מאמר שיטה

מערכות מודל רקמות אורגנוטיפיות לחקירת אינטראקציות מארח-פתוגן במבחנה

DOI:

10.3791/67487

⸱

28 במרץ 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Oral Sciences Research Group, Glasgow Dental School, School of Medicine, College of Medical, Veterinary and Life Sciences, University of Glasgow, 2Glasgow Biofilm Research Network, 3Department of Restorative Dental Sciences, College of Dentistry, Jouf University, 4Department of Biological and Biomedical Sciences, Glasgow Caledonian University, 5Safeguarding Health through Infection Prevention Research Group, Glasgow Caledonian University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את היישום של מודלים של רקמות אורגנוטיפיות לחקירת אינטראקציות מארח-פתוגן במבחנה. באופן ספציפי, מערכת המודל המתוארת משתמשת באפיתל אוראלי רב שכבתי החשוף למיקרואורגניזמים הקשורים לביופילמים (רובד שיניים) בהקשר של בריאות הפה לעומת מחלות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סיכום ממשק המארח-פתוגן במחסום האפיתל או הרירית במבחנה נותר סיכוי מאתגר עבור ביולוגים זיהומיים. בעוד שחד-שכבות אפיתל דו-ממדיות שגדלו בבית חסרות ייצוג אמיתי של המצב in vivo , לעתים קרובות מתעלמים מדגמי רקמות זמינים מסחרית בשל העלות והמעשיות שלהם. עם זאת, עם תכנון קפדני, מודלים כאלה מספקים פלטפורמות הניתנות לשחזור עבור מגוון עצום של יישומים שונים. כאן, אנו מדווחים על שימוש במודלים אפיתל שניתן להשתמש בהם למגוון רחב של מטרות ניסיוניות כדי לחקור אינטראקציות מארח-פתוגן בנישות אקולוגיות שונות, כגון חלל הפה, העור ורירית הנרתיק. מתאים פלנקטוניים פשוטים ועד לתרבית משותפת מורכבת של ביופילם, מודלים אפיתליים משמשים להערכת היצמדות ופלישה של חיידקים, ולהערכת תגובת המארח ברמת שעתוק ו/או חלבון, עם מרחב לפרופיל מפורט יותר באמצעות גישות אומיקס שונות. יתר על כן, מערכות ביולוגיות אלו יכולות לשמש כמיטות בדיקה מדויקות יותר להערכת פעילות אנטי-מיקרוביאלית קונבנציונלית וחדשנית במיקרו-סביבה מורכבת של מארח-פתוגן במבחנה. הפרוטוקולים המתוארים כאן מתעדים כיצד מודלים מטופלים עם הגעתם ומוכנים במעבדה לגירוי תרבית משותפת עם קהילות ביופילם. השיטות מפרטות כיצד מושגות תפוקות ניסיוניות ממערכות המודל, כולל עיבוד רקמות, הגדרת תרבית משותפת והפקת נתונים. ניסויים אלה כוללים ביטוי גנים מארח באמצעות ניתוחי qPCR יחידים ומרובים וזיהוי חלבון דלקתי באמצעות ELISAs. לסיכום, מודלים אפיתליים מספקים מערכות מבחנה שימושיות למחקרי מחקר פרה-קליניים לאינטראקציות פשוטות או מורכבות של מארח-פתוגן.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכות מודל במבחנה מספקות מיטות בדיקה מצוינות לחקירת אינטראקציות מארח-פתוגן. מערכות אורגנוטיפיות אלה שואפות לסכם את המיקרו-סביבה של נישות אקולוגיות שונות המועדות להפרעות מיקרוביאליות. מספר מאמרי מחקר פורסמו תוך שימוש במודלים של רקמות EpiSkin (לשעבר SkinEthic) כדי להעריך אינטראקציות מארח-פתוגן בחלל הפה 1,2,3,4,5, מחסום העור 6,7,8,9,10,11 ורירית הנרתיק 5,12,13בין היתר 14,15., בניגוד לתרבית תאים "דו-ממדית" או "דו-ממדית", המסתמכת על שימוש בשכבות חד-שכבתיות של קווי תאי אפיתל החשופים למיקרואורגניזמים, מודלים זמינים מסחריים אלה מורכבים משכבות מרובות של תאים מובחנים הגדלים בממשק אוויר-נוזל. למרות שהן זולות יותר ונחשבות לעתים קרובות ניתנות לשחזור יותר, מערכות תרבית דו-ממדיות מועדות לנזק תאי בתרבית עם מיקרואורגניזמים, מה שלא תמיד מייצג במדויק מחסומי אפיתל או רירית in vivo16,17.

עדויות עדכניות מראות שטכניקות תרבות "תלת מימדיות" או "תלת מימדיות" הופכות פופולריות יותר בדיסציפלינות מדעיות שונות, כולל מדעי הסרטן, מחקר תאי גזע וגילוי תרופות16,18. בהקשר של ביולוגיה של זיהום, ניתן להשתמש במודלים תלת מימדיים של רקמות לחקירות של אינטראקציות חיידקים-מארחים, פטריות או מינים מעורבים בממשק מחסום האפיתל או הרירית בתוך מיקרו-סביבה מבוקרת במבחנה. מודלים אלה מחזיקים ביתרונות רבים למערכות תרבית דו-ממדיות, המאפשרים הערכה של קולוניזציה ו/או פלישה של רקמות על ידי אורגניזמים פתוגניים או קהילות ביופילם מורכבות17, והערכת תגובות מארח ברמה מרובת רכיבים עבור סמנים ביולוגיים שונים שבהם מודלים דו-ממדיים מוגבלים לפעמים על ידי פרופילי השעתוק או הפרוטאומיקה שלהם 16,17,18. בסופו של דבר, היישומים הפרה-קליניים של מערכות תלת מימד כאלה הם עצומים, ומספקים נתוני מחקר חשובים שניתן לקחת קדימה למודלים in vivo או למחקרים קליניים.

בהקשר של בריאות הפה ומחלות, הבנת המסלולים הדלקתיים המעורבים במשטח רירית הפה חשובה לרופאים, מכיוון שהדבר עשוי לכוון את שיטות הטיפול. מחקרים קודמים הראו כי ביופילמים "הקשורים לבריאות" יכולים לעורר תגובות דלקתיות מינימליות 3,19,20,21. זה יכול לנבוע מעומס ביולוגי מיקרוביאלי נמוך יותר הקשור לבריאות הפה או בשל הרכב הביופילם עם Streptococcus spp. נחשב באופן נרחב למודולטוריחיסוני 22,23. מצד שני, ביופילמים המורכבים ממיקרואורגניזמים הקשורים למחלות כגון Fusobacterium nucleatum ו-Porphyromonas gingivalis הם פרו-דלקתיים באופיים 3,20,24,25,26,27. סקירה של Mountcastle et al. בשנת 2020 תיארה את כל המודלים הרלוונטיים של קו-תרבית שהיו קיימים באותה תקופה עבור המיקרו-סביבה האוראלית17. למרות שמודלים אורגנוטיפיים כאלה נמצאים בשפע, עם כמה שיוצרו מאז28,29, נותרו מספר מכשולים מאתגרים הקשורים ליצירת מודלים תלת מימדיים כאלה. אם להזכיר כמה, מודלים אלה דורשים אופטימיזציה משמעותית והם עתירי עבודה ומשאבים לייצור; יכולת השחזור יכולה להיות גם משתנה מאוד אלא אם כן נשלטת בקפידה16,17. מודלים זמינים מסחרית עוקפים בעיות כאלה, ומספקים פלטפורמות לחקירת אינטראקציות מארח-פתוגן בתוך חלל הפה ובנישות אקולוגיות אחרות בגוף האדם.

