מאמר שיטה

מכשיר מתיחה שווה צירי למיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית של תאים חיים בהגדלה גבוהה

DOI:

10.3791/67520

⸱

13 ביוני 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Bioengineering of Catalonia (IBEC), Barcelona Institute of Science and Technology (BIST), 2University of Barcelona (UB), 3Department of Physics, King's College London, 4ICFO-Institut de Ciencies Fotoniques, The Barcelona Institute of Science and Technology, 5Centro de Investigación Biomédica en Red en Bioingeniería, Biomateriales y Nanomedicina (CIBER-BBN), 6Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA)

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים מכשיר מתיחה שווה צירי רב-תכליתי המופעל פניאומטית ותואם למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים חשופים באופן רציף לכוחות מכניים במצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים, כולל מגוון מתחי מתיחה ודחיסה. ישנו מחקר פעיל מאוד הבוחן כיצד תאים ורקמות מגיבים ומסתגלים ללחצים כאלה וכיצד תגובות אלה משתלבות עם איתות מכני. זה יצר צורך בכלים מתוחכמים התואמים לפרוטוקולים סטנדרטיים של תרביות תאים ושיטות מיקרוסקופיה, המשחזרים מתחים פיזיולוגיים במחקרים חוץ גופיים. מחקר זה מציג את התכנון, התפקוד והאפיון של מכשיר מתיחה התואם למיקרוסקופיה אופטית ופלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה. מכשירי מתיחה רבים, פנאומטיים או מוטוריים, פותחו ושימשו בשטח. אנו מציגים אחת מהמערכות הללו בפירוט, כולל הנחיות תכנון, מגוון יישומים וכל הכלים לייצור מערך דומה. המערכת מבוססת על ממברנת פולידימתילסילוקסן (PDMS) מעוותת, הנמתחת באופן שיווי משקל בעת יישום ואקום, מה שהופך זן דגימה הומוגני, ניתן לשחזור ומבוקר. הוא מספק מגוון מתחי מתיחה, החל ממתיחה דייקנית ומיידית ועד למחזורי שחרור מתיחה חוזרים ונשנים של משרעת ותדירות מבוקרים. ציפוי מצע עם חלבוני הדבקה מאפשר לזרוע תאים הנושאים מדווחים פלואורסצנטיים במכשיר המתיחה ולבצע הדמיה חיה של תאים אלה בעת מתיחה באמצעות מיקרוסקופים פלואורסצנטיים בהגדלה גבוהה. ניתן להפעיל מתחי דחיסה גם על ידי מתן אפשרות לדגימה להסתגל למתיחה ולאחר מכן שחרורה או על ידי זריעת הדגימה על מצע מתוח מראש לפני שחרור המתיחה. דפוס טופוגרפי נוסף של מצע ה-PDMS מאפשר הדמיה של אותה דגימה במצבי מיקרוסקופיה שונים (כגון פלואורסצנציה ומיקרוסקופ אלקטרונים). ניתן לחבר ג'ל פוליאקרילאמיד גם לממברנת ה-PDMS, וכתוצאה מכך להימתח תאים שנזרעו על מצעים בעלי קשיחות שונה. בסך הכל, על ידי הפעלת מתחי מתיחה מבוקרים על דגימות חיות, מכשיר מתיחה זה, יחד עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית איכותית, יכול לענות על מגוון גדול של שאלות במכניוביולוגיה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ממברנות פולידימתילסילוקסן דקות מעוותות (PDMS) נמצאות בשימוש נרחב במגוון מכשירי מתיחה בהתאמה אישית 1,2,3, שכן PDMS הוא חומר אינרטי תואם ביולוגית מבוסס התואם להדמיית מיקרוסקופיה. כאן, כמו רבים אחרים 4,5,6,7,8,9, הרעיון הפשוט של הפעלת ואקום משמש לעיוות הממברנה כדי להרכיב מכשיר מתיחה שיווי צירי חזק וניתן לשליטה. על ידי הידוק הממברנה בתוך טבעת עגולה ואיטום הטבעת על גבי "עמוד מתיחה" (איור 1A-C), מושג עיוות אחיד ואיזוטרופי. הדגימה הביולוגית ממוקמת במרכז הטבעת על ממברנת ה-PDMS העומדת בפני עצמה, המאפשרת הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. כאן, מוצגות שתי הגדרות מותאמות אישית, תואמות לשני מודלים של שלב מיקרוסקופ (איור 1D-F) ורב-תכליתיות ביותר מבחינת יישומים ביולוגיים. בעוד שהעיצוב הכללי פשוט וניתן להעברה לשלבים אחרים, יש לבחור בקפידה את מידות ההתקנה כך שיתאימו לדרישות ההדמיה. לאחר השגתו, יש לאפיין ולאמת את פרופיל המתח של ההתקן.

מלבד ההתקנה עצמה, מוצגת שיטה פשוטה המלווה בקוד Matlab לאפיון גודל המתח, הומוגניות ואיזוטרופיה. לאחר מכן ניתן להשתמש במכשיר המתיחה כדי להפעיל מתחי מתיחה שיווי צירי על מערכות סינתטיות10, תאים בודדים 11,12 או חד-שכבות13, תוך רישום ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה של התגובה הביולוגית של הדגימה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. ניתן לצבוע את הממברנה בחלבוני הידבקות מטריצה חוץ-תאיים שונים14,15. ניתן להוסיף תכונות נוספות בהתאם לצרכי המחקר הביולוגי. לדוגמה, ניתן לחבר ג'לים פוליאקרילאמיד לממברנת ה-PDMS כדי לכוונן את קשיחות המצע תוך מתיחהשל 13,16, וניתן לייצר את ממברנות ה-PDMS עם רשת ממוספרת ייחוס להדמיה אחורית של אותו אזור עניין בתוך דגימה12. ניתן לעבד דגימות מתוחות קבועות גם על ידי צביעה חיסונית ולאחר מכן למתוח אותן מחדש להדמיה פלואורסצנטית17. ניתן לשלוט בדפוס המתיחה המיושם, החל מדופק מתיחה מיידי יחיד ועד למתח מחזורי בגדלים, תדרים או צורות משתנים14,16.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. עיצוב הבמה ועמוד המתיחה (איור 1)

  1. תכנן עמוד מתיחה התואם במידות עם גודל הבמה/מחזיקים ותצורת המטרה. שני עמודי המתיחה הספציפיים מוצגים באיור 1A,D.
    הערה: קבצי ה-FreeCAD המסופקים בפרוטוקול זה (תיקייה משלימה 1) תואמים למיקרוסקופים ולשלבים הבאים של ניקון: Eclipse Ni-E זקוף מצויד ב-NI-SH-E stage, ו-Eclipse Ti-E/B הפוך מצויד ב-TI-S-ER STAGE , איור 1D. ניתן להדפיס את העמוד בתלת מימד (תלת מימד) אך עלול להתעוות לאחר שימוש חוזר; עמודים מבוססי אלומיניום לא יסבלו מהחיסרון הזה. הקפד לבצע אנודיזציה של עמודים מבוססי אלומיניום כדי למנוע חמצון. תצורה זקופה מאפשרת משרעת תנועה גדולה יותר. בנוסף, תצורה זקופה מספקת הדמיה ישירה של הדגימה ללא ממשק, וזה חיובי אופטית במקרה של מצע ממברנת PDMS הניתן לעיוות. במקום זאת, בתצורה הפוכה, אלומת התאורה עוברת דרך ממברנת ה-PDMS (איור 1F); מכיוון שבעת יישום מתיחה, קרום ה-PDMS יזוז, יש לבחור בקפידה את אמצעי הטבילה למטרה (סוגי טבילה מומלצים במים, אוויר או גליצרול; טבילה בשמן אינה מומלצת עקב אי התאמה למצעי PDMS). ניתן לשנות מחזיקים מסחריים באמצעות חורי ברגים נוספים; היזהר משימוש בבורג מפלסטיק או על בסיס טפלון כדי למנוע אבק בזמן ההברגה. זה יכול להיות נוח לעצב מחזיק המאפשר להתקין את עמוד המתיחה על גבי הבמה, כפי שמוצג באיור 1E. קובץ ה-FreeCAD המסופק בפרוטוקול זה תואם לשלב של מיקרוסקופ זקוף Eclipse Ni-E.
  2. תכנן טבעות מתיחה (איור 1C) התואמות בגודלן עם עמוד המתיחה (איור 1A,B). קבצי ה-FreeCAD המסופקים בפרוטוקול זה תואמים לעמודים המתאימים (כדי לכסות את הטבעות בזמן הטיפול בדגימות, ניתן לבחור את הקוטר שלהם כך שיתאים לגודל צלחת פטרי).
    הערה: הטבעת יכולה להיות גם על בסיס אלומיניום (אנודייז) או מודפסת בתלת מימד. כלול אטמים בקטרים נאותים כדי לאטום בוואקום את עמוד המתיחה והטבעות.
  3. אופציונלי: לייצר בקר ואקום. מפה חשמלית של תיבת בקרת הוואקום המשמשת בפרוטוקול זה מסופקת במידע משלים (ראה תיקייה משלימה 2). זה מאפשר שליטה ידנית ברמת הוואקום המופעלת על מכשיר המתיחה.
    הערה: בקרי ואקום מסחריים יכולים גם לספק פונקציות דומות ובדרך כלל יכולים להיות מלווים בתוכנת בקרה המאפשרת יישום של מגוון סוגי אותות (סינוסואידלי, משולש וכו') (פלוינט, קובלט).

2. ייצור הממברנה הנמתחת

  1. עיצוב צלחות עגולות (חומר מומלץ: פולימתאקרילט, PMMA). ודא שהלוחות הללו רחבים יותר מהטבעות ותואמות בגודלן לציפוי המסתובב (איור 2A). ראה טבלה 1 למידות מוצעות ולתיקיה משלימה 3.
    הערה: עבור עמוד 1, נעשה שימוש בקוטר 12 ס"מ; עבור עמוד 2, קוטר 18-21 ס"מ. לפני ובין כל שימוש, יש לנקות היטב את הצלחות באמצעות מגבונים לא ארוגים ואתנול 96%. חשוב להימנע מהצטברות PDMS בצלחות, כמו גם על הגבולות ומתחתיה.
  2. מכינים PDMS 1:10 ומערבבים היטב לקבלת תחליב הומוגני מאוד (השתמשו בכפות ערבוב מומלצות).
    הערה: עבור 12 ס"מ, הכינו 4.5 גרם לצלחת; לצלחות בגודל 18 ס"מ, 8 גרם לצלחת. להכנת צלחות מרובות, הכינו PDMS נוספים, למשל 10 מ"ל יותר מהנדרש עבור 10 צלחות. עבור 10 צלחות של 12 ס"מ, הכינו 50 גרם של רכיב A ו -5 גרם של רכיב B. זה שימושי להשתמש בכלי קיבול גדולים כדי לפפט בקלות. אסור שהשקע יכיל אבק או כל לכלוך אחר שעלול להפריע לסיבוב וריפוי תקין של PDMS. השתמש בכפפות מחומר תואם (הימנע מלטקס; כפפות ויניל מתאימות) כדי להבטיח ריפוי PDMS.
  3. דגה למשך שעה לפחות באמצעות תא ואקום.
    הערה: לחלופין, ניתן לצנטריפוגה את ה-PDMS ב-0.2 × גרם למשך 5 דקות באמצעות צינור של 50 מ"ל, אך היזהר שמסובך לשאוב את תערובת ה-PDMS מצינור עם מזרק המחלק (הכרחי לשלב 2.4). אין להסיר גז במשך זמן רב מדי (לא יותר משעתיים) עם אור ישיר כדי למנוע ריפוי מוקדם של PDMS.
  4. ציפוי ספין PDMS על גבי לוחות PMMA
    1. הוצא 4.2 מ"ל או 7.5 מ"ל של PDMS נטול גז על גבי לוחות ה-PMMA.
    2. סובב את הצלחות באמצעות ההגדרות המומלצות הבאות:
      1. מעיל מסתובב ל-5 שניות ב-500 סל"ד עם תאוצה של 100 סל"ד לשנייה.
      2. מעיל מסתובב למשך דקה אחת ב-500 סל"ד עם תאוצה של 300 סל"ד לשנייה.
        הערה: זה יכול להיות נוח לסמן את מרכז לוחית ה-PMMA בצד התחתון שלה כדי להבטיח את ריכוז הלוחות במהלך סיבוב וסחיטה הומוגנית. שלב 2.4.2.1 אינו חובה במיוחד אם לא ניתן לכוונן את פרמטר התאוצה; זה עוזר להפיץ את ה-PDMS לפני הסיבוב. פרוטוקול זה מניב ממברנות PDMS בעובי של כ-140 מיקרומטר (נמדד עם אינטרפרומטריה; ראה איור משלים 1 וטבלה 2). יש לבצע כיולים לפני ניסויים למקרה שדגם ציפוי הספין או הפרמטרים יובילו למאפייני ממברנה שונים.
  5. אחסן כל צלחת בצלחת פטרי כדי למנוע הצטברות אבק ופלמר למשך הלילה בחום של 65 מעלות צלזיוס בתוך התנור.
    הערה: היזהר משימוש בכלים עמידים בטמפרטורה. מצב הריפוי ישפיע על עיוות ה-PDMS עבור רמת ואקום נתונה המופעלת.

3. כריך ממברנה בטבעות

  1. עיצוב חומר ההרכבה.
    1. תכנן טבעות PMMA בקוטר פנימי/חיצוני כדי להניח את הממברנה העגולה PDMS מצופה ספין (איור 2A). ראה את המידות המוצעות בטבלה 1 ובתיקיה משלימה 3.
    2. תכנן תומך הרכבה (איור 2B) שעליו תתאים הטבעת, והגובה יקבע גם את המתיחה המוקדמת בעת הרכבת הממברנה בטבעת.
      הערה: תמיכת ההרכבה יכולה להיות פתרון פשוט המבוסס על כלי מעבדה קיימים (למשל, צלחת פטרי). פתרון אלגנטי יותר הוא להדפיס בתלת מימד את התמיכה (ראה קובץ FreeCAD של חלק זה המסופק בפרוטוקול זה, ראה תיקייה משלימה 3), מכיוון שניתן להגדיר את הגובה על ידי המשתמש ולשנות אותו בקלות (גובה של 10 מ"מ שימש בפרוטוקול זה עבור הטבעות הקטנות). יש לבחור את גובה החלק המרכזי של התמיכה קטן מגובה חצי הטבעת כך שמצע ה-PDMS לא ייגע בתמיכה בעת ההרכבה (ראה שימוש נוסף בשלב 3.4.2). מדפסת תלת מימד המשתמשת בחוטי חומצה פולילקטית (PLA) (ראה טבלת חומרים) מתאימה לכך. טבעת חיתוך יכולה גם להיות מתוכננת, מודפסת בתלת-ממד, כדי לשמש כמדריך לאזמל (איור 2A).
    3. תכנן ויצר משקולות פליז התואמות בגודלן כדי להפעיל משקל על הטבעת בזמן הרכבת הממברנה (איור 2C) ולהוביל למתיחה מוקדמת הניתנת לשחזור.
      הערה: קבצי ה-FreeCAD המופיעים כאן (ראה תיקייה משלימה 3) תואמים למידות הטבעת המוצגות בפרוטוקול זה.
  2. הסר את קרום ה-PDMS מלוח ה-PMMA.
    1. הכן טבעות PMMA על גבי דף נייר ספסל לבן.
      הערה: חשוב שהספסל והנייר יישארו שטוחים כדי למנוע מהנייר לגעת בממברנת ה-PDMS במהלך ההרכבה.
    2. הסתובבו בזהירות סביב קצה הלוח עם להב (פעם או פעמיים) ואז עקבו אחר אותו הקצה בפינצטה חדה כדי להבטיח של-PDMS יש חתך נקי לאורך כל ההיקף שלו (איור 2A).
    3. השתמש בפינצטה כדי להרים בזהירות את הממברנה בקצה אחד. לאחר מכן, קלף בעדינות את קצה גיליון ה-PDMS עם האגודלים כדי להרים את הממברנה באופן שווה בקצה. נתקו את קצה הממברנה מהצלחת לאורך מחצית מהיקף הצלחת (איור 2A).
      הערה: שפיכת כמה טיפות של 96% אתנול מתחת לממברנת ה-PDMS תעזור להרים את הממברנה מבלי לשבור אותה.
  3. יבש את קרום ה-PDMS.
    1. נגב 96% אתנול סביב כל המשטח העליון של טבעת ה-PMMA שהוכנה בעבר (שלב 3.2.1), בעזרת האצבעות כדי לפזר אותה באופן שווה.
    2. הסר בזהירות את קרום ה-PDMS, הרם מהקצה המורם בעבר (מוסבר בשלב 3.2.3), והנח אותו בצורה סימטרית על טבעת ה-PMMA המכוסה באתנול. הסר קמטים מה-PDMS, אך הקפד לא למתוח את הממברנה; רק ליישר אותו.
      הערה: החלת מתיחה מוקדמת בשלב זה תשפיע על עיוות ה-PDMS עבור רמת ואקום נתונה המופעלת.
    3. לאחר ייבוש מלא של האתנול, ודא שממברנת ה-PDMS דבוקה היטב לטבעת ה-PMMA.
  4. הרכיבו את טבעת המתיחה.
    1. קח עוד טבעת PMMA ריקה. הניחו אותו על גבי טבעת ההרכבה והשתמשו בתפסי מתכת כדי לאטום אותם יחד, תוך סנדוויץ' של ממברנת ה-PDMS בין שתי הטבעות (כריך ממברנה PDMS, איור 2B).
    2. הנח את החצי התחתון של טבעת המתיחה על תומך ההרכבה שתוכנן בשלב 3.1.2 (איור 2B).
    3. הנח את כריך טבעת ה-PDMS על טבעת המתיחה ודחף אותו כלפי מטה בחוזקה עד שהוא מגיע עד למטה. מצע ה-PDMS אינו נוגע בתמיכת ההרכבה. אבטח את האטם במיקום הנכון (איור 2B).
    4. הנח את משקולות הפליז העגולות על גבי הדגימה (איור 2C). זה מחיל מתח מקדים קבוע הדומה לזה של כל הטבעות המותקנות, ומבטיח שחזור נוסף בעת כיול המערכת.
    5. הנח את החצי העליון של טבעת המתיחה המתכתית למעלה, עם חורי ברגים מיושרים, הנח את כל הברגים והדק (איור 2C).
      הערה: בשלב זה, לממברנת ה-PDMS יש חורים, לכן אל תנסה לבטל או לחזור אחורה בפרוטוקול.
    6. חותכים את ה-PDMS סביב הטבעת בעדינות עם להב (איור 2C).
    7. מכסים (למשל, עם צלחת פטרי) כדי להגן על הממברנה מפני אבק (איור 2C).
      הערה: אם יש צורך בתפקוד ה-PDMS עם ג'ל פוליאקרילאמיד, המשך לסעיף 5. למדידות כיול ראשוניות, המשך לסעיף 6. אם יש להשתמש בטבעת ה-PDMS לזריעת תאים, המשך לסעיף 7.

