מאמר שיטה

מידול צריכת אלכוהול במכרסמים באמצעות שתיית כלוב ביתי לבחירה בשני בקבוקים וניתוח מיקרו-מבני

DOI:

10.3791/67486

⸱

8 בנובמבר 2024

 ,  , 
1Center for Alcohol Research in Epigenetics, Department of Psychiatry, University of Illinois Chicago

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר פרדיגמת שתייה סטנדרטית של שני בקבוקים בכלוב ביתי לבחירה לסירוגין כדי להדגים צריכת אלכוהול בחולדות. בנוסף, הוא מספק הוראות שלב אחר שלב להגדלת הפרוטוקול הסטנדרטי עם מערכת זיהוי ליקוק עשה זאת בעצמך המאפשרת ניתוח מיקרו-מבני של התנהגות השתייה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שתיית כלוב ביתי לבחירה בשני בקבוקים היא אחת הפרדיגמות הנפוצות ביותר לחקר צריכת אתנול במכרסמים. בצורתו הפשוטה ביותר, לבעלי חיים ניתנת גישה לשני בקבוקי שתייה, אחד מהם מכיל מי ברז רגילים והשני אתנול, כאשר הצריכה היומית נמדדת על ידי שינוי במשקל הבקבוק במהלך תקופה של 24 שעות. כתוצאה מכך, גישה זו אינה דורשת ציוד מעבדה מיוחד. בעוד שקלות יישום כזו היא ככל הנראה התורמת הגדולה ביותר לאימוץ הנרחב שלה על ידי חוקרי אלכוהול פרה-קליניים, הרזולוציה של נתוני השתייה שנרכשו בגישה זו מוגבלת על ידי מספר הפעמים שהחוקר מודד את משקל הבקבוק (למשל, פעם ביום). עם זאת, הרצון לבחון דפוסי שתייה בהקשר של צריכה כוללת, התערבויות פרמקולוגיות ומניפולציות עצביות הוביל לפיתוח מערכות זיהוי ליקוק כלובים ביתיות שיכולות לרכוש נתונים ברמת הליקוקים הבודדים. למרות שמספר מערכות אלו פותחו לאחרונה, מערכת הקוד הפתוח, LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home cage Device), זכתה לתשומת לב משמעותית בתחום בשל המחיר הסביר והידידותיות למשתמש. למרות שהיא מרגשת, המערכת הזו תוכננה לשימוש בעכברים. כאן, אנו סוקרים נהלים מתאימים לשתייה סטנדרטית ומצוידת בשני בקבוקים בכלוב ביתי. אנו מציגים גם שיטות להתאמת מערכת LIQ HD לחולדות, כולל שינויי חומרה כדי להתאים לגודל כלוב גדול יותר ומחזיק בקבוקים מודפס בתלת מימד שעוצב מחדש התואם לבקבוקי שתייה סטנדרטיים מהמדף. באמצעות גישה זו, החוקרים יכולים לבחון דפוסי שתייה יומיים בנוסף לרמות הצריכה בחולדות רבות במקביל ובכך להגדיל את הרזולוציה של הנתונים הנרכשים בהשקעה מינימלית במשאבים נוספים. שיטות אלה מספקות לחוקרים את הגמישות להשתמש בבקבוקים סטנדרטיים או במכשיר המצויד בליקומטר כדי לחקור את המנגנונים הנוירוביולוגיים העומדים בבסיס שתיית אלכוהול בהתאם לצרכי הניסוי המדויקים שלהם.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות ששימוש מתון באלכוהול נקשר היסטורית ליתרונות בריאותיים מתונים, מחקרים מקיפים בקנה מידה גדול שנערכו לאחרונה גילו שאף כמות של צריכת אלכוהול אינה בטוחה1,2. למעשה, שימוש באלכוהול הוא גורם הסיכון השביעי המוביל למוות ונכות בעולם1, כאשר אנשים ששותים אפילו כמויות קטנות של אלכוהול נמצאים בסיכון מוגבר לסרטן, מחלות זיהומיות ופציעה1,3. בארצות הברית, מקרי המוות משימוש באלכוהול עלו בכמעט 30% בין 2016 ל-20214. חשוב לציין, הסיכון למוות ונכות עולה באופן מונוטוני עם עלייה בצריכה1.

למרות שמחקרים בבני אדם סיפקו תובנות חשובות לגבי הנוירוביולוגיה של שימוש באלכוהול ושימוש לרעה, הבקרה הניסויית הניתנת על ידי מודלים של בעלי חיים חיונית להבנה מעמיקה של המנגנונים העומדים בבסיס התנהגות השתייה והסיכון לשתייה מרובה. מודלים אלה הם גם כלים חשובים לפיתוח טיפולים שמטרתם להפחית צריכה בלתי מבוקרת. שתיית כלוב ביתי עם שני בקבוקים היא אחת הפרדיגמות הפרה-קליניות הנפוצות ביותר לחקר צריכת אלכוהול במכרסמים. זה נובע במידה רבה מקלות היישום שלו מכיוון שהוא מאפשר מדידה של שתיית אלכוהול מרצון והעדפה ללא צורך בציוד מחקר מיוחד או ניתוחים מורכבים. באמצעות גישה זו, חוקרים יכולים לאסוף מדידות במרווחי הזמן הרצויים להם (למשל, שעות, ימים, שבועות) על ידי חישוב השינוי במשקל הבקבוק מתחילת סשן השתייה ועד סופו. וריאציות על שיטה בסיסית זו שימשו רבים בתחום כדי להקל על רמות נמוכות עד בינוניות עד בולמוסיות של צריכת אלכוהול לפרקי זמן קצרים וארוכים כאחד. לדוגמה, נעשה שימוש בהליכי בחירה רציפים ולסירוגין של שני בקבוקים כדי להקל על רמות נמוכות ומתונות של צריכת אלכוהול, בהתאמה, הן ב5 והן ב-rats6,7,8. אותן פרדיגמות יכולות לקדם רמות גבוהות של צריכה בזנים המעדיפים אלכוהול7,9. לחלופין, התאמה של שיטה זו המגבילה את הגישה לאלכוהול ל-2-4 שעות ביום החל מ-3 שעות לאחר תחילת מחזור החושך הוכחה כמולידה שתייה מופרזת בעכברים (כלומר, שתייה בחושך)10,11. וריאציות נוספות על שיטות אלה שימשו בשילוב עם שיטות המאפשרות תלות באלכוהול (כלומר, חשיפה כרונית לאדי אתנול לסירוגין) כדי לבחון את ההסלמה של שתיית אלכוהול מרצון במהלך גמילה12,13,14,15,16,17,18,19.

למרות שאומצה באופן נרחב על ידי התחום, הגישה הסטנדרטית של מדידת צריכת אלכוהול על ידי שינוי במשקל הבקבוק מוגבלת ברזולוציה לצריכה הכוללת לכל מפגש שתייה. כתוצאה מכך, גישה זו אינה מסוגלת ללכוד דפוסי שתייה, הידועים היטב כמשפיעים הן על הסיכון והן על החומרה של הפרעת שימוש באלכוהול (AUD)20,21,22. ואכן, הצריכה הממוצעת של אדם לאורך זמן יכולה להיות תוצאה של מספר אפיזודות שתייה כבדות או אפיזודות שתייה רבות שכל אחת מהן קשורה לצריכה נמוכה יחסית, והניואנסים הללו אינם מתגלים כאשר הצריכה נמדדת כצריכה הכוללת לכל מפגש שתייה. חשוב לציין, באופן משמעותי יותר אפיזודות שתייה הקשורות להתקפי שתייה גדולים (כלומר, בליעה) נצפות אצל אנשים עם AUD בהשוואה לקבוצת ביקורת בריאה23 ונתונים בפרימטים לא אנושיים מצביעים על כך שאנשים שקובעים דפוס צריכת אלכוהול הכולל התקפי שתייה גדולים בשלב מוקדם בהיסטוריית השתייה שלהם נמצאים בסיכון משמעותי ל-AUD22. יתר על כן, אפיזודות שתייה הכוללות התקפי צריכה גדולים מגבירות משמעותית את הסיכון לתחלואה ותמותה ללא תלות באבחון21. בסך הכל, נתונים אלה הובילו לעניין מוגבר בבחינת דפוסי שתייה בנוסף לרמות הצריכה הכוללת במודלים פרה-קליניים והניעו את הפיתוח של מספר מערכות במורכבות משתנה המסוגלות ללכוד נתוני שתייה ברמת הליקוקים הבודדים.

בין הראשונים היה פיתוח מערכת של שני בקבוקים המצוידת בזיהוי ליקוק פוטו-beam המיועדת לשימוש ב-mice24. מערכת זו הותאמה לאחר מכן על ידי קבוצה נפרדת לשימוש ב-rats25. בשנים שחלפו מאז, וריאציות על נושא זה שימשו לפיתוח מערכות דומות הכלולות בדיור מכרסמים מותאם אישית26, המאפשרות זיהוי ליקוק של בעלי חיים בודדים השוהים חברתית27,28, ואשר לוכדות הן התנהגות האכלה והן שתייה29. בין אלה, LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home cage Device)30 זכה לתשומת לב משמעותית על הצעת מערכת לשימוש בעכברים המקבילה לקלות היישום ובמחיר סביר של המערכת שפותחה על ידי Godnyuck et al.24. מערכת זו משתמשת בחישה קיבולית כדי לזהות ישירות מגע בין הלשון לצינור המתכת המוליך, בניגוד לאמצעים עקיפים כגון גישת לגימה או אינטראקציה הניתנים באמצעות מערכת זיהוי הפוטו-קרן. המחברים מספקים נתונים המדגימים כי מערכת החישה הקיבולית שלהם מעניקה דיוק ורגישות גדולים יותר באופן משמעותי בזיהוי ליקוק, ומייצרת מתאמים חזקים יותר בין מספר הליקוק לשינוי במשקל הבקבוק מאשר זיהוי קרן פוטו. המחברים מדגימים עוד את היכולת להשתמש במערכת זו בשילוב עם פרדיגמת שתייה בכלוב ביתי לבחירה רציפה של שני בקבוקים כדי ללכוד מדדים של מיקרו-מבנה שתיית אלכוהול בנוסף למדדים של צריכת צריכה יומית כוללת30.

כאן, אנו מתארים נהלים לשתיית אלכוהול בכלוב ביתי לבחירה של שני בקבוקים באמצעות גישה סטנדרטית, כמו גם שיטות המאפשרות זיהוי ליקוק (איור 1). אנו מציגים גם שיטות לבנייה והטמעה של LIQ HDR - התאמה של LIQ HD30 לשימוש בחולדות הכוללת שינויי חומרה כדי להתאים לגדלי כלוב גדולים יותר ומחזיק בקבוקים מודפס בתלת מימד שעוצב מחדש התואם לבקבוקי מדף סטנדרטיים. שיטות אלו מספקות לחוקרים את הגמישות להשתמש בגישה סטנדרטית או מצוידת בליקומטר בהתאם למשאבי הניסוי ולצורכי איסוף הנתונים שלהם.

להלן תיאור של החומרים הדרושים והוראות שלב אחר שלב ללכידת שתייה בכלוב ביתי באמצעות נוהל שתייה לבחירת שני בקבוקים בגישה לסירוגין המותאם מ-Simms et al.7. בהליך זה, לחולדות ניתנת גישה 24 שעות ביממה לשני בקבוקי שתייה 7 ימים בשבוע. בימי שני, רביעי ושישי (MWF), חולדות מקבלות בקבוק אחד שמכיל מים (H2O) ובקבוק אחר שמכיל אתנול (EtOH). בקבוקים אלה מוסרים בימי שלישי, חמישי ושבת (TRS) ומוחלפים בשני בקבוקי מים. חולדות שותות מאותם שני בקבוקי מים בימי שבת וראשון. שים לב שניתן להתאים את השיטות הללו בקלות ללוחות זמנים חלופיים של גישה לאתנול (למשל, רציף, בולמוס וכו') אם תרצה. הוראות נפרדות ניתנות לגישות סטנדרטיות ומצוידות בליקומטר.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הנתונים המייצגים נאספו באמצעות חולדות לונג-אוונס בוגרות בעלות בית יחיד באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת אילינוי בשיקגו ובהתאם להנחיות ה-NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. נדרש דיור יחיד על מנת לפקח במדויק על צריכת הנוזלים על ידי כל נבדק. חולדות זכר בוגרות (n = 38) ונקבות (n = 22) היו P50-80 עם הגעתם והורשו להתאקלם בוויווריום במשך שבוע לפני תחילת הניסוי. לחולדות הייתה גישה אד-ליביטום לצ'או סטנדרטי (Teklad 7912, Envigo) ולמים, אלא אם כן צוין אחרת.

1. הכנה לפני הניסוי

  1. סמן בקבוקי שתייה כ-H2O או EtOH. לאחר מכן, סמנו תווית עם מזהה ייחודי לכל חולדה בקבוק H2O אחד ובקבוק EtOH אחד עבור MWF ושני בקבוקי H2O עבור TRS.
    הערה: לחלופין, השתמש בסרט צבע שונה כדי לזהות בקבוקי H2O ו-EtOH כדי לסייע במניעת שגיאות פוטנציאליות במהלך החלפת הבקבוק.
  2. מלאו בקבוקי H2O במי שתייה יום אחד לפני תאריך תחילת הניסוי. הכן תמיסת EtOH על ידי שילוב של 190 הוכחות EtOH עם מי שתייה (20% v/v) יום אחד לפני תאריך תחילת הניסוי.
    זהירות: זה קריטי שה-EtOH המשמש לא יהיה מפורק, מכיוון ש-EtOH מפוגל הוא רעיל.
  3. הכינו כלוב ריק על אותם מדפים כמו החולדות המשתתפות בניסוי. כלוב זה ישמש לחישוב שפיכה.
  4. צייד כלובים במערכת LIQ HDR אם אתה משתמש (ראה שלב 3, <מחלקה חזקה="xfig">איור 2, <מחלקה חזקה="xfig">איור 3, <מחלקה חזקה="xfig">איור 4, <מחלקה חזקה="xfig">איור 5, <מחלקה חזקה="xfig">איור 6, ואיור משלים 1).
  5. קבע את השעה המדויקת ביום להחלפת בקבוק לפני תחילת המחקר. יש להחליף בקבוקים באותה שעה בכל יום על מנת לקבל מדידה מדויקת של צריכה של 24 שעות.
    הערה: מחקרים קודמים הראו שמכרסמים מציגים את מידת הצריכה הגדולה ביותר מוקדם לאחר תחילת המחזור האפל10,31. לכן, על מנת ללכוד את הצריכה במהלך תקופה פעילה מאוד זו (ראה שלב 2.3.1 ללכידת שתייה מופרזת), מומלץ להחליף בקבוק 30-60 דקות לאחר כיבוי האורות. השתמש במנורות אדומות במהלך החלפת הבקבוק כדי לאפשר הדמיה ללא הפרעה למחזור האור-חושך.

2. נהלים ותחזוקה יומיומיים

  1. ביום הראשון של הניסוי, בצע את הפעולות הבאות.
    1. יש להוציא בקבוקי מים סטנדרטיים מהכלובים.
    2. אופציונלי: חולדות לעתים קרובות מתנגשות בחלק העליון של הכלוב בזמן שהן מחפשות מזון, מה שעלול לגרום לשפיכה שלא ניתן לתקן על ידי כלוב השפיכה הריק. השימוש בכוסות מזון בתוך הכלוב יכול להקל על חשש זה. אם משתמשים, הוציאו את האוכל מהחלק העליון של הכלוב כעת, הוסיפו אוכל בתוך הכלוב ומלאו אותו בצ'או. ודא ששטח הרצפה המוקצה לחולדה עדיין עומד בהנחיות המוסדיות המבוססות על גודל כלוב החולדות וגודל המזון.
    3. ציין לצוות הטיפול והגידול, לפי העניין, שאנשי המחקר יספקו מזון ומים למשך הניסוי.
    4. שינויים בכלוב יכולים לשבש את איסוף הנתונים. בצע החלפת כלוב במקביל להשגת מדידות משקל גוף. חוקרים הבוחרים לעשות זאת צריכים ליידע את צוות הטיפול והגידול שלהם בהתאם.
  2. בימים שלאחר מכן, בצע את הנהלים המפורטים להלן.
    הערה: זכור שכל תנועה של כלובים ובקבוקים עלולה ליצור שפיכה. לכן, חשוב להיות עדינים בתנועות ולהשתמש באותן שיטות של מריחה והסרה של בקבוקים על כלוב השפיכה כמו בכלובי חולדות.
    1. היכנסו לחדר לפני שעת החלפת הבקבוקים, הקפידו על מספיק זמן לבצע את השלבים הבאים, והניחו בקבוקים חדשים על כלובים בזמן תחילת הפגישה המתאים.
    2. הסר את צמרות המסנן מהכלובים. אם MWF, המשך לשלב 2.2.3. אם TRS, המשך לשלב 2.2.4.
    3. בימי שני, רביעי ושישי, הסר בקבוקי TRS מצמרות הכלובים. שקלו בקבוקי MWF (אחד EtOH ואחד H2O). רשום את המשקל ההתחלתי של הבקבוק לסשן השתייה של היום. ספק מזון נוסף לראש הכלוב או לכוסות המזון במידת הצורך. בזמן תחילת המפגש המיועד, הניחו בקבוקים על החלק העליון של הכלוב של כל חולדה עם סרט פונה כלפי מעלה כדי שהחולדות לא ילעסו את תווית הבקבוק.
      הערה: בדרך כלל, צריכת מים אינה נרשמת או מדווחת עבור TRS, אך חוקרים יכולים לאסוף נתונים אלה באופן אופציונלי על ידי השגת משקלי בקבוק לסירוגין כמתואר להלן בשלב 2.2.3 ושלב 2.2.4 אם תרצה. יש להחליף את הצד של בקבוק ה-EtOH לאחר כל סבב שתייה על מנת למנוע התפתחות של העדפת צד פוטנציאלית, שעלולה להטות את נתוני הצריכה בטעות.
      1. אופציונלי: עבודות קודמות הראו שחולדות רבות מפגינות שתייה מופרזת בתחילת מפגש השתייה8,32,33. רוב החוקרים המתעדים שתיית אלכוהול מופרזת במהלך תקופה זו מדווחים על צריכה במהלך 30-60 הדקות הראשונות של השתייה. כדי לקבל נתוני צריכה במהלך פרק בולמוס פוטנציאלי זה, בצע את השלבים המתוארים להלן.
      2. הגדר טיימר לאחר החלת בקבוקים על הכלוב האחרון. השאירו את החדר ללא הפרעה במהלך התקופה המתוזמנת.
      3. היכנס שוב לחדר כאשר הטיימר מצלצל. הסר את בקבוקי EtOH ו-H2O ורשום את משקל הבקבוקים. החזירו בקבוקי EtOH ו-H2O לכלובים.
        הערה: שלב זה אינו נדרש כדי ללכוד פרקי בינג' בעת שימוש במערכת המצוידת לזיהוי ליקוק.
    4. בימי שלישי, חמישי ושבת, יש להוציא את בקבוקי ה-MWF מהכלובים בשעת סיום המפגש המיועדת, המתאימה ל-24 שעות לאחר שעת ההתחלה. שקלו כל בקבוק ורשמו את משקל קצה הבקבוק עבור מפגש השתייה של MWF. השג ורשום את משקל הגוף של כל חולדה. במידת הצורך, ספק מזון נוסף לראש הכלוב או לכוסות האוכל. הנח בקבוקי TRS H2O על החלק העליון של הכלוב של כל חולדה עם סרט פונה כלפי מעלה כדי שהחולדות לא ילעסו את תווית הבקבוק.
    5. החזירו את צמרות המסנן לכלובים וצאו מחדר החיות.
      הערה: אופציונלי לכסות את לוגמי בקבוקי EtOH כדי למנוע אידוי. אם החלפת כלובים מבוצעת על ידי צוות המחקר, הקצה יום אחד בשבוע במהלך תפקידי TRS לביצוע משימה זו. הכניסו כל חולדה לכלוב נקי לאחר השגת משקל גוף.
  3. יש לשטוף בקבוקים ולרענן נוזלים על בסיס שבועי או דו-שבועי קבוע בהתאם לנהלי הטיפול והגידול של המוסד. הקפד לבצע את המטלות הללו באופן שאינו מפריע למפגשי השתייה. לדוגמה, ניתן לשטוף ולמלא בקבוקי TRS H2O לאחר ההסרה ב-MWF. באופן דומה, בקבוקי MWF H2O ו-EtOH ניתנים לשטיפה ומילוי מחדש לאחר ההסרה ב-TRS.

3. זיהוי ליקוק במהלך ניסויי בחירה של שני בקבוקים

הערה: חוקרים המעוניינים ללכוד נתוני שתייה ברזולוציה גבוהה יכולים לשנות את ההליך לעיל על ידי הוספת יכולות זיהוי ליקוק לבקבוקים. LIQ HD30 היא מערכת עשה זאת בעצמך (DIY) בעלות נמוכה המאפשרת סוג זה של איסוף נתונים בעכברים. הנהלים המפורטים להלן מתארים את השינויים הדרושים להתאמת LIQ HD לשימוש בחולדות (המכונה LIQ HDR). ראה טבלת חומרים לרשימה של כל החלקים הנמכרים מסחרית והמודפסים בתלת מימד המותאמים אישית הדרושים לבניית מערכת זיהוי ליקוק אחת, שיכולה ללכוד נתוני בחירה של שני בקבוקים עבור עד 18 חולדות. ניתן למצוא את קבצי ה-.stl להדפסת תלת מימד והוראות באתר האינטרנט של המחבר (www.ejgloverlab.com/3dprints).

  1. הגדרת יחידות חיישנים קיבוליות
    הערה: כל מערכת LIQ HDR מורכבת משלוש יחידות חיישנים קיבוליות, אשר יחד לוכדות נתוני ליקוק מ-36 בקבוקים במקביל המתאימים ל-18 חולדות חד-ביתיות. כל יחידת חיישן מורכבת מלוח פיצול תקשורת I2C דיפרנציאלי אחד ולוח חיישן קיבולי אחד עם 12 מקשים, שיתחבר לליקומטרים משישה כלובים נפרדים דרך שישה זוגות של כבלים 2 פינים מקודדים בצבע עבור כל ליקומטר (<מחלקה חזקה="xfig">איור 2A).
    1. אסוף את החומרים הנדרשים לבניית כל שלוש יחידות החיישנים הקיבוליים, כפי שמוצג באיור 2B, יחד עם כלי ההלחמה הנדרשים.
    2. כדי להתחיל לבנות יחידת חיישן A, כסו כבל מחבר נקבה 2 פינים בצינור אדום מתכווץ בחום באורך 7 אינץ', הכניסו את קצות החוטים האדומים והשחורים שלו לפין #0 ו-#1 בלוח החיישן (<מחלקה חזקה="xfig">איור 2C-1), והלחמו במקום (<מחלקה חזקה="xfig">איור 2C-2). ודא שהכבל נמצא בקדמת לוח החיישן כפי שמוצג על מנת לסדר את הכלובים בסדר מספרי משמאל לימין בוויווריום מבלי לחפוף את הכבלים ועלול לשבש את ההקלטה (ראה שלב 3.6 ו- איור 6).
    3. כסו חמישה כבלים נוספים עם צינורות כיווץ חום בצבע מובהק והלחמה לפין #2-11 כפי שמוצג (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 2C-3). ודא שכל החוטים האדומים מולחמים לפינים זוגיים, שיתחברו לכל הבקבוקים בצד שמאל, וכל החוטים השחורים מולחמים לפינים אי-זוגיים, שיתחברו לכל הבקבוקים בצד ימין.
    4. מכסים את מפרקי ההלחמה בדבק חם מכל הצדדים להגנה (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 2C-4). סמן את המחברים בסדר מספרי, וספק מזהה ייחודי עבור כל ליקומטר (<מחלקה חזקה="xfig">איור 2C-4).
    5. כדי להרכיב יחידת חיישן A, חבר את לוח החיישן A ל-EndPoint של פריצת תקשורת עם כבל 50 מ"מ 4 פינים, וחבר את ה-EndPoint ליציאת V 3.3 של מעביר הידית V 5 ל-V 3 עם כבל 4 פינים של 100 מ"מ (<מחלקה חזקה="xfig">איור 2D-1). למרות שגם ללוח החיישנים וגם ללוח פיצול התקשורת יש שני מחברים זהים עם 4 פינים, עדיין חשוב לוודא שהחיווט הוא בדיוק כפי שמוצג (איור 2D-1 ו-איור 2F) על מנת להשתמש במארזי החיישנים המודפסים בתלת-ממד ובמערך ה-vivarium המוצע (ראה שלב 3.6 ו-איור 6). יחידת חיישן בית A בתוך המארז המודפס בתלת-ממד (<מחלקה חזקה="xfig">איור 2D-2). סגור בעדינות את החלק העליון, הקפד לא לרסק את כבל מעביר המפלס (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 2D-3).
    6. שנה את כתובות I2C של לוחות חיישנים B ו-C על ידי הלחמת חוט מגשר מפין ה-ADDR לפין 3Vo או SDA כפי שמצוין (איור 2E).
    7. הלחמת שישה כבלי מחבר נקבה מקודדים בצבע ללוחות חיישנים B ו-C באותו סדר המשמש עבור לוח A. סמן כל מחבר עם מספר הזיהוי המתאים של הליקומטר. חבר לוח B לפריצת התקשורת MidPoint ו-C ל-EndPoint עם כבלים 50 מ"מ 4 פינים (<מחלקה חזקה="xfig">איור 2F).
    8. יחידות חיישן בית B ו-C במארזים המודפסים בתלת מימד בהתאמה. שרשר את כל שלוש יחידות החיישנים עם כבלי Ethernet כדי להשלים את הגדרת החיישן (איור 2G).
  2. הגדרת ממשק המיקרו-בקר
    הערה: ממשק המיקרו-בקר LIQ HDR (איור משלים 1A) זהה למתואר עבור LIQ HD30 עם שינויים קלים מאוד. ההליכים המתוארים להלן מספקים סקירה כללית של השלבים הדרושים להגדרת הממשק עם השינויים המתוארים בשלבים 3.2.6 ו-3.2.8. החוקרים מופנים לפרוטוקול המקורי ולסרטון ההדרכה המסופק בדף GitHub של המחבר לקבלת הוראות מפורטות יותר שלב אחר שלב30.
    1. אסוף את החומרים וכלי ההלחמה הנדרשים לבניית ממשק המיקרו-בקר (איור משלים 1B). בצד האחורי של מגן המגע (איור משלים 1C-1), צור מגשר הלחמה על פני רפידות ההלחמה האחוריות (איור משלים 1C-2).
    2. בצד האחורי של מגן רישום הנתונים, נתק את עקבות משטח המגשר של פין CS (איור משלים 1D-1). בצד הקדמי של לוגר הנתונים, הלחמו חוט מגשר קצר מפין CS לפין #7 (איור משלים 1D-2).
    3. כדי להתקין את כותרות ערימת המגן, ערמו אותן תחילה בחלק האחורי של מגן מסך המגע (איור משלים 1E-1). ערמו את לוגר הנתונים למסך המגע, השתמשו בסרט כדי לייצב והלחמו את כל פיני הכותרת ללוגר הנתונים (איור משלים 1E-2). לאחר מכן הסירו את מסך המגע.
    4. ערמו את הכותרת הנותרת של 2 x 3 למיקרו-בקר (איור משלים 1F-1), ולאחר מכן ערמו את לוגר הנתונים על המיקרו-בקר לפני הלחמת פיני הכותרת במקומם (איור משלים 1F-2).
    5. הכנס את סוללת המטבעות לתוך לוגר הנתונים (איור משלים 1G-1). ערמו את מסך המגע על לוגר הנתונים (איור משלים 1G-1). הכנס את כרטיס ה-microSD יחד עם המתאם שלו לתוך לוגר הנתונים (איור משלים 1G-2).
    6. כדי ליצור את חוט ההארקה הנוסף, חתכו מחבר זכר אחד מחוט מגשר והפשיטו את הקצה ל-~1/4 אינץ' (איור משלים 1H-1). הלחמו גדיל של חוט ליבה מוצק מופשט לחוט המגשר וכסו את מפרק ההלחמה בצינורות כיווץ חום (איור משלים 1H-2).
    7. חבר את חוטי המגשר עם 4 פינים וחוט הארקה נוסף למיקרו-בקר (שחור - GND, אדום - 5V, צהוב - פין #21, כחול - פין #20, איור משלים 1I-1). אבטח את החיבורים עם דבק חם (איור משלים 1I-2). לחלופין, עטפו את חוטי המגשר בצינורות כיווץ חום (איור משלים 1I-2).
    8. מאכלסים את ממשק המיקרו-בקר המורכב במלואו במארז המודפס בתלת-ממד, עם חוטי המגשר עם 4 פינים וחוט הארקה מושחלים דרך הפתח בחלק העליון (איור משלים 1J).
    9. עקוב אחר הפרוטוקול המקורי עבור התקנת תוכנת ממשק מיקרו-בקר30.
  3. בניית LIQ HDR lickometers
    הערה: הדפסת התלת מימד המותאמת אישית המחזיקה את הבקבוקים מיועדת לשימוש עם בקבוק שתייה רגיל למכרסמים בקוטר צינור לגימה של 8 מ"מ (ראה טבלת חומרים, <מחלקה חזקה = "xfig">איור 3A). ניתן להתאים בקלות את מחזיק הבקבוקים לשימוש עם בקבוקים דומים ושפופרות לגימה ללא שינויים קלים.
    1. אסוף את החומרים, הדפסות תלת מימד וכלי ההלחמה הנדרשים לבניית ליקומטר אחד כפי שמוצג באיור 3B. שימו לב שכל מערכת LIQ HDR מכילה מקסימום 18 ליקומטרים ל-36 בקבוקים.
    2. כדי להאריך את כבל המחבר הזכר, הפשיטו את שני קצותיו לאורך של ~1/4 אינץ', כמו גם את החוטים השחורים והאדומים המאריכים (<מחלקה חזקה="xfig">איור 3C-1).
    3. הלחמו את חוטי ההארכה לכבל המחבר (<מחלקה חזקה="xfig">איור 3C-2) וכסו את מפרקי ההלחמה בצינורות כיווץ חום (<מחלקה חזקה="xfig">איור 3C-3). כסו את כבל המחבר הזכרי בצינורות כיווץ חום המותאמים בצבע לכבל מחבר נקבה מתאים ביחידת החיישן (איור 3C-4).
    4. כדי להיות עקביים עם חיווט לוח החיישנים (<מחלקה חזקה="xfig">איור 2), השחילו את החוט האדום והשחור דרך מעבר הכבל הפנימי השמאלי והימני של מחזיק הבקבוק, בהתאמה (<מחלקה חזקה="xfig">איור 3D-1).
    5. הלחמו כל חוט עד לקצה סרט הנחושת המוליך בגודל 1 3/4 אינץ' (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 3D-2) וקפלו את סרטי הנחושת לשניים (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 3D-3).
    6. שחרר את סרט הנחושת והשתמש בזוג מלקחיים כדי לתמרן אותו בזהירות בתוך תושבת הלגימה (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 3E-1) לפני שתדביק אותו היטב לדפנות הפנימיות של תושבת הלגימה (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 3E-2). ודא שצד ההלחמה של סרט הנחושת מודבק לקיר קרוב יותר לקו האמצע של מחזיק הבקבוק, כפי שמצוין (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 3E-2). דחוף צינור לגימה דרך התושבת כדי ללחוץ את הסרט בחוזקה על הקיר ולטשטש את התושבת.
    7. כדי לחזק את צד ההלחמה של סרט הנחושת, שאינו דביק ונוטה להתקלף, מרחו כף דבק חם על מפרק ההלחמה (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 3E-3). מרחו את הדבק כדי לכסות גם את סרט הנחושת וגם כל חלק חשוף סמוך של ההדפסה התלת מימדית (איור 3E-4).
    8. השחילו את הכבל דרך המעבר הפנימי של מגן הכבל (איור 3F). הקפד לבחור את מגן הכבלים המתאים (פונה שמאלה או ימינה) עבור כל ליקומטר על מנת להשתמש בהגדרת הוויווריום המוצעת (ראה שלב 3.6 ו<מחלקה חזקה = "xfig">איור 6)."הערה: ליקומטרים 5-6, 11-12 ו- 17-18, המתוארים בכבלים בצבע כחול או סגול בהגדרה הנוכחית, דורשים מגן כבלים הפונה שמאלה (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 4D-1), בעוד שכל הליקומטרים האחרים דורשים מגן כבל הפונה ימינה (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 4D-2).
    9. כדי להתקין את תפס הכבל, הכנס תחילה חוט אחד לחריץ של מחצית אחת של תפס הכבל (איור 3G-1), ולאחר מכן התקן את החצי השני מעל החוט השני, ולאחר מכן סגור היטב את שני החצאים עם האום (איור 3G-2).
    10. סמן את המחבר הזכר עם מספר הזיהוי המתאים של הליקומטר (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 3H). חזור על שלבים אלה עד שכל 18 הליקומטרים נבנים.
  4. התקנת LIQ HDR lickometers
    הערה: LIQ HDR מיועד להתקנה על כלוב עכברוש רגיל עם חלק עליון של חוט מתכת (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 4A-1).
    1. זהה שני זוגות מוטות עם מרחק מרכז למרכז של ~75 מ"מ על החלק העליון של כלוב התיל על מנת להכיל את מחזיק הבקבוק. השתמש בזוג צבת כדי לפתוח מעט את מוטות המתכת סביב פתחי הלגימה. בידוד מוטות אלה עם סרט חשמלי על מנת למנוע מגע מתכת למתכת בין הלוגמים לחלק העליון של הכלוב (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 4A-2).
      הערה: למרות שהסרט החשמלי אינו נגיש לחולדות ולכן אינו רגיש ללעיסה, אנו ממליצים להשליך אותו בסוף המחקר ולא לעשות בו שימוש חוזר בין המחקרים.
    2. התקן את הליקומטר ואת לוח אקריליק הלייזר בעובי 1/8 אינץ' לחלק העליון של הכלוב עם שני סטים של ברגים ואומים M5 (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 4B). ודא שפתחי הלגימה על הליקומטר והלוח האקרילי מיושרים, ושהלוגמים אינם במגע עם חלק כלשהו בחלק העליון של הכלוב.
    3. אבטח את תפס הכבל למוט החיצוני ביותר (קוטר ~4 מ"מ) של החלק העליון של כלוב החוט (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 4C). כוונן את תפס הכבל במידת הצורך כדי לוודא שהחלק העליון של הכלוב מונח היטב על תחתית הכלוב ושהכבל אינו נמשך או מכופף במתח רב מדי. ודא שמגן הכבלים הנכון נמצא בשימוש עבור כל ליקומטר (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 4D וראה שלב 3.8.8).
    4. כוונן את צינורות הלגימה לפי הצורך כך שרק ~2 ס"מ מהלגימה משתרעת מהמכסה (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 4E-1). להתקנת בקבוקים, הכנס את צינור הלגימה דרך תושבת הלגימה של מחזיק הבקבוק עד שהוא נעצר (איור 4E-2). רק קצה צינור הלגימה צריך להשתרע מעבר ללוח האקרילי (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 4E-3). חיוני שאף חלק אחר של צינור הלגימה לא ייחשף על מנת למנוע ליקוקים חיוביים כוזבים מהתנהגויות שאינן מספקות, כגון החולדה נוגעת או משחקת עם שפופרת הלגימה. חלק עליון של מסנן אמור להיות מסוגל לנוח היטב מעל החלק העליון של כלוב החוט ותפס הכבל מבלי להפריע לכבל עצמו (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 4F).
      הערה: ניתן להשתמש בפאנל אקרילי עבה יותר או בערימה של מספר לוחות בגודל 1/8 אינץ' כדי לסגור במלואם צינורות לגימה באורכים ארוכים יותר לניסויים הדורשים שצינורות הלגימה יימשכו רחוק יותר לתוך הכלוב, כגון בעת מדידת שתייה בחולדות צעירות שעלולות להתקשות להגיע ללגימה קצרה.
  5. התקנה ושימוש בחוסמי sipper
    הערה: חוסם הלגימה (איור 5A) נועד להגביל את הגישה של החולדה ללגימה במהלך החלפת בקבוק ולהבטיח כיול מדויק של ליקומטר בתחילת כל מפגש שתייה.
    1. אסוף את החלקים המודפסים בתלת מימד ובורג, אום ומכונת כביסה M5 עבור חוסם לגימה אחד כפי שמוצג ב<מחלקה חזקה = "xfig">איור 5B.
    2. הכנס את SIPPER_Gear לתוך SIPPER_Base (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 5C-1). ודאו שהכיוון של SIPPER_Gear מדויק כפי שמוצג בכניסה לעיבוד תלת-ממד. הכנס את SIPPER_Worm לפתח בחלק העליון של SIPPER_Base. סובב את התולעת בכיוון השעון תוך כדי הכנסה עד שהראש מיושר עם הבסיס (איור 5C-2).
    3. הברג את SIPPER_Nut לקצה התולעת מתחתית הבסיס (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 5C-3). השתמש במלקחיים כדי להדק את האום תוך כדי סיבוב חוגת התולעת. הכנס את הצוואר העגול והצר של SIPPER_Blockers לתוך חריצי ה-Gear (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 5C-4).
    4. התקן את חוסם הלגימה המורכב על החלק העליון של הכלוב באמצעות סט הברגים M5 (<מחלקה חזקה="xfig">איור 5D). ודא ששני חוסמי הלגימה מתיישרים עם פתחי הלגימה.
    5. כדי לחסום את הגישה ללוגמים, סובב את חוגת התולעת בכיוון השעון כדי להוריד את החוסמים עד שהם מכסים לחלוטין את פתחי הלגימה (איור 5E).
    6. כדי לספק גישה ללוגמים, סובב את החוגה נגד כיוון השעון עד שהחוסמים נמצאים במצב אנכי בניצב לחלק העליון של הכלוב (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 5F-1). משוך ידנית כלפי מעלה כל זרוע חוסם עד שהראשים נמצאים ממש מתחת לחלק העליון של כלוב החוט. סובב את החוסמים ב-90 מעלות כך שהראשים יהיו מקבילים למוטות המתכת בחלק העליון של הכלוב והזרועות ננעלות במקומן (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 5F-2). המשך לסובב את החוגה נגד כיוון השעון עד ששני החוסמים מורמים מעל החלק העליון של הכלוב (<מחלקה חזקה="xfig">איור 5F-3) והלוגמים נגישים לחלוטין (<מחלקה חזקה="xfig">איור 5F-4).
  6. שימוש במערכת LIQ HDR ב- vivarium
    הערה: מערך ה-vivarium הבא מותאם ללכידת שתייה לבחירה של שני בקבוקים באמצעות ממשק מיקרו-בקר יחיד המחובר ל-18 כלובי חולדות סטנדרטיים. כל הרכיבים האלקטרוניים, כולל ממשק המיקרו-בקר, יחידות החיישנים והכבלים השונים, מאובטחים למדפי חוטי מתכת המורכבים על הקיר המחזיקים את הכלובים (<מחלקה חזקה="xfig">איור 6A). ייתכן שיידרשו שינויים מסוימים כדי להתאים למתקני בעלי חיים ולצרכי המשתמש.
    1. התקן כל יחידת חיישן על מדפי הוויווריום באמצעות בורג ההרכבה המודפס בתלת-ממד המותאם אישית (איור 6B). ודא שכל יחידת חיישן מותקנת ישירות מתחת לכלוב עם הליקומטר בצבע צהוב על מנת למנוע מתח כבלים מיותר (איור 6A).
    2. סדרו ואבטחו כל כבל מחבר נקבה תוך הקפדה על כך שהם אינם חופפים זה לזה או מתכופפים יתר על המידה בקצות ההלחמה שלהם, מה שעלול לגרום לגילוי ליקוק גרוע (איור 6B). אם משתמשים במדפי מוטות מתכת, ניתן להשיג זאת בקלות על ידי קשירת כבל את כבלי המחברים למוטות נפרדים על המדף כפי שמתואר.
    3. התקן את ממשק המיקרו-בקר ליד יחידת חיישן A באמצעות אותו בורג הרכבה מודפס בתלת מימד וחבר את מחבר 4 הפינים שלו ליציאת הכניסה V 5 של מעביר הרמה V 5 ל- V 3 המחובר ליחידת חיישן A (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 6C).
    4. השתמש בסרט חשמלי כדי להדק את חוט ההארקה הנוסף למקור הארקה כגון מדפי המתכת (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 6D).
    5. סדר כל כלוב על סמך הצבע והמזהה של הליקומטר המותקן לפי תיאור איור 6A על מנת למזער את חפיפת הכבלים והמתח
      6. .
    6. חבר בצורה מאובטחת את כל כבלי מחבר הליקומטר הזכר לכבלי מחבר חיישן הנקבה התואמים (<מחלקה חזקה="xfig">איור 6E). חבר את ספק הכוח כדי להפעיל את ממשק המיקרו-בקר (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 6F).
    7. בדף הראשי של ממשק המשתמש הגרפי (איור 6G), הקש על סמל ההגדרה כדי לפתוח את דף ההגדרות. משתמשים יכולים לשנות את זמן ההדלקה והכיבוי של האורות על סמך לוח הזמנים של הוויווריום כדי להבטיח שתצוגת הממשק תתעמעם אוטומטית עם תחילת מחזור החושך (איור 6H-1).
    8. הקש על ערוך הגדרות חיישן (איור 6H-1) כדי לכוונן את סף המגע ל-8 ואת סף השחרור ל-2, שמצאנו כדי לאפשר את זיהוי הליקוק העקבי ביותר עבור חולדות המשתמשות בהגדרה הנוכחית (<מחלקה חזקה="xfig">איור 6H-2). עם זאת, שים לב שייתכן שמשתמשים יצטרכו להתנסות בהגדרות שונות אם יוצגו שינויים כלשהם במערכת הנוכחית.
    9. בטל את הסימון של כיול אוטומטי אם הנתונים נאספים רק במשך תקופה של 24 שעות או פחות (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 6H-2).

4. נהלים יומיים לשתייה בכלוב ביתי לבחירה בשני בקבוקים באמצעות זיהוי ליקוק

  1. בצע את השלבים המפורטים בשלב 2 עבור הליכי בחירה סטנדרטיים של שני בקבוקים עם השינויים הבאים.
  2. בימי שני, רביעי ושישי, לפני הנחת בקבוקי ה-MWF, השתמשו בחוסמי הלגימה כדי לכסות את פתחי הלגימה בכל הכלובים (ראו שלב 3.5.5 ו-<מחלקה חזקה="xfig">איור 5E).
  3. לפני ההקלטה, בחר את הצד הניסיוני הנכון בדף ה-GUI הראשי, שיהיה הצד של בקבוק ה-EtOH לאותו יום (איור 6G).
  4. לאחר התקנת כל בקבוקי ה-MWF, הקישו על START! בעמוד הראשי (איור 6G) כדי להתחיל לכייל חיישנים, שבמהלכו מומלץ למשתמשים להתרחק צעד אחד מהמערכת ולוודא שהחולדות אינן מלקקות את הלוגמים (איור 6I-1). השלמת הכיול אורכת מספר שניות, ולאחר מכן המערכת נכנסת לדף ההקלטה הראשי המציג את מספרי הליקוק המצטברים על כל בקבוק עבור כל ליקומטר (איור 6I-2).
  5. הרם את כל חוסמי הלגימה מעל החלק העליון של הכלוב כדי לאפשר גישה ללוגמים (ראה שלב 3.5.6 ו-<מחלקה חזקה="xfig">איור 5F), והחזר בעדינות את כל צמרות המסננים כמתואר (ראה שלב 3.4.4 ו-<מחלקה חזקה="xfig">איור 4F).
  6. הקש על רענן כדי לעדכן את מספרי הליקוק על המסך, שלא יתעדכן בזמן אמת מעצמו (איור 6I-2).
  7. בימי שלישי, חמישי ושבת, הקש על שמור וצא כדי להפסיק את ההקלטה ולחזור לדף הראשי (איור 6I-2) לפני הסרת בקבוקי ה-MWF.
  8. כדי להסיר כרטיס SD להעברת נתונים, הקש על הוצא SD לפני ניתוק כרטיס ה-SD (<מחלקה חזקה="xfig">איור 6G). הכנס את כרטיס ה-SD לכל מחשב והעתק/הדבק את .csv הנתונים file על שם תאריך הבקבוק לאותו מחשב (איור 6K). כדי לטעון מחדש את כרטיס ה-SD להקלטה הבאה, הכנס את הכרטיס לממשק והקש על Mount SD (איור 6J).
    הערה: אנו ממליצים לגבות קבצי נתונים מדי יום.
  9. רצוי להגביל את מדידות משקל הגוף לפעם בשבוע כאשר הן תואמות את מודל החי ופרוטוקול השימוש בבעלי חיים ולבצע משימה זו ביום המיועד להחלפת כלוב על מנת למזער הפרעות מיותרות לליקומטרים ולחיישנים. נתק את כל כבלי הליקומטר הזכריים מכבלי החיישן הנקביים התואמים לפני העברת כלובים. לאחר שקילת כל חולדה, החזירו את החולדה לכלוב נקי. העבירו את הליקומטר לחלק העליון של כלוב חדש וחברו מחדש כל ליקומטר לחיישן המתאים במידת הצורך.
  10. לניסויים הבודקים את ההשפעה של התערבות (למשל, הזרקת סמים) על צריכת EtOH ומיקרו-מבנה שתייה, קבעו התערבויות כאלה לפני תחילת מפגש השתייה במידת האפשר. במקרים שבהם זה לא אפשרי, חוקרים יכולים להפריע לזיהוי הליקוק על ידי הקשה על Pause (איור 6I-2) ולחדש את לכידת הנתונים על ידי הקשה על Resume לאחר השלמת ההתערבות. אנו מציעים לאסוף משקולות בקבוקים במהלך כל הפסקה בפגישת השתייה על מנת ללכוד שינויים בצריכת EtOH לפני ואחרי ההתערבות וכן כדי לקחת בחשבון שפיכה שעלולה להתרחש בעת הסרת החלק העליון של הכלוב כדי לקבל גישה לבעל החיים.
  11. בסוף המחקר, יש לחטא היטב את כל הרכיבים בכלוב לפני השימוש בהם עם בעלי חיים חדשים כדי להגביל את העברת המזהמים בין בעלי חיים. אנו ממליצים לרסס ולנגב בעדינות את הליקומטר בתמיסת 70% EtOH, תוך הקפדה על אי הפרעה לרכיבים החשמליים הפנימיים. ניתן לשטוף את חוסם הלגימה והפאנל האקרילי במי סבון חמים.

5. ניתוח נתונים

  1. לפני הערכת מדדים תלויים, יש לתקן את נתוני הצריכה עבור שפיכה המתרחשת באופן בלתי נמנע כתוצאה מהחלפת בקבוקים מדי יום. לשם כך, ממוצע את השינוי במשקל הבקבוק עבור בקבוקי EtOH ו-H2O בכלוב השפיכה לאורך כל תקופת המחקר.
  2. אל תכלול ערכים הגדולים משתי סטיות תקן מהממוצע עבור כל בקבוק. לאחר אי הכללת חריגים אלה, הפחיתו את האמצעים המחושבים מהשינויים במשקל הבקבוק EtOH ו-H2O המתקבלים מבקבוקים בכלובים המכילים בעלי חיים. על ידי הפחתת סכום זה, החוקרים יכולים להיות בטוחים שההפסד הממוצע הנובע משפיכה של תמיסה נתונה אינו נלקח בחשבון במדדי הצריכה. הפחתת כמות הדליפה הממוצעת עלולה לגרום לערך שלילי עבור בעלי חיים מסוימים במקרים מסוימים. המר אותם לאפס ופרש אותם כהיעדר כל צריכה לפתרון זה.
  3. המדדים התלויים העיקריים לניסויי שתייה בשני בקבוקים הם צריכת EtOH (גרם/ק"ג) והעדפה (%). חשב את הצריכה משינוי במשקל בקבוק EtOH (גרם) ונרמל למשקל גוף (ק"ג) באמצעות השלבים הבאים.
    1. המר את השינוי במשקל הבקבוק (g) לשינוי בנפח (mL) באמצעות המשוואה הבאה :
      figure-protocol-1
      הצפיפות של אתנול טהור היא 0.789 גרם/מ"ל. לכן, צפיפות התרומה של 20% EtOH היא 0.1578 גרם/מ"ל. H2O שוקל 1 גרם/מ"ל. לכן, צפיפות התרומה של 80% H2O = 0.80 גרם/מ"ל. כתוצאה מכך, כל מ"ל של תמיסת EtOH של 20% (v/v) מורכב מ-0.1578 (EtOH) + 0.80 (H2O) = 0.9578 גרם/מ"ל. לכן, המשוואה הסופית בעת שימוש בריכוז EtOH של 20% (v/v) היא:
      figure-protocol-2
    2. חשב את מינון האתנול הנצרך באמצעות המשוואה שלהלן. השתמש במשקלי גוף שהתקבלו באותו שבוע כמו נתוני הצריכה על מנת לחשב אתנול הנצרך במונחים של משקל גוף בעלי חיים.
      figure-protocol-3
    3. חישוב העדפה באמצעות המשוואה הבאה:
      figure-protocol-4
  4. כמו מקבילו לעכבר30, LIQ HDR לוכד מגוון משתנים של מיקרו-מבנה שתייה, כולל משך הליקוק, מספר הסיבוב, משך הסיבוב, מספר הליקוק ומשך הליקוק (<מחלקה חזקה="xfig">איור 6K). התקף שתייה מוגדר כסדרה של ליקוקים שמתחילה בלפחות 3 ליקוקים המבוצעים בפחות משנייה אחת ומסתיימת לאחר שחלפו 3 שניות ללא ליקוקים נוספים. לאחר מכן ניתן להשתמש במדדים אלה כדי לחשב את משך הליקוק הבודד הממוצע, משך הסיבוב הבודד הממוצע, המספר הממוצע של ליקוקים לכל סיבוב, תדירות הליקוק הממוצעת, מרווח הליקוק המשוער ומרווח בין הסיבוב המשוער.
    הערה: ממשק המיקרו-בקר מספק את נתוני המיקרו-מבנה הללו ברזולוציה של דקה אחת בקובץ .csv (<מחלקה חזקה="xfig">איור 6K). חוקרים יכולים להשתמש באפליקציית הניתוח המסופקת עם פרוטוקול LIQ HD המקורי30 או בפלטפורמת העיבוד המועדפת עליהם כדי לאסוף ולסכם נתונים בהתאם לצרכי המחקר. נתוני מיקרו-מבנה מסוכמים בדרך כלל לאורך כל התקופה של 24 שעות כדי להשוות הבדלים ממוצעים ברמת המאקרו, או בפח של 30 דקות עד שעה כדי לבחון שינויים בדפוסי השתייה על פני מחזור אור-חושך.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כלוב ביתי סטנדרטי לבחירה לסירוגין של שני בקבוקים EtOH נתוני שתייה
באמצעות ההליך הסטנדרטי (איור 7A), חוקרים יכולים ללכוד צריכה של 24 שעות (איורים 7B-D) כמו גם שתייה דמוית בולמוס אם משקולות הבקבוקים נאספות זמן קצר לאחר תחילת סשן השתייה (איורים 7E-F). על ידי חישוב צריכת אתנול ביחס לצריכת מים, חוקרים יכולים גם לקבל נתוני העדפה בכל נקודות הזמן שנמדדו (<מחלקה חזקה = "xfig">איורים 7D,F). כפי שמוצג באיור 7C, חולדות מציגות לעתים קרובות תקופה של הסלמה בצריכת אתנול במהלך הימים הראשונים של גישה לבחירה של שני בקבוקים. לאחר מכן מגיעה רמה שבמהלכה הצריכה נשארת יציבה יחסית. אף על פי שנצפה באופן עקבי בחולדות זכרים7,32,33,34,35,36, דפוס זה לא תמיד נצפה אצל נקבות. במקום זאת, מחקרים מסוימים מדווחים על רמות יציבות של צריכת אתנול לאורך כל תקופת המחקר בחולדות37,38. בנוסף, מחקרים מסוימים מצביעים על כך שצריכת אתנול עשויה להסלים עוד יותר עם תקופות ממושכות יותר של access36,39. הצריכה היומית יכולה להשתנות באופן משמעותי בין אנשים. עם זאת, הצריכה היומית הממוצעת אופיינה היטב עבור הזנים הנפוצים ביותר במחקר אלכוהול ויכולה לשמש כאמת מידה להצלחה כאשר מסתכלים על נתונים מקובצים7,8,33,34,35,39.