לסיכום, הפרוטוקול הנוכחי נועד להתוות את היישום של מודלים של רקמות אורגנוטיפיות לחקירת אינטראקציות מארח-פתוגן במבחנה בהקשר של בריאות הפה ומחלות. באופן ספציפי, מערכת המודל המתוארת משתמשת באפיתל אוראלי רב שכבתי זמין מסחרית החשוף לקהילת ביופילם מוגדרת המייצגת את המחלה הדלקתית בפה, דלקת חניכיים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הבא כולל הכנת ביופילם רב-מינים המייצג דלקת חניכיים, המכיל בסך הכל 7 מינים (spp.)7,30. שלושה סטרפטוקוקוס זנים, סטרפטוקוקוס מיטיס (NCTC 12261), סטרפטוקוקוס אינטרמדיוס (DSM 20753) וסטרפטוקוקוס אוראליס (NTCC 11427) כלולים כדי לחקות את בריאות הפה, ופועלים כמתיישבים ראשוניים של פליקל הרוק. לאחר מכן מתווספים ארבעה מיקרואורגניזמים אנאירוביים הקשורים למעבר מבריאות הפה למחלה: Veillonella dispar (NCTC 11831), Actinomyces naeslundii (DSM 17233), ושני Fusobacterium spp. Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953) ותת-מין Fusobacterium nucleatum (subspp.) vincentii (DSM 19507). כל השלבים המעורבים מבוצעים באופן אספטי בלהבה או בארון בטיחות מסוג II. כל המדיה ותמיסת מלח עם פוספט (PBS) המשמשים לתכשירים מיקרוביולוגיים עוברים חיטוי לפני השימוש, והסטריליות מוערכת במרווחי זמן קבועים במהלך הפרוטוקול. פרטי הריאגנטים והציוד המשמש במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת קהילות מיקרוביאליות לתרבית משותפת

הערה: פרוטוקול זה מתאר יצירת ביופילם רב-מינים המייצג קונסורציום הקשור לדלקת ברקמת החניכיים, הידועה גם בשם דלקת חניכיים. מודל כזה שימש להערכת תגובת המארח בבריאות הפה ובמחלות, כפי שתואר קודם לכן3.

  1. החיו את כל שלושת מיני הסטרפטוקוקוס על צלחות אגר דם (בסיס אגר דם קולומביה המכיל 5% דם סוס דפיברין סטרילי) ממאגרים קפואים של חרוזים נקבוביים (שהושגו מסחרית) המכילים את המיקרואורגניזמים המאוחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. זה מושג על ידי שימוש בלולאת חיסון ובטכניקת צלחת הפסים.
    1. יש לדגור במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, ולאחר מכן לבודד 3-4 מושבות להפצה ל-10 מ"ל של מדיום מרק סויה טריפטון. מרק תרבית למשך 16-18 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
  2. עבור פתוגנים ביניים, החיו את V. dispar, A. naeslundii, F. nucleatum ו- F. nucleatum subspp. vincentii באופן אנאירובי על בסיס אגר אנאירובי קפדני המכיל 5% דם סוס דפיברין סטרילי למשך 48 שעות ב-37 מעלות צלזיוס, לפני תרבית במרק של שאדלר למשך 24-48 שעות נוספות באותם תנאים.
  3. לאחר הצמיחה, תרחיפי תאי גלולה על ידי צנטריפוגה למשך 5 דקות, 20 מעלות צלזיוס ב-3000 x גרם, ואז שטפו כדורים ב-10 מ"ל של PBS סטרילי (pH 7.2-7.6). מתלי תאי גלולה שוב באמצעות צנטריפוגה למשך 5 דקות, 20 מעלות צלזיוס ב-3000 x גרם, ולאחר מכן חזור על שלבי הכביסה בפעם השנייה. השעו מחדש תאים שטופים ב -10 מ"ל של PBS סטרילי לצורך סטנדרטיזציה.
  4. תקנן את כל שלושת הסטרפטוקוקוס בנפרד באמצעות ספקטרופוטומטר ב-550 ננומטר. ערכי ספיגה של 0.50 (נעים בין 0.45-0.55 מקובלים) מעידים על ספירת תאים של ~1 x 108 תאים/מ"ל, כפי שנקבע בעבר באמצעות טכניקת ספירת התאים של מיילס ומיסרה31. כדי להשיג קריאת ספיגה זו, יש לדלל עוד יותר 10 מ"ל של מתלי תאים שטופים ב-PBS סטרילי.
  5. לאחר הסטנדרטיזציה, יש לדלל את כל הסטרפטוקוקוס 1:10 עד 1 x 107 תאים/מ"ל בתערובת של 1:1 של מרק טוד יואיט (THB) ומכון רוזוול פארק ממוריאל (RPMI). הוסף 500 מיקרוליטר של תרחיפי תאים על ידי פיפטינג ללוחית תרבית רקמה מיקרוטיטר בעלת 24 בארות המכילה דיסק הידרוקסיאפטיט בקוטר 13 מ"מ. השאירו את הביופילמים להתבגר במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
    הערה: ניתן לגדל ביופילמים מרובי מינים על מצעים שונים הרלוונטיים לפה כגון אמייל, דנטין32 ומשטחי תותבות פולי (מתיל מתאקרילט)33,34. ניתן להשתמש גם במדיה חלופית עבור מודלים אלה, כגון רוק מלאכותי או סינתטי, אם כי יש לשקול היטב בהתאם לקונסורציום המיקרואורגניזמים המשמשים: מחקרים הראו שלבחירת אמצעי גידול יש השלכות חשובות על צמיחת ביופילם בקהילה מעורבת35,36.
  6. למחרת, תקנו את ארבעת המיקרואורגניזמים האנאירוביים באופן דומה לאמור לעיל (שלבים 1.2-1.4). תרחיפי תאי גלולה, שטפו פעמיים, ואז תקנו את V. dispar ל-0.50 ספיגה (טווח בין 0.45-0.55) ואת שלושת המיקרואורגניזמים הנותרים לספיגה של 0.20 (טווח בין 0.18-0.22). לאחר הסטנדרטיזציה, יש לדלל עוד יותר את כל המתלים 1:10 עד 1 x 107 תאים/מ"ל בתערובת של 1:1 של THB ו-RPMI.
  7. הסר בזהירות תאים שאינם דבוקים ומדיה משומשת והשליך אותם מהביופילמים של סטרפטוקוקוס על ידי פיפטינג. החלף בארות צלחת מיקרוטיטר ב-500 מיקרוליטר של מתלים סטנדרטיים של 1 x 107 תאים/מ"ל של ארבעת האנארובים. תרבית ביופילמים למשך 24 שעות בתנאים אנאירוביים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  8. לאחר 24 שעות, הסר תאים לא דבוקים ומדיה משומשת מהביופילמים של 7 המינים והחלף ב-500 מיקרוליטר של תערובת סטרילית 1:1 של THB: מדיה RPMI. ביופילמים נותרים להתבגר באופן אנאירובי ב-37 מעלות צלזיוס למשך 4 ימים, כאשר המדיה מוסרת ומתחדשת על בסיס יומי (ארבעה החלפות מדיה בסך הכל).
  9. ביום השביעי, הביופילם הרב-מיני בוגר לחלוטין ומוכן לניסויים במורד הזרם. שטפו ביופילמים פעמיים עם 500 מיקרוליטר PBS סטרילי לשימוש בתרבית משותפת.
    הערה: ניתן לאפיין ביופילמים באמצעות מגוון מתודולוגיות ביולוגיות כגון qPCR (להערכת הרכב) ופרופיל מיקרוסקופי עם מיקרוסקופיה קונפוקלית או אלקטרונים כפי שתואר קודם לכן3.

2. טיפול ברקמות אורגנוטיפיות והגדרת ניסויים

הערה: המערך הניסיוני המתואר להלן כולל רקמת אפיתל אוראלי אנושי (HOE) המורכבת מתאי TR146 המעובדים על מסנן ממברנה פוליקרבונט אינרטי. קיימים מודלים אחרים, כולל מודלים של אפידרמיס, שלפוחית השתן, הוושט, הקרנית, החניכיים ואפיתל הנרתיק. כל המודלים מטופלים ומוכנים באופן דומה לזה המתואר להלן לחקירת אינטראקציות מארח-פתוגן.

  1. עם ההגעה, הוציאו את האריזה והעבירו את הטישו והמדיה של HOE לארון בטיחות Class II. הוסף בסך הכל 1 מ"ל של אמצעי תחזוקה המסופקים עם הרקמה לצלחות של 12 בארות.
  2. הסר תוספות פוליקרבונט המכילות את ה-HOE עם פינצטה סטרילית מצלחות 24 הבארות והאגר התזונתי המשמש למשלוח והעבר אותם לצלחות 12 הבארות המכילות את המדיה, וודא שלא יישארו בועות אוויר מתחת לרקמה. ודא שכל אגר עודף המחובר לדפנות או לתחתית התוספות מוסר בזהירות באמצעות פינצטה נוספת או נייר טישו.
  3. דגירה של דגמי רקמות למשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 לפני הגדרת הניסוי כדי להתאקלם לתנאי המעבדה לאחר המשלוח. ראוי לציין כי אמצעי תחזוקה נוספים או אמצעי גידול זמינים לתחזוקה ארוכה יותר או להבשלה נוספת של דגמי הרקמות.
  4. כעת ניתן לערוך ניסויים בתרבות משותפת. לדוגמא המובאת כאן, הסר את הביופילמים של 7 המינים שנוצרו לעיל (שלבים 1.1-1.9) מהמצעים שלהם על ידי סוניקציה. כדי להשיג זאת, הסר דיסקי HA המכילים ביופילמים מתחתית צלחות 24 בארות באמצעות מחט 19 גרם ופינצטה, ולאחר מכן העביר ביז'ו המכיל 1 מ"ל של PBS סטרילי של Dulbecco. סוניקציה ב -35 קילוהרץ למשך 10 דקות באמבט מים סוניקציה.
  5. הסר בזהירות תוספות המכילות את דגמי הרקמות באמצעות פינצטה מההתאקלמות הלילית, והוסף 100 מיקרוליטר של תרחיף סוניקט ביופילם ישירות לרקמה על ידי פיפטינג. השתמש ברקמות בקרה לא מגורות למטרות השוואתיות. עבור תוספות רקמת בקרה אלה, הוסף 100 מיקרוליטר של PBS סטרילי של Dulbecco ללא תרחיף הביופילם.
    הערה: ניתן להשתמש בתאים פלנקטוניים, סופרנטנטים ביופילם משומשים המכילים תאים מפוזרים, או ביופילמים שלמים למודל התרבות המשותפת במקום סוניקט ביופילם. יישומים שונים עבור מודלים אלה של פתוגן מארח המשתמשים בממריצים מיקרוביאליים שונים משורטטים באיור 1 כפי שתועד במקום אחר 3,5,6,8,13,37,38.
  6. לאחר התוספת, העבירו את התוספות לצלחת נוספת של 12 בארות המכילה 1 מ"ל של אמצעי תחזוקה טריים, ושוב הבטיחו שאין בועות אוויר מתחת לתוספות. דגירה של צלחות המכילות דגמי רקמות למשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 לפני עיבוד רקמות ליישומים במורד הזרם.
    הערה: ספקי רקמות יכולים לספק מדיה נוספת כדי לתמוך בהמשך התרבית של הרקמה לאחר חשיפה לאגרגטים סוניקטיביים או ביופילמים. לשם כך, פורסמו מספר מודלים קודמים שחקרו חיסון ממושך של רקמות ביופילם 21,28,39. כדי להשיג תוצאות דומות באמצעות המודל האורגנוטיפי הנוכחי, סוניקציה של הרקמה (כנ"ל, שלב 2.6) והשאיר את המיקרואורגניזמים להיצמד למשך 24 שעות. השליכו את כל ההשעיה המיקרוביאלית שנותרה והמשיכו בתרבית בממשק האוויר-נוזל למשך מהלך הזמן הניסיוני הנדרש.

3. עיבוד רקמות לתפוקות ניסיוניות

הערה: בעקבות תרבית משותפת, מודלים של רקמות מעובדים לתפוקות ניסיוניות. השלבים הבאים מתעדים כיצד RNA מופק מהרקמה לצורך פרופיל שעתוק, וכיצד נעשה שימוש במדיה של רקמה מבוזבזת לזיהוי חלבונים. רקמה עשויה להיות מקובעת גם בפורמלין, פרפורמלדהיד או קיבוע דומה להערכה היסטולוגית, כפי שתואר קודם לכן 3,6.

  1. ראשית, הכינו 350 מיקרוליטר של מאגר ליזה RLT בצינורות O-Ring עם מכסה בורג של 2.0 מ"ל המכילים 1% של β-מרקפטואתנול ו~100 מיקרוליטר שווה ערך לחרוזי זכוכית שטופים בחומצה של 0.5 מ"מ.
  2. הסר את התוספות המכילות את הרקמה מהמדיה באמצעות פינצטה, והשליך את כל התרחיף המיקרוביאלי שנותר מהתצוגה. לאחר מכן, החזיקו, הפוך, בגובה העיניים לנוחיותכם. בעזרת מחט של 19 גרם, פורסים בזהירות את הרקמה והממברנה מתחתית התוספת ומעבירים למאגר RLT.
    1. הומוגניזציה של רקמות ב-30 שניות באמצעות הומוגנייזר מקצף חרוזים שולחני, ולאחר מכן חלץ RNA מהליזאט בהתאם להוראות היצרן של ערכת מיצוי ה-RNA (ראה טבלת חומרים).
      הערה: RNA מופק משמש לסינתזת cDNA כדי לאפיין את הביטוי של גנים ציטוקינים וכימוקינים כסמנים לדלקת באמצעות PCR כמותי (qPCR) או ריצוף RNA. qPCR מושג באמצעות מערכי מולטיפלקס כגון מערך פרופילי RT2 PCR המכיל בארות עם פריימרים מוכנים לגנים ספציפיים, או ריאגנט ירוק SYBR עם רצפי פריימר מעוצבים פנימיים ו-ddH2O3 ללא נוקלאז.
  3. אסוף את מדיית הרקמה המושקעת הנותרת (~850-900 מיקרוליטר) לניתוחים פרוטאומיים באמצעות מתודולוגיות בעלות תפוקה נמוכה וגבוהה כגון ELISAs, בדיקות אימונולוגיות מרובות או ניתוח סמנים ביולוגיים של חלבון מרובה7.
  4. באמצעות מדיית הרקמה המושקעת, העריכו מגוון סמנים הקשורים לדלקת ברמת החלבון. ניתן להשתמש ישירות במדיה משומשת עבור המתודולוגיות לעיל (שלב 3.3) או לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס או -80 מעלות צלזיוס. הימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה מרובים של המדיה לצורך ניתוחים כאלה.
    הערה: ייתכן שיהיה צורך לדלל את המדיה ביחס של 1:10 בהתאם לממריץ הרקמות לפרופיל פרוטאומי מדויק באמצעות ELISAs.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בניסוי זה, HOE נחשף ל-7 מינים של ביופילם סוניקט המכיל אורגניזם המייצג את המעבר מבריאות הפה לדלקת חניכיים (המכונה דלקת חניכיים). מחלה זו נובעת מדלקת ברקמת האפיתל של החניכיים או הפה עקב הפרעות מיקרוביאליות מהצטברות רובד שיניים על פני השן. לאחר גירוי, רקמות ומדיה משומשת משמשים לניתוחים שעתוק ופרוטאומיים, כפי שנדון לעיל. עבור ניסוי זה, ביטוי גנים של פאנל של סמנים ביולוגיים דלקתיים זוהה ברקמה לאחר גירוי באמצעות ביופילם סוניקט (איור 2). זה הושג על ידי שימוש במערך פרופיל RT2 PCR מותאם אישית המכיל 16 גנים שונים, וביטוי הגנים הוצג כשינוי קפל ביחס לרקמה לא מגורה לאחר נורמליזציה לגן משק הבית GAPDH. גירוי מיקרוביאלי הגדיל את הביטוי של כל הגנים למעט CXCL5, עם הבדלים סטטיסטיים שנצפו עבור NFKB, CCL2, CXCL1, CXCL3, CSF2, CSF3, TNF, IL1A, IL1B ו-TLR4 (איור 2A). השינוי הגדול ביותר בקיפול נצפה עבור CCL2, CXCL1 ו-CSF3, עם עליות של 16.9, 10.3 ו-15.1, בהתאמה (איור 2B).

מדיה HOE משומשת שימשה לניתוחים פרוטאומיים כדי לזהות חלבונים המיוצרים ומשתחררים על ידי הרקמה לאחר גירוי. זה שימושי לקביעה אם ביטוי גנים נמצא בקורלציה עם ייצור חלבון. לשם כך, ביטוי הגן IL8 ושחרור חלבון IL-8 הוערכו ברקמת בקרה וברקמה מגורה של ביופילם-סוניקט (איור 3). ביטוי הגנים הוערך באמצעות qPCR מבוסס ירוק SYBR עם פריימרים עבור IL8 ו-GAPDH כפי שתואר קודם לכן3. ביטוי ה-mRNA של IL8 ב-HOE גדל פי 8.67 בעקבות גירוי עם ביופילם סוניקט (איור 3A). ברמת החלבון, רמות IL-8 כומתו באמצעות ערכת IL-8 ELISA. ריכוז ה-IL-8 במדיה המושקעת הועלה מ~1.005 ננוגרם/מ"ל ברקמת הבקרה ל~4.245 ננוגרם/מ"ל ברקמה מגורה ביופילם-סוניקט (איור 3B).

figure-results-1
איור 1: יישומים שונים עבור מודלים של תרבית משותפת של רקמות אורגנוטיפיות. תרחיפים סטנדרטיים של מיקרואורגניזמים מוחלים ישירות על הרקמה כדי לחקור אינטראקציות בין מינים למארח (A). אלה משמשים לעתים קרובות להערכת קולוניזציה מיקרוביאלית על פני פרק זמן קצר (למשל, <24 שעות). ביופילמים מורכבים עוברים סוניקציה כדי לחקור את ההשפעות של תאים מפוזרים או אגרגטים של ביופילם על הרקמות (B). זה חשוב מכיוון שבעבר הוכח כי לתאים כאלה יש פנוטיפים ייחודיים בהשוואה לעמיתיהם הפלנקטוניים או הביופילמים; לשם כך, ניתן להוסיף ביופילמים שלמים ישירות לרקמה באמצעות תוספות קטנות נוספות כדי ליצור חשיפה סמוכה עם המארח (C). לבסוף, תאים פלנקטוניים מתווספים לרקמה במצע תרבית מתאים כדי להעריך קולוניזציה מיקרוביאלית, היווצרות ביופילם ודינמיקת גדילה על הרקמה (D). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: ביטוי גנים של רקמת HOE לאחר גירוי עם ביופילם סוניקט של 7 מינים. שינוי קפל ביטוי mRNA של סך של 15 גנים דלקתיים מנורמלים לגן משק הבית, GAPDH, ברקמת HOE בבקרה, דגימות לא מגורות ואשר נחשפו ל-100 מיקרוליטר של 7 מינים ביופילם סוניקט (A). שלושת הגנים (CCL2, CXCL1, CSF3) עם השינויים הגבוהים ביותר בביטוי mRNA מוצגים ב-(B). ניתוחים סטטיסטיים נערכו באמצעות מבחן T פרמטרי לא מזווג, עם שינויים מובהקים שתוארו כ-*p <-0.05, **p <-0.01 ו-***p <-0.001, בהתאמה. הנתונים שורטטו ונותחו באמצעות תוכנות סטטיסטיות וגרפיות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: ביטוי גן IL8 ורמות חלבון IL-8 המיוצרות על ידי רקמת HOE. שינוי קפל ביטוי mRNA של IL8 ברקמת HOE כפי שנקבע על ידי רמות qPCR (A) ו-IL-8 מבוססות ירוק של SYBR שכומתו ממדיה של רקמה מבוזבזת באמצעות מתודולוגיית ELISA (B). ניתוחים סטטיסטיים נערכו באמצעות מבחן T פרמטרי לא מזווג, עם שינויים משמעותיים שתוארו כ-*p <-0.05 ו-****p <-0.0001, בהתאמה. הנתונים שורטטו ונותחו באמצעות תוכנות סטטיסטיות וגרפיות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, מתוארות מתודולוגיות לייצור מודל ביופילם מורכב רב-מינים המייצג דלקת חניכיים לתרבית משותפת עם רקמת HOE כדי להעריך את תגובת המארח לאחר גירוי מיקרוביאלי. ניתן להתאים פרוטוקול זה לשימוש בחקירת אינטראקציות מארח-פתוגן בין תאים פלנקטוניים, ביופילמים של מינים בודדים, כפולים או מעורבים, או תאים מפוזרים ביופילם עם רקמת אפיתל מנישות אקולוגיות שונות בגוף האדם. השימוש במודלים של רקמות לחקירת אינטראקציות מארח-פתוגן מספק התקדמות חשובה למערכות קודמות של תרבית משותפת המוגבלות לחד-שכבות דו-ממדיות שלא תמיד מסכמות באמת את המצב in vivo, לפיו רקמת אפיתל מכילה שכבות תאים מרובות 16,17,18. יתר על כן, אתגרים הקשורים לגידול במבחנה של מודלים של רקמות רב-שכבתיות הם בשפע, עם שימוש בקווי תאים מרובים ו/או צמיחה של שכבות תאים בממשק אוויר-נוזל הנוטה לזיהום. הרקמות הזמינות מסחרית מספקות פלטפורמה הניתנת לשחזור עם מודלים באיכות גבוהה באופן עקבי הניתנים להשוואה בין שכפולים לאצווה, כפי שהוצג בפרסומים קודמים 3,7.

עבור הסעיף "הכנת קהילות מיקרוביאליות לתרבית משותפת", הכללת מיקרואורגניזמים אלה למודל דלקת חניכיים בת 7 מינים נבחרה על סמך קומנסלים ופתוגנים שזוהו בדרך כלל הקשורים למעבר מבריאות הפה למחלה. כמו בכל מערכות מודל הביופילם המורכבות במבחנה, הכללת מיקרואורגניזמים מכוונת על ידי מחקרי מיקרוביום הקשורים לנישה האקולוגית הבריאה או החולה המסוימת. לשם כך, אנו ואחרים דיווחנו על שימוש במודל ביופילם הקשור לבריאות הפה המכיל מיקרואורגניזמים קומנסליים (למשל, סטרפטוקוקוס ורותיה spp.)3,40,41. יתר על כן, ניתן להוסיף פתוגנים נוספים למודלים אלה כדי ליצור ביופילמים הקשורים למחלות אחרות. לדוגמה, ניתן להוסיף שלושה מיקרואורגניזמים ל-7 המינים המתוארים כאן כדי ליצור מודל מחלה הקשור לדלקת חניכיים3, בעוד שניתן להוסיף את הפתוגן הפטרייתי קנדידה אלביקנס כדי להגביר את הפולימיקרוביאליות וכן להוסיף שכבה של מורכבות בין-ממלכתית33. ואכן, לקידום אינטראקציות פטרייתיות-חיידקיות יכולות להיות השלכות עצומות על תפוקות ניסיוניות שונות המשתמשות במודלים כאלה של ביופילם במבחנה בהשוואה לביופילם חיידקיבלבד 42. בסופו של דבר, מומלץ מאוד לנקוט בשיקול דעת בעת יצירת מודל ביופילם רב-מינים חדש למחקרים כאלה. בעוד שהמיקרואורגניזמים הכלולים אמורים להיות ניתנים לזיהוי בקלות מחיפושי ספרות נרחבים, עבור רוב הנישות ו/או המחלות, אלה עשויים שלא להשתלב היטב במודל מורכב במבחנה מסיבות שונות. להלן כמה שיקולים פוטנציאליים אחרים שיש לקחת בחשבון:

דינמיקת היווצרות ביופילם
היווצרות ביופילם in vivo כרוכה לעתים קרובות בהתיישבות מוקדמת, בינונית ומאוחרת על ידי מיקרואורגניזמים מסוימים. היווצרות רובד שיניים על-חניכיים ותת-חניכיים מאופיינת במידה רבה בהצמדה ראשונית של פליקל הרוק שנמצא על האמייל על ידי מינים חלוציים (למשל, מיני סטרפטוקוקוס ), עם פתוגנים בינוניים ומאוחרים יותר הדורשים אותם כפיגום להתיישבות43. תופעה דומה הוצעה בסביבת הנרתיק במהלך וגינוזיס חיידקי, לפיה מאמינים שגרדנרלה וגינליס היא המתיישבת הראשונית, ואחריה אנאירובים עוקבים44. עם זאת, חשוב לציין כי ייתכן שזה לא המקרה עבור מחלות אחרות בנישות אקולוגיות אחרות.

צפיפות זריעה לכל מיקרואורגניזם
למיקרואורגניזמים יהיו גדלים ו/או דינמיקת גדילה שונים כאשר הם מתורבתים במבחנה; לכן, חשוב לקחת זאת בחשבון במהלך תהליך התקינה. לדוגמה, C. albicans הוא פי 100-150 מגודל תאי חיידקים45,46, ולכן הוא עשוי להצדיק תוספת בריכוז נמוך יותר, למשל, 1 x 106 תאים למ"ל, למודלים כאלה של ביופילם.

אנטגוניזם מינים
מיקרואורגניזמים מסוימים (כולל אותו מין אך מבודדים שונים, זנים מעבדתיים ו/או קליניים) המשמשים למודלים אלה עשויים להתחרות באחרים במהלך היווצרות ביופילם, מה שמוביל לעיכוב הצמיחה של כמה מינים מיקרוביאליים47. מחקר של Sadiq et al. הדגיש כיצד שילובים שונים של מיקרואורגניזמים יכולים להשפיע על ביומסה של ביופילם הנובעת מסינרגיה מיקרוביאלית (או אנטגוניזם)48. למרות שחקירת אינטראקציות כאלה בתוך מודל ביופילם עשויה לעניין קבוצות מחקר (למשל, בדיקת טיפול מקדים או פרוביוטי), אחרים עשויים שלא להסביר אנטגוניזם כזה, מה שעלול להשפיע על מורכבות מרובת מינים בעת יצירת המודל.

משך הבשלת הביופילם
זה קריטי לייעל את מסגרות הזמן להבשלה של ביופילם מכיוון שזה יכול להיות תלוי בדינמיקת הצמיחה של המיקרואורגניזמים הכלולים ובמערכת המודל (כולל שכבות תחתון) המשמשת לתרבית. זמני התבגרות ארוכים יותר יכולים לגרום להתיישבות טובה יותר עבור פתוגנים מאוחרים יותר, אך יותר מוות של תאים בתוך המודלים, במיוחד של המתיישבים המוקדמים יותר. לעומת זאת, זמני דגירה קצרים יותר יכולים להיות חשובים אם רוצים לחקור את ההשפעות של מודלים לא בשלים של ביופילם על המארח. מחקר של בראון ועמיתיו תיאר כיצד לאותו מודל ביופילם פצע של 10 מינים היו פרופילים דלקתיים שונים בתאי THP-1 אנושיים כאשר התבגרו במשך 24 שעות, 48 שעות ו-72 שעות, מה שמצביע על כך שככל שהביופילם פחות בוגר, כך הוא יותר פרו-דלקתי7. ניתן היה לראות תוצאות דומות במודלים של רקמות רב-שכבתיות. חשוב גם לציין ששינויים יומיומיים קבועים במדיה הם הכרחיים כדי למזער את מוות התאים בביופילם, אם כי ניתן לשנות זאת בהתאם למשטרי הטיפול המתמשכים, למשל, אם מעריכים את ההשפעות של התערבויות אנטי-מיקרוביאליות ממושכות.

עבור הסעיף "טיפול ברקמות אורגנוטיפיות, הגדרת ניסוי ועיבוד רקמות", ניתן להתאים את מסגרות הזמן של הדגירה בהתאם לצרכי החוקר. ניתן לחקור אינטראקציות מארח-פתוגן בנקודות זמן מוקדמות יותר, למשל, 1-12 שעות, לנקודות זמן מאוחרות יותר של 48 שעות ו-72 שעות, בהתאם לשאלת המחקר. שנית, כל אמצעי התחזוקה המכילים אנטיביוטיקה מסופקים; לפיכך, יש להגיש בקשות לחברה עם ההזמנה להסיר אותן בהתאם לתכנון הניסוי. למרות שהמדיה שמתחת לתוסף אינה באה במגע ישיר עם הפריפריה העליונה של הרקמה, אלא אם כן נגרם פצע במודל 6,8, הסרת אנטיביוטיקה עשויה להיות ראויה לשקול אם חוקרים פלישה מיקרוביאלית לרקמה.

ניתן גם לשנות את החומר המיקרוביאלי המשמש לגירוי תרבית משותפת, כפי שנדון לעיל, עם היכולת להעריך סופרנטנטים פלנקטוניים, ביופילם משומש (מסוננים ולא מסוננים), ביופילמים שלמים או דגירות סוניקט של ביופילם עם הרקמה. לדוגמה, עדויות קודמות הראו כי מודלים של רקמות כמו אלה שסופקו על ידי EpiSkin מספקים מודלים שימושיים לחקירת אינטראקציות פטרייתיות פלנקטוניות: C. albicans, Candida auris, Malassezia furfur ותאי Trichophyton rubrum הוכחו כמתחברים ומקיימים אינטראקציה עם שכבות רקמה היקפיות ב-HOE, אפידרמיס אנושי משוחזר (RHE) או אפיתל נרתיקי אנושי, כאשר חלק מהמחקרים הללו הראו גירוי של תגובת המארח בעקבות זיהום פטרייתי 1,5,6,11,12,49. פרסומים דומים קיימים עבור אינטראקציות חיידקים-מארחים, למשל, היווצרות ביופילם של Cutibacterium acnes, פתוגן נפוץ הקשור למיקרוביוטה של הקרקפת בקשקשים, נחקר על פני השטח של RHE, כאשר הוא מתורבת לבד ועם אורגניזם העור הפטרייתי, Malassezia restricta10. אחרים חקרו את היכולת של Staphylococcus spp. להיצמד ל-RHE, ומדדו את המאפיינים הפיזיקוכימיים והמיקרוביולוגיים של אינטראקציה חיידקית-מארח זו50. N'Diaye והמחברים השותפים חקרו כיצד הנוירופפטיד שמקורו באדם, Calcitonin Gene-Related Peptide, השפיע על אלימות Staphylococcus aureus במודל הרקמה RHE51. אחרים חקרו את ההשפעות המגנות של התערבויות פרוביוטיות על זיהום Pseudomonas aeruginosa של אפיתל14 בקרנית האנושית. בינתיים, מנקודת מבט פולימיקרוביאלית, קבוצות שונות חקרו את ההשפעות של ביופילמים של מינים מעורבים על מצעי רקמה שונים 2,3,7,13.

בסך הכל, פרוטוקולים ומחקרים אלה שהוזכרו לעיל מתעדים את המגוון העצום של יישומים עבור מודלים של רקמות אורגנוטיפיות לחקירת אינטראקציות מארח-פתוגן. למרות שמחקרים הראו שלדגמי EpiSkin, במיוחד למודל העור RHE, יש ישימות טובה לבדיקת מוצרים קוסמטיים לקורוזיה/גירוי 52,53,54,55, קיימות מגבלות מסוימות בין אלה לבין צמחי רקמות ex vivo בעולם האמיתי או ספקים אחרים של רקמות זמינות מסחרית 56,57. מגבלה ברורה אחת תהיה שכל דגמי הרקמה הזמינים מסחרית נוצרים מקווי תאים בסביבה סטרילית ו"נטולת חיידקים", כלומר הרקמה מעולם לא נחשפה להפרעות מיקרוביאליות: זה עלול להחמיר כל תגובה דלקתית במארח, הרבה מעבר למה שניתן לראות בגוף החי או בעקבות גירוי של רקמות ex vivo 57. לעומת זאת, מערכות מודל מעבדה אלה לא יכילו שכבות חיבור או כלי דם בסיסיים שניתן לשייך אליהם רקמת in vivo, מאפיינים שניתן לשמר במהלך הוצאת רקמות ex vivo ותכונות המשפיעות על תגובות דלקתיות. ואכן, סקירה שיטתית שנערכה לאחרונה הדגישה כי יש לשקול היטב להשתמש במודלים של רקמות עם כלי דם מתאימים שנוצרו באמצעות טכנולוגיות הנדסיות שונות, כולל ביו-חומרים58. לדוגמה, מחקר שנערך לאחרונה השתמש במטריצה מבוססת פיברין המוטמעת בפיברובלסטים חניכיים ותאי אנדותל מיקרו-וסקולריים כדי ליצור מקבילה לרקמת חניכיים וסקולרית. המחברים תיארו תגובה דלקתית דיפרנציאלית במודל בעקבות חשיפה למיקרואורגניזמים בריאותיים או הקשורים למחלה59. מנקודת מבט מסחרית, קיימים כיום מודלים מורכבים יותר, כמו "מודל T-Skin", המכיל רקמה בעובי מלא המורכבת מדרמיס המורכב מפיברובלסטים המכוסים באפידרמיס. יהיה מעניין לראות כיצד מודלים מורכבים כאלה משתווים למערכות האפידרמיס בלבד.

בעוד שאף מודל אינו מושלם, מודלים של רקמות אורגנוטיפיות מייצגים חלופות מבטיחות לניסויים פרה-קליניים, התואמים את המסגרת המתוארת על ידי שלושת ה-R, להחלפה, הפחתה ועידון בביצוע מחקר בבעלי חיים. למטרה זו, אף על פי שמודלים של בעלי חיים מספקים תובנות חשובות לגבי האופי הפתופיזיולוגי המורכב של מחלות אנושיות הקשורות לביופילם, יש להם חסרונות ברורים. מודלים תלת-ממדיים אלה ניתנים למניפולציה בקלות, ומאפשרים שינויים גדולים ועדינים בחקירות ללא אישור אתי. שילוב מודלים אלה עם מערכות ביופילם מורכבות קיימות שתוארו לעיל יכול לשפר מאוד את הבנתנו את האינטראקציות בין מארח-פתוגן ולחזות טוב יותר את הצלחתם של טיפולים חדשים לפני חקירות in vivo .

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות ל-Haleon על תמיכתה במימון סעיד אל-קחטאני להפעלת פרויקטים נלווים הקשורים למודלים של הרקמות המתוארות, כמו גם למשרד החינוך בערב הסעודית למימון הדוקטורט של מוהנא אל-שהרי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
דיסקיות הידרוקסיאפטיט (HA) 13 מ"מPlasma Biotal Limitedn/a (מיוצר לפי הזמנה)מצע ליצירת ביופילם דרך הפה, המחקה את פני השן
מחט 19 G (40 מ"מ) VWR613-2028משמש לסיוע בהסרת דיסקי HA מהצלחות ולחיתוך רקמות מתוספות
24 צלחות מיקרוטיטר תחתונות שטוחות שטופלו היטב ב-TC עם מכסים ציוד מעבדה מדעית3524 (חבילה של 100)צלחות לתרבית ביופילמים וניסויי תרבית משותפת של רקמות
חרוזי זכוכית שטופים בחומצה (425-600 μ m)Merck: Sigma-AldrichG8772לליזה של רקמות לשיפור התפוקה של מיצוי RNA   
Actinomyces naeslundii DSM 17233 מכון לייבניץ DSMZn/aאחד המיקרואורגניזמים המשמשים למודל הביופילם המורכב
Bead Mill 24 Homogenizer (או שווה ערך) פישר סיינטיפיק15-340-163לליזה של רקמות לשיפור התשואה של מיצוי RNA   
ביז'וקס  (7 מ"ל)גריינר ביו-וואן189170 (700 לשקית)משמש לסוניקציה של ביופילם   
ערכת סינתזת cDNA (קיבולת גבוהה)Thermo Fisher Scientific4368814 (ל-200 תגובות)סינתזת cDNA מרקמת RNA
קולומביה דם אגר (CBA) בסיס תרמו פישר סיינטיפיקCM0331B (עבור 500 גרם)משמש להכנת צלחות CBA לגידול מיקרואורגניזמים אירוביים
דפיברין דם סוסE& O מעבדותDHBמשמש להשלמת לוחות CBA ו-FAA לגידול מיקרואורגניזמים אירוביים ואנאירוביים
תמיסת מלח פוספט (dPBS: ללא CaCl2 ו-MgCl2)Merck: Sigma-AldrichDB537dPBS לתרבית תאים משותפת עם ביופילם סוניקט
Fusobacterium nucleatum ATCC 10953אוסף תרביות מסוג אמריקאיn/aאחד המיקרואורגניזמים המשמשים למודל הביופילם המורכב
Fusobacterium nucleatum subspecies (subspp.) vincentii DSM 19507Leibniz Institute DSMZn/aאחד המיקרואורגניזמים המשמשים למודל הביופילם המורכב
GraphPad Prism (גרסה 10)GraphPad Software, Incn/aליצירת גרפים וניתוח נתונים 
ערכת ELISA אנושית IL-8 (ערכת ELISA לא מצופה עם צלחות)Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)88-8086-86 (עבור 10 x 96 בדיקות)ערכת ELISA וצלחות להערכת חלבון של מדיה רקמה מבוזבזת
אפיתל אוראלי אנושי (HOE) Episkinn/a (מיוצר לפי הזמנה)רקמת האפיתל המשמשת למערכת מודל התרבות המשותפת
לולאות חיסון (חד פעמי, 10 ומיקרו; L, או שווה ערך) 12870155 פישר סיינטיפיק(חבילה של 1000)לתרבית מיקרוביולוגית במדיה מוצקה ונוזלית
MicroAmp תגובה מהירה 96 בארות qPCR לוחות (0.1 מ"ל) Thermo Fisher Scientific4346907 (ל-10 צלחות)לפרופיל ביטוי גנים qPCR של חרוזי מיקרובנק של רקמות
Pro-Lab DiagnosticsPL.170אחסון ושימור מיקרואורגניזמים 
מים ללא נוקלאזThermo Fisher ScientificAM9935 (10 x 1.5 מ"ל)מים בדרגת RT-PCR לניסויי qPCR 
צלחות פטרי (90 מ"מ)פישר סיינטיפיק (סטרילין) 11309283 (חבילה של 500)משמש להכנת צלחות אגר לתרבית מיקרוביאלית
מלח חוצץ פוספט (PBS)Thermo Fisher Scientific 18912014 (חבילה של 100 טבליות)PBS לסטנדרטיזציה של מיקרואורגניזמים ושלבי שטיפת ביופילם
ערכת מיני RneasyQiagen74106 (ל -250 תגובות)ערכת מיצוי RNA מבוססת עמודות לרקמות 
מכון הזיכרון רוזוול פארק 1640 בינוניMerck: Sigma-AldrichR7755-10L (עבור 10 ליטר) מדיה לתרבות ביופילם 
מערך פרופיל RT2Qiagen330171 (בהתאמה אישית)מערך qPCR המכיל פריימרים מוכנים לפרופיל ביטוי גנים
בסיס אגר אנאירובי SchaedlerMerck: Sigma-Aldrich (Millipore)91019 (עבור 500 גרם)משמש להכנת צלחות אגר אנאירוביות מהירות 
מרק אנאירובי שאדלרתרמו פישר סיינטיפיק CM0497B (עבור 500 גרם)מדיה נוזלית לגידול מיקרואורגניזמים אנאירוביים
צינור טבעת O-Ring עם מכסה הברגה Scientific Laboratory SuppliesZ763837-1000EA (חבילה של 1000)לשימוש ב-Bead Mill 24 הומוגנייזר, לליז רקמות
אמבט סוניקציהFisher Scientific (Fisherbrand)n/aלסוניקציה של ביופילמים מדיסקי HA 
סטרפטוקוקוס אינטרמדיוס DSM 20753 מכון לייבניץ DSMZn/aאחד המיקרואורגניזמים המשמשים למודל הביופילם המורכב
Streptococcus mitis NCTC 12261האוסף הלאומי של תרביות סוגn/aאחד המיקרואורגניזמים המשמשים למודל הביופילם המורכב
Streptococcus oralis NTCC 11427 אוסף לאומי של תרביות סוגn/aאחד המיקרואורגניזמים המשמשים למודל הביופילם המורכב
SYBR-green (qPCRBIO SyGreen Mix Hi-ROX)PCR BiosystemsPB20.12SYBR-green mix עבור qPCR 
מרק טוד יואיטמרק: סיגמא-אולדריץ'T1438 מדיה לתרבות ביופילם 
מרק סויה טריפטון (TSB) בינוניMerck: Sigma-Aldrich22092 (עבור 500 גרם)מדיה נוזלית לגידול מיקרואורגניזמים אירוביים
פינצטה (150 מ"מ, נירוסטה, משוננת)RS-Pro 545-187משמש להזזת דיסקי HA ותוספות רקמות/תמציות רקמות
אוניברסליים  (30 מ"ל)גריינר ביו-וואן201150 (400 בשקית)כלים לתרבית מיקרואורגניזמים בתרבית נוזלית 
Veillonella dispar NCTC 11831האוסף הלאומי של תרביות סוגn/a'אחדהמיקרואורגניזמים המשמשים למודל הביופילם המורכב
&בטא;-metacapthoethanolMerck: Sigma-AldrichM3148RNase deactivation בדגימות רקמה
צינורות

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moyes, D. L., et al. A biphasic innate immune MAPK response discriminates between the yeast and hyphal forms of candida albicans in epithelial cells. Cell Host Microbe. 8 (3), 225-235 (2010).
  2. Morse, D. J., et al. Denture-associated biofilm infection in three-dimensional oral mucosal tissue models. J Med Microbiol. 67 (3), 364-375 (2018).
  3. Brown, J. L., et al. Biofilm-stimulated epithelium modulates the inflammatory responses in co-cultured immune cells. Sci Rep. 9 (1), 15779(2019).
  4. Yadev, N. P., Murdoch, C., Saville, S. P., Thornhill, M. H. Evaluation of tissue engineered models of the oral mucosa to investigate oral candidiasis. Microb Pathog. 50 (6), 278-285 (2011).
  5. Schaller, M., Zakikhany, K., Naglik, J. R., Weindl, G., Hube, B. Models of oral and vaginal candidiasis based on in vitro reconstituted human epithelia. Nat Protoc. 1 (6), 2767-2773 (2006).
  6. Brown, J. L., et al. Candida auris phenotypic heterogeneity determines pathogenicity in vitro. mSphere. 5 (3), e00371-e00420 (2020).
  7. Brown, J. L., et al. Assessing the inflammatory response to in vitro polymicrobial wound biofilms in a skin epidermis model. NPJ Biofilms Microbiomes. 8 (1), 19(2022).
  8. Butcher, M. C., et al. Antifungal-loaded calcium sulfate beads as a potential therapeutic in combating candida auris. Antimicrob Agents Chemother. 66 (1), e0171321(2022).
  9. Duckney, P., et al. The role of the skin barrier in modulating the effects of common skin microbial species on the inflammation, differentiation and proliferation status of epidermal keratinocytes. BMC Res Notes. 6, 474(2013).
  10. Meloni, M., Balzaretti, S., Collard, N., Desaint, S., Laperdrix, C. Reproducing the scalp microbiota community: Co-colonization of a 3D reconstructed human epidermis with c. Acnes and m. Restricta. Int J Cosmet Sci. 43 (2), 235-245 (2021).
  11. Pedrosa, A. F., et al. Malassezia colonisation on a reconstructed human epidermis: Imaging studies. Mycoses. 62 (12), 1194-1201 (2019).
  12. Schaller, M., Weindl, G. Models of oral and vaginal candidiasis based on in vitro reconstituted human epithelia for the study of host-pathogen interactions. Methods Mol Biol. 470, 327-345 (2009).
  13. Rosca, A. S., et al. Six bacterial vaginosis-associated species can form an in vitro and ex vivo polymicrobial biofilm that is susceptible to thymbra capitata essential oil. Front Cell Infect Microbiol. 12, 824860(2022).
  14. Paterniti, I., et al. Protective effect of probiotics against pseudomonas aeruginosa infection of human corneal epithelial cells. Int J Mol Sci. 25 (3), 1770(2024).
  15. Pellegatta, G., et al. Evaluation of human esophageal epithelium permeability in presence of different formulations containing hyaluronic acid and chondroitin sulphate. Med Devices (Auckl). 13, 57-66 (2020).
  16. Jensen, C., Teng, Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, (2020).
  17. Mountcastle, S. E., et al. A review of co-culture models to study the oral microenvironment and disease. J Oral Microbiol. 12 (1), 1773122(2020).
  18. Cacciamali, A., Villa, R., Dotti, S. 3D cell cultures: Evolution of an ancient tool for new applications. Front Physiol. 13, 836480(2022).
  19. Langfeldt, D., et al. Health- and disease-associated species clusters in complex natural biofilms determine the innate immune response in oral epithelial cells during biofilm maturation. FEMS Microbiol Lett. 360 (2), 137-143 (2014).
  20. Ramage, G., et al. The epithelial cell response to health and disease associated oral biofilm models. J Periodontal Res. 52 (3), 325-333 (2017).
  21. Shang, L., et al. Multi-species oral biofilm promotes reconstructed human gingiva epithelial barrier function. Sci Rep. 8 (1), 16061(2018).
  22. Myers, S., et al. Immunomodulatory streptococci that inhibit cxcl8 secretion and NF-kappaB activation are common members of the oral microbiota. J Med Microbiol. 70 (3), 001329(2021).
  23. Tang, Y. L., Sim, T. S., Tan, K. S. Oral streptococci subvert the host innate immune response through hydrogen peroxide. Sci Rep. 12 (1), 656(2022).
  24. Peyyala, R., Kirakodu, S. S., Novak, K. F., Ebersole, J. L. Oral microbial biofilm stimulation of epithelial cell responses. Cytokine. 58 (1), 65-72 (2012).
  25. Yee, M., Kim, S., Sethi, P., Duzgunes, N., Konopka, K. Porphyromonas gingivalis stimulates il-6 and il-8 secretion in gsm-k, hsc-3 and h413 oral epithelial cells. Anaerobe. 28, 62-67 (2014).
  26. Groeger, S., Jarzina, F., Domann, E., Meyle, J. Porphyromonas gingivalis activates NF-kappaB and MAPK pathways in human oral epithelial cells. BMC Immunol. 18 (1), 1(2017).
  27. Groeger, S., Zhou, Y., Ruf, S., Meyle, J. Pathogenic mechanisms of fusobacterium nucleatum on oral epithelial cells. Front Oral Health. 3, 831607(2022).
  28. Li, X., et al. Saliva-derived microcosm biofilms grown on different oral surfaces in vitro. NPJ Biofilms Microbiomes. 7 (1), 74(2021).
  29. Krishnamoorthy, A. L., Lemus, A. A., Solomon, A. P., Valm, A. M., Neelakantan, P. Interactions between Candida albicans and Enterococcus faecalis in an organotypic oral epithelial model. Microorganisms. 8 (11), 1771(2020).
  30. Brown, J. L., et al. Generation of multi-species oral bacteria biofilm models. Methods Mol Biol. 2588, 187-199 (2023).
  31. Miles, A. A., Misra, S. S., Irwin, J. O. The estimation of the bactericidal power of the blood. J Hyg (Lond). 38 (6), 732-749 (1938).