4. וריאציה של ייצור קרום PDMS: דפוס רשת ייחוס

  1. הכן לוחית PMMA (לפני ציפוי ספין PDMS) "מעוצבת" עם רשת מבוססת SU8 שנוצרה באמצעות פוטוליתוגרפיה (איור 2D). לשם כך, עצב דפוס מעניין ליצירת סרט מסכת צילום (מסכת אצטט).
    הערה: קובץ ה-pdf המסופק בפרוטוקול זה (ראה תיקייה משלימה 4) יוצר רשת עם מספרים חלופיים; ראה איור 2D. ניתן ליצור את הרשת באמצעות תוכנה פשוטה כגון Inkscape בהתחשב בגודל התבנית (או חלופות כגון Clewin או FreeCAD). ניתן להדפיס את העיצוב על ידי חברות חיצוניות על סרטי צילום (ראה טבלת חומרים).
  2. פרוטוקול פוטוליתוגרפיה על לוחית PMMA (ראה תיקייה משלימה 3 למאפיינים אופטיים של PMMA).
    1. בצע טיפול בפלזמת חמצן של לוחות PMMA למשך 20 דקות ב-7 וואט עם זרימת חמצן קבועה של 0.8 בר.
      הערה: ודא שהגנת הפלסטיק האפשרית של הלוחות מוסרת וצלחות PMMA שקופות לחלוטין.
    2. אופים 5 דקות בחום של 95 מעלות.
    3. מצננים את לוחית ה-PMMA באמצעות אקדח חנקן, ולאחר מכן מניחים 4 מ"ל של שרף SU-8 2100 על צלחת ה-PMMA בגודל 12 ס"מ (כוונן את עוצמת הקול אם משתמשים בגדלי צלחת שונים).
    4. סובב עם הפרמטרים הבאים (או התאם את פרמטרי הספין ליצירת שכבה בגובה של כ-10 מיקרומטר): 5 שניות ב-500 סל"ד עם תאוצה של 100 סל"ד לשנייה ואחריה 30 שניות ב-4000 סל"ד עם תאוצה של 300 סל"ד לשנייה.
    5. אופים 2.5 דקות בחום של 95 מעלות צלזיוס.
    6. הנח את לוחית ה-PMMA על קשתיות יישור מסיכה בנוכחות מסיכת הגיטרה והשתמש בפרמטרים הבאים: ללא i-line. חשיפה בפס רחב (בין 260 ל-460 ננומטר), 25 mW/cm2, חשיפה של 7.5 שניות.
    7. אופים 3.5 דקות בחום של 95 מעלות צלזיוס.
    8. פתח את התבנית למשך דקה אחת עם פרופילן גליקול מונומתיל אתר אצטט.
    9. שוטפים בהרחבה עם איזופרופנול.
    10. בצע אימות חזותי של איכות התבנית באמצעות אובייקט הגדלה נמוך (2-10x) במיקרוסקופ שדה בהיר.
      הערה: סילניזציה של הצלחת בדוגמת PMMA מגדילה את אורך החיים של התבנית לשימוש חוזר. לשם כך, הפעל את צלחת ה-PMMA המעוצבת למשך 30 שניות עם טיפול בפלזמת חמצן ולאחר מכן בצע טיפול של שעה אחת עם טריכלורו (1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)סילאן תחת ואקום במכסה מנוע כימי.
  3. השתמש בלוחית ה-PMMA המעוצבת כמו בשלבים 2.2 עד 2.5 כדי לסובב את הממברנה הניתנת למתיחה של PDMS.
    הערה: ניתן לדמיין את ה-PDMS המעוצב במיקרוסקופ שדה בהיר, כפי שהוזכר קודם לכן, כמו גם במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (איור 2D). היזהר איזה צד של התבנית פונה כלפי מעלה בעת הרכבת קרום ה-PDMS בטבעת המתיחה כדי להשיג את התבנית בכיוון הרצוי.

5. הצמדת ג'ל פוליאקרילאמיד (PAA) על גבי קרום ה-PDMS

הערה: שלב זה יכול להתבצע על קרום ה-PDMS המחובר ללוחית ה-PMMA (ראה סעיף 2) או על טבעות המתיחה שהותקנו בעבר (ראה סעיף 3). עבודה מתחת למכסה מנוע כימי; לשלבים הכרוכים בחימום, נוח להשתמש בתנור קטן המתאים מתחת למכסה המנוע הכימי, ראה טבלת חומרים; אחרת, שמור את הדגימות בקופסה הרמטית בתנור).

  1. ציפוי מקדים של ממברנת PDMS (איור 2E)
    1. הכן את תמיסת הציפוי על ידי ערבוב 96% אתנול עם 10% (3-אמינופרופיל) טריאתוקסיסילן (APTES) בצינור מיקרוצנטריפוגה (למשל, 20 מיקרוליטר של APTES ב-180 מיקרוליטר אתנול).
    2. הפעל את ממברנות ה-PDMS עם מפרק פלזמה קורונה למשך דקה אחת (או הפעל למשך 30 שניות באמצעות מנקה פלזמה חמצן).
    3. הנח 200 מיקרוליטר מתמיסת APTES/אתנול במרכז הממברנה.
    4. השאירו את הממברנה בחום של 65 מעלות צלזיוס בתוך התנור למשך שעה.
    5. יש לשטוף פעמיים עם PBS. לכביסה השנייה, השאירו את ה- PBS למשך 10 דקות תוך כדי ניעור.
    6. הכן את תמיסת 3% glutaraldehyde (GA) ב-PBS. הניחו 200 מיקרוליטר GA לכל ממברנה על אותו אזור של הממברנה שטופלה ב-APTES.
    7. המתן 25 דקות (לא יותר מ-30 דקות).
    8. יש לשטוף פעמיים עם PBS, בפעם השנייה תוך כדי ניעור.
    9. שאפו את הנוזל והניחו את הטבעת במצב דחייה, עד ש-PBS מתייבש לחלוטין.
  2. סילאניזציה של Coverslip
    1. מכינים 6 מ"ל של Repel Silane ויוצקים אותו לצלחת פטרי.
    2. מניחים כיסויי זכוכית מרובעים בגודל 18 מ"מ בזהירות, בזה אחר זה, לתוך הנוזל.
    3. דגרו את הכיסויים למשך 5 דקות.
    4. הכינו שתי כוסות; האחד מכיל 96% אתנול והשני מים טהורים במיוחד.
    5. הסר את הכיסוי מה-Repel Silane בעזרת פינצטה, ושטוף תחילה באתנול 96%, ולאחר מכן שטיפה במים טהורים במיוחד (הכיסוי אמור לצאת "יבש" משטיפת המים).
    6. מניחים לייבוש במשך 30 דקות נוספות בגבול צלחת פטרי.
  3. חיבור ג'ל פוליאקרילאמיד (PAA) לקרום PDMS
    1. מסדרים מחצית מהכיסויים שטופלו ב- Repel Silane בתחתית צלחת פטרי.
    2. הכינו תערובת ג'ל PAA בקשיחות הרצויה16,18.
    3. מניחים טיפה של 10 מיקרוליטר תערובת ג'ל על גבי כל כיסוי.
    4. הניחו כיסוי נוסף שטופל ב-Repel Silane למעלה כדי לפזר את הג'ל. אל תיישר את שני הכיסויים. ודא שהם מסודרים בצורת כוכב כדי להקל על הפרדה קלה. לחץ בעדינות כך שהג'ל יהיה שטוח אך לא יחרוג מאזור הכיסוי.
    5. המתן 45 דקות עד שעה.
    6. הפרד את הכיסויים בעדינות בעזרת פינצטה. ודא שהג'ל נשאר מחובר לאחד מהחלקות הכיסוי.
    7. קח את הכיסוי שאליו מחובר הג'ל והנח את הג'ל במגע עם אזור ה-PDMS שטופל בעבר ב-GA (איור 2E).
    8. לחץ בשתי אצבעות מלמטה ומלמעלה למשך 5 שניות.
    9. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    10. למחרת, מלאו את הטבעת ב-PBS למשך 30 דקות.
    11. נתק בעדינות את הכיסוי העליון בעזרת פינצטה.
    12. צייר את היקף ג'ל ה- PAA עם טוש קבוע מהצד השני של קרום ה- PDMS. פעולה זו עוזרת לאתר את הדגימה בשלבים הבאים.
    13. שאפו את ה-PBS.
    14. בצע שלב פונקציונליזציה כדי להקל על ההצמדה של חלבון המטריצה החוץ-תאי הרצוי לג'ל15.

6. פעולת מכשיר מתיחה, כיול מתח והערכת רזולוציה

  1. הכן טבעת מתיחה PDMS עם חרוזי פלורסנט לכיול מתח.
    1. הכן דילול של 1:50000 של חרוז פלואורסצנטי של 0.1 מיקרומטר או 0.2 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים) בתמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) על ידי דילול סדרתי (תמיסת ביניים של 1:500 של 1 מ"ל ב-PBS עם 2 מיקרוליטר של תמיסת מלאי החרוזים ואחריו דילול סופי של 10 מיקרוליטר מתמיסת הביניים ב-1 מ"ל של PBS).
      הערה: צפיפות חרוזים גבוהה על הממברנה היא אופטימלית לשלב הכיול; אל תעשה סוניקציה של התמיסה, מכיוון שגושי חרוזים עוזרים לפעולה במהלך הכיול.
    2. הנח טיפה של 10-30 מיקרוליטר במרכז ה-PDMS.
      הערה: ניתן לתכנן בנוחות את תמיכת ההרכבה עם דגימה צולבת למרכז
    3. השאירו לייבוש בטמפרטורה של לא יותר מ-40 מעלות צלזיוס כדי למנוע בעיות מבלבלות לאחר ריפוי.
  2. הכן טבעת מתיחה PDMS עם חרוזים פלואורסצנטיים להערכת רזולוציה.
    1. עקוב אחר הפרוטוקול של קול ו-al.19 כדי להכין את תמיסת החרוזים באמצעות חרוזים בקוטר קטן מגבול העקיפה, בדרך כלל חרוזים בקוטר 0.1 מיקרומטר.
      (ראה טבלת חומרים). סוניקציה קפדנית של פתרונות החרוזים בכל שלב ביניים.
    2. השתמש בטיפול בקורונה במרכז הטבעת כדי להפעיל את מצע ה-PDMS.
    3. מורחים מיד 20 מיקרוליטר מתמיסת החרוזים על גבי האזור המרכזי של ה-PDMS המטופל ומניחים לייבוש.
      הערה: במקרה זה, תמיסת החרוזים מדוללת מאוד ומודגרת על ה-PDMS ההידרופילי כדי להבטיח פיזור נרחב ולקבל חרוזים בודדים מופרדים של 0,1 מיקרומטר הנספגים על המצע.
  3. הרכבת מכשיר המתיחה על המיקרוסקופtagמחזיק (איור 1F).
    1. הרכיב את עמוד המתיחה במיקרוסקופ.
    2. מרחו בנדיבות חומר סיכה (וזלין) על גבי האזור העגול של העמוד (החלק האמצעי, איור 1D, F).
      הערה: השימוש בחומר הסיכה הוא חובה למצע ה-PDMS כדי להתגבר על חיכוכים ולהחליק על העמוד, ויש צורך לרענן את חומר הסיכה בין כל דגימה. וזלין משמש כחומר סיכה נוח מאוד בהתקנה המוצגת בפרוטוקול זה.
    3. התקן את טבעת המתיחה שהוכנה בשלב 6.1 במוט המתיחה והברג את המכסה העליון כדי לאטום את המכלול.
    4. חבר את בקר הוואקום למקור הוואקום ולעמוד המתיחה (איור 3A).
      1. חבר את החלק האחורי של תיבת בקרת הוואקום למקור הוואקום (איור 3A).
      2. חבר את החלק הקדמי של הקופסה לעמוד המתיחה (איור 1B, D, F).
        הערה: מקור הוואקום יכול להיות קו הוואקום הזמין בתשתית הבניין. נדרש ואקום מתון למתיחה מספקת אך תלוי בקוטר טבעת המתיחה (יתקבל מתח קטן יותר באותה רמת ואקום לקוטר קטן יותר). לחלופין, משאבות ואקום זמינות מסחרית (Fluigent או Elveflow מספקות משאבות ואקום אוטונומיות); במקרה זה, עקוב אחר הוראות היצרן לחיבור למקור הוואקום. אל תשתמש באספקת ואקום ללא מקור מבוקר ואקום (כגון תיבת בקרת הוואקום המותאמת אישית המוצגת בפרוטוקול זה או המערכות הזמינות מסחרית)
  4. כיול מתח
    1. בחר תחום עניין הכולל צפיפות חרוזים גבוהה בכל שדה הראייה וגושי חרוזים ניתנים לזיהוי עבור המשתמש (ראה איור 3B).
    2. רכוש תמונה "במנוחה" של שדה הראייה הנבחר (שמור את המיקום).
    3. החל מתיחה ברמת ואקום נמוכה (בהגדרה זו, -20 mbar). הדגימה תנוע לכל הכיוונים (XYZ).
    4. התמקד מחדש תחילה במישור ה-z.
    5. הזז את הבמה בכיווני x-y כדי למצוא את אותו אזור עניין שמצולם במנוחה, מקד את תמונת החרוזים במצב מתוח וקבל תמונה.
      הערה: אם הדגימה מאוד לא ממורכזת, אזור העניין ישתנה באופן משמעותי, בהתאם לגודל המתח. התזוזה תהיה גדולה יותר מהמרכז, אך גודל המתח אינו תלוי במיקום הדגימה על המצע. הקלט תמונות ללא שילוב, ברזולוציה של 2048x2048.
    6. שחרר את המתח. חזור על שלבים 6.4.3-6.4.5 עם רמת ואקום גבוהה יותר (-30 mbar, -40 mbar וכו').
      הערה: למטרות כיול, חזור תמיד למצב מנוחה לפני מתיחה מחדש (ראה איור משלים 3A), מכיוון של-PDMS יש התנהגות היסטרזיס בעת עיוות.
    7. הרכיב טבעת מתיחה שנייה וחזור על שלבים 6.4.1-6.4.6. בצע כיול זה עבור לפחות 3 טבעות מתיחה שונות.
    8. אחסן את התמונות שנרכשו בתיקייה המאורגנת לפי דוגמה.
    9. בכל תיקיה, תן שם לתמונת חרוז הייחוס שנרכשה במנוחה reference_str1, והתמונות נמתחות בוואקום הולך וגובר stretched_str1, stretched_str2, stretched_str3 וכו'.
      הערה: שלב זה מהווה את כיול הליבה של המערכת. בהתאם לצרכי המשתמש, יש לבצע כיול נוסף באמצעות דגימות חרוזים דומות אך באמצעות פרוטוקולי יישום ואקום אחרים. החל פרוטוקול זן הדומה לזן המופעל על הדגימה הביולוגית (ראה סעיף תוצאות מייצגות).
  5. השתמש בקוד Matlab כדי לכמת את הזן20.
    1. הורד את כל תיקיית Matlab בקישור הבא https://github.com/xt-prc-lab/Le_Roux_et_al_2024_JOVE
      הערה: הקוד הראשי שיש להריץ נקרא gel_strain וקורא לקבצי קוד אחרים של Matlab שיש לשמור כפי שסופקו, המאוחסנים באותה תיקייה כמו הקוד הראשי.
    2. פתח את Matlab ופתח את הקוד gel_strain.
    3. הגדר את הפרמטרים (ראה טבלה 3, Code_Parameter להגדרות מומלצות).
    4. הגדר את נתיבי תיקיית האב ותיקיית הניסוי כפי שמצוין בקוד.
      הערה: אם התיקייה אינה קיימת, הקוד יציג חלון אזהרה קופץ; בחר הוסף לנתיב ודפדף עד לתיקיית הניסוי שבה מאוחסנות תמונות.
    5. הפעל את קוד gel_strain .
    6. פתח stretched_str1 כמתבקש בקוד.
    7. פתח reference_str1 כמתבקש בקוד.
      הערה: נוח לעבד את כל התמונות המתוחות ברמות ואקום שונות בבת אחת כפי שמצוין בפרוטוקול זה; יש לאחסן את כל הקבצים באותה תיקייה ניסיונית, אך הקוד מבקש רק לפתוח את התמונה המתוחה הראשונה. שמות תמונות צריכים להסתיים בשמות strX, X הם מספרים מצטברים 1, 2, 3 וכו', כפי שמצוין בנקודה 6.4.9 בפרק זה.
    8. ודא שתיקיית התוצאות מופיעה עם 4 תיקיות המשנה: נתונים חתוכים המכילים את הנתונים שנחתכו ומיושרים; תזוזות המכילות את קובץ תזוזת החרוזים; תמונות המכילות את התרשים של התזוזה הרדיאלית והמתח; זנים המכילים את הגיליון האלקטרוני של מטריצת המתח המתקבלת עבור כל רמת ואקום.
      1. חשב את החציון של מטריצת המתח עבור כל רמת ואקום.
      2. חזור על הפעולה עבור כל דגימה (מינימום 3).
      3. שרטט את מטריצת המתח החציונית לעומת רמת הוואקום עבור 3 הדגימות כדי לקבל את עקומת הכיול (איור 3C).
        הערה: ניתן לשנות כמה פרמטרים למקרה שתמונת החרוז לא תעובד כראוי מהקוד. לשם כך, פתח את set_settings_stretch הקובץ ב-Matlab ושנה את Settings.Resolution ו-Settings.Overlap בהתאם להמלצות בהערות קוד (ראה גם טבלה 3). בהתאם לצרכי הניסוי, הזן המופעל על הדגימה הביולוגית יכול להיות מגוון (מתח מחזורי, מתח גדול יותר וכו'): מומלץ כיול של תנאים אלה (ראה דוגמאות באיור משלים 2 ובאיור משלים 3).
  6. הערכת רזולוציה (עקוב אחר הפרוטוקול של Cole et al.19)
    1. הרכיב את טבעת המתיחה שהוכנה בשלב 6.2.
    2. דמיינו שדה ראייה המכיל נקודות חרוז בודדות (דמיינו ערימה עם מרחק צעד Z הרלוונטי למטרה בה נעשה שימוש).
    3. השתמש ב-MetroloJ (תוסף פיג'י), כפי שמצוין ב-Cole et al., כדי לאפיין את רזולוציית ה-XYZ של מערך המתיחה (איור 3D ואיור משלים 4).

7. זריעה ומתיחה של תאים

  1. ציפוי ה-PDMS בחלבון הידבקות תאים
    1. עקרו את טבעת ה-PDMS על ידי חשיפתה לאור אולטרה-סגול למשך 15 דקות (איור 4A). בצע את כל השלבים הבאים של הפרוטוקול מתחת למכסה המנוע כדי להבטיח סטריליות.
    2. שוטפים את הצלחת מתחת למכסה המנוע עם PBS סטרילי.
    3. דגירה של חלבון הידבקות תא 11,14,15 על ידי הפקדת טיפה של 100-200 מיקרוליטר של התמיסה במרכז הטבעת (איור 4A).
      הערה: בדרך כלל, תמיסה של 10 מיקרוגרם/מ"ל של פיברונקטין מתאימה11. ניתן להשתמש בחלבוני הידבקות מעניינים אחרים לציפוי ה-PDMS (למשל, למינין, קרטין15; ייתכן שיידרשו טיפולים/פרוטוקולים ספציפיים). דגירה לציפוי פיברונקטין מומלצת למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס; השיטה החלופית היא שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס.
    4. צייר את היקף הטיפה עם טוש קבוע מהצד התחתון של קרום ה-PDMS. פעולה זו עוזרת לאתר את הדוגמה בשלבים הבאים.
  2. זריעת תאים על טבעת ה-PDMS (איור 4A).
    1. במידת הצורך, העבירו את התאים המעניינים עם חלבון פלואורסצנטי לפני ניסוי המתיחה (עבור טרנספקציות חולפות, 1-3 ימים לפני הניסוי, תלוי בשיטת הטרנספקציה ובמאפיינים) או השתמשו בפרוטוקולים ספציפיים כדי לדמיין את הסמנים הפלואורסצנטיים המעניינים.
      הערה: לניסויים ראשוניים, נוח להשתמש בסמן קרום פלזמה כגון GFP-mem11,12 כדי לדמיין את תגובת קרום התא וקרעים פוטנציאליים. קל להעביר את הסמן, ומומלץ למתוח את התאים המועברים ברמות מתח הולכות וגדלות כדי להעריך את סף המתח שיוביל לקרע בקרום הפלזמה. ראה את מפת הפלסמיד בתיקייה משלימה 5. זה תלוי בסוג התא ויהיה נמוך יותר בניסויים של תא בודד בהשוואה לחד-שכבות של תאים. סמן ממברנה זה תואם למתיחת תאים, בניגוד לכמה צבעים המוחדרים לממברנה שנצפו כמובילים לקרע בקרום הפלזמה ברמות מתיחה נמוכות.
    2. ביום הניסוי, יש לחמם את המדיה הסלולרית ולהכין מדיה בלתי תלויה ב-CO2.
      הערה: אם למיקרוסקופ יש בקרת CO2 התואמת למערכת המתיחה, ניתן לבצע את הניסויים במדיה רגילה של תרבית תאים (זו תהיה הגדרה הכרחית עבור דגימות עדינות שאינן יכולות לשרוד במדיה בלתי תלויה ב-CO2). מומלץ ליטול ללא תלות ב-CO2 עם חומר נוגד הלבנה (למשל, עבור חלבוני GFP, תוסף רוטין21 במינון 10 מ"ג/מ"ל).
    3. נסה את התאים וספור אותם.
    4. זרע מספר מתאים של תאים בנפח קטן (20-50 מיקרוליטר