תוך התחשבות ב-P < 0.05 כמובהקת סטטיסטית. לבצע את כל הניתוחים הסטטיסטיים באמצעות תוכנות סטטיסטיות וגרפיות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כפי שמוצג באיור 4A, הרגישות לשיעול בקבוצת המודל (קבוצת CA) עלתה באופן משמעותי לאחר שבוע אחד של חשיפה בהשוואה לקבוצת הביקורת (קבוצת NS), ורגישות מוגברת זו נמשכה לאורך כל תקופת החשיפה. לא קבוצת הביקורת ולא עכברי קבוצת המודל חוו תמותה במהלך תהליך המידול (איור 4B). איור 4C ואיור 4D מדגימים כי מספר אירועי השיעול הספונטני גדל באופן משמעותי בקבוצת המודל לאחר החשיפה. בנוסף, הרגישות לשיעול שנגרמה על ידי NS (איור 4E

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה ביסס בהצלחה מודל עכבר עם רגישות יתר לשיעול באמצעות שאיפה מתמשכת של חומצת לימון (CA). מודל זה הראה עלייה אמינה ברגישות לשיעול הן לשיעול ספונטני והן לשיעול רפלקסיבי הנגרם על ידי חומצת לימון וקפסאיצין. חומצת לימון וקפסאיצין נמצאים בשימוש נרחב להערכת רגישות לרפלקס שיעול16.

מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה מבטיחים את יעילותו. ראשית, אסור שתא החשיפה המשמש לניסויים יהיה א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC 82100034), פרויקט תכנון המדע והטכנולוגיה של גואנגג'ואו (202102010168).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.9% תמיסת מלח רגילהBiosharpBL158A
קפסאיציןקיימן כימי92350
חומצת לימוןסיגמא-אולדריץ'C2404
אתנולמפעל ריאגנטים כימיים גואנגג'ואוGSHB15-AR-0.5L
ערכת סינתזה cDNA גדיל ראשוןTransGen BiotechAT341
MethacholineSigma-AldrichA2251
מערכת פלתיסמוגרפיה לא פולשנית לכל הגוף (WBP)DSI601-1400-001
פנטוברביטל נתרןMerkP3761
PerfectStart Green qPCR SuperMixTransGen BiotechAQ601
פוספט חוצץ מלח (PBS)MeilunbioMA0015
בזמן אמת  כמותי  PCR  זיהוי  מערכתביו-רד CFX  חבר
מגיב TRIzolInvitrogen15596026CN
Tween-80SolarbioT8360-100
נבולייזר אולטראסוניYuwell402AI

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morice, A. H. Epidemiology of cough. Pulm Pharmacol Ther. 15 (3), 253-259 (2002).
  2. Lai, K., Long, L. Current status and future directions of chronic cough in China. Lung. 198 (1), 23-29 (2020).
  3. Zeiger, R. S., et al. Patient-reported burden of chronic cough in a managed care organization. J Allergy Clin Immunol Pract. 9 (4), 1624-1637.e10 (2021).
  4. Chamberlain, S. A., et al. The impact of chronic cough: A cross-sectional European survey. Lung. 193 (3), 401-408 (2015).
  5. Morice, A. H., et al. Expert opinion on the cough hypersensitivity syndrome in respiratory medicine. Eur Respir J. 44 (5), 1132-1148 (2014).
  6. Mazzone, S. B., Undem, B. J. Vagal afferent innervation of the airways in health and disease. Physiol Rev. 96 (3), 975-1024 (2016).
  7. Shapiro, C. O., et al. Airway sensory nerve density is increased in chronic cough. Am J Respir Crit Care Med. 203 (3), 348-355 (2021).
  8. Ando, A., et al. Neural correlates of cough hypersensitivity in humans: Evidence for central sensitization and dysfunctional inhibitory control. Thorax. 71 (4), 323-329 (2016).
  9. Plevkova, J., et al. Animal models of cough. Respir Physiol Neurobiol. 290, 103656(2021).
  10. Smith, J. A., Hilton, E. C. Y., Saulsberry, L., Canning, B. J. Antitussive effects of memantine in guinea pigs. Chest. 141 (4), 996-1002 (2012).
  11. Hewitt, M. M., et al. Pharmacology of bradykinin-evoked coughing in guinea pigs. J Pharmacol Exp Ther. 357 (3), 620-628 (2016).
  12. Zhong, S., et al. Antitussive activity of the Schisandra chinensis fruit polysaccharide (SCFP-1) in guinea pigs models. J Ethnopharmacol. 194, 378-385 (2016).
  13. Zhong, S., et al. Effects of Schisandra chinensis extracts on cough and pulmonary inflammation in a cough hypersensitivity guinea pig model induced by cigarette smoke exposure. J Ethnopharmacol. 165, 73-82 (2015).
  14. Wei, L., et al. Effects of Shiwei longdanhua formula on LPS-induced airway mucus hypersecretion, cough hypersensitivity, oxidative stress and pulmonary inflammation. Biomed Pharmacother. 163, 114793(2023).
  15. Chen, L., Lai, K., Lomask, J. M., Jiang, B., Zhong, N. Detection of mouse cough based on sound monitoring and respiratory airflow waveforms. PLoS One. 8 (3), e59263(2013).
  16. Gibson, P., et al. Treatment of unexplained chronic cough: Chest guideline and expert panel report. Chest. 149 (1), 27-44 (2016).
  17. Nakaji, H., et al. Airway remodeling associated with cough hypersensitivity as a consequence of persistent cough: An experimental study. Respir Investig. 54 (6), 419-427 (2016).
  18. Xu, X., et al. Association of cough hypersensitivity with tracheal trpv1 activation and neurogenic inflammation in a novel guinea pig model of citric acid-induced chronic cough. J Int Med Res. 46 (7), 2913-2924 (2018).
  19. Iwata, T., et al. Mechanical stimulation by postnasal drip evokes cough. PLoS One. 10 (11), e0141823(2015).
  20. Chen, L., et al. Establishment of a mouse model with all four clinical features of eosinophilic bronchitis. Sci Rep. 10 (1), 10557(2020).
  21. Zhang, C., Lin, R. L., Hong, J., Khosravi, M., Lee, L. Y. Cough and expiration reflexes elicited by inhaled irritant gases are intensified in ovalbumin-sensitized mice. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 312 (5), R718-R726 (2017).
  22. Amato, A., Becci, A., Beolchini, F. Citric acid bioproduction: The technological innovation change. Crit Rev Biotechnol. 40 (2), 199-212 (2020).
  23. Hu, W., Li, W. J., Yang, H. Q., Chen, J. H. Current strategies and future prospects for enhancing microbial production of citric acid. Appl Microbiol Biotechnol. 103 (1), 201-209 (2019).
  24. Morice, A. H., Kastelik, J. A., Thompson, R. Cough challenge in the assessment of cough reflex. Br J Clin Pharmacol. 52 (4), 365-375 (2001).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים