הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מידול צריכת אלכוהול במכרסמים באמצעות שתיית כלוב ביתי לבחירה בשני בקבוקים וניתוח מיקרו-מבני

1.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67486

⸱

8 בנובמבר 2024

 ,  , 
1Center for Alcohol Research in Epigenetics, Department of Psychiatry, University of Illinois Chicago

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר פרדיגמת שתייה סטנדרטית של שני בקבוקים בכלוב ביתי לבחירה לסירוגין כדי להדגים צריכת אלכוהול בחולדות. בנוסף, הוא מספק הוראות שלב אחר שלב להגדלת הפרוטוקול הסטנדרטי עם מערכת זיהוי ליקוק עשה זאת בעצמך המאפשרת ניתוח מיקרו-מבני של התנהגות השתייה.

תקציר

שתיית כלוב ביתי לבחירה בשני בקבוקים היא אחת הפרדיגמות הנפוצות ביותר לחקר צריכת אתנול במכרסמים. בצורתו הפשוטה ביותר, לבעלי חיים ניתנת גישה לשני בקבוקי שתייה, אחד מהם מכיל מי ברז רגילים והשני אתנול, כאשר הצריכה היומית נמדדת על ידי שינוי במשקל הבקבוק במהלך תקופה של 24 שעות. כתוצאה מכך, גישה זו אינה דורשת ציוד מעבדה מיוחד. בעוד שקלות יישום כזו היא ככל הנראה התורמת הגדולה ביותר לאימוץ הנרחב שלה על ידי חוקרי אלכוהול פרה-קליניים, הרזולוציה של נתוני השתייה שנרכשו בגישה זו מוגבלת על ידי מספר הפעמים שהחוקר מודד את משקל הבקבוק (למשל, פעם ביום). עם זאת, הרצון לבחון דפוסי שתייה בהקשר של צריכה כוללת, התערבויות פרמקולוגיות ומניפולציות עצביות הוביל לפיתוח מערכות זיהוי ליקוק כלובים ביתיות שיכולות לרכוש נתונים ברמת הליקוקים הבודדים. למרות שמספר מערכות אלו פותחו לאחרונה, מערכת הקוד הפתוח, LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home cage Device), זכתה לתשומת לב משמעותית בתחום בשל המחיר הסביר והידידותיות למשתמש. למרות שהיא מרגשת, המערכת הזו תוכננה לשימוש בעכברים. כאן, אנו סוקרים נהלים מתאימים לשתייה סטנדרטית ומצוידת בשני בקבוקים בכלוב ביתי. אנו מציגים גם שיטות להתאמת מערכת LIQ HD לחולדות, כולל שינויי חומרה כדי להתאים לגודל כלוב גדול יותר ומחזיק בקבוקים מודפס בתלת מימד שעוצב מחדש התואם לבקבוקי שתייה סטנדרטיים מהמדף. באמצעות גישה זו, החוקרים יכולים לבחון דפוסי שתייה יומיים בנוסף לרמות הצריכה בחולדות רבות במקביל ובכך להגדיל את הרזולוציה של הנתונים הנרכשים בהשקעה מינימלית במשאבים נוספים. שיטות אלה מספקות לחוקרים את הגמישות להשתמש בבקבוקים סטנדרטיים או במכשיר המצויד בליקומטר כדי לחקור את המנגנונים הנוירוביולוגיים העומדים בבסיס שתיית אלכוהול בהתאם לצרכי הניסוי המדויקים שלהם.

מבוא

למרות ששימוש מתון באלכוהול נקשר היסטורית ליתרונות בריאותיים מתונים, מחקרים מקיפים בקנה מידה גדול שנערכו לאחרונה גילו שאף כמות של צריכת אלכוהול אינה בטוחה1,2. למעשה, שימוש באלכוהול הוא גורם הסיכון השביעי המוביל למוות ונכות בעולם1, כאשר אנשים ששותים אפילו כמויות קטנות של אלכוהול נמצאים בסיכון מוגבר לסרטן, מחלות זיהומיות ופציעה1,3. בארצות הברית, מקרי המוות משימוש באלכוהול עלו בכמעט 30% בין 2016 ל-20214. חשוב לציין, הסיכון למוות ונכות עולה באופן מונוטוני עם עלייה בצריכה1.

למרות שמחקרים בבני אדם סיפקו תובנות חשובות לגבי הנוירוביולוגיה של שימוש באלכוהול ושימוש לרעה, הבקרה הניסויית הניתנת על ידי מודלים של בעלי חיים חיונית להבנה מעמיקה של המנגנונים העומדים בבסיס התנהגות השתייה והסיכון לשתייה מרובה. מודלים אלה הם גם כלים חשובים לפיתוח טיפולים שמטרתם להפחית צריכה בלתי מבוקרת. שתיית כלוב ביתי עם שני בקבוקים היא אחת הפרדיגמות הפרה-קליניות הנפוצות ביותר לחקר צריכת אלכוהול במכרסמים. זה נובע במידה רבה מקלות היישום שלו מכיוון שהוא מאפשר מדידה של שתיית אלכוהול מרצון והעדפה ללא צורך בציוד מחקר מיוחד או ניתוחים מורכבים. באמצעות גישה זו, חוקרים יכולים לאסוף מדידות במרווחי הזמן הרצויים להם (למשל, שעות, ימים, שבועות) על ידי חישוב השינוי במשקל הבקבוק מתחילת סשן השתייה ועד סופו. וריאציות על שיטה בסיסית זו שימשו רבים בתחום כדי להקל על רמות נמוכות עד בינוניות עד בולמוסיות של צריכת אלכוהול לפרקי זמן קצרים וארוכים כאחד. לדוגמה, נעשה שימוש בהליכי בחירה רציפים ולסירוגין של שני בקבוקים כדי להקל על רמות נמוכות ומתונות של צריכת אלכוהול, בהתאמה, הן ב5 והן ב-rats6,7,8. אותן פרדיגמות יכולות לקדם רמות גבוהות של צריכה בזנים המעדיפים אלכוהול7,9. לחלופין, התאמה של שיטה זו המגבילה את הגישה לאלכוהול ל-2-4 שעות ביום החל מ-3 שעות לאחר תחילת מחזור החושך הוכחה כמולידה שתייה מופרזת בעכברים (כלומר, שתייה בחושך)10,11. וריאציות נוספות על שיטות אלה שימשו בשילוב עם שיטות המאפשרות תלות באלכוהול (כלומר, חשיפה כרונית לאדי אתנול לסירוגין) כדי לבחון את ההסלמה של שתיית אלכוהול מרצון במהלך גמילה12,13,14,15,16,17,18,19.

למרות שאומצה באופן נרחב על ידי התחום, הגישה הסטנדרטית של מדידת צריכת אלכוהול על ידי שינוי במשקל הבקבוק מוגבלת ברזולוציה לצריכה הכוללת לכל מפגש שתייה. כתוצאה מכך, גישה זו אינה מסוגלת ללכוד דפוסי שתייה, הידועים היטב כמשפיעים הן על הסיכון והן על החומרה של הפרעת שימוש באלכוהול (AUD)20,21,22. ואכן, הצריכה הממוצעת של אדם לאורך זמן יכולה להיות תוצאה של מספר אפיזודות שתייה כבדות או אפיזודות שתייה רבות שכל אחת מהן קשורה לצריכה נמוכה יחסית, והניואנסים הללו אינם מתגלים כאשר הצריכה נמדדת כצריכה הכוללת לכל מפגש שתייה. חשוב לציין, באופן משמעותי יותר אפיזודות שתייה הקשורות להתקפי שתייה גדולים (כלומר, בליעה) נצפות אצל אנשים עם AUD בהשוואה לקבוצת ביקורת בריאה23 ונתונים בפרימטים לא אנושיים מצביעים על כך שאנשים שקובעים דפוס צריכת אלכוהול הכולל התקפי שתייה גדולים בשלב מוקדם בהיסטוריית השתייה שלהם נמצאים בסיכון משמעותי ל-AUD22. יתר על כן, אפיזודות שתייה הכוללות התקפי צריכה גדולים מגבירות משמעותית את הסיכון לתחלואה ותמותה ללא תלות באבחון21. בסך הכל, נתונים אלה הובילו לעניין מוגבר בבחינת דפוסי שתייה בנוסף לרמות הצריכה הכוללת במודלים פרה-קליניים והניעו את הפיתוח של מספר מערכות במורכבות משתנה המסוגלות ללכוד נתוני שתייה ברמת הליקוקים הבודדים.

בין הראשונים היה פיתוח מערכת של שני בקבוקים המצוידת בזיהוי ליקוק פוטו-beam המיועדת לשימוש ב-mice24. מערכת זו הותאמה לאחר מכן על ידי קבוצה נפרדת לשימוש ב-rats25. בשנים שחלפו מאז, וריאציות על נושא זה שימשו לפיתוח מערכות דומות הכלולות בדיור מכרסמים מותאם אישית26, המאפשרות זיהוי ליקוק של בעלי חיים בודדים השוהים חברתית27,28, ואשר לוכדות הן התנהגות האכלה והן שתייה29. בין אלה, LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home cage Device)30 זכה לתשומת לב משמעותית על הצעת מערכת לשימוש בעכברים המקבילה לקלות היישום ובמחיר סביר של המערכת שפותחה על ידי Godnyuck et al.24. מערכת זו משתמשת בחישה קיבולית כדי לזהות ישירות מגע בין הלשון לצינור המתכת המוליך, בניגוד לאמצעים עקיפים כגון גישת לגימה או אינטראקציה הניתנים באמצעות מערכת זיהוי הפוטו-קרן. המחברים מספקים נתונים המדגימים כי מערכת החישה הקיבולית שלהם מעניקה דיוק ורגישות גדולים יותר באופן משמעותי בזיהוי ליקוק, ומייצרת מתאמים חזקים יותר בין מספר הליקוק לשינוי במשקל הבקבוק מאשר זיהוי קרן פוטו. המחברים מדגימים עוד את היכולת להשתמש במערכת זו בשילוב עם פרדיגמת שתייה בכלוב ביתי לבחירה רציפה של שני בקבוקים כדי ללכוד מדדים של מיקרו-מבנה שתיית אלכוהול בנוסף למדדים של צריכת צריכה יומית כוללת30.

כאן, אנו מתארים נהלים לשתיית אלכוהול בכלוב ביתי לבחירה של שני בקבוקים באמצעות גישה סטנדרטית, כמו גם שיטות המאפשרות זיהוי ליקוק (איור 1). אנו מציגים גם שיטות לבנייה והטמעה של LIQ HDR - התאמה של LIQ HD30 לשימוש בחולדות הכוללת שינויי חומרה כדי להתאים לגדלי כלוב גדולים יותר ומחזיק בקבוקים מודפס בתלת מימד שעוצב מחדש התואם לבקבוקי מדף סטנדרטיים. שיטות אלו מספקות לחוקרים את הגמישות להשתמש בגישה סטנדרטית או מצוידת בליקומטר בהתאם למשאבי הניסוי ולצורכי איסוף הנתונים שלהם.

להלן תיאור של החומרים הדרושים והוראות שלב אחר שלב ללכידת שתייה בכלוב ביתי באמצעות נוהל שתייה לבחירת שני בקבוקים בגישה לסירוגין המותאם מ-Simms et al.7. בהליך זה, לחולדות ניתנת גישה 24 שעות ביממה לשני בקבוקי שתייה 7 ימים בשבוע. בימי שני, רביעי ושישי (MWF), חולדות מקבלות בקבוק אחד שמכיל מים (H2O) ובקבוק אחר שמכיל אתנול (EtOH). בקבוקים אלה מוסרים בימי שלישי, חמישי ושבת (TRS) ומוחלפים בשני בקבוקי מים. חולדות שותות מאותם שני בקבוקי מים בימי שבת וראשון. שים לב שניתן להתאים את השיטות הללו בקלות ללוחות זמנים חלופיים של גישה לאתנול (למשל, רציף, בולמוס וכו') אם תרצה. הוראות נפרדות ניתנות לגישות סטנדרטיות ומצוידות בליקומטר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הנתונים המייצגים נאספו מחולדות Long-Evans בוגרות ששוכןו בנפרד, באישור של ועדת הרعاية והשימוש בבעלי חיים המוסדית של אוניברסיטת אילינוי שיקגו ובהתאם להנחיות ה-NIH לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה. שיכון בנפרד נדרש על מנת לנטר במדויק את צריכת הנוזלים של כל נבדק. חולדות Long-Evans זכרים בוגרים (n = 38) ונקבות בוגרות (n = 22) היו בגיל P50-80 עם הגעתן והותרו להסתגל לוויבאריום במשך שבוע לפני תחילת הניסוי. לחולדות הייתה גישה ad libitum למזון סטנדרטי (Teklad 7912, Envigo) ולמים, אלא אם צוין אחרת.

1. הכנות לפני הניסוי

  1. סמנו את בקבוקי השתייה כ-H2O או EtOH. לאחר מכן, סמנו מזהה ייחודי עבור כל חולדה על בקבוק H2O אחד ובקבוק EtOH אחד עבור MWF, ושני בקבוקי H2O עבור TRS.
    הערה: באופן רבמי, השתמשו בסרט צבעוני שונה כדי לזהות את בקבוקי ה-H2O וה-EtOH כדי לסייע במניעת טעויות פוטנציאליות במהלך החלפת הבקבוקים.
  2. מלאו את בקבוקי ה-H2O במי שתייה יום אחד לפני תאריך תחילת הניסוי. הכינו תמיסת EtOH על ידי ערבוב של EtOH בריכוז 190 proof עם מי שתייה (20% v/v) יום אחד לפני תאריך תחילת הניסוי.
    זהירות: קריטי להשתמש ב-EtOH שאינו דנטורה (non-denatured), מכיוון ש-EtOH דנטורה הוא רעיל.
  3. הכינו כלוב ריק על אותו מדף שבו נמצאים החולדות המשתתפות בניסוי. כלוב זה ישמש לחישוב השפיכה.
  4. ציידו את הכלובים במערכת LIQ HDR במידה ואתם משתמשים בה (ראו שלב 3, איור 2, איור 3, איור 4, איור 5, איור 6, ו-איור משלים 1).
  5. קבעו את השעה המדויקת ביום להחלפת הבקבוקים לפני תחילת המחקר. יש להחליף את הבקבוקים באותה השעה מדי יום על מנת לקבל מדידה מדויקת של צריכה ל-24 h.
    הערה: מחקרים קודמים הראו כי מכרסמים מראים את דרגת הצריכה הגבוהה ביותר זמן קצר לאחר תחילת מחזור החשיכה10,31. לכן, על מנת לתפוס את הצריכה במהלך תקופה פעילה זו (ראו שלב 2.3.1 לצורך תפיסת שתייה דמוית בינג), מומלץ לבצע את החלפת הבקבוקים 30-60 min לאחר כיבוי האורות. השתמשו במנורות אדומות במהלך החלפת הבקבוקים כדי לאפשר ראייה ללא הפרעה של מחזור האור-חושך.

2. נהלים יומיים ותחזוקה

  1. ביום הראשון של הניסוי, בצעו את הפעולות הבאות:
    1. הסירו את בקבוקי המים הסטנדרטיים מהכלובים.
    2. אופציונלי: חולדות נוטות לעיתים להניע את חלקו העליון של הכלוב בעת חיפוש מזון, דבר שעלול לגרום לשפיכה שלא ניתן לתקן באמצעות כלוב השפיכה הריק. שימוש בכוסות מזון בתוך הכלוב יכול להקל על בעיה זו. במקרה של שימוש בכוסות, הסירו כעת את המזון מחלקו העליון של הכלוב, הוסיפו כוס מזון בתוך הכלוב ומלאו אותה במזון. ודאו ששטח הרצפה המוקצב לחולדה עדיין עומד בהנחיות המוסדיות בהתבסס על גודל כלוב החולדה וגודל כוס המזון.
    3. הודיעו לצוות הטיפול והתחזוקה, במידת הצורך, שצוות המחקר יספק מזון ומים למשך תקופת הניסוי.
    4. החלפת כלובים עלולה להפריע לאיסוף הנתונים. בצעו החלפות כלובים במקביל למדידות משקל הגוף. חוקרים שיבחרו לעשות זאת צריכים להודיע לצוות הטיפול והתחזוקה בהתאם.
  2. בימים הבאים, פעלו לפי הפרוטוקולים המפורטים להלן.
    הערה: זכרו שכל תנועה של כלובים ובקבוקים עלולה לגרום לשפיכה. לכן, חשוב להניע אותם בעדינות ולהשתמש בשיטות אותן משתמשים בכלובים של החולדות לצורך הצמדה והסרה של הבקבוקים מכלוב השפיכה.
    1. היכנסו לחדר לפני מועד החלפת הבקבוקים, תוך הבטחה שיש מספיק זמן לביצוע השלבים הבאים, והניחו בקבוקים חדשים על הכלובים במועד תחילת הסשן המתאים.
    2. הסירו את מכסי המסנן מהכלובים. אם מדובר בימי MWF, המשיכו לשלב 2.2.3. אם מדובר בימי TRS, המשיכו לשלב 2.2.4.
    3. בימי שני, רביעי ושישי, הסירו את בקבוקי ה-TRS מחלקו העליון של הכלוב. שקלו את בקבוקי ה-MWF (בקבוק EtOH אחד ובקבוק H2O אחד). רשמו את משקל ההתחלה של הבקבוק עבור סשן השתייה של היום. ספקו מזון נוסף לחלק העליון של הכלוב או לכוסות המזון במידת הצורך. במועד תחילת הסשן שנקבע, הניחו את הבקבוקים על חלקו העליון של כלוב כל חולדה כאשר הסרט פונה כלפי מעלה, כדי שהחולדות לא ילעסו את תווית הבקבוק.
      הערה: בדרך כלל, צריכת מים אינה נרשמת או מדווחת עבור TRS, אך חוקרים יכולים לאסוף נתונים אלה באופן אופציונלי על ידי קבלת משקלי בקבוק בתחילת ובסוף הסשן, כפי שמתואר להלן בשלב 2.2.3 ובשלב 2.2.4, אם חפצו בכך. יש להחליף את הצד של בקבוק ה-EtOH לאחר כל סשן שתייה כדי למנוע התפתחות של העדפה לצד מסוים, מה שעלול להטות בטעות את נתוני הצריכה.
      1. אופציונלי: עבודות קודמות הראו כי חולדות רבות מציגות שתייה דמוית-בינג (binge-like drinking) בתחילת סשן השתייה8,32,33. רוב החוקרים המתעדים שתיית בינג בזמן זה מדווחים על הצריכה במהלך 30-60 הדקות הראשונות של סשן השתייה. כדי לקבל נתוני צריכה במהלך אירוע בינג פוטנציאלי זה, פעלו לפי השלבים המתוארים להלן.
      2. הפעילו טיימר לאחר הצמדת הבקבוקים לכלוב האחרון. השאירו את החדר ללא הפרעה במהלך פרק הזמן שנקבע.
      3. היכנסו שוב לחדר עם צלצול הטיימר. הסירו את בקבוקי ה-EtOH וה-H2O ורשמו את משקלי הבקבוקים. החזירו את בקבוקי ה-EtOH וה-H2O לכלובים.
        הערה: שלב זה אינו נדרש לתיעוד אירועי בינג בעת שימוש במערכת המצוידת לזיהוי לגימות (lick detection).
    4. בימי שלישי, חמישי ושבת, הסירו את בקבוקי ה-MWF מהכלובים במועד סיום הסשן שנקבע, המקביל ל-24 h לאחר זמן ההתחלה. שקלו כל בקבוק ורשמו את משקל הסיום של הבקבוק עבור סשן השתיית ה-MWF. מדדו ורשמו את משקל הגוף של כל חולדה. במידת הצורך, ספקו מזון נוסף לחלק העליון של הכלוב או לכוסות המזון. הניחו בקבוקי H2O של TRS על חלקו העליון של כלוב כל חולדה כאשר הסרט פונה כלפי מעלה, כדי שהחולדות לא ילעסו את תווית הבקבוק.
    5. החזירו את מכסי המסנן לכלובים ועזבו את חדר בעלי החיים.
      הערה: ניתן לכסות באופן אופציונלי את פיות השתייה של בקבוקי ה-EtOH כדי למנוע התאיידות. אם החלפת כלובים מבוצעת על ידי צוות המחקר, הקדישו יום אחד בשבוע במהלך תפקידי ה-TRS לביצוע משימה זו. העבירו כל חולדה לכלוב נקי לאחר קבלת משקל הגוף.
  3. שטפו את הבקבוקים וחדשו את הנוזלים על בסיס שבועי או דו-שבועי קבוע, בהתאם לנהלי הטיפול והתחזוקה של בעלי חיים במוסד. הקפידו לבצע מטלות אלו באופן שלא יקטע את סשני השתייה. לדוגמה, ניתן לשטוף ולמלא מחדש בקבוקי H2O של TRS לאחר הסרתם ב-MWF. באופן דומה, ניתן לשטוף ולמלא מחדש בקבוקי H2O ו-EtOH של MWF לאחר הסרתם ב-TRS.

3. זיהוי ליקוק במהלך ניסויי בחירה בין שני בקבוקים

הערה: חוקרים המעוניינים להשיג נתוני שתייה ברזולוציה גבוהה יכולים לשנות את הפרוצדורה שלעיל על ידי הוספת יכולות גילוי לקיקה לבקבוקים. LIQ HD30 היא מערכת זולה להרכבה עצמית (DIY) המאפשרת סוג זה של איסוף נתונים בעכברים. הפרוצדורות המתוארות להלן מפרטות את השינויים הדרושים כדי להתאים את LIQ HD לשימוש בחולדות (המכונה LIQ HDR). ראו את טבלת החומרים לרשימה של כל החלקים הנמכרים מסחרית והחלקים המודפסים בתלת-ממד הדרושים לבניית מערכת גילוי לקיקה אחת, שיכולה לתעד נתוני בחירה בין שני בקבוקים עבור עד 18 חולדות. ניתן למצוא את קובצי ה-.stl להדפסה בתלת-ממד ואת ההוראות באתר של המחבר (www.ejgloverlab.com/3dprints).

