הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הכנת ספריית ATAC-Seq של נויטרופילים שמקורם במח עצם עכברים

1.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67490

⸱

3 בינואר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Innovation Center, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, 2Beijing Key Laboratory for Therapeutic Cancer Vaccines

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כתב יד זה מתאר פרוטוקול להכנת ספריית ATAC-seq של נויטרופילים ממח עצם עכבר, במטרה להבטיח כדאיות אופטימלית של נויטרופילים ואיכות ספרייה גבוהה. הוא מציע הוראות שלב אחר שלב על הכנת BMC, מיון אימונומגנטי ובניית ספרייה, ומשמש כמדריך רב ערך, במיוחד עבור מצטרפים חדשים לחקר נויטרופילים.

תקציר

בדיקה עבור כרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ריצוף (ATAC-seq) היא טכניקה רבת עוצמה בעלת תפוקה גבוהה להערכת נגישות כרומטין והבנת ויסות אפיגנומי. נויטרופילים, כסוג לויקוציטים חיוני בתגובות חיסוניות, עוברים שינויים ארכיטקטוניים משמעותיים של כרומטין במהלך התמיינות והפעלה, המשפיעים באופן משמעותי על ביטוי הגנים הדרושים לתפקודם. ATAC-seq היה חיוני בחשיפת גורמי שעתוק מרכזיים בהבשלת נויטרופילים, חשיפת חתימות אפיגנומיות ספציפיות לפתוגן וזיהוי מטרות טיפוליות למחלות אוטואימוניות. עם זאת, הרגישות של נויטרופילים לסביבה החיצונית מסבכת את הפקת נתוני ATAC-seq באיכות גבוהה. כאן, אנו מציעים פרוטוקול ניתן להרחבה להכנת ספריות ATAC-seq מניטרופילים שמקורם במח עצם מכרסמים, הכולל הפרדה אימונומגנטית משופרת כדי להבטיח כדאיות תאים אופטימלית וספריות באיכות גבוהה. המרכיבים החיוניים המשפיעים על איכות הספרייה ועקרונות האופטימיזציה להרחבה מתודולוגית נדונים בפירוט. פרוטוקול זה יתמוך בחוקרים המוכנים לחקור את ארכיטקטורת הכרומטין ותכנות מחדש אפיגנומי של נויטרופילים, ולקדם מחקרים באימונולוגיה בסיסית וקלינית.

מבוא

נויטרופילים הם אחד מסוגי התאים החיסוניים הנפוצים והחיוניים ביותר בבעלי חוליות, ומהווים 50%-70% מהלויקוציטים האנושיים1. נויטרופילים ממלאים תפקיד מרכזי באיתור וחיסול מיקרואורגניזמים במארחים. במהלך אלח דם, נויטרופילים בוגרים הם בין המגיבים הראשונים2. הם מתגייסים במהירות לאתרי זיהום באמצעות כימוטקסיס3, שם הם נלחמים בפתוגנים על ידי בליעת מיקרואורגניזמים (פגוציטוזיס), ייצור מיני חמצן תגובתיים תלויי NADPH אוקסידאז (התפרצויות נשימה), הפרשת גרגירים (דה-גרנולציה) ויצירת מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) שתופסות והורגות חיידקים חוץ-תאיים ברגע שהם מגיעים לאתר הדלקת4. נויטרופילים לא בשלים מגויסים במהירות גם ממח העצם למחזור הדם ההיקפי על ידי כימוקינים 5,6. נויטרופילים אלה הנמשכים לאתר הזיהומי משחררים גם ציטוקינים, המעורבים במספר תהליכים פיזיולוגיים, כגון המטופואיזה, אנגיוגנזה וריפוי פצעים 7,8. חולים הסובלים ממחלות מולדות או נרכשות הגורמות לירידה בספירת הנויטרופילים רגישים יותר לזיהומים 9,10. עם זאת, הפעלת נויטרופילים היא חרב פיפיות. הפעלה מוגזמת ושחרור ציטוקינים עלולים לגרום לנזק לרקמות ולאיברים, מה שמוביל לתפקוד לקוי של איברים מרובים אם זיהומים אינם נשלטים באופן מיידי11,12. בנוסף, נויטרופילים תורמים גם למחלות דלקתיות ואוטואימוניות שונות ויכולים להשפיע על התקדמות הסרטן וגרורות13,14. זה מדגיש את הצורך לחקור את ויסות פעילות הנויטרופילים כדי לאזן תגובה חיסונית יעילה ולמנוע נזק למארח.

בנויטרופילים, ארכיטקטורת הכרומטין עוברת שינויים מובהקים ודינמיים בבידול, בנדידה ובהפעלה שלהם, ומפעילה תפקידי רגולציה מרכזיים לאורך תוחלת החיים התאית. מסע זה, מהגרעין הגדול, העגול והעשיר באוכרומטין של מיאלובלסטים לגרעין שקוע יותר במיאלוציטים ומטאמילוציטים, ולאחר מכן לתאים בפס בצורת C או S ובעלי אונות גבוהות עם כרומטין צפוף בנויטרופילים פולימורפו-גרעיניים15,16, הוא עדות למורכבות הביולוגיה של הנויטרופילים. תצורת הכרומטין המיוחדת מבטיחה ביטוי סלקטיבי של גנים החיוניים לתפקוד נויטרופילים, כגון אלה המעורבים בייצור גרגירים ותגובות שעתוק מהירות הנחוצות לחיסול יעיל של פתוגנים17. כאשר נויטרופילים מגויסים לאתרים דלקתיים באמצעות כימוטקסיס, הנדידה הטרנסאנדותללית מפעילה לחץ על קומפלקס הקישור המורכב של נוקלאוסקלטון/שלד ציטו (LINC), מה שגורם לעיצוב מחדש של כרומטין ופוטנציאל הפעלה נוסף18. באלח דם, נויטרופילים מופעלים מציגים "תזוזה גרעינית-שמאלה", עם מורפולוגיה לא תקינה של כרומטין, כגון גרעינים דו-כיווניים או ללא אונות ועיבוי כרומטין רופף משמעותית19. התוצאה היא נגישות מוגברת בתוך אזורי גנים הקשורים לתגובה דלקתית, ובכך גורמת לביטוי משמעותי של גנים אלה. אם זיהומים אינם נשלטים כראוי, יש צורך בציטרולינציה של היסטון ופירוק כרומטין לאחר מכן כדי ליצור NETs20,21. לכן, הבנת ארכיטקטורת כרומטין נויטרופילים חיונית לקידום הביולוגיה של הנויטרופילים ולפיתוח טיפולים למחלות דלקתיות ואוטואימוניות, ומציעה תקווה לטיפול עתידי במחלות.

נגישות כרומטין משמשת כמדד לארכיטקטורת כרומטין ברמה האפיגנומית. הוא מציין כיצד אזורים גנומיים מותרים פיזית למשפרים, מקדמים, מבודדים וגורמים קושרי כרומטין וכיצד אלמנטים אלה משפיעים על ביטוי גנים22. בדיקה לכרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ריצוף (ATAC-seq) היא טכניקה בשימוש נרחב להערכת נגישות כרומטין על פני הגנום23. הוא אינו דורש ידע מוקדם באלמנטים רגולטוריים, מה שהופך אותו לכלי רב עוצמה למחקר אפיגנטי. שיטה זו כוללת בידוד גרעינים של דגימות, פיצול DNA גנומי על ידי טרנספוזאז Tn5, והוספת פריימרים לריצוף להכנת ספרייה, ריצוף וניתוח נתונים23. ATAC-seq היה חיוני בחקר מיפוי נוקלאוזומים, ניתוח קשירת גורמי שעתוק, מנגנוני ויסות בסוגי תאים או מחלות שונות, זיהוי משפר חדש, גילוי סמנים ביולוגיים וכו'22,23. לעתים קרובות הוא משולב עם טכניקות אחרות, כגון ריצוף RNA, לניתוח מקיף של ביטוי גנים.

ATAC-seq קידם את הידע שלנו בביולוגיה של נויטרופילים על ידי חשיפת מנגנונים אפיגנטיים מדויקים בבריאות וחולי. הוא חשף מספר גורמי שעתוק מרכזיים (כלומר, RUNX1, KLF6, PU.1 וכו') בהתבגרות נויטרופילים ותגובות אפקטור24,25, חשף חתימות ספציפיות לפתוגן עם פוטנציאל סמן ביולוגי באלח דם26, הבהיר את המנגנונים האפיגנומיים של הזיכרון החיסוני המולד12, וזיהה מטרות טיפוליות בלוקמיה מיאלואידית חריפה בילדים (AML)27. עם זאת, כמרכיב תאי בולט במעקב חיסוני, נויטרופילים מפגינים רגישות גבוהה לסביבה החיצונית שלהם ולכן מהווים אתגר להפקת נתוני ATAC-seq באיכות גבוהה. בנסיבות פיזיולוגיות, זמן מחצית החיים החציוני של נויטרופילים אנושיים מדווח על 3.8 ימים, בעוד שזמן מחצית החיים הממוצע של נויטרופילים עכברים הוא 12.5 שעות. ראוי לציין שמחצית החיים שלהם קצרה משמעותית כאשר הם נלמדים במבחנה 28,29. במהלך פעולה חוץ גופית של נויטרופילים מבודדים, חשיפה למיקרואורגניזמים או דפוסים מולקולריים הקשורים לפתוגן (PAMPs), כמו גם הליכים ניסיוניים מיותרים ופעולות קשות, עלולה לגרום להפעלה חריגה של נויטרופילים ולירידה בכדאיות התאים עקב אפופטוזיס או NETosis. התאים המתים מאכלסים בדרך כלל כמויות משמעותיות של DNA לא כרומטיני רגיש מאוד ל-Tn5, וכתוצאה מכך מגבירים את רעש הרקע של ATAC-seq23.

כאן, אנו מציעים פרוטוקול ניתן להרחבה להכנת ספריות ATAC-seq המותאמות לנויטרופילים שמקורם בדגימות מח עצם של מכרסמים. איור 1 מציג סקירה גרפית של הפרוטוקול, הכוללת את ההפרדה האימונומגנטית של נויטרופילים ממח העצם, ואחריה ATAC-seq. המיון האימונומגנטי המשופר מבטיח את הכדאיות האופטימלית של נויטרופילים לפני חילוץ הגרעין לספריית ATAC-seq, ובכך מבטיח את האיכות הגבוהה של הספריות ומקל על שילוב הערכות נויטרופילים נוספות בתכנית. יישום פרוטוקול זה יסייע לחוקרים בהבנת תכונות ארכיטקטורת הכרומטין ומנגנוני התכנות מחדש האפיגנומיים של נויטרופילים כאשר הם נחשפים לאתגרים מיקרו-סביבתיים שונים. צפויים להיות לכך יישומים נרחבים במחקרי אימונולוגיה בסיסיים וקליניים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הנהלים בבעלי חיים המוצגים להלן עמדו בהנחיות ובתקנות הלאומיות לאתיקה ולרווחת בעלי חיים, שאושרו על ידי ועדת האתיקה למחקר בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית קפיטל, בייג'ינג, סין (sjtkl11-1x-2022(060)).

1. הכנת תרחיפי תאי מח עצם (BMC).

  1. עכברי C57BL/6J זכרים נבחרים בגילאי 6-8 שבועות במשקל 19-21 גרם. המתת חסד של העכברים באמצעות תא CO2 , ואחריו נקע צוואר הרחם לאחר שהרפלקס העמוק נעלם. חטאו אותם בתרסיס אתנול 70% על מחצלת חיתוך.
  2. השתמש במספריים ובמלקחיים קטנים כדי להפריד בזהירות את עצם הירך ממפרק הירך והשוקה, להסיר את העור המחובר ואת שריר השלד ולשטוף את עצם הירך במי מלח קרים עם פוספט (PBS) בצלחת פטרי בגודל 10 ס"מ.
  3. חתכו את האפיפיזות של עצם הירך, הכניסו בעדינות מחט 28 גרם המחוברת למזרק של 2 מ"ל לחלל המח, ושטפו את מח העצם עם PBS קר המכיל 2% סרום בקר עוברי (FBS).
  4. חזור על השלב הקודם עד שהנוזל האדום הכהה הסמוק הופך לשקוף. בדרך כלל נדרשות שלוש שטיפה.
    הערה: הימנע מהכנסת המחט עמוק מדי לחלל מח העצם כדי להבטיח רכישת תאים אופטימלית.
  5. השתמש במסננת תאים של 70 מיקרומטר כדי לסנן את תרחיף התא לתוך צינור מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטי (FACS) (5 מ"ל).
  6. ליזה את האריתרוציטים ב-BMCs עם מאגר ליזה אריתרוציטים מסחרי ללא פוליפורמלדהיד.
    1. צנטריפוגה את הצינור ב-500 x גרם למשך 5 דקות ב-25 מעלות צלזיוס, הסר בזהירות את ה-supernatant, והשאיר כ-100 מיקרוליטר נוזל בתחתית, והקש בעדינות על הצינור כדי לשחרר את הגלולה.
    2. הוסף 2 מ"ל של מאגר ליזה, מדולל ממאגר ליזה אריתרוציטים (פי 10), וערבב על ידי הפיכת הצינור שלוש פעמים. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינור ב-500 x גרם למשך 5 דקות, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא על ידי הקשה עדינה.
    3. שטפו את התאים פעמיים עם מדיום RPMI 1640 המכיל 10% FBS והשעו אותם בנפח של 2 מ"ל.
      הערה: כאשר מתמודדים עם גושי תאים לא מפוזרים, מומלץ להשתמש בקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר כדי לבחור אותם במקום לסנן את מתלי התאים דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר. שיטה זו יכולה להפחית את אובדן התאים.
  7. חשב את הכדאיות התאית ואת המספר הכולל של תאים חיים לדגימה עם צביעה כחולה טריפאן.

2. תיוג אימונומגנטי של נויטרופילים עם חרוזים מגנטיים נגד Ly6G

  1. השעו מחדש את תאי מח העצם (~2 x 107 תאים חיים לעכבר) ב-2 מ"ל של מדיום RPMI 1640 המכיל 10% FBS וצנטריפוגה ב-500 x גרם למשך 5 דקות ב-25 מעלות צלזיוס.
    הערה: בהתחשב בדרישה המוגבלת של 1 x 105 תאים עבור ATAC-seq, ניתן להקצות את הנויטרופילים העודפים לניתוחים אפיגנומיים נוספים (למשל, ChIP-seq ו-Hi-C) או הערכות תפקוד חיסוני (למשל, ייצור ציטוקינים, פגוציטוזיס ו-NETs) באמצעות נויטרופילים המתקבלים מאותו עכבר.
  2. שאפו את רוב הסופרנטנט, והשאירו אחריהם כ-100 מיקרוליטר, והקישו בעדינות על הצינור כדי לשחרר את הגלולה.
  3. הוסף 30 מיקרוליטר של חרוזי Ly6G וערבב עם ה-BMC על ידי הקשה עדינה.
    הערה: יש לערבב חרוזים מגנטיים למשך 10 שניות לפחות לפני השימוש. לאחר הוספת החרוזים ל-BMC, מומלץ להימנע ממערבולת.
  4. דגרו את הצינור בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  5. הוסף 2 מ"ל PBS כדי להשעות מחדש את החרוזים והתאים, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-500 x גרם למשך 5 דקות ב-25 מעלות צלזיוס.
  6. שאפו את רוב הסופרנטנט, והשאירו אחריהם כ-100 מיקרוליטר, והקישו בעדינות על הצינור כדי לשחרר את הגלולה. הוסף PBS נוסף לנפח סופי של 1 מ"ל.
    הערה: כאשר מתמודדים עם גושי תאים לא מפוזרים, מומלץ להשתמש בקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר כדי לבחור אותם במקום לסנן את מתלי התאים דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר. שיטה זו יכולה להפחית את אובדן התאים.

3. הפרדת נויטרופילים עם מיון תאים אימונומגנטיים

  1. טפל מראש בעמודת MS עם PBS.
    1. מקם את עמודת MS בתוך השדה המגנטי של מפריד מיון תאים מופעל מגנטי (MACS) תואם. מקם צינור לא תפוס של 5 מ"ל מתחת לנוזל הנפלט מעמודת MS.
    2. שוטפים את העמוד עם 500 מיקרוליטר PBS. חזור על שלב זה לאחר הזרימה המלאה של PBS לעמודה MS.
      הערה: יש לאפשר ל-PBS לזרום בהדרגה, טיפה אחר טיפה, לתוך צינור מיון התאים המופעל על ידי פלואורסצנטי (FACS) בנפח 5 מ"ל דרך עמודת MS. ודא שלא ייכנס אוויר לעמוד, מכיוון שבועות אוויר עלולות לחסום את העמוד.
  2. החל את מתלה ה-BMC המסומן מגנטית על עמודת MS על ידי הוספת 500 מיקרוליטר בכל פעם, מילוי מחדש מיד לאחר שמאגר העמודה ריק.
    הערה: ודא שמתלי התאים נטולי מסת תא. במידת הצורך, מקם צינור FACS חדש של 5 מ"ל מתחת לעמודת הטרשת הנפוצה כדי לאסוף את התאים הלא מסומנים (למשל, מונוציטים ולימפוציטים) לפני שלב זה.
    הערה: שימו לב לקצב זרימת הטיפות. קצב זרימה איטי יכול להצביע על כך שעמודת המיון חסומה.
  3. שטפו את עמודת MS על ידי הוספת 500 מיקרוליטר PBS בכל פעם שהמאגר ריק, וחזרו על תהליך זה פעמיים.
    הערה: הוספה מוקדמת של PBS עלולה לעכב את כניסתם של תאים מסוימים לעמודת המיון, ועלולה לפגוע בטוהר מיון התאים.
  4. אסוף את הנויטרופילים המסומנים מגנטית.
    1. לאחר שמאגר העמודים מתרוקן, הסר את העמוד מהשדה המגנטי ומקם אותו בזהירות על צינור של 5 מ"ל.
      הערה: לפני הסרת העמודה, ודא שאין בתוכו שאריות נוזל כדי למנוע אובדן נויטרופילים עקב פריקת טיפות במהלך התהליך. ניתן היה להסיר את השאריות בעמודה באמצעות פיפטה.
    2. הוצא 2 מ"ל PBS על העמודה, ולאחר מכן דחף מיד ובחוזקה את הבוכנה לתוך העמודה כדי להוציא את הנויטרופילים המסומנים מגנטית.
      הערה: כדי לרכוש מספיק נויטרופילים, הקפידו על נפח פליטה נאות והישארו קצרים בעת דחיפת הבוכנה לתוך העמודה.
  5. השתמש בהמוציטומטר כדי לספור את התאים המבודדים. זהה את טוהר הנויטרופילים המבודדים על ידי לקיחת 100 מיקרוליטר מתרחיף התאים שלאחר המיון וניתוחם עם ציטומטריית זרימה.

4. מיצוי גרעין

  1. צנטריפוגה את 50,000 התרחיפים החד-תאיים המכילים את הנויטרופילים ב-500 x g למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס בשפופרת של 0.2 מ"ל, ואז השליכו את הסופרנטנט.
  2. השעו מחדש את הנויטרופילים ב-50 מיקרוליטר של מאגר ליזיס מקורר מראש (עיין בטבלה 1), ערבבו בעדינות את התמיסה באמצעות פיפטה, ודגרו על קרח למשך 10 דקות.
    הערה: אם נפח הדגימה נמוך מ-5 מיקרוליטר, מותר להוסיף את מאגר הליזיס ישירות. ריכוז תרחיף התאים אינו עולה על 1 x 107 תאים / מ"ל.
  3. צנטריפוגה ב-500 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, ואז השליכו את הסופרנטנט ואספו את הגרעין. מקם את הצינור על קרח לפני תחילת ההליכים הבאים.
    הערה: כדי למזער את אובדן הדגימה, ציין את הצד של דופן הצינור שבו מצטברים כדורים ושואב בעדינות את הנוזל מהצד הנגדי בעת הסרת הסופרנטנט.

5. תיוג קשור נוקלאוזום עם טרנספוזאז

  1. הכן את תערובת תגובת התיוג המכילה טרנספוזאז Tn5 בצינור תגובת שרשרת פולימראז (PCR) בהתאם להנחיות של ערכת ההכנה של ספריית ה-DNA (עיין בטבלה 2) וחמם מראש את חרוזי טיהור האמפליקון בקירור ב-25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות.
  2. השעו מחדש את גרעין הנויטרופילים עם 50 מיקרוליטר של תערובת תגובת תיוג וערבבו בעדינות עם פיפטה, ולאחר מכן צנטריפוגה למשך 5 שניות באמצעות צנטריפוגה ידנית (~2600 x גרם).
  3. דגרו את צינור התגובה במכשיר PCR בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  4. הוסף 100 מיקרוליטר של חרוזי טיהור אמפליקון מערבולת מראש לליזאט, ולאחר מכן ערבב היטב את החרוזים המגנטיים בתמיסה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים.
    הערה: חרוזים מגנטיים הם דביקים ויכולים להתחבר בקלות לקצות הפיפטה, לכן הקפידו לשאוב את הנפח הנכון ולהוציא אותם לאט מהקצות בעת העברת החרוזים.
  5. דגרו את צינור התגובה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה למשך 5 שניות עם צנטריפוגה ידנית (~2600 × גרם).
  6. טהר את שבר ה- DNA שנקטע על ידי הנחת צינור התגובה על מתלה מגנטי עד שהתמיסה תתבהר (כ -5 דקות). לאחר מכן, הסירו בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לחרוזים המגנטיים.
  7. שטפו את החרוז המגנטי עם 200 מיקרוליטר של 80% אתנול טרי שהוכן בכל פעם, תוך שמירה על צינור התגובה על המדף המגנטי למשך 30 שניות. הימנע מהפרעה לחרוזים בעת הוספת אתנול. חזור על ההליך המתואר בשלב 5.7.
  8. צנטריפוגה את צינור התגובה עם צנטריפוגה כף יד (כ -2600 × גרם), שאפו את האתנול עם קצות פיפטה של 10 מיקרוליטר, ואז יבשו את החרוזים המגנטיים למשך 3-5 דקות תוך כדי פתיחת המכסה.
    הערה: משך הייבוש של חרוזים מגנטיים עשוי להשתנות באזורים שונים עקב שינויים ברמות הלחות. יש לייבש את החרוזים רק עד שהם מאבדים את הברק שלהם. ייבוש יתר עלול לסבך את תהליך הפליטה, בעוד שייבוש לא מספיק עלול לגרום לנוכחות שאריות אלכוהול, ולהשפיע על הניסויים הבאים. בנוסף, מיקום המתלה המגנטי אופקית תורם יותר לייבוש אחיד של החרוזים המגנטיים.
  9. לאחר הסרת צינור התגובה מהמתלה המגנטי, הוסף 26 מיקרוליטר של ddH2O כדי לכסות את החרוזים המגנטיים, פיפטינג למעלה ולמטה כדי להבטיח ערבוב יסודי. לאחר מכן, דגרו בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
    הערה: האריכו את משך הדגירה כראוי אם החרוזים המגנטיים מיובשים יתר על המידה.
  10. צנטריפוגה קצרה את צינור התגובה עם צנטריפוגה כף יד (כ -2600 × גרם) והפרד את החרוזים המגנטיים באמצעות מתלה מגנטי עד שהתמיסה מתבהרת (כ -5 דקות).
  11. העבירו בזהירות את ה-24 מיקרוליטר לצינור ה-PCR החדש.

6. בניית ספרייה לריצוף מהדור הבא (NGS)

  1. הכן את תערובת תגובת ה-PCR בצינור מעוקר תוך שימוש בשברי DNA מטוהרים ופריימרים המכילים מתאמי ריצוף (עיין בטבלה 3).
  2. בצע את תגובת ה-PCR בהתאם להליכים המומלצים (עיין בטבלה 4), בדרך כלל דורש כשעה.
    הערה: הניסוי עשוי להיפסק זמנית לאחר הליך זה, וניתן לאחסן את מוצרי ה-PCR בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס או לפחות שבועיים.
  3. הוסף 27.5 מיקרוליטר של חרוזי טיהור אמפליקון עם מערבולת מראש ל-50 מיקרוליטר של מוצרי PCR, ולאחר מכן ערבב היטב את החרוזים המגנטיים בתמיסה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים.
    הערה: היחס השגוי בין חרוזים מגנטיים למוצרי PCR עלול לגרום לאי התאמות באורכי השברים הממוינים. השתמש ב-ddH2O כדי למלא את הנפח המאודה של מוצר ה-PCR ל-50 מיקרוליטר. הקפד לשאוב את הנפח הנכון של חרוזים מגנטיים ולהוציא אותם לאט מקצות הפיפטה כדי למזער את החרוזים שעלולים להיות מחוברים.
  4. דגרו את צינור התגובה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה למשך 5 שניות בעזרת צנטריפוגה ידנית (כ-2600 x גרם).
  5. טהר את ה-DNA של הספרייה על ידי הנחת צינור התגובה על מתלה מגנטי עד שהתמיסה תתבהר (כ-5 דקות). לאחר מכן, העבירו בזהירות את הסופרנטנט לצינור PCR מעוקר חדש והשליכו את החרוזים המגנטיים.
  6. הוסף 50 מיקרוליטר של חרוזי טיהור אמפליקונים מוכנים מראש לסופרנטנט, ולאחר מכן ערבב היטב את החרוזים המגנטיים בתמיסה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים.
  7. דגרו את צינור התגובה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה למשך 5 שניות בעזרת צנטריפוגה ידנית (כ-2600 x גרם).
  8. הנח את צינור התגובה על מתלה מגנטי עד שהתמיסה תתבהר (כ-5 דקות), ולאחר מכן הסר בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לחרוזים המגנטיים.
  9. שטפו את החרוז המגנטי פעמיים עם 200 מיקרוליטר של 80% אתנול טרי שהוכן בכל פעם, ושמרו את צינור התגובה על המדף המגנטי למשך 30 שניות. הימנע מהפרעה לחרוזים בעת הוספת אתנול.
  10. יבש את החרוזים המגנטיים למשך 5 דקות תוך כדי פתיחת המכסה.
  11. לאחר הסרת צינור התגובה מהמתלה המגנטי, הוסף 22 מיקרוליטר של ddH2O כדי לכסות את החרוזים המגנטיים, צנרת למעלה ולמטה במשך 10 פעמים כדי להבטיח ערבוב יסודי. לאחר מכן, דגרו בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  12. צנטריפוגה קצרה של צינור התגובה עם צנטריפוגה כף יד (כ -2600 × גרם) והפרד את החרוזים המגנטיים באמצעות מתלה מגנטי עד שהתמיסה מתבהרת (כ -5 דקות).
  13. העבירו בזהירות את ה-20 מיקרוליטר לצינור PCR מעוקר חדש ואחסנו אותו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    הערה: כדי להשיג ספרייה עם התפלגות אורך מרוכזת יותר, שקול להשתמש בערכת שחזור ג'ל כדי למיין את המוצר המוגבר. לחלופין, אם אין דרישות ספציפיות לטווח התפלגות האורך, ניתן לטהר את המוצר המוגבר ישירות באמצעות ערכת טיהור חרוזים מגנטיים או עמודים ללא מיון אורך.

7. בקרת איכות ורצף ספרייה

  1. השתמש בפלטפורמות מנתח מקטעי DNA כדי להעריך את התפלגות האורך של ה-DNA בספרייה.
  2. השתמש בפלטפורמות NGS כדי לבצע ריצוף תפוקה גבוהה בספריות שעברו את בדיקת האיכות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר שימש לבידוד נויטרופילים ממח העצם של עכברי C57BL/6 ולהשוות את השונות שלהם בהתאמה בנגישות הכרומטין לפני ואחרי גירוי ליפופוליסכריד (LPS) באמצעות ATAC-seq. בדרך כלל, ניתן לקצור 2 x 107 BMCs משתי עצם הירך של עכבר C57BL/6 בן 6-8 שבועות, ולאחר מכן ניתן לבודד 2-5 x 106 נויטרופילים. ביניהם, 1 x 105 תאים משמשים עבור ATAC-seq, בעוד שניתן להקצות את התאים העודפים לניתוח נויטרופילים מקיף.

אימונופנוטיפ FACS אומץ כדי לקבוע את טוהר הנויטרופילים ואת כדאיות הנויט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כתב יד זה מדווח על פרוטוקול ניסיוני להכנת ספריות ATAC-seq המותאמות לנויטרופילים שמקורם בדגימות מח עצם של מכרסמים. בשל היותם של נויטרופילים רגישים מאוד ומופעלים בקלות, מאמצי האופטימיזציה נתנו עדיפות לשמירה על הכדאיות של נויטרופילים מבודדים. טיפול לא נכון עלול להוביל ל-NETosis ולצורות אחרות של מוות תאי, לעורר שחרור של כמויות משמעותיות של DNA לא כרומטיני ובכך לתרום לרעשי הרקע23. ייעלנו את ההליך לפני מיצוי הגרעין ובחרנו במאגר ליזיס אריתרוציטים ללא פוליפורמלדהיד. בניגו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מתוכנית המו"פ של ועדת החינוך העירונית של בייג'ינג (KZ202010025041) והמכונים הסיניים למחקר רפואי בבייג'ינג (מענק מס. CX24PY29).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.4% Trypan BlueScientificT10282
1x תמיסת מלח חוצצת פוספטBiosharpBL302A
20 bp– 5000 bp סמן יישורBiopticC109102-100Aמנתח שברי DNA תומך מוצרים 5k
סמן גודל (סולם סטנדרטי 50 bp)BiopticC109101-100Aמנתח שברי DNA מוצרים תומכים
חרוזי טיהור אמפליקוניםבקמןA63881חרוזי טיהור אמפליקונים היא ערכת טיהור חומצות גרעין להשגת מוצרי DNA באיכות גבוהה.
Anti-Ly6G MicroBeads Ultrapure, עכברmiltenyi130-120-337העכבר Anti-Ly-6G MicroBeads UltraPure, פותחו לבחירה חיובית או דלדול של נויטרופילים של עכברים מתרחיפים חד-תאיים של מח עצם העכבר.
נגד עכבר CD11b-BV605 (1:200)BDCat#563015
נגד עכבר CD48-PE-Cy7 (1:400)BDCat#560731
נגד עכבר Ly6G-BV510 (1:200)BDCat#740157
C57BL/6J עכברים, סוג בר, בן 8 שבועות, זכרהמכון למדעי חיות מעבדה, האקדמיה הסינית למדעי הרפואההמכון למדעי חיות המעבדה, האקדמיה הסינית לרפואה Sciences
DNA Separation BufferBiopticC104406DNA מנתח שברי DNA תומך במוצרים
תומכים E. coli נגזר LPS אולטרה-טהור (serotype0111: B4)Sigma-AldrichCat#L-2630
DNA Quantitative ReagentvazymeEQ111DNA Quantitative Reagentt הוא ערכת בדיקה כמותית פלואורסצנטית פשוטה, רגישה ומדויקת של DNA דו-גדילי (dsDNA).
מאגר ליזה אריתרוציטים (10x)BioLegendCat#420301
סרום בקר עובריGibcoCat#10099141C
MS עמודות הפרדהmiltenyi130-042-201עמודות MS מיועדות לבחירה חיובית של תאים. 
RPMI 1640 בינוניGibcoC11875500BT
S2 מחט אלקטרופורזה ג'ל מנתח שברי DNAC105101 ביואופטי
מכשירים כירורגיים: אזמל, מספריים דיסקציה, מספריים מיקרו-דיסקציה, מלקחיים עדינים, מלקחיים אנטומיים קהים, מחזיק מחטפישר סיינטיפיקhttps://www.fishersci.com/us/en/browse/90184247/surgical-toolsניתן לרכוש מספקים מוסמכים אחרים
מזרק (1  מ"ל)פישר סיינטיפיק ניתן לרכוש https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955464 מספקים מוסמכים אחרים
ערכת הכנה לספריית DNA TruePrepTM V2 עבור IlluminavazymeTD501-01ערכת הכנה לספריית DNA TruePrep V2 עבור Illumina היא ערכה ייעודית שפותחה במיוחד עבור פלטפורמת הרצף בתפוקה גבוהה של Illumina. באמצעות הערכה, ניתן להכין DNA לספריות ריצוף המוקדשות לפלטפורמת הריצוף בתפוקה גבוהה של Illumina.
ערכת אינדקס TruePrepTM V2 עבור IlluminavazymeTD202ערכת אינדקס TruePrep V2 עבור Illumina היא ערכה עבור ערכת ההכנה לספריית ה-DNA של TruePrep V2 עבור Illumina. ניתן להשתמש בו להכנת 96 ספריות אינדקס דו-צדדיות שונות.
מוצרים תומכים