כפי שמוצג באיור 7E, חולדות רבות צורכות חלק משמעותי מצריכת האתנול היומית שלהן זמן קצר לאחר תחילת סשן השתייה8,33. דפוס דמוי בולמוס זה של צריכת אתנול קשור לעתים קרובות להעדפה משמעותית של אתנול על פני מים (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 7F). עם זאת, החוקרים לא צריכים להיות מופתעים אם העדפת 24 שעות אינה עולה על 50%. זה נכון במיוחד עבור זני מכרסמים שאינם מעדיפים אלכוהול או שאינם מעדיפים אלכוהול ומחקרים המוגבלים לתקופות קצרות יחסית של גישה לשני בקבוקים7,32,33,35,37.

אימות של LIQ HDR לניתוח מיקרו-מבנה שתייה לבחירה בשני בקבוקים
התוספת של מערכת LIQ HDR לפרדיגמת בחירת שני בקבוקי החולדה הסטנדרטית מאפשרת לחוקרים לחזות בצורה מדויקת ומדויקת את הצריכה באמצעות נתוני שתייה שנלכדו. זה מאושר על ידי נוכחות של מתאם חזק ומובהק בין המספר המצטבר של הליקוקים שזוהו לבין השינוי במשקל הבקבוקים הן עבור ה-EtOH (R2 = 0.7789, F(1,113) = 398.1, p < 0.0001) והן עבור בקבוק H2O (R2 = 0.7910, F(1,117) = 442.9, p < 0.0001) במשך תקופה של 24 שעות (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 8A). זה נכון גם עבור ימים שבהם חולדות קיבלו שני בקבוקים שהכילו H2O (R2 = 0.8875, F(1,188) = 1484, p < 0.0001; <מחלקה חזקה = "xfig">איור 8B).

LIQ HDR מאפשר גם ניתוח מדויק של דפוסי שתייה ברזולוציה זמנית גבוהה שאינה ניתנת על ידי פרדיגמת הבחירה הסטנדרטית של שני בקבוקים. באמצעות גישה זו, לחוקרים יש הזדמנות לבחון הבדלים בדפוסי השתייה בין פתרונות שונים, על פני מחזור האור, בין המינים, קבוצות הסמים ועוד. כדי להמחיש, שילוב ליקוקים ממוצעים למרווחים של 30 דקות מאפשר ניתוח קל של דפוסי שתייה ממוצעים של 24 שעות. כצפוי, הניתוח הזה מגלה צריכה גבוהה יותר באופן משמעותי גם עבור EtOH וגם עבור H2O במהלך מחזור החושך, כאשר החולדות ערות, מאשר במחזור האור, כאשר חולדות בדרך כלל ישנות (<מחלקה חזקה="xfig">איור 8C). באמצעות גישה דומה, חוקרים יכולים לחקור הבדלים בין קבוצות בדפוסי השתייה. לדוגמה, ניתן להשוות את המיקרו-מבנה של שתייה בין חולדות זכרים ונקבות על ידי בחינת המספר הממוצע של ליקוקים עבור EtOH (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 8D) או מים (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 8E) לאורך תקופה של 24 שעות. כדי לחקור שתייה קדמית ו/או דמוית בולמוס, חוקרים יכולים להגדיל את הרזולוציה של הניתוח שלהם כדי להתמקד בשתייה המתרחשת זמן קצר לאחר תחילת הפגישה באמצעות חלון פח קטן יותר לסיכום נתונים. פעולה זו מאפשרת לחוקרים לחקור תקופות של שתייה מופרזת מבלי לדרוש איסוף של משקלי בקבוקים מרובים בתוך תקופה של 24 שעות. כפי שמוצג באיור 8C (מוכנסת), ניתוח זה מגלה שרוב השתייה שנלכדת על ידי משקל בקבוק המתקבלת 30 דקות לאחר תחילת הפגישה מתרחשת ב-5 הדקות הראשונות, ולא לאורך 30 הדקות. נתונים כאלה יכולים לסייע בזיהוי נקודות זמן אופטימליות לאיסוף דגימות דם למדידת ריכוז אתנול בדם (BEC). ואכן, דפוס דומה של העמסה קדמית נצפה ביום שתייה נפרד שבמהלכו נלכדו דפוסי שתייה ברזולוציה גבוהה בפרק זמן קצר של 15 דקות (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 8F). ממוצע הליקוקים שנרשמו במהלך מפגש זה חזה באופן מהימן שינוי במשקל הבקבוק (EtOH: R2 = 0.6316, F(1,10) = 17.15, p = 0.0020; H2O: R2 = 0.8601, F(1,10) = 61.47, p < 0.0001; <מחלקה חזקה = "xfig">איור 8G). יתר על כן, BECs שנלקחו מדגימות דם שהתקבלו 15 דקות לאחר תחילת הסשן היו בקורלציה טובה עם מספר הליקוקים שזוהו (R2 = 0.4327, F(1,10) = 7.627, p = 0.0201; <מחלקה חזקה="xfig">איור 8H) אפילו עבור רמות נמוכות יחסית של צריכת EtOH.

LIQ HDR לוכד מדדים שונים של מיקרו-מבנה שתייה אשר מזוהים ומחושבים בזמן אמת במהלך מפגשי שתייה ונשמרים בפחים של דקה אחת בדומה לזיהוי ליקוק (איור 6K). מדדים אלה מתוארים בקצרה בשלב 5.4 והוגדרו קודם לכן30. חוקרים יכולים לבצע ניתוחים מפורטים של שינויים במיקרו-מבנה השתייה האישי ולבחון כיצד ובאיזו מידה דפוסי השתייה תורמים להבדלים בצריכה הכוללת. כדי להמחיש זאת, מצאנו שאף על פי שחולדות זכרים ונקבות הפגינו מספר דומה של ליקוקים, התקפי שתייה ואורך התקף (<מחלקה חזקה="xfig">איור 9A-C) בעת שתיית מים, זה היה קשור לצריכה כוללת גדולה יותר (גרם/ק"ג) בנקבות מאשר בזכרים (מבחן t; t=2.882, df=10, p=0.0163; <מחלקה חזקה = "xfig">איור 9D). זה צפוי בהתחשב בדימורפיזם המיני במשקל הגוף, המאפשר רמות גבוהות יותר של צריכה לפי משקל גוף לנקבות מאשר לגברים למספר זהה של ליקוקים. באופן מדהים, זה מנוגד להשוואה של הבדלי המינים בדפוסי המיקרו-מבנה עבור EtOH, שגילתה מיקרו-מבנה שתייה דומה הקשור לרמות דומות של צריכת EtOH (<מחלקה חזקה = "xfig">איורים 9E-H). נתונים אלה מצביעים על כך שבעוד שנפח הליקוק של מים דומה בין המינים, בהשוואה לזכרים, לחולדות נקבות יש נפח ליקוק קטן יותר עבור EtOH. יחד, נתונים מיקרו-מבניים אלה תומכים ברעיון שחולדות זכרים ונקבות ככל הנראה נבדלים באסטרטגיות שתייה מרצון בהתבסס על סוג הנוזל הנצרך בכלוב הביתי. עבודות קודמות דיווחו גם על הבדלים בין המינים באסטרטגיות שתייה התלויות בסוג הנוזל40,41, אם כי ההבדלים שנצפו במחקרים אלה לא הוגבלו רק לצריכת מים. אורך היסטוריית השתייה עשוי לשחק תפקיד בהבדלים שנצפו בין מחקרים, שכן שתייה בשני בקבוקים הוגבלה ל-5 שבועות במערך הנתונים הנוכחי, בעוד שהיא עלתה על 12 שבועות בעבודה קודמת40,41.