  1. הקמת יחידות חיישן קיבולי
    הערה: כל מערכת LIQ HDR מורכבת משלוש יחידות חיישן קיבולי, אשר יחד לוכדות נתוני לקיקה מ-36 בקבוקים במקביל, המתאימים ל-18 חולדות השוכנות בנפרד. כל יחידת חיישן מורכבת מ-I דיפרנציאלי אחד2לוח פריצה (breakout board) לתקשורת C ולוח חיישן קיבולי עם 12 מקשים, אשר יתחברו למד-ליקוקים (lickometers) משש כלובים נפרדים באמצעות שישה זוגות של כבלים בעלי 2 פינים, המקודדים בצבעים עבור כל מד-ליקוקים (איור 2A).
    1. אספו את החומרים הדרושים לבניית כל שלוש יחידות החיישן הקיבולי, כפי שמוצג ב- איור 2B, יחד עם כלי ההלחמה הנדרשים.
    2. כדי להתחיל בבניית יחידת חיישן A, כסו כבל עם מחבר נקבה בעל 2 פינים בשרוול בידוד מתכווץ בחום בצבע אדום ובאורך של 7 אינץ', והכניסו את קצוות החוטים האדום והשחור לפינים מס' 0 ו-1 בלוח החיישן (איור 2C-1), ולהלחים במקום (איור 2C-2). ודאו שהכבל נמצא בחזית לוח החיישנים כפי שמוצג, כדי לסדר את הכלובים בסדר מספרי משמאל לימין בבית הגידול (vivarium) מבלי להחליף בין הכבלים ובכך למנוע הפרעה פוטנציאלית להקלטה (ראו שלב 3.6 ו- איור 6).
    3. כסו חמישה כבלים נוספים בבידוד מעטפת פחית (heat shrink tubing) בצבעים שונים, והחליתו אותם לפינים מס' 2-11 כפי שמוצג (איור 2C-3וודאו שכל החוטים האדומים מהולתים לפינים בעלי מספרים זוגיים, אשר יתחברו לכל הבקבוקים בצד שמאל, ושכל החוטים השחורים מהולתים לפינים בעלי מספרים אי-זוגיים, אשר יתחברו לכל הבקבוקים בצד ימין.
    4. כסו את חיבורי ההלחמה בדבק חם מכל הצדדים להגנה (איור 2C-4). סמנו את המחברים בסדר מספרי, תוך מתן מזהה ייחודי לכל ליקומיטר (lickometerאיור 2C-4).
    5. כדי להרכיב את יחידת חיישן A, חברו את לוח חיישן A לנקודת קצה (EndPoint) של פריצת תקשורת באמצעות כבל 4-פינים באורך 50 מ"מ, וחברו את נקודת הקצה למוצא של 3.3V של ממיר הרמות (level shifter) מ-5V ל-3V באמצעות כבל 4-פינים באורך 100 מ"מ (איור 2D-1). למרות שללוח החיישנים וללוח הפריצה לתקשורת (communication breakout board) יש שני מחברים זהים בעלי 4 פינים, עדיין חשוב לוודא שהחיווט הוא בדיוק כפי שמוצג (איור 2D-1 ו- איור 2F) על מנת להשתמש במארזי החיישנים שהודפסו בתלת-ממד ובמערך הוויוואריום המוצע (ראו שלב 3.6 ו- איור 6). הכניסו את יחידת החיישן A לתוך המארז המודפס בתלת-ממד (איור 2D-2). סגרו בעדינות את החלק העליון, תוך הקפדה לא למעוך את כבל ממיר הרמות המתח (איור 2D-3).
    6. שנה את ה-I2כתובות C של לוחות החיישנים B ו-C על ידי הלחמה של חוט ג'מפר מפין ה-ADDR לפין ה-3Vo או לפין ה-SDA כפי שמצוין (איור 2E).
    7. הלחים שישה כבלי מחברים נקביים בעלי קידוד צבעים ללוחות החיישנים B ו-C, תוך שימוש באותו סדר שבו נעשה עבור לוח A. סמן כל מחבר עם מספר ה-ID המתאים של הליקומטר (lickometer). חבר את לוח B לנקודת הפריצה לתקשורת MidPoint ואת לוח C ל-EndPoint באמצעות כבלים של 4 פינים באורך 50 מ"מ (איור 2F).
    8. הכניסו את יחידות החיישן B ו-C למארזים המודפסים בתלת-ממד המתאימים להן. חברו את שלוש יחידות החיישן בשרשרת (Daisy-chain) באמצעות כבלי Ethernet כדי להשלים את הגדרת החיישנים (איור 2G).
  2. הגדרת ממשק הבקר זעיר (microcontroller)
    הערה: ממשק הבקר הזעיר של LIQ HDR (איור משלים 1A) זהה לתיאור עבור LIQ HD30 עם שינויים מינוריים בלבד. ההליכים המתוארים להלן מספקים סקירה כללית של השלבים הדרושים להקמת הממשק, עם השינויים המתוארים בשלבים 3.2.6 ו-3.2.8. חוקרים מוזמנים לעיין בפרוטוקול המקורי ובמדריך הווידאו המוצג בעמוד ה-GitHub של המחבר לקבלת הנחיות מפורטות יותר שלב אחר שלב.30.
    1. אספו את החומרים וכלי ההלחמה הדרושים לבניית הממשק של המיקרו-בקר (איור משלים 1B). בצד האחורי של מגן המגע (איור משלים 1C-1), צרו גשר הלחמה (solder jumper) בין פדי ההלחמה של תאורת הרקע (back light) (איור משלים 1C-2).
    2. בצד האחורי של מגן רישום הנתונים (data logging shield), נתקו את נתיב רפידת הגשר (jumper pad trace) של פין ה-CS (איור משלים 1D-1). בצדו הקדמי של דוגם הנתונים (data logger), הלחים חוט גישור קצר מפין ה-CS לפין מס' 7 (איור משלים 1D-2).
    3. כדי להתקין את מחברי הערימה של המגן (shield stacking headers), ערמו אותם תחילה בחלקו האחורי של מגן מסך המגע (איור משלים 1E-1יש להניח את רשם הנתונים (data logger) על גבי מסך המגע, להשתמש בסרט הדבקה לצורך ייצוב, ולהלחים את כל פיני המחברים (header pins) לרשם הנתונים.איור משלים 1E-2). לאחר מכן, הסירו את מסך המגע.
    4. הצמד את מחבר ה-header שנותר, בגודל 2 x 3, אל המיקרו-בקר (איור משלים 1F-1), ולאחר מכן יש להניח את רשם הנתונים (data logger) מעל לבקר המיקרו (microcontroller) לפני הלחמת פיני המחברים (header pins) במקומם (איור משלים 1F-2).
    5. הכנס את סוללת הכפתור למקליט הנתונים (איור משלים 1G-1). הצמידו את מסך המגע אל רשם הנתונים (איור משלים 1G-1). הכנס את כרטיס ה-microSD יחד עם המתאם שלו לתוך רשם הנתונים (איור משלים 1G-2).
    6. כדי להכין את חוט ההארקה הנוסף, חתכו מחבר זכר אחד מחוט מגשר (jumper wire) וקלפו את הקצה ל-~1/4 אינץ' (איור משלים 1H-1הלחים גדיל של חוט ליבה מוצקה שקולף לחוט המקשר (jumper wire) וכסו את חיבור ההלחמה בצינור בידוד מתכווץ בחום (heat shrink tubing).איור משלים 1H-2).
    7. חברו את חוטי הגישור בעלי 4 הפינים ואת חוט ההארקה הנוסף לבקר המיקרו (שחור - GND, אדום - 5V, צהוב - פין מס' 21, כחול - פין מס' 20, איור משלים 1I-1). הדק את החיבורים באמצעות דבק חם (איור משלים 1I-2). באופן רבוי, ניתן לעטוף את חוטי הגישור (jumper wires) בשרוך בידוד מתכווץ בחום (heat shrink tubing) (איור משלים 1I-2).
    8. הכניסו את ממשק המיקרו-בקר המורכב במלואו למארז המודפס בתלת-ממד, כאשר חוטי הגשר (jumper wires) בעלי 4 הפינים וחוט ההארקה מושחלים דרך הפתח בחלק העליון (איור משלים 1J).
    9. עקבו אחר הפרוטוקול המקורי להתקנת תוכנת הממשק של הבקר המיקרו-בקר (microcontroller)30.
  3. בניית מד-ליקוקים מסוג LIQ HDR
    הערה: ההדפסה התלת-ממדית המותאמת אישית למחזיקי הבקבוקים תוכננה לשימוש עם בקבוק שתייה סטנדרטי למכרסמים בעל צינורית שתייה בקוטר של 8 מ"מ (ראה טבלת חומרים, איור 3A). ניתן להתאים בקלות את מחזיק הבקבוקים הזה לשימוש עם בקבוקים וצינורות שאיבה דומים, עם שינויים מינוריים או ללא שינויים כלל.
    1. אספו את החומרים, ההדפסים בתלת-ממד וכלי ההלחמה הדרושים לבניית מד-לקק (lickometer) אחד, כפי שמוצג ב- איור 3Bשימו לב כי כל מערכת LIQ HDR תומכת בעד 18 ליקומטרים עבור 36 בקבוקים.
    2. כדי להאריך את כבל המחבר הזכרי, קלפו את שני קצותיו לאורך של כ-1/4 אינץ', וכן את החוטים השחור והאדום של ההארכה (איור 3C-1).
    3. הלחים את חוטי ההארכה לכבל המחבר (איור 3C-2) וכסו את חיבורי ההלחמה בשרוול בידוד מתכווץ בחום (איור 3C-3). כסו את כבל המחבר הזכר בצינור בידוד מתכווץ בחום (heat shrink tubing) שצבעו תואם לצבע כבל המחבר הנקבי התואם ביחידת החיישן (איור 3C-4).
    4. כדי לשמור על עקביות עם חיווט לוח החיישן (איור 2), השחילו את החוט האדום והשחור דרך מעברי הכבלים הפנימיים השמאלי והימני של מחזיק הבקבוק, בהתאמה (איור 3D-1).
    5. הלחים כל חוט לקצה הממשו של ה-1 ¾ סרט נחושת מוליך בגודל אינץ' (איור 3D-2) וקפלו את סרטי הנחושת לחצי (איור 3D-3).
    6. קלפו את סרט הנחושת והשתמשו בפינצטה כדי להניח אותו בזהירות בתוך תושבת הפיפיה (איור 3E-1) לפני הדבקה חזקה של הרכיב לדפנות הפנימיות של תושבת הלוחית (sipper bracket)איור 3E-2). ודאו שצד ההלחמה של סרט הנחושת מודבק לדופן הקרובה יותר לקו האמצע של מחזיק הבקבוק, כפי שסומן (איור 3E-2הדחפו צינורית שאיבה (sipper tube) דרך התושבת כדי להצמיד את הסרט בחוזקה לדופן ולהכין את התושבת לעבודה (prime).
    7. כדי לחזק את צד ההלחמה של סרט הנחושת, שאינו דביק באותה מידה ונוטה להתקלף, יש למרוח טיפה של דבק חם על חיבור ההלחמה (איור 3E-3). מרחו את הדבק כך שיכסה הן את סרט הנחושת והן כל חלק חשוף סמוך של ההדפסה התלת-ממדית (איור 3E-4).