  32. Lukic, D., Karygianni, L., Flury, M., Attin, T., Thurnheer, T. Endodontic-like oral biofilms as models for multi-species interactions in endodontic diseases. Microorganisms. 8 (5), 674(2020).
  33. Sherry, L., et al. Viable compositional analysis of an eleven-species oral polymicrobial biofilm. Front Microbiol. 7, 912(2016).
  34. Brown, J. L., et al. An in vitro evaluation of denture cleansing regimens against a polymicrobial denture biofilm model. Antibiotics (Basel). 11 (1), 113(2022).
  35. Ammann, T. W., Gmur, R., Thurnheer, T. Advancement of the 10-species subgingival zurich biofilm model by examining different nutritional conditions and defining the structure of the in vitro biofilms. BMC Microbiol. 12, 227(2012).
  36. Montelongo-Jauregui, D., Srinivasan, A., Ramasubramanian, A. K., Lopez-Ribot, J. L. An in vitro model for oral mixed biofilms of candida albicans and streptococcus gordonii in synthetic saliva. Front Microbiol. 7, 686(2016).
  37. Rumbaugh, K. P., Sauer, K. Biofilm dispersion. Nat Rev Microbiol. 18 (10), 571-586 (2020).
  38. Chua, S. L., et al. Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles. Nat Commun. 5, 4462(2014).
  39. Buskermolen, J. K., Janus, M. M., Roffel, S., Krom, B. P., Gibbs, S. Saliva-derived commensal and pathogenic biofilms in a human gingiva model. J Dent Res. 97 (2), 201-208 (2018).
  40. Rosier, B. T., Buetas, E., Moya-Gonzalvez, E. M., Artacho, A., Mira, A. Nitrate as a potential prebiotic for the oral microbiome. Sci Rep. 10 (1), 12895(2020).
  41. Rosier, B. T., Moya-Gonzalvez, E. M., Corell-Escuin, P., Mira, A. Isolation and characterization of nitrate-reducing bacteria as potential probiotics for oral and systemic health. Front Microbiol. 11, 555465(2020).
  42. Young, T., et al. Candida albicans as an essential "keystone" component within polymicrobial oral biofilm models. Microorganisms. 9 (1), 59(2020).
  43. Marsh, P. D., Lewis, M. A., Rogers, H., Williams, D., Wilson, M. Marsh and Martin's oral microbiology-e-book: Marsh and Martin's oral microbiology-e-book. , Elsevier Health Sciences. (2016).
  44. Johnston, W., et al. In vitro bacterial vaginosis biofilm community manipulation using endolysin therapy. Biofilm. 5, 100101(2023).
  45. Janus, M. M., Willems, H. M., Krom, B. P. Candida albicans in multi-species oral communities; a keystone commensal. Adv Exp Med Biol. 931, 13-20 (2016).
  46. Delaney, C., et al. Fungi at the scene of the crime: Innocent bystanders or accomplices in oral infections. Curr Clin Microbiol Rep. 5, 190-200 (2018).
  47. Luo, A., Wang, F., Sun, D., Liu, X., Xin, B. Formation, development, and cross-species interactions in biofilms. Front Microbiol. 12, 757327(2021).
  48. Sadiq, F. A., De Reu, K., Burmolle, M., Maes, S., Heyndrickx, M. Synergistic interactions in multi-species biofilm combinations of bacterial isolates recovered from diverse food processing industries. Front Microbiol. 14, 1159434(2023).
  49. Liang, P. P., et al. A trichophyton rubrum infection model based on the reconstructed human epidermis - EpiSkin(r). Chin Med J (Engl). 129 (1), 54-58 (2016).
  50. Lerebour, G., Cupferman, S., Bellon-Fontaine, M. N. Adhesion of staphylococcus aureus and staphylococcus epidermidis to the EpiSkin reconstructed epidermis model and to an inert 304 stainless steel substrate. J Appl Microbiol. 97 (1), 7-16 (2004).
  51. N'diaye, A. R., et al. Skin-bacteria communication: Involvement of the neurohormone calcitonin gene-related peptide (cgrp) in the regulation of staphylococcus epidermidis virulence. Sci Rep. 6, 35379(2016).
  52. Géniès, C., et al. Comparison of the metabolism of 10 cosmetics-relevant chemicals in EpiSkin s9 subcellular fractions and in vitro human skin explants. J Appl Toxicol. 40 (2), 313-326 (2020).
  53. Alépée, N., Grandidier, M. -H., Cotovio, J. Usefulness of the EpiSkin reconstructed human epidermis model within integrated approaches on testing and assessment (IATA) for skin corrosion and irritation. Toxicol Vitro. 54, 147-167 (2019).
  54. Spielmann, H., et al. The ECVAM international validation study on in vitro tests for acute skin irritation: Report on the validity of the EpiSkin and epiderm assays and on the skin integrity function test. Alternatives to Laboratory Animals. 35 (6), 559-601 (2007).
  55. Cotovio, J., Grandidier, M. -H., Portes, P., Roguet, R., Rubinstenn, G. The in vitro acute skin irritation of chemicals: Optimisation of the EpiSkin prediction model within the framework of the ECVAM validation process. Alt Lab Anim. 33 (4), 329-349 (2005).
  56. Netzlaff, F., Lehr, C. M., Wertz, P. W., Schaefer, U. F. The human epidermis models EpiSkin, SkinEthic and epiderm: An evaluation of morphology and their suitability for testing phototoxicity, irritancy, corrosivity, and substance transport. Eur J Pharm Biopharm. 60 (2), 167-178 (2005).
  57. Larson, P. J., Chong, D., Fleming, E., Oh, J. Challenges in developing a human model system for skin microbiome research. J Invest Dermatol. 141 (1), 228-231.e4 (2021).
  58. Dechelette, C., Smirani, R., Medina, C., Naveau, A. Cellularized biomaterials used as gingival connective tissue substitutes in vivo: A systematic review. Tissue Eng Part B Rev. , (2024).
  59. Makkar, H., Lim, C. T., Tan, K. S., Sriram, G. Modeling periodontal host-microbe interactions using vascularized gingival connective tissue equivalents. Biofabrication. 15 (4), (2023).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

In VitroMultiplex qPCR

מאמרים קשורים