figure-results-1
איור 1: שתייה בכלוב ביתי לבחירה בשני בקבוקים. (A) חוקרים יכולים למדוד צריכה והעדפה של אתנול בכלוב ביתי מרצון (ביחס למים) באמצעות גישה סטנדרטית המחשבת את הצריכה על סמך השינוי במשקל הבקבוק. (B) על ידי שימוש ב-LIQ HDR, מערכת זיהוי ליקוק כלוב ביתי בעלות נמוכה המיועדת לחולדות, חוקרים יכולים לרכוש את אותם אמצעים כמו בהליך הבחירה הסטנדרטי של שני בקבוקים תוך לכידת מיקרו-מבנה שתייה ברזולוציה גבוהה במהלך כל תקופת ההקלטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: בניית יחידות חיישנים קיבוליות. (א) חלקים אלקטרוניים ותרשים חיווט. (B) חומרים לבניית שלוש יחידות חיישנים קיבוליות הנדרשים לבניית מערכת LIQ HDR אחת. (C) הלחמת כבלי מחבר נקבה 2 פינים לכלובים #1-6 ללוח פין A #0-11 ולאבטח את מפרקי ההלחמה עם דבק חם. כבלי קוד צבע עם צינורות כיווץ חום צבעוניים ותווית כל אחד עם מספר זיהוי ייחודי של ליקומטר. (ד) חבר את לוח A ואת מעביר הרמה של 5V ל-3V לפריצת תקשורת דיפרנציאלית I2C EndPoint עם כבלים בעלי 4 פינים (1), ולוח בית A ופריצת התקשורת במעטפת המודפסת בתלת מימד (2-3). (E) שנה את כתובות I2C של לוחות B ו-C על ידי הלחמת חוט מגשר מפין ה-ADDR לפיני 3Vo ו-SDA, בהתאמה. (F) הלחמת כבלי מחבר נקבה 2 פינים ללוחות חיישנים B ו-C, תווית עם מזהי הליקומטר המתאימים, וחיבור לוח B לפריצת תקשורת MidPoint ולוח C ל-EndPoint עם כבלים 4 פינים. (G) יחידות חיישני בית B ו-C במארזים המודפסים בתלת-ממד שלהן בהתאמה ושרשרת דייזי את כל שלוש היחידות עם כבלי Ethernet. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: בנה את הליקומטר LIQ HDR. (A) עיבוד תלת-ממדי של הרכיבים בתוך הכלוב. (ב) חומרים להקמת ליקומטר אחד עם שני בקבוקים. שימו לב שמערכת LIQ HDR אחת יכולה להכיל 18 ליקומטרים עם שני בקבוקים. (ג) הארך את אורך כבל המחבר הזכר בעל 2 פינים עם זוג חוטים שחורים ואדומים וקוד צבע עם צינורות כיווץ חום. (ד) השחילו את החוטים השחורים והאדומים דרך הפתחים השמאלי (L) והימני (R) במחזיק הבקבוק (1) והלחמו את הקצוות לסרטי הנחושת (2-3). (ה) הדביקו את סרטי הנחושת לדפנות הפנימיות של תושבות הלגימה (1-2) וחיזקו אותם בדבק חם (3-4). (ו) השחילו את הכבל דרך מגן הכבל. (ז) התקן את תפס הכבל. (ח) סמן את המחבר במספר מזהה ליקומטר תואם. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
<מחלקה חזקה = "xfig">איור 4: התקנת ליקומטר. (א) השתמש בסרט חשמלי כדי לבודד את מוטות המתכת סביב פתחי הלגימה בחלק העליון של כלוב המתכת. (ב) התקן את הליקומטר ולוח האקריליק לחלק העליון של הכלוב עם שני סטים של ברגים ואומים M5. (ג) אבטח את תפס הכבל למוט החיצוני ביותר של החלק העליון של כלוב התיל. (ד) הקפד להשתמש במגן הכבלים המתאים (L שמאלי או R ימין) עבור כל כלוב. (E) ודאו שרק ~2 ס"מ מלוגמי הבקבוקים חשופים (1), כך שכאשר הבקבוקים מונחים על הכלוב (2) רק קצות הלוגמים נמשכים מעבר ללוח האקרילי ונגישים לחולדות. (F) החלק העליון של המסנן צריך להתאים מעל תפס הכבל מבלי להפריע לכבל עצמו. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: התקנה ושימוש בחוסם Sipper. (A) עיבוד תלת-ממדי של חוסם ה-sipper. (ב) חלקים מודפסים בתלת מימד מותאמים אישית עבור חוסם סיפר אחד. (ג) הרכיבו את החלקים המודפסים בתלת מימד. (ד) התקן את חוסם הלגימה המורכב על החלק העליון של הכלוב עם בורג M5 + אום + מכונת כביסה. (E) סובב את החוגה בכיוון השעון כדי לחסום את הגישה ללוגמים. (F) סובב את החוגה נגד כיוון השעון כדי להסיר חוסמים מהלגימה (1), הרם את החוסמים וסובב 90° (2), והמשך לסובב את החוגה נגד כיוון השעון עד שהחוסמים נמצאים מעל החלק העליון של הכלוב (3-4). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: הגדרת Vivarium ופעולת ממשק משתמש גרפי. (א) התקנה מומלצת של vivarium ותרשים חיווט. (ב) התקן כל יחידת חיישן על המדפים וסדר וייצב את כבלי החיישן למדפים. (ג) התקן את ממשק המיקרו-בקר על המדפים וחבר את מגשר 4 הפינים שלו למעביר המפלס של 5V ל-3V המחובר ליחידת החיישן A. (D) אבטח את חוט ההארקה הנוסף עם סרט חשמלי. (ה) חבר את כבלי החיישן לכבלי הליקומטר המתאימים. (F) חבר את ספק הכוח כדי להפעיל את ממשק המיקרו-בקר. (G) הדף הראשי של ממשק ה-GUI. (H) הקש על הגדרות כדי להתאים את זמן ההפעלה/כיבוי של האורות ללוח הזמנים של תאורת הוויווריום (1) והקש על הגדרות חיישן כדי לכוונן את סף המגע והשחרור עבור חולדות (2). (I) כדי להקליט נתונים, בחר את צד בקבוק EtOH בעמוד הראשי, הקש על START! כדי לכייל את החיישנים (1), ולהתחיל להקליט (2). הקש על רענן כדי לעדכן את מספר הליקוק המוצג על המסך, והקש על שמור וצא כדי להפסיק את ההקלטה. (J) הקש על הוצא SD בעמוד הראשי כדי להסיר את כרטיס ה-SD ולהעביר נתונים. הקש על הר SD לאחר הכנסת כרטיס ה-SD. (K) צילום מסך של קובץ נתונים גולמיים מייצג הממחיש כיצד נתוני מיקרו-מבנה נשמרים בסל של דקה אחת על ידי ממשק המיקרו-בקר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7
איור 7: נתוני שתייה מייצגים של שני בקבוקים שנלכדו באמצעות ההליך הסטנדרטי. בפרדיגמת השתייה של EtOH בכלוב ביתי עם שני בקבוקים לסירוגין, (A) חולדות מקבלות 20% (v/v) תמיסת EtOH (כתום) ו-H2O (כחול) בימי שני, רביעי ושישי (MWF), ושני בקבוקים המכילים H2O בימי שלישי, חמישי וסופי שבוע. (B) מדדים של צריכת נוזלים יומית מראים שבעוד שחולדות שומרות על רמה עקבית יחסית של צריכת נוזלים כוללת (מ"ל) לאורך כל תקופת המחקר, (C) חולדות מציגות לעתים קרובות הסלמה בצריכת EtOH במהלך מפגשי השתייה הראשונים, ולאחר מכן רמות הצריכה מתייצבות. (D) דפוס זה של הסלמה ותחזוקה משתקף באופן דומה בהעדפה ל-EtOH. חוקרים יכולים גם ללכוד צריכת EtOH דמוית בולמוס (E) אם משקלי הבקבוקים נאספים לאחר 30-60 הדקות הראשונות של תחילת הפגישה. (F) זה קשור לעתים קרובות להעדפה גבוהה ל-EtOH על פני H2O. קווי שגיאה מוצללים מייצגים ±-SEM (n = 32 לזכרים ו-n = 16 לנקבות). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-8
איור 8: LIQ HDR לוכד במדויק צריכה ברזולוציה זמנית גבוהה. הדיוק והדיוק של מערכת LIQ HDR מאושרים, בין השאר, על ידי נוכחות של מתאם חיובי משמעותי בין מספר הליקוקים לשינוי במשקל הבקבוק בימים שבהם חולדות מקבלות (A) H2O ו-EtOH וכן (B) ימים שבהם שני הבקבוקים מכילים H2O. (C) הבדלים בדפוסי השתייה בין H2ניתן להעריך בקלות את O (כחול) ו-EtOH (כתום) לאורך תקופת השתייה של 24 שעות על ידי שילוב ליקוקים ממוצעים למרווחים של 30 דקות. הכניסה תואמת לליקוקים ממוצעים בפחים של 5 דקות במהלך 30 הדקות הראשונות של הגישה לבקבוק (מודגש באפור), שבמהלכן חולדות מפגינות לעתים קרובות התנהגות משמעותית של טעינה קדמית. ניתן גם לבחון הבדלים בין קבוצות בדפוסי השתייה באמצעות גישה דומה כפי שמודגם על ידי מיקרו-מבנה ליקוק עבור (D) EtOH ו-(E) H2O המתואר עבור חולדות זכרים ונקבות לאורך תקופה של 24 שעות. (F) ניתן להעריך את דפוסי השתייה גם ברזולוציה זמנית גבוהה על פני תקופת בדיקה קצרה יותר, (G) שבמהלכה LIQ HDR ממשיך לעקוב במדויק אחר הצריכה ו-(H) לחזות את ריכוז האתנול בדם (BEC) אפילו עבור רמות נמוכות יחסית של צריכת EtOH. קווי שגיאה מוצללים מייצגים ± SEM (n = 6 לכל מין). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-9
איור 9: נתוני מיקרו-מבנה מייצגים של שתייה. LIQ HDR מאפשר ללכוד מדדים של מיקרו-מבנה שתייה, כולל (A) מספר הליקוקים, (B) מספר התקפי השתייה ו-(C) אורך ההתקף, בנוסף ל-(D) מדידת צריכת המים הכוללת על ידי שינוי במשקל הבקבוק. (א-ה) ניתן להשיג אמצעים דומים עבור אתנול. השוואות בין קבוצות של מדדים אלה יכולות לזהות דפוסי שתייה מובחנים, כפי שקורה בדוגמה הנוכחית, החושפת הבדלים בין המינים באסטרטגיות שתייה בהתבסס על התמיסה הנצרכת. קו מלא מציין חציון, וקווים מקווקוים מציינים רביעונים (n = 6 לכל מין); מבחן t לא מזווג; *עמ' < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: הגדרת ממשק המיקרו-בקר. (א) חלקים אלקטרוניים ותרשים חיווט. (B) חומרים לבניית ממשק המיקרו-בקר הנדרשים למערכת LIQ HDR אחת. (C) בצד האחורי של מגן המגע הקיבולי, הוסף מגשר הלחמה על פני רפידות ההלחמה האחוריות. (D) בצד האחורי של מגן רישום הנתונים, נתק את עקבות משטח המגשר של פין CS (1). הלחמו חוט מגשר מפין CS לפין #7 (2). (E) הלחמת פיני כותרת ללוגר הנתונים באמצעות מגן המגע כבסיס. (F) ערמו את כותרת ה-2x4 הנותרת למיקרו-בקר (1), ערמו את לוגר הנתונים על המיקרו-בקר והלחמו את הכותרת במקומה (2). (G) הכנס את סוללת המטבעות לתוך לוגר הנתונים (1), ערם את מסך המגע על לוגר הנתונים והכנס את כרטיס ה-SD ללוגר הנתונים (2). (H) כדי ליצור את חוט ההארקה הנוסף, חתכו מחבר זכר אחד מחוט המגשר והלחמו את הקצה לחוט ליבה מוצק מופשט. (I) חבר את חוטי המגשר עם 4 פינים וחוט הארקה נוסף למיקרו-בקר (1) ואבטח עם דבק חם (2). (J) לשכן את ממשק המיקרו-בקר במעטפת המודפסת בתלת מימד מותאמת אישית. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הנוכחי מספק הוראות שלב אחר שלב ללכידת נתוני שתיית אתנול באמצעות נוהל כלוב ביתי לבחירת שני בקבוקים לסירוגין. ניתן ליישם שיטה זו בקלות יחסית ובעלות נמוכה עד אפסית או צורך בציוד מחקר מיוחד. באמצעות הנהלים הניתנים כאן לבנייה ויישום של LIQ HDR - מערכת זיהוי ליקוק לשימוש בחולדות - חוקרים יכולים ללכוד נתוני מיקרו-מבנה שתייה ברזולוציה גבוהה בנוסף למדדים סטנדרטיים של צריכה והעדפה.

לוח הזמנים לגישה לסירוגין המתואר בפרוטוקול הנוכחי הוא הליך בשימוש נרחב במידה רבה מכיוון שהוא ידוע כמייצר רמות גבוהות יותר של צריכת אתנול מאשר לוחות זמנים חלופיים רבים של גישה לאתנול. ואכן, מחקרים קודמים הראו שלחולדות עם גישה בלוח זמנים לסירוגין יש צריכת אתנול יומית ממוצעת גבוהה יותר מאשר לחולדות עם גישה רציפה של 24 שעות 6,7. עם זאת, לוחות זמנים שונים של גישה לאתנול עשויים להיות רצויים בהתאם לשאלת המחקר או לפרמטרים אחרים של תכנון ניסוי. חוקרים יכולים בקלות רבה לשנות את הפרוטוקול הנוכחי כך שיתאים ללוחות זמנים שונים (למשל, גישה רציפה, שתייה בחושך וכו') פשוט על ידי שינוי זמן וימי ההפעלה/כיבוי של הבקבוק.

למרות ששתייה בשני בקבוקים היא פרדיגמה פשוטה יחסית ליישום, עלולות להתעורר בעיות שיש להן פוטנציאל לפגוע באיסוף הנתונים. לכן, חיוני שהנסיינים יבדקו נתונים על בסיס יומי על מנת לזהות במהירות בעיות פוטנציאליות. בפרט, חוקרים צריכים לשים לב היטב לשינויים גדולים מאוד או קטנים מאוד במשקל הבקבוקים שעשויים להעיד על לגימה דולפת או סתומה, בהתאמה. זיהוי סימנים לבעיות אלה בשלב מוקדם יכול למנוע אי הכללה של כל הנתונים מנושא נתון מהניתוח. ואכן, אם חוקרים מבחינים בשינויים דרסטיים (או היעדר שינוי) במשקל הבקבוק במשך תקופה של 24 שעות, מעבר פשוט לבקבוק חדש יכול לעזור לאשר אם יש להוציא בקבוק נתון מהמחזור. מסיבות אלה, כדאי להחזיק בקבוקים ולוגמים נוספים בהישג יד. עם זאת, יש לציין שחלק מהחולדות מציגות באופן טבעי רמות נמוכות מאוד של שתיית אתנול, למשל, 35. זה נכון במיוחד עבור חולדות מזנים מסוימים, ראה8 לסקירה. לפיכך, חוקרים לא צריכים להיבהל אם לאוכלוסייה קטנה של בעלי חיים בניסוי נתון יש צריכת אתנול נמוכה או ללא צריכת אתנול. כמו כן, חלק מבעלי החיים נוטים לשחק עם הלגימה/בקבוק בדרכים שעלולות לקדם שפיכה. למרות שהם נדירים, מקרים חוזרים ונשנים של שינויים גבוהים במשקל הבקבוק שאינם קשורים לצריכה עשויים לדרוש הוצאת בעל חיים מסוים מהניסוי.