    8. השחילו את הכבל דרך המעבר הפנימי של מגן הכבלים (איור 3F). ודאו כי בחרתם במגן הכבל המתאים (פונה שמאלה או ימינה) עבור כל מד-ליקוק (lickometer), כדי שתוכלו להשתמש במערך ה-vivarium המוצע (ראו שלב 3.6 ו- איור 6)."הערה: עבור מד-ליקוקים (Lickometers) 5-6, 11-12 ו-17-18, המוצגים באמצעות כבלי צבע כחול או סגול בהגדרה הנוכחית, נדרש מגן כבלים הפונה שמאלה (איור 4D-1), בעוד שכל שאר מדליקים (lickometers) דורשים מגן כבל הפונה ימינה (איור 4D-2).
    9. כדי להתקין את תפס הכבל, ראשית הכניסו חוט אחד לחריץ של מחצית אחת של תפס הכבל (איור 3G-1), לאחר מכן התאם את החצי השני מעל התיל השני, וסגור את שני החצאים בחוזקה באמצעות האום (איור 3G-2).
    10. סמנו את המחבר הזכרי עם מספר ה-ID המתאים של הליקומטר (lickometer)איור 3H). חזרו על שלבים אלו עד להשלמת בניית כל 18 הלקיומטרים (lickometers).
  4. התקנת ליקומטרים מסוג LIQ HDR
    הערה: LIQ HDR תוכנן להתקנה על כלוב חולדות סטנדרטי מסוג shoebox עם מכסה רשת מתכת (איור 4A-1).
    1. זהו שני זוגות של מוטות במרחק של כ-75 מ"מ ממרכז למרכז בחלק העליון של כלוב התבניות, כדי לאפשר את התקנת מחזיק הבקבוקים. השתמש בפלייר כדי לפתוח מעט את מוטות המתכת סביב פתחי השאיבה. בודד מוטות אלה בעזרת סרט בידוד חשמלי כדי למנוע מגע מתכת-מתכת בין השואבים לחלק העליון של הכלוב (איור 4A-2).
      הערה: למרות שסרט הבידוד החשמלי אינו נגיש לחולדות ולכן אינו חשוף ללעיסה, אנו ממליצים להשליכו בסיום המחקר ולא להשתמש בו שוב בין מחקרים.
    2. התקינו את הליקומטר (lickometer) ואת לוח האקריליק לייזר בעובי 1/8 אינץ' לחלק העליון של הכלוב באמצעות שתי סדרות של ברגי M5 ואומים (איור 4B). ודאו שפתחי הפיפטאות (sippers) בליקומטר ובפאנל האקרילי מסונכרנים, ושהפיפטאות אינן באהב עם שום חלק של חלקו העליון של הכלוב.
    3. הדק את תופס הכבל למוט החיצוני ביותר (בקוטר של כ-4 מ"מ) בחלקו העליון של כלוב התיל (איור 4C). התאימו את תפס הכבל במידת הצורך כדי לוודא שחלקו העליון של הכלוב מונח בצורה הדוקה על חלקו התחתון, ושהכבל אינו נמשך או מתכופף תחת מתח רב מדי. ודאו שנעשה שימוש במגן הכבל המתאים עבור כל מד-לקים (lickometer)איור 4D וראו שלב 3.8.8).
    4. כוון את צינורות השאיבה (sipper tubes) כנדרש, כך שרק כ-2 ס"מ מהצינור יבלטו מהפקק (איור 4E-1). כדי להתקין בקבוקים, הכנס את צינור השאיבה דרך תושבת השאיבה של מחזיק הבקבוקים עד למעצור (איור 4E-2). רק קצהו של צינור השאיבה (sipper tube) צריך לבלוט מעבר ללוח האקרילי (איור 4E-3). חיוני ששום חלק אחר של צינור השאיבה לא יהיה חשוף, וזאת כדי למנוע תוצאות חיוביות שגויות של לגימות הנובעות מהתנהגויות שאינן צריכה, כגון נגיעה של החולדה בצינור השאיבה או משחק בו. מכסה מסנן צריך להיות מסוגל להישען בצורה הדוקה על חלקו העליון של כלוב התיל ועל תפס הכבל, מבלי להפריע לכבל עצמו (איור 4F).
      הערה: ניתן להשתמש בפאנל אקרילי עבה יותר או בערימה של מספר פנלים בעובי 1/8 אינץ' כדי לסגור באופן מלא צינורות שתייה (sipper tubes) באורכים גדולים יותר עבור ניסויים הדורשים את השטחתם של צינורות השתייה עמוק יותר לתוך הכלוב, כגון במדידת שתייה בחולדות צעירות שייתכן ויתקשרו להגיע לצינור שתייה קצר.
  5. התקנה ושימוש בחוסמי שאיבה (sipper blockers)
    ​הערה: חוסם השאיבה (sipper blocker)איור 5Aנועד להגביל את גישת החולדה למשקיה במהלך החלפת הבקבוקים ולהבטיח כיול מדויק של הליקומטר (lickometer) בתחילתה של כל הפסקה של שתייה.
    1. אספו את החלקים המודפסים בתלת-ממד ואת בורג M5, אום ודיסקיות עבור חוסם לגימה (sipper blocker) אחד, כפי שמוצג ב- איור 5B.
    2. הכנס את ה-SIPPER_Gear לתוך ה-SIPPER_Base (איור 5C-1). ודאו שגלגל השיניים (SIPPER_Gear) מונח בדיוק כפי שמוצג בהדמיית התלת-ממד המצורפת. הכניסו את התולעת (SIPPER_Worm) לתוך הפתח בחלקו העליון של הבסיס (SIPPER_Base). סובבו את התולעת עם כיוון השעון תוך כדי ההחדרה, עד שהראש יהיה בקו אחד עם הבסיס (איור 5C-2).
    3. הברג את אום ה-SIPPER לקצה התולעת (Worm) מהחלק התחתון של הבסיס (Base)איור 5C-3). השתמשו בפינצטה כדי להדק את האום תוך כדי סיבוב של חוגת התולעת. הכניסו את הצוואריים העגולים והצרים של ה-SIPPER_Blockers לתוך החריצים של הגלגל שיניים (איור 5C-4).
    4. התקינו את חוסם הלוּחסי (sipper blocker) המורכב על חלקו העליון של הכלוב באמצעות סט ברגי M5 (איור 5D). ודאו ששני חוסמי הלוף (sipper blockers) מיושרים עם פתחי הלוף.
    5. כדי לחסום את הגישה למשאבים (sippers), סובב את חוגת התולעת עם כיוון השעון כדי להוריד את החוסמים עד שיכסו לחלוטין את פתחי המשאבים (איור 5E).
    6. כדי לאפשר גישה לשותי המים, סובב את החוגה נגד כיוון השעון עד שהחוסמים יהיו במצב אנכי, בניצב לחלק העליון של הכלוב (איור 5F-1). משוך כל זרוע של החוסם כלפי מעלה באופן ידני עד שראשיהם יהיו ממש מתחת לחלק העליון של כלוב התיל. סובב את החוסמים 90° כך הראשים מקבילים למוטות המתכת בחלקו העליון של הכלוב והזרועות נעולות במקומן (איור 5F-2המשיכו לסובב את החוגה נגד כיוון השעון עד ששני החסמים יהיו מורמים מעל לראש הכלוב (איור 5F-3) והשוקות נגישות באופן מלא (איור 5F-4).
  6. שימוש במערכת LIQ HDR בבית הגידול לבעלי חיים (vivarium)
    הערה: מערך הוויווריום (vivarium) הבא עבר אופטימיזציה כדי לתעד בחירת שתייה בין שני בקבוקים באמצעות ממשק בקר זעיר (microcontroller) יחיד המחובר ל-18 כלובים סטנדרטיים לחולדות מסוג shoebox. כל הרכיבים האלקטרוניים, כולל ממשק הבקר הזעיר, יחידות החיישנים וכבלים שונים, מעוגנים למדפי רשת ממתכת המותקנים על הקיר ועליהם מונחים הכלובים (איור 6A). ייתכן שיידרשו מספר התאמות כדי להתאים את הפרוטוקול למתקני בעלי החיים ולצרכי המשתמש.
    1. התקינו כל יחידת חיישן על מדפי הוויווריום (vivarium) באמצעות בורג ההתקנה המותאם אישית שהודפס בתלת-ממד (איור 6B). ודאו שכל יחידת חיישן מותקנת ישירות מתחת לכלוב עם הליקומיטר (lickometer) הצהוב, כדי למנוע מתיחה מיותרת של הכבלים (איור 6A).
    2. סדרו ואבטחו כל כבל מחבר נקבי, תוך כדי וידוא שהם אינם חופפים זה לזה ואינם מתכופפים יתר על המידה בקצות ההלחמה שלהם, דבר שעלול להוביל לזיהוי דליפה לקוי (איור 6Bאם נעשה שימוש במדפי רשת ממתכת, ניתן להשיג זאת בקלות על ידי קישור כבלי החיבור למוטות נפרדים במדף באמצעות אזיקי כבלים, כפי שמוצג.
    3. התקן את ממשק המיקרו-בקר לצד יחידת חיישן A באמצעות אותו בורג עיגון מודפס בתלת-ממד, וחבר את מחבר 4-הפינים שלו לכניסת ה-5V של ממיר הרמות מ-5V ל-3V המחובר ליחידת חיישן A (איור 6C).
    4. השתמשו בסרט בידוד כדי להצמיד את חוט ההארקה הנוסף למקור הארקה, כגון מדף מתכת (איור 6D).
    5. סדרו כל כלוב בהתאם לצבע ולמזהה של הליקומטר (lickometer) המותקן, לפי... איור 6A תיאור במטרה למזער חפיפת כבלים ומתיחות.
    6. חברו באופן מאובטח את כל כבלי החיבור הזכריים של הליקומטר (lickometer) לכבלי החיבור הנקביים התואמים של החיישן (איור 6E). חבר את ספק הכוח כדי להפעיל את ממשק המיקרו-בקר (איור 6F).
    7. בדף ממשק המשתמש הגרפי (GUI) הראשי (איור 6G), הקש על ה סמל הגדרה לפתיחת דף ההגדרות. המשתמשים יכולים לשנות את זמני הדלקת וכיבוי האורים בהתאם ללוח הזמנים של הויבאריום, כדי להבטיח שתצוגת הממשק תעמעם באופן אוטומטי עם תחילת מחזור החשיכה (איור 6H-1).
    8. נקישה עריכת הגדרות החיישן (איור 6H-1) לכוון את סף המגע (Touch Threshold) ל-8 ואת סף השחרור (Release Threshold) ל-2, הגדרות שמצאנו כי מאפשרות את זיהוי הליקקות העקבי ביותר עבור חולדות בשימוש במערך הנוכחי (איור 6H-2). עם זאת, יש לשים לב כי משתמשים עשויים להידרש לניסוי עם הגדרות שונות במידה ויוכנסו שינויים כלשהם למערכת הנוכחית.
    9. ביטול סימון כיול אוטומטי אם נתונים נאספים רק לאורך תקופה של 24 שעות או פחות (איור 6H-2).