מקורות

  1. Mortaz, E., Alipoor, S. D., Adcock, I. M., Mumby, S., Koenderman, L. Update on neutrophil function in severe inflammation. Front Immunol. 9, 2171(2018).
  2. Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann Intern Med. 109 (2), 127-142 (1988).
  3. De Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: Going forward in reverse. Nat Rev Immunol. 16 (6), 378-391 (2016).
  4. Herrera-Uribe, J., et al. Integrative profiling of gene expression and chromatin accessibility elucidates specific transcriptional networks in porcine neutrophils. Front Genet. 14, 1107462(2023).
  5. Kipnis, E. Neutrophils in sepsis: Battle of the bands. Crit Care Med. 41 (3), 925-926 (2013).
  6. Kong, Y., et al. Sepsis-induced thymic atrophy is associated with defects in early lymphopoiesis. Stem Cells. 34 (12), 2902-2915 (2016).
  7. Cassatella, M. A. Neutrophil-derived proteins: Selling cytokines by the pound. Adv Immunol. 73, 369-509 (1999).
  8. Tecchio, C., Cassatella, M. A. Neutrophil-derived cytokines involved in physiological and pathological angiogenesis. Chem Immunol Allergy. 99, 123-137 (2014).
  9. Newburger, P. E. Autoimmune and other acquired neutropenias. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2016 (1), 38-42 (2016).
  10. Skokowa, J., Dale, D. C., Touw, I. P., Zeidler, C., Welte, K. Severe congenital neutropenias. Nat Rev Dis Primers. 3, 17032(2017).
  11. Burn, G. L., Foti, A., Marsman, G., Patel, D. F., Zychlinsky, A. The neutrophil. Immunity. 54 (7), 1377-1391 (2021).
  12. Wang, B., et al. Sepsis induces non-classic innate immune memory in neutrophils. Cell Rep. 42 (9), 113044(2023).
  13. Dinauer, M. C. Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2016 (1), 43-50 (2016).
  14. Shaul, M. E., Fridlender, Z. G. Tumour-associated neutrophils in patients with cancer. Nat Rev Clin Oncol. 16 (10), 601-620 (2019).
  15. Hong, C. W. Current understanding in neutrophil differentiation and heterogeneity. Immune Netw. 17 (5), 298-306 (2017).
  16. Carvalho, L. O., Aquino, E. N., Neves, A. C., Fontes, W. The neutrophil nucleus and its role in neutrophilic function. J Cell Biochem. 116 (9), 1831-1836 (2015).
  17. Tamassia, N., et al. Cutting edge: An inactive chromatin configuration at the il-10 locus in human neutrophils. J Immunol. 190 (5), 1921-1925 (2013).
  18. Shiraishi, K., et al. Biophysical forces mediated by respiration maintain lung alveolar epithelial cell fate. Cell. 186 (7), 1478-1492.e15 (2023).
  19. Chang, C. C., Sun, J. T., Chu, F. Y. Bacterial sepsis, neutrophils and intracellular organisms. QJM. 110 (6), 393-394 (2017).
  20. Walling, B. L., Murphy, P. M. Protean regulation of leukocyte function by nuclear lamins. Trends Immunol. 42 (4), 323-335 (2021).
  21. Sollberger, G., Tilley, D. O., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: The biology of chromatin externalization. Dev Cell. 44 (5), 542-553 (2018).
  22. Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nat Rev Genet. 20 (4), 207-220 (2019).
  23. Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nat Protoc. 17 (6), 1518-1552 (2022).
  24. Khoyratty, T. E., et al. Distinct transcription factor networks control neutrophil-driven inflammation. Nat Immunol. 22 (9), 1093-1106 (2021).
  25. Fischer, J., et al. Safeguard function of pu.1 shapes the inflammatory epigenome of neutrophils. Nat Immunol. 20 (5), 546-558 (2019).
  26. Ram-Mohan, N., et al. Profiling chromatin accessibility responses in human neutrophils with sensitive pathogen detection. Life Sci Alliance. 4 (8), e202000976(2021).
  27. Wei, L., et al. Integrative analysis of single-cell rna-seq and atac-seq data across treatment time points in pediatric AML. Blood. 136 (1), 29(2020).
  28. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
  29. Pillay, J., et al. In vivo labeling with 2H20 reveals a human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 116 (4), 625-627 (2010).
  30. Orchard, P., Kyono, Y., Hensley, J., Kitzman, J. O., Parker, S. C. J. Quantification, dynamic visualization, and validation of bias in ATAC-seq data with ataqv. Cell Syst. 10 (3), 298-306.e4 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

נגישות כרומטיןנויטרופילים ממחולק הגווןהפרדה אימונו-מגנטיתבידוד נויטרופיליםTn5 Transposaseבקרה אפיגנומיתמיקום נוקלאוזומיםטיהור PCRתכנות מחדש של הכרומטין
הכנת ספריית ATAC-Seq של נויטרופילים שמקורם במח עצם עכברים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.