הפרוטוקול המפורט שלנו שלב אחר שלב מדגים את קלות היישום והשימוש במערכת LIQ HDR לחולדות. חוקרים ללא ידע או כישורים קודמים באלקטרוניקה ותכנות של מיקרו-בקרים יכולים להתאים בקלות את המערכת הזו לצרכי הניסוי שלהם עם שינוי מועט או ללא שינוי. הנתונים המייצגים שלנו מדגימים עוד יותר את היישום המוצלח שלו למחקרי שתייה בכלוב ביתי של חולדות ואת יכולתו העוצמתית ללכוד מדדי מיקרו-מבנה שתייה רבים ברזולוציה זמנית גבוהה. LIQ HDR כולל מספר שינויי עיצוב ביחס לקודמו בעכבר30. זה נעשה לא רק כהכרח להתאמה מוצלחת לשימוש בחולדות אלא גם כדי לשפר את הפונקציונליות ואת חווית המשתמש. רכיבים בתוך הכלוב, כולל מחזיק הבקבוקים המודפסים בתלת מימד, חוסם הלגימה והרכיבים האלקטרוניים, מועברים לחלק העליון של הכלוב כדי להגן מפני לעיסה, מה שעלול לגרום לאובדן נתונים תכוף ומשמעותי ותחלופת חומרה. התוספת של פאנל אקרילי בחיתוך לייזר מסייעת עוד יותר במניעת הרס של רכיבים פגיעים אלה. מלבד הפאנל האקרילי, שהוא אותו חומר כמו כלוב חולדות רגיל, כל שאר רכיבי LIQ HDR אינם נגישים לבעל החיים מתוך הכלוב או נגישים רק לרגע קצר במהלך החלפת הבקבוק. תכנון זה מגביל את הפוטנציאל להרס רכיבי המכשיר ואת הסיכון לבעל החיים באמצעות בליעת פריטים שאינם מזון. בניגוד לבקבוקים עתירי העבודה יחסית בהתאמה אישית המשמשים בעיצוב LIQ HD, מחזיק הבקבוקים המודפס בתלת מימד של LIQ HDR נועד להיות תואם לבקבוקי שתייה מסחריים של מכרסמים מהמדף. בקבוקים מותקנים על החלק העליון של הכלוב ונגישים לחולדות באותו אופן שבו בקבוקי שתייה מיושמים במהלך טיפול וגידול סטנדרטיים. התוספת של חוסמי לגימה היא פתרון פשוט אך יעיל המשפר את אמינות המערכת ומונע אובדן נתונים יקרי ערך שבהיעדר החוסם יכול לנבוע משתייה המתרחשת לפני התחלת לכידת נתונים בממשק Arduino או אמצעי ליקוק שגויים המתרחשים כאשר חולדות מקיימות אינטראקציה עם הלוגמים במהלך הכיול היומי. בעוד שכלובי החולדות הגדולים בהרבה מחייבים הגדלת תכן החומרה המקורי בגודל, השימוש בכבלים ארוכים משמעותית יכול להשפיע לרעה על הרגישות והדיוק של חישה קיבולית עקב הפרעות, כמו גם על תקינות תקשורת I2C בין לוחות החיישנים המשורשרים וממשק Arduino. אנו עוקפים בעיה זו עם אימוץ מערכת התקשורת הדיפרנציאלית I2C כדי להשיג שידור אותות לטווח ארוך במיוחד וכמעט ללא הפסדים דרך כבלי Ethernet. החומרים המשמשים לרכיבי הכלוב מאפשרים ניקוי וחיטוי קלים בין השימושים. ניתן לעקר ולנגב את הליקומטר עם תמיסת EtOH של 70%, תוך הקפדה על כך שהרכיבים החשמליים, כגון סרט הנחושת המוליך, יישארו שלמים. ניתן לשטוף היטב ציוד שאינו חשמלי הנמצא במגע ישיר עם החיה, כגון חוסם הלגימה ולוח אקרילי, במי סבון חמים.

האמינות והיעילות של כל מערכת זיהוי ליקוק דורשות בנייה והתקנה נאותות, כמו גם בדיקות נרחבות, ניטור שגיאות קפדני ופתרון בעיות יעיל. יש לייצר ולהרכיב את כל רכיבי ה-DIY במיומנות ובזהירות. זה חשוב במיוחד לשלבים הכוללים הלחמה, שעשויים לדרוש תרגול למתחילים. בלי קשר, נדרשת בדיקה מקיפה של כל הליקומטרים לפני השימוש בניסויים בפועל. אם יש לשנות את המערכת על מנת להתאים את עצמה לצרכי הניסוי האישיים, ייתכן שיהיה צורך לכוונן עוד יותר את הגדרות החיישן (למשל, סף מגע ושחרור) לזיהוי ליקוק מדויק. למשתמשים בפעם הראשונה, אנו מציעים לבדוק את המערכת במחקר פיילוט קצר במדגם קטן תוך שימוש בפתרון טעים ביותר שיגרום לרמות גבוהות של שתייה. ניתן לאמת את זיהוי הליקוק בזמן אמת על ידי בדיקה ויזואלית של לוח החיישן כאשר הנורית מהבהבת בכל פעם שנרשם ליקוק. יש להשתמש בקורלציות חזקות, משמעותיות ועקביות בין מספר הליקוק לשינוי במשקל הבקבוק כאמת מידה להתקנה נכונה של חומרה ותוכנה. גם לאחר סיום ההגדרה, אנו ממליצים להתחיל הקלטה לניסוי נתון ביום שבו חולדות מקבלות שני בקבוקים המכילים מים על מנת לפתור בעיות בציוד שעשויות להיות ניכרות בתחילת הניסוי. זה עשוי להיות יתרון גם לבדוק את תפקוד הליקומטר ביום המים הקשור להחלפת כלוב מכיוון שהדבר דורש לנתק את הליקומטרים ולחבר אותם מחדש לחיישן. כשל אקראי של ליקומטר או חיישן בודד, שיגרום לנתונים חריגים ברורים מאוד (למשל, לא זוהו ליקוקים או מעט ליקוקים למרות שינוי מהותי במשקל הבקבוק) באופן עקבי עבור אותו ליקומטר, מעיד על רכיבים פגומים. אנו ממליצים להכין מראש רכיבים נוספים לכל אלמנט במערכת הליקומטר כדי לאפשר החלפה קלה במידת הצורך. לבסוף, לא ניתן להדגיש יתר על המידה את החשיבות של לוודא שכבלי חיישן אינם חופפים או מתכופפים יתר על המידה. פעולה זו עלולה לגרום למקרים אקראיים של זיהוי ליקוק לקוי, המתבטא במספר ליקוק נמוך באופן בלתי סביר עבור שינוי נתון במשקל הבקבוק או משכי ליקוק גדולים במיוחד (קרוב ל-60,000 אלפיות השנייה לסל של דקה) המשתרעים על פני דקות או שעות. עם זאת, אובדן קטן של נתונים הוא בלתי נמנע במחקרים שאוספים נתונים במשך 24 שעות עבור בעלי חיים רבים לאורך ימים רבים באמצעות הגישה הסטנדרטית או המצוידת בליקומטר. חוקרים יכולים לשלול נתונים שגויים עבור מפגשי השתייה הנדירים כאשר משקל הבקבוק ו/או הליקוקים אינם משקפים בבירור את הצריכה (למשל, סתימת לגימה, שגיאת כיול וכו'). במקרים כאלה, הערך הממוצע עבור מדד נתון (למשל, צריכה (גרם/ק"ג), ליקוקים וכו') לאורך תקופת המחקר עבור אותו נושא מסוים יכול להיות מוחלף בערך החסר במהלך ניתוח הנתונים. ANOVA עם אפקטים מעורבים יכול לשמש גם כחלופה להתאמה לנקודות נתונים חסרות.

אחד היתרונות של פרדיגמת השתייה של שני בקבוקים הוא ההיבט הוולונטרי של צריכת אתנול. זה מעניק תוקף פנים מצוין, במיוחד לאור הממצאים המראים כי אלכוהול הניתן על ידי נסיינים יכול לייצר השפעות שונות באופן משמעותי על תפקוד המוח והתנהגותו בהשוואה לאלכוהול הניתן בעצמומרצון. יתר על כן, האופי הוולונטרי של הפרדיגמה מאפשר לחוקרים ללכוד הבדלים אינדיבידואליים בצריכה בדומה לשונות בהעדפת האלכוהול ובדפוסי השתייה שנצפו בבני אדם. הבדלים אינדיבידואליים אלה יכולים לספק הזדמנות רבת עוצמה לחוקרים לתאם את הצריכה (צריכה ו/או דפוסים) עם גודל ההשפעות הפתולוגיות שנצפו.

עם זאת, יש לקחת בחשבון כמה מגבלות של פרדיגמת השתייה בכלוב ביתי עם שני בקבוקים. לדוגמה, למרות ששונות אינדיבידואלית בצריכת אתנול יכולה להיות יתרון עבור ניסויים מסוימים, היא עשויה להיות חיסרון בניסויים אחרים שבהם רמה עקבית של שיכרון או חשיפה לאתנול עשויה להיות רצויה. זה נכון במיוחד עבור ניסויים הבוחנים את ההשלכות של תלות וגמילה מחשיפה כרונית לאתנול. חשוב לציין, שתייה בשני בקבוקים אינה מאופיינת כמודל של תלות - אפילו בחולדות עם גישה לאתנול לפרקי זמן ממושכים. לפיכך, בהיעדר תסמינים נלווים של גמילה, על החוקרים לנקוט משנה זהירות בפירוש ההשלכות של צריכת אתנול ממושכת כהשפעות של תלות ו/או גמילה. אכן, ייתכן, אם לא מתקבל על הדעת, שחולדות ששותות כמויות גדולות יחסית של אתנול במהלך הליך בחירת שני בקבוקים מציגות תסמיני גמילה, אך חולדות ששותות כמויות נמוכות יותר בפרק זמן נתון של 24 שעות אינן מראות סימני תלות דומים. דפוסי שתייה יכולים גם הם לשחק תפקיד חשוב בשיקול זה, שכן שני בעלי חיים ששותים את אותה כמות במשך תקופה של 24 שעות יכולים לחוות רמות שונות מאוד של שיכרון (כלומר, BEC) בהתאם לדפוסצריכת האתנול שלהם. זה מדגיש את התועלת של LIQ HDR בהליך בחירת שני בקבוקים מכיוון שהוא יכול לזהות בקלות חולדות שצורכות מנה נתונה של אתנול בקצב מהיר (כלומר, לבלוע) לעומת אלה שצורכות את אותו מינון בקצב איטי בהרבה (כלומר, לגימה). למרות שפוטנציאל לא רצוי למחקרים החוקרים את ההשפעות של מינון מבוקר של אתנול, לזיהוי שינויים בדפוסי השתייה (למשל, הפחתת אירועי בולמוס) לאחר התערבות ניסיונית מסוימת יש ערך תרגומי משמעותי בהתחשב בגישת הפחתת הנזק הננקטת יותר ויותר במרפאה. לבסוף, אין צורך במאמץ על מנת שבעלי חיים יקבלו גישה לאתנול בפרדיגמות שתייה בכלובים ביתיים, כולל זו המתוארת כאן. לכן, התועלת של פרדיגמה זו מוגבלת לניתוח של שתייה בלבד, בעוד ששיטות אופרנטיות מועדפות במקרים שבהם חוקרים מעוניינים לבחון חיפוש אלכוהול - מאפיין חשוב של AUD.