4. פרוצדורות יומיות לבחירה בין שני בקבוקים של מי שתייה בכלוב ביתי באמצעות זיהוי ליקוק

  1. בצע את השלבים המפורטים בשלב 2 עבור פרוצדורות סטנדרטיות של בחירה בין שני בקבוקים, עם השינויים הבאים.
  2. בימי שני, רביעי ושישי, לפני הצבת בקבוקי ה-MWF, השתמשו בחוסמי הלוף (sipper blockers) כדי לכסות את פתחי הלוף בכל הכלובים (ראו שלב 3.5.5 ו- איור 5E).
  3. לפני ההקלטה, בחר את ה- הצד הניסיוני בדף ממשק המשתמש (GUI) הראשי, איזה בקבוק EtOH יהיה בשימוש לאותו היום (איור 6G).
  4. לאחר התקנת כל בקבוקי ה-MWF, הקישו אנא ספק את הטקסט באנגלית שברצונך לתרגם. בעמוד הראשי (איור 6G) כדי להתחיל בכיול החיישנים, במהלכו מומלץ למשתמשים להתרחק מהמערכת ולוודא שהחולדות אינן לוקקות את פיית השתייה (איור 6I-1). הכיול נמשך מספר שניות, ולאחריו המערכת עוברת לדף ההקלטה הראשי המציג את מספר הליקקים המצטבר בכל בקבוק עבור כל ליקומטר (איור 6I-2).
  5. הגביהו את כל חסמי השותייה (sipper blockers) מעל לחלק העליון של הכלוב כדי לאפשר גישה לשותייה (ראו שלב 3.5.6 ו- איור 5F), והחזר בעדינות את כל מכסי המסננים כפי שתואר (ראה שלב 3.4.4 ו- איור 4F).
  6. הקשה רענן כדי לעדכן את מספר הליקוקים (lick numbers) על המסך, אשר לא יתעדכנו בזמן אמת באופן עצמאי (איור 6I-2).
  7. בימי שלישי, חמישי ושבת, הקישו שמור & יציאה להפסקת ההקלטה ולחזרה לדף הראשי (איור 6I-2) לפני הסרת בקבוקי ה-MWF.
  8. כדי להוציא את כרטיס ה-SD לצורך העברת נתונים, הקש על הוצא SD לפני ניתוק כרטיס ה-SD (איור 6Gהכנס את כרטיס ה-SD לכל מחשב והעתק/הדבק את קובץ הנתונים בפורמט .csv, ששמו נקבע לפי תאריך הפעלת הבקבוק, למחשב זה.איור 6K). כדי להרכיב מחדש את כרטיס ה-SD להקלטה הבאה, הכניסו את הכרטיס לממשק והקישו על קיבוע SD (איור 6J).
    הערה: אנו ממליצים לגבות את קבצי הנתונים מדי יום.
  9. מומלץ להגביל את מדידות משקל הגוף לפעם אחת בשבוע, במידה והדבר תואם למודל החיי ופרוטוקול השימוש בבעלי חיים, ולבצע משימה זו ביום שנקבע להחלפת הכלובים כדי למזער הפרעות מיותרות למלקומטרים (lickometers) ולחיישנים. יש לנתק את כל כבלי הזכר של המלקומטרים מכבלי החיישן הנקביים התואמים לפני הזזת הכלובים. לאחר שקילת כל חולדה, יש להחזירה לכלוב נקי. העבירו את המלקומטר למכסה כלוב חדש וחברו מחדש כל מלקומטר לחיישן התואם לו במידת הצורך.
  10. עבור ניסויים הבודקים את השפעת התערבות (למשל, הזרקת תרופה) על צריכת EtOH ועל מיקרו-מבנה השתייה, תזמנו התערבויות אלו לפני תחילת מפגש השתייה במידת האפשר. במקרים שבהם הדבר אינו אפשרי, חוקרים יכולים להפסיק את זיהוי הליקוקים על ידי הקשה הפסקה (איור 6I-2) וכחזור ללכידת נתונים על ידי לחיצה על קורות חיים לאחר השלמת ההתערבות. אנו ממליצים למדוד את משקל הבקבוקים בכל הפסקה במהלך סשן השתייה, וזאת כדי לתעד שינויים בצריכת EtOH לפני ואחרי ההתערבות, וכן כדי להביא בחשבון נשפכות שעלולות להתרחש בעת הסרת מכסה הכלוב לצורך גישה לבעל החיים.
  11. בסיום המחקר, יש לחטא היטב את כל רכיבי הכלוב לפני השימוש בהם עם בעלי חיים חדשים, וזאת כדי להגביל את מעבר המזהמים בין בעלי החיים. אנו ממליצים לרסס בעדינות ולנקות את הליקומטר (lickometer) באמצעות תמיסת EtOH 70%, תוך הקפדה לא לפגוע ברכיבים החשמליים הפנימיים. ניתן לשטוף את חוסם השותה (sipper blocker) ואת לוח האקרילי במים חמימים וסבון.

5. ניתוח נתונים

  1. לפני הערכת המדדים התלויים, תקנו את נתוני הצריכה עבור דליפה המתרחשת באופן בלתי נמנע כתוצאה מהחלפת הבקבוקים מדי יום. לשם כך, חשבו את הממוצע של השינוי במשקל הבקבוקים עבור EtOH ובקבוקי H2O בכלוב הדליפה לאורך כל תקופת המחקר.
  2. הסירו ערכים הגבוהים משתי סטיות תקן מהממוצע עבור כל בקבוק. לאחר הסרת חריגים אלו, החסירו את הממוצעים שחושבו מהשינויים במשקל בקבוקי EtOH ו-H2O שהתקבלו מבקבוקים בכלובים המכילים חיות. באמצעות החסרת כמות זו, חוקרים יכולים להיות בטוחים שהאובדן הממוצע הנובע מדליפה של תמיסה נתונה אינו נכלל במדדי הצריכה. החסרת כמות הדליפה הממוצעת עשויה להוביל לערך שלילי עבור חלק מהחיות במקרים מסוימים. המירו ערכים אלו לאפס ופרשו אותם כהיעדר צריכה כלשהי של אותה תמיסה.
  3. המדדים התלויים העיקריים בניסויי שתייה של בחירה בין שני בקבוקים הם צריכת EtOH (g/kg) והעדפה (%). חשבו את הצריכה מהשינוי במשקל בקבוק ה-EtOH (g) ונרמלו למשקל גוף (kg) באמצעות השלבים הבאים.
    1. המירה של השינוי במשקל הבקבוק (g) לשינוי בנפח (mL) באמצעות המשוואה הבאה:
      figure-protocol-1
      הצפיפות של אתנול טהור היא 0.789 g/mL. לכן, הצפיפות התורמת של 20% EtOH היא 0.1578 g/mL. משקל H2O הוא 1 g/mL. לכן, הצפיפות התורמת של 80% H2O = 0.80 g/mL. כתוצאה מכך, כל mL של תמיסת 20% EtOH (v/v) מורכב מ-0.1578 (EtOH) + 0.80 (H2O) = 0.9578 g/mL. לכן, המשוואה הסופית בעת שימוש בריכוז 20% (v/v) EtOH היא:
      figure-protocol-2
    2. חשבו את מנת האתנול שנצרכה באמצעות המשוואה למטה. השתמשו במשקלי גוף שהתקבלו במהלך אותו שבוע של נתוני הצריכה כדי לחשב את כמות האתנול שנצרכה ביחס למשקל גוף החיה.
      figure-protocol-3
    3. חשבו את ההעדפה באמצעות המשוואה הבאה:
      figure-protocol-4
  4. בדומה למקבילו בעכברים30, מערכת LIQ HDR לוכדת מגוון משתני מיקרו-מבנה של שתייה, כולל משך הליק, מספר באאוטים (bouts), משך באאוט, מספר הליקים בבאאוט ומשך הליק בבאאוט (איור 6K). באאוט שתייה מוגדר כסדרה של ליקים המתחילה בלפחות 3 ליקים שבוצעו בפחות מ-1 sec ומסתיימת לאחר שחלפו 3 sec ללא ליקים נוספים. מדדים אלו יכולים לשמש לאחר מכן לחישוב משך הליק האישי הממוצע, משך הבאאוט האישי הממוצע, מספר הליקים הממוצע לבאאוט, תדירות הליקים הממוצעת, מרווח בין-ליקי מוערך ומרווח בין-באאוטים מוערך.
    הערה: ממשק המיקרו-בקר מספק נתוני מיקרו-מבנה אלו ברזולוציה של 1-min בקובץ .csv (איור 6K). חוקרים יכולים להשתמש באפליקציית הניתוח המסופקת עם פרוטוקול LIQ HD המקורי30 או בפלטפורמת עיבוד נתונים מועדפת עליהם כדי לאסוף ולסכם את הנתונים בהתאם לצורכי המחקר. נתוני מיקרו-מבנה מסוכמים בדרך כלל לאורך כל תקופת ה-24 h כדי להשוות הבדלים ממוצעים ברמה המקרו, או בטווחים (bins) של 30 min עד 1 h כדי לבחון שינויים בדפוסי השתייה לאורך מחזור אור-חושך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