לסיכום, הפרוטוקול המתואר כאן מספק לחוקרים את כל המידע והמשאבים הדרושים למדידת צריכת אתנול בחולדות בכלוב הביתי. אנו מציגים אפשרויות לגישות ברזולוציה נמוכה וגבוהה יחסית המספקות לחוקרים את הגמישות לבחור את השיטה המתאימה ביותר לצרכי המחקר שלהם.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לג'וזף פיטוק ולקייטי פז'יביש, דוקטורט על הסיוע הטכני במהלך פיתוח LIQ HDR. אנו מודים גם לניקולס פיטרסן ולדוקטורט מארי דויל על שיחות מועילות רבות במהלך הפיתוח של LIQ HDR. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי להתמכרות לאלכוהול ואלכוהוליזם במכונים הלאומיים לבריאות (P50 AA022538 ו-R01 AA029130 ל-EJG).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>רכיבים זמינים מסחרית<חזק>כמות
12 מקשים פריצת חיישן מגע קיבולי (MPR121)Adafruit19823
זוג כבלים תואם 2 פינים (JST XH 2.5 מ"מ)Adafruit487218
מגשר לוח אב-טיפוס 4 פינים (Qwiic)SparkFunPRT-179121
כבל 4 פינים (100 מ"מ Qwiic)SparkFunPRT-172591
כבל 4 פינים (50 מ"מ Qwiic)SparkFunPRT-172603
פריצת מעביר מפלס 5V ל-3VAdafruit56371
מגן מגע קיבולי (2.8 אינץ')Adafruit19471
סרט מוליך נחושת (1/4 אינץ')DigiKey4393-CFT-1/4-ND1
נתונים מגן עציםAdafruit11411
ערכת פריצת תקשורת I2C דיפרנציאלית (QwiicBus)SparkFunKIT-17250
1 סרט חשמליDigiKey3M156004-ND1
צינורות כיווץ חום (3/16 אינץ' צבעים שונים)אזיקוני כבלים ועודHS357-S106
ערכת צינורות לכווץ חום (4 אינץ' שחור)Jameco20959631
סוללת מטבע ליתיום (3V 12.5 מ"מ)DigiKey1908-CR1220JAUCHSB-ND1
M5 מכונת כביסה שטוחהGrainger54FN661
M5 אגוז משושהGrainger6CA721
M5 בורג מכונה (12 מ"מ)Grainger6GU881
M5 בורג מכונה (25 מ"מ)Grainger  6GU912
חוט מגשר זכר/זכרAdafruit19571
לוח מיקרו-בקר (Arduino Mega 2560 Rev3)DigiKey1050-1018-ND1
נימה PETG (כסף 2.85 מ"מ)MatterHackersM-DDH-UZR22
נימה PLA (2.85 מ"מ שחור)MatterHackersM-SEW-RUAW2
נימה PLA (2.85 מ"מ כסף)MatterHackersM-66P-6CLE1
ספק כוח (DC 9V 1A)Newegg9SIBPPKJYR59911
כרטיס זיכרון SD/microSD (8GB)Adafruit12941
כותרות ערימה ShieldAdafruit851
חוט ליבה מוצקה (22AWG אדום)Adafruit2881
חוט ליבה תקועה (22AWG שחור)Adafruit29761
חוט ליבה תקוע (אדום 22AWG)Adafruit30681
צינור לגימת כובע טוויסט עם כדורעיצוב אלטרנטיביTCCN8.5-ST2.5SB38
בקבוק מים (8oz)עיצוב חלופיWB8FS38
<חזק>רכיבים מודפסים בתלת מימד מותאמים אישית<חזק>כמות
>תחתית מארז Arduino מודפס בתלת מימדN/AARDUINO_Bottom.stl1
מארז Arduino מודפס בתלת מימד למעלהN/AARDUINO_Top.stl1
קליפ כבלים מודפס בתלת מימד LN/ACLIP_L.stl18
אגוז קליפ כבלים מודפס בתלת מימדN/ACLIP_Nut.stl18
קליפ כבלים מודפס בתלת מימד RN/ACLIP_R.stl18
מחזיק בקבוק ליקומטר מודפס בתלת מימדN/ALICKOMETER_Bottle Holder.stl19
מגן כבל ליקומטר מודפס בתלת מימד LN/ALICKOMETER_Cable Protector_L.stl6
מגן כבל ליקומטר מודפס בתלת מימד RN/ALICKOMETER_Cable Protector_R.stl12
אותיות ליקומטר מודפסות בתלת מימדN/ALICKOMETER_Letters.stl19
בורג הרכבה מודפס בתלת מימדN/AMount Screw.stl4
מארז חיישן מודפס בתלת מימד תחתוןN / ASENSOR_A_Bottom.stl1
מארז חיישן מודפס בתלת מימד A עליוןN / ASENSOR_A_Top.stl1
מארז חיישן מודפס בתלת מימד B תחתוןN / ASENSOR_B_Bottom.stl1
מארז חיישן מודפס בתלת מימד B עליוןN / ASENSOR_B_Top.stl1
מארז חיישן מודפס בתלת מימד C תחתוןN / ASENSOR_C_Bottom.stl1
מארז חיישן מודפס בתלת מימד C למעלהN / ASENSOR_B_Top.stl1
אותיות מארז חיישן מודפס בתלת מימדN/ASENSOR_Letters.stl1
חוסם sipper מודפס בתלת מימדN/ASIPPER_Blocker.stl36
בסיס חוסם sipper מודפס בתלת מימדN/ASIPPER_Base.stl18
ציוד חוסם sipper מודפס בתלת מימדN/ASIPPER_Gear.stl18
אגוז חוסם סיפר מודפס בתלת מימדN/ASIPPER_Nut.stl18
תולעת חוסם סיפר מודפסת בתלת מימדN/ASIPPER_Worm.stl18
לוח אקרילי ליקומטר חתוך בלייזרN/ALICKOMETER_Acrylic Panel_Sketch.dxf19

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. GBD 2016 Alcohol Collaborators. Alcohol use and burden for 195 countries and territories, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 392 (10152), 1015-1035 (2018).
  2. Fillmore, K. M., Stockwell, T., Chikritzhs, T., Bostrom, A., Kerr, W. Moderate alcohol use and reduced mortality risk: systematic error in prospective studies and new hypotheses. Annals Epidemiol. 17 (5 Suppl), S16-S23 (2007).
  3. GBD 2020 Alcohol Collaborators. Population-level risks of alcohol consumption by amount, geography, age, sex, and year: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2020. Lancet. 400 (10347), 185-235 (2020).
  4. Esser, M. B., Sherk, A., Liu, Y., Naimi, T. S. Deaths from excessive alcohol use - United States, 2016-2021. Morbidity Mortality Weekly Rep. 73, 154-161 (2024).
  5. Melendez, R. I. Intermittent (every-other-day) drinking induces rapid escalation of ethanol intake and preference in adolescent and adult C57BL/6J mice. Alcohol Clin Exp Res. 35 (4), 652-658 (2011).
  6. Wise, R. A. Voluntary ethanol intake in rats following exposure to ethanol on various schedules. Psychopharmacologia. 29 (3), 203-210 (1973).
  7. Simms, J. A., et al. Intermittent access to 20% ethanol induces high ethanol consumption in Long-Evans and Wistar rats. Alcohol Clin Exp Res. 32 (10), 1816-1823 (2008).
  8. Carnicella, S., Ron, D., Barak, S. Intermittent ethanol access schedule in rats as a preclinical model of alcohol abuse. Alcohol. 48 (3), 243-252 (2014).
  9. Loi, B., et al. Increase in alcohol intake, reduced flexibility of alcohol drinking, and evidence of signs of alcohol intoxication in Sardinian alcohol-preferring rats exposed to intermittent access to 20% alcohol. Alcohol Clin Exp Res. 34 (12), 2147-2154 (2010).
  10. Rhodes, J. S., Best, K., Belknap, J. K., Finn, D. A., Crabbe, J. C. Evaluation of a simple model of ethanol drinking to intoxication in C57BL/6J mice. Physiol Behavior. 84 (1), 53-63 (2005).
  11. Thiele, T. E., Navarro, M. "Drinking in the dark" (DID) procedures: a model of binge-like ethanol drinking in non-dependent mice. Alcohol. 48 (3), 235-241 (2014).
  12. Rimondini, R., Sommer, W., Heilig, M. A temporal threshold for induction of persistent alcohol preference: behavioral evidence in a rat model of intermittent intoxication. J Studies Alcohol. 64 (4), 445-449 (2003).
  13. Sommer, W. H., et al. Upregulation of voluntary alcohol intake, behavioral sensitivity to stress, and amygdala crhr1 expression following a history of dependence. Biol Psychiatry. 63 (2), 139-145 (2008).
  14. Nentwig, T. B., et al. The lateral habenula is not required for ethanol dependence-induced escalation of drinking. Neuropsychopharmacol. 47 (12), 2123-2131 (2022).
  15. Becker, H. C., Lopez, M. F. Increased ethanol drinking after repeated chronic ethanol exposure and withdrawal experience in C57BL/6 mice. Alcohol Clin Exp Res. 28 (12), 1829-1838 (2004).
  16. Lopez, M. F., Becker, H. C. Effect of pattern and number of chronic ethanol exposures on subsequent voluntary ethanol intake in C57BL/6J mice. Psychopharmacology. 181 (4), 688-696 (2005).
  17. Griffin, W. C., Lopez, M. F., Becker, H. C. Intensity and duration of chronic ethanol exposure is critical for subsequent escalation of voluntary ethanol drinking in mice. Alcohol Clin Exp Res. 33 (11), 1893-1900 (2009).
  18. Hwa, L. S., et al. Persistent escalation of alcohol drinking in C57BL/6J mice with intermittent access to 20% ethanol. Alcohol Clin Exp Res. 35 (11), 1938-1947 (2011).
  19. Vierkant, V., Xie, X., Wang, X., Wang, J. Experimental models of alcohol use disorder and their application for pathophysiological investigations. Curr Prot. 3 (6), e831(2023).
  20. Greenfield, T. K., et al. Risks of alcohol use disorders related to drinking patterns in the U.S. general population. J Studies Alcohol Drugs. 75 (2), 319-327 (2014).
  21. Rehm, J., Greenfield, T. K., Rogers, J. D. Average volume of alcohol consumption, patterns of drinking, and all-cause mortality: results from the US National Alcohol Survey. Am J Epidemiol. 153 (1), 64-71 (2001).
  22. Grant, K. A., et al. Drinking typography established by scheduled induction predicts chronic heavy drinking in a monkey model of ethanol self-administration. Alcohol Clin Exp Res. 32 (10), 1824-1838 (2008).
  23. Nathan, P. E., O'Brien, J. S. An experimental analysis of the behavior of alcoholics and nonalcoholics during prolonged experimental drinking: A necessary precursor of behavior therapy. Behav Ther. 2 (4), 455-476 (1971).
  24. Godynyuk, E., Bluitt, M. N., Tooley, J. R., Kravitz, A. V., Creed, M. C. An open-source, automated home-cage sipper device for monitoring liquid ingestive behavior in rodents. eNeuro. 6 (5), (2019).
  25. Frie, J. A., Khokhar, J. Y. An open source automated two-bottle choice test apparatus for rats. HardwareX. 5, e00061(2019).
  26. Melo, M. C., Alves, P. E., Cecyn, M. N., Eduardo, P. M. C., Abrahao, K. P. Development of eight wireless automated cages system with two lick-o-meters each for rodents. eNeuro. 9 (4), (2022).
  27. Wong, K., et al. Socially integrated polysubstance (SIP) system: An open-source solution for continuous monitoring of polysubstance fluid intake in group housed mice. Addiction Neurosci. , (2023).
  28. Frie, J. A., Khokhar, J. Y. FARESHARE: An open-source apparatus for assessing drinking microstructure in socially housed rats. NPP-Digit Psychiatry Neurosci. 2 (1), 1-7 (2024).
  29. Zhao, Z., et al. INGEsT: An open-source behavioral setup for studying self-motivated ingestive behavior and learned operant behavior. bioRxiv. , (2024).
  30. Petersen, N., Adank, D. N., Raghavan, R., Winder, D. G., Doyle, M. A. LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home Cage Device): An open-source tool for recording undisturbed two-bottle drinking behavior in a home cage environment. eNeuro. 10 (4), (2023).
  31. Trujillo, J. L., Roberts, A. J., Gorman, M. R. Circadian timing of ethanol exposure exerts enduring effects on subsequent ad libitum consumption in C57 mice. Alcohol Clin Exp Res. 33 (7), 1286-1293 (2009).
  32. Nentwig, T. B., Margaret Starr, E., Judson Chandler, L., Glover, E. J. Absence of compulsive drinking phenotype in adult male rats exposed to ethanol in a binge-like pattern during adolescence. Alcohol. 79, 93-103 (2019).
  33. Patwell, R., Yang, H., Pandey, S. C., Glover, E. J. An operant ethanol self-administration paradigm that discriminates between appetitive and consummatory behaviors reveals distinct behavioral phenotypes in commonly used rat strains. Neuropharmacology. 201, 108836(2021).
  34. Bito-Onon, J. J., Simms, J. A., Chatterjee, S., Holgate, J., Bartlett, S. E. Varenicline, a partial agonist at neuronal nicotinic acetylcholine receptors, reduces nicotine-induced increases in 20% ethanol operant self-administration in Sprague-Dawley rats. Addict Biol. 16 (3), 440-449 (2011).
  35. Mill, D. J., Bito-Onon, J. J., Simms, J. A., Li, R., Bartlett, S. E. Fischer rats consume 20% ethanol in a long-term intermittent-access two-bottle-choice paradigm. PloS One. 8 (11), e79824(2013).
  36. Carnicella, S., Amamoto, R., Ron, D. Excessive alcohol consumption is blocked by glial cell line-derived neurotrophic factor. Alcohol. 43 (1), 35-43 (2009).
  37. Moore, C. F., Lynch, W. J. Alcohol preferring (P) rats as a model for examining sex differences in alcohol use disorder and its treatment. Pharmacol Biochem Behav. 132, 1-9 (2015).
  38. Pitock, J. R., et al. Presence of distinct operant phenotypes and transient withdrawal-induced escalation of operant ethanol intake in female rats. bioRxiv. , (2024).
  39. Carnicella, S., Yowell, Q. V., Ron, D. Regulation of operant oral ethanol self-administration: a dose-response curve study in rats. Alcohol Clin Exp Res. 35 (1), 116-125 (2011).
  40. De Oliveira Sergio, T., et al. Sex- and estrous-related response patterns for alcohol depend critically on the level of compulsion-like challenge. Prog Neuro-Psychopharmacol Biol Psychiatry. 133, 111008(2024).
  41. Foo, J. C., Skorodumov, I., Spanagel, R., Meinhardt, M. W. Sex- and age-specific effects on the development of addiction and compulsive-like drinking in rats. Biol Sex Diff. 14 (1), 44(2023).
  42. Moolten, M., Kornetsky, C. Oral self-administration of ethanol and not experimenter-administered ethanol facilitates rewarding electrical brain stimulation. Alcohol. 7 (3), 221-225 (1990).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

LickometerBinge like drinking

מאמרים קשורים