נתוני שתיית EtOH בבית כלוב בבחירה סטנדרטית של שני בקבוקים לסירוגין
בשימוש בפרוצדורה הסטנדרטית (איור 7A), חוקרים יכולים לתעד צריכה של 24 שעות (איור 7B-D) כמו כן שתייה דמוית-בנג' (binge-like drinking) אם משקלי הבקבוקים נאספים זמן קצר לאחר תחילת סשון השתייה (איור 7E-F). על ידי חישוב צריכת האתנול ביחס לצריכת המים, חוקרים יכולים להשיג גם נתוני העדפה בכל נקודות הזמן שנמדדו (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול הנוכחי מספק הוראות שלב אחר שלב ללכידת נתוני שתיית אתנול באמצעות נוהל כלוב ביתי לבחירת שני בקבוקים לסירוגין. ניתן ליישם שיטה זו בקלות יחסית ובעלות נמוכה עד אפסית או צורך בציוד מחקר מיוחד. באמצעות הנהלים הניתנים כאן לבנייה ויישום של LIQ HDR - מערכת זיהוי ליקוק לשימוש בחולדות - חוקרים יכולים ללכוד נתוני מיקרו-מבנה שתייה ברזולוציה גבוהה בנוסף למדדים סטנדרטיים של צריכה והעדפה.

לוח הזמנים לגישה לסירוגין המתואר בפרוטוקול הנוכחי הוא הליך בשימוש נרחב במידה רבה מכיוון שהוא ידוע כמייצר רמות גבו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

כל המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

המחברים מודים לג'וזף פיטוק ולקייטי פז'יביש, דוקטורט על הסיוע הטכני במהלך פיתוח LIQ HDR. אנו מודים גם לניקולס פיטרסן ולדוקטורט מארי דויל על שיחות מועילות רבות במהלך הפיתוח של LIQ HDR. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי להתמכרות לאלכוהול ואלכוהוליזם במכונים הלאומיים לבריאות (P50 AA022538 ו-R01 AA029130 ל-EJG).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>רכיבים זמינים מסחרית<חזק>כמות
12 מקשים פריצת חיישן מגע קיבולי (MPR121)Adafruit19823
זוג כבלים תואם 2 פינים (JST XH 2.5 מ"מ)Adafruit487218
מגשר לוח אב-טיפוס 4 פינים (Qwiic)SparkFunPRT-179121
כבל 4 פינים (100 מ"מ Qwiic)SparkFunPRT-172591
כבל 4 פינים (50 מ"מ Qwiic)SparkFunPRT-172603
פריצת מעביר מפלס 5V ל-3VAdafruit56371
מגן מגע קיבולי (2.8 אינץ')Adafruit19471
סרט מוליך נחושת (1/4 אינץ')DigiKey4393-CFT-1/4-ND1
נתונים מגן עציםAdafruit11411
ערכת פריצת תקשורת I2C דיפרנציאלית (QwiicBus)SparkFunKIT-17250
1 סרט חשמליDigiKey3M156004-ND1
צינורות כיווץ חום (3/16 אינץ' צבעים שונים)אזיקוני כבלים ועודHS357-S106
ערכת צינורות לכווץ חום (4 אינץ' שחור)Jameco20959631
סוללת מטבע ליתיום (3V 12.5 מ"מ)DigiKey1908-CR1220JAUCHSB-ND1
M5 מכונת כביסה שטוחהGrainger54FN661
M5 אגוז משושהGrainger6CA721
M5 בורג מכונה (12 מ"מ)Grainger6GU881
M5 בורג מכונה (25 מ"מ)Grainger  6GU912
חוט מגשר זכר/זכרAdafruit19571
לוח מיקרו-בקר (Arduino Mega 2560 Rev3)DigiKey1050-1018-ND1
נימה PETG (כסף 2.85 מ"מ)MatterHackersM-DDH-UZR22
נימה PLA (2.85 מ"מ שחור)MatterHackersM-SEW-RUAW2
נימה PLA (2.85 מ"מ כסף)MatterHackersM-66P-6CLE1
ספק כוח (DC 9V 1A)Newegg9SIBPPKJYR59911
כרטיס זיכרון SD/microSD (8GB)Adafruit12941
כותרות ערימה ShieldAdafruit851
חוט ליבה מוצקה (22AWG אדום)Adafruit2881
חוט ליבה תקועה (22AWG שחור)Adafruit29761
חוט ליבה תקוע (אדום 22AWG)Adafruit30681
צינור לגימת כובע טוויסט עם כדורעיצוב אלטרנטיביTCCN8.5-ST2.5SB38
בקבוק מים (8oz)עיצוב חלופיWB8FS38
<חזק>רכיבים מודפסים בתלת מימד מותאמים אישית<חזק>כמות
>תחתית מארז Arduino מודפס בתלת מימדN/AARDUINO_Bottom.stl1
מארז Arduino מודפס בתלת מימד למעלהN/AARDUINO_Top.stl1
קליפ כבלים מודפס בתלת מימד LN/ACLIP_L.stl18
אגוז קליפ כבלים מודפס בתלת מימדN/ACLIP_Nut.stl18
קליפ כבלים מודפס בתלת מימד RN/ACLIP_R.stl18
מחזיק בקבוק ליקומטר מודפס בתלת מימדN/ALICKOMETER_Bottle Holder.stl19
מגן כבל ליקומטר מודפס בתלת מימד LN/ALICKOMETER_Cable Protector_L.stl6
מגן כבל ליקומטר מודפס בתלת מימד RN/ALICKOMETER_Cable Protector_R.stl12
אותיות ליקומטר מודפסות בתלת מימדN/ALICKOMETER_Letters.stl19
בורג הרכבה מודפס בתלת מימדN/AMount Screw.stl4
מארז חיישן מודפס בתלת מימד תחתוןN / ASENSOR_A_Bottom.stl1
מארז חיישן מודפס בתלת מימד A עליוןN / ASENSOR_A_Top.stl1
מארז חיישן מודפס בתלת מימד B תחתוןN / ASENSOR_B_Bottom.stl1
מארז חיישן מודפס בתלת מימד B עליוןN / ASENSOR_B_Top.stl1
מארז חיישן מודפס בתלת מימד C תחתוןN / ASENSOR_C_Bottom.stl1
מארז חיישן מודפס בתלת מימד C למעלהN / ASENSOR_B_Top.stl1
אותיות מארז חיישן מודפס בתלת מימדN/ASENSOR_Letters.stl1
חוסם sipper מודפס בתלת מימדN/ASIPPER_Blocker.stl36
בסיס חוסם sipper מודפס בתלת מימדN/ASIPPER_Base.stl18
ציוד חוסם sipper מודפס בתלת מימדN/ASIPPER_Gear.stl18
אגוז חוסם סיפר מודפס בתלת מימדN/ASIPPER_Nut.stl18
תולעת חוסם סיפר מודפסת בתלת מימדN/ASIPPER_Worm.stl18
לוח אקרילי ליקומטר חתוך בלייזרN/ALICKOMETER_Acrylic Panel_Sketch.dxf19

מקורות

  1. GBD 2016 Alcohol Collaborators. Alcohol use and burden for 195 countries and territories, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 392 (10152), 1015-1035 (2018).
  2. Fillmore, K. M., Stockwell, T., Chikritzhs, T., Bostrom, A., Kerr, W. Moderate alcohol use and reduced mortality risk: systematic error in prospective studies and new hypotheses. Annals Epidemiol. 17 (5 Suppl), S16-S23 (2007).
  3. GBD 2020 Alcohol Collaborators. Population-level risks of alcohol consumption by amount, geography, age, sex, and year: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2020. Lancet. 400 (10347), 185-235 (2020).
  4. Esser, M. B., Sherk, A., Liu, Y., Naimi, T. S. Deaths from excessive alcohol use - United States, 2016-2021. Morbidity Mortality Weekly Rep. 73, 154-161 (2024).
  5. Melendez, R. I. Intermittent (every-other-day) drinking induces rapid escalation of ethanol intake and preference in adolescent and adult C57BL/6J mice. Alcohol Clin Exp Res. 35 (4), 652-658 (2011).
  6. Wise, R. A. Voluntary ethanol intake in rats following exposure to ethanol on various schedules. Psychopharmacologia. 29 (3), 203-210 (1973).
  7. Simms, J. A., et al. Intermittent access to 20% ethanol induces high ethanol consumption in Long-Evans and Wistar rats. Alcohol Clin Exp Res. 32 (10), 1816-1823 (2008).
  8. Carnicella, S., Ron, D., Barak, S. Intermittent ethanol access schedule in rats as a preclinical model of alcohol abuse. Alcohol. 48 (3), 243-252 (2014).
  9. Loi, B., et al. Increase in alcohol intake, reduced flexibility of alcohol drinking, and evidence of signs of alcohol intoxication in Sardinian alcohol-preferring rats exposed to intermittent access to 20% alcohol. Alcohol Clin Exp Res. 34 (12), 2147-2154 (2010).
  10. Rhodes, J. S., Best, K., Belknap, J. K., Finn, D. A., Crabbe, J. C. Evaluation of a simple model of ethanol drinking to intoxication in C57BL/6J mice. Physiol Behavior. 84 (1), 53-63 (2005).
  11. Thiele, T. E., Navarro, M. "Drinking in the dark" (DID) procedures: a model of binge-like ethanol drinking in non-dependent mice. Alcohol. 48 (3), 235-241 (2014).
  12. Rimondini, R., Sommer, W., Heilig, M. A temporal threshold for induction of persistent alcohol preference: behavioral evidence in a rat model of intermittent intoxication. J Studies Alcohol. 64 (4), 445-449 (2003).
  13. Sommer, W. H., et al. Upregulation of voluntary alcohol intake, behavioral sensitivity to stress, and amygdala crhr1 expression following a history of dependence. Biol Psychiatry. 63 (2), 139-145 (2008).
  14. Nentwig, T. B., et al. The lateral habenula is not required for ethanol dependence-induced escalation of drinking. Neuropsychopharmacol. 47 (12), 2123-2131 (2022).
  15. Becker, H. C., Lopez, M. F. Increased ethanol drinking after repeated chronic ethanol exposure and withdrawal experience in C57BL/6 mice. Alcohol Clin Exp Res. 28 (12), 1829-1838 (2004).
  16. Lopez, M. F., Becker, H. C. Effect of pattern and number of chronic ethanol exposures on subsequent voluntary ethanol intake in C57BL/6J mice. Psychopharmacology. 181 (4), 688-696 (2005).
  17. Griffin, W. C., Lopez, M. F., Becker, H. C. Intensity and duration of chronic ethanol exposure is critical for subsequent escalation of voluntary ethanol drinking in mice. Alcohol Clin Exp Res. 33 (11), 1893-1900 (2009).
  18. Hwa, L. S., et al. Persistent escalation of alcohol drinking in C57BL/6J mice with intermittent access to 20% ethanol. Alcohol Clin Exp Res. 35 (11), 1938-1947 (2011).
  19. Vierkant, V., Xie, X., Wang, X., Wang, J. Experimental models of alcohol use disorder and their application for pathophysiological investigations. Curr Prot. 3 (6), e831(2023).
  20. Greenfield, T. K., et al. Risks of alcohol use disorders related to drinking patterns in the U.S. general population. J Studies Alcohol Drugs. 75 (2), 319-327 (2014).
  21. Rehm, J., Greenfield, T. K., Rogers, J. D. Average volume of alcohol consumption, patterns of drinking, and all-cause mortality: results from the US National Alcohol Survey. Am J Epidemiol. 153 (1), 64-71 (2001).
  22. Grant, K. A., et al. Drinking typography established by scheduled induction predicts chronic heavy drinking in a monkey model of ethanol self-administration. Alcohol Clin Exp Res. 32 (10), 1824-1838 (2008).
  23. Nathan, P. E., O'Brien, J. S. An experimental analysis of the behavior of alcoholics and nonalcoholics during prolonged experimental drinking: A necessary precursor of behavior therapy. Behav Ther. 2 (4), 455-476 (1971).
  24. Godynyuk, E., Bluitt, M. N., Tooley, J. R., Kravitz, A. V., Creed, M. C. An open-source, automated home-cage sipper device for monitoring liquid ingestive behavior in rodents. eNeuro. 6 (5), (2019).
  25. Frie, J. A., Khokhar, J. Y. An open source automated two-bottle choice test apparatus for rats. HardwareX. 5, e00061(2019).
  26. Melo, M. C., Alves, P. E., Cecyn, M. N., Eduardo, P. M. C., Abrahao, K. P. Development of eight wireless automated cages system with two lick-o-meters each for rodents. eNeuro. 9 (4), (2022).
  27. Wong, K., et al. Socially integrated polysubstance (SIP) system: An open-source solution for continuous monitoring of polysubstance fluid intake in group housed mice. Addiction Neurosci. , (2023).
  28. Frie, J. A., Khokhar, J. Y. FARESHARE: An open-source apparatus for assessing drinking microstructure in socially housed rats. NPP-Digit Psychiatry Neurosci. 2 (1), 1-7 (2024).
  29. Zhao, Z., et al. INGEsT: An open-source behavioral setup for studying self-motivated ingestive behavior and learned operant behavior. bioRxiv. , (2024).
  30. Petersen, N., Adank, D. N., Raghavan, R., Winder, D. G., Doyle, M. A. LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home Cage Device): An open-source tool for recording undisturbed two-bottle drinking behavior in a home cage environment. eNeuro. 10 (4), (2023).
  31. Trujillo, J. L., Roberts, A. J., Gorman, M. R. Circadian timing of ethanol exposure exerts enduring effects on subsequent ad libitum consumption in C57 mice. Alcohol Clin Exp Res. 33 (7), 1286-1293 (2009).
  32. Nentwig, T. B., Margaret Starr, E., Judson Chandler, L., Glover, E. J. Absence of compulsive drinking phenotype in adult male rats exposed to ethanol in a binge-like pattern during adolescence. Alcohol. 79, 93-103 (2019).
  33. Patwell, R., Yang, H., Pandey, S. C., Glover, E. J. An operant ethanol self-administration paradigm that discriminates between appetitive and consummatory behaviors reveals distinct behavioral phenotypes in commonly used rat strains. Neuropharmacology. 201, 108836(2021).
  34. Bito-Onon, J. J., Simms, J. A., Chatterjee, S., Holgate, J., Bartlett, S. E. Varenicline, a partial agonist at neuronal nicotinic acetylcholine receptors, reduces nicotine-induced increases in 20% ethanol operant self-administration in Sprague-Dawley rats. Addict Biol. 16 (3), 440-449 (2011).
  35. Mill, D. J., Bito-Onon, J. J., Simms, J. A., Li, R., Bartlett, S. E. Fischer rats consume 20% ethanol in a long-term intermittent-access two-bottle-choice paradigm. PloS One. 8 (11), e79824(2013).
  36. Carnicella, S., Amamoto, R., Ron, D. Excessive alcohol consumption is blocked by glial cell line-derived neurotrophic factor. Alcohol. 43 (1), 35-43 (2009).
  37. Moore, C. F., Lynch, W. J. Alcohol preferring (P) rats as a model for examining sex differences in alcohol use disorder and its treatment. Pharmacol Biochem Behav. 132, 1-9 (2015).
  38. Pitock, J. R., et al. Presence of distinct operant phenotypes and transient withdrawal-induced escalation of operant ethanol intake in female rats. bioRxiv. , (2024).
  39. Carnicella, S., Yowell, Q. V., Ron, D. Regulation of operant oral ethanol self-administration: a dose-response curve study in rats. Alcohol Clin Exp Res. 35 (1), 116-125 (2011).
  40. De Oliveira Sergio, T., et al. Sex- and estrous-related response patterns for alcohol depend critically on the level of compulsion-like challenge. Prog Neuro-Psychopharmacol Biol Psychiatry. 133, 111008(2024).
  41. Foo, J. C., Skorodumov, I., Spanagel, R., Meinhardt, M. W. Sex- and age-specific effects on the development of addiction and compulsive-like drinking in rats. Biol Sex Diff. 14 (1), 44(2023).
  42. Moolten, M., Kornetsky, C. Oral self-administration of ethanol and not experimenter-administered ethanol facilitates rewarding electrical brain stimulation. Alcohol. 7 (3), 221-225 (1990).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

צריכת אלכוהול במכרסמיםמיקרו-מבנה שתייהמערכת ליקומטר (Lickometer)צריכת אתנול בחולדותדפוסי שתייהריכוז אתנול בדםשתייה דמוית בינג׳ (Binge-like drinking)
מידול צריכת אלכוהול במכרסמים באמצעות שתיית כלוב ביתי לבחירה בשני בקבוקים וניתוח מיקרו-מבני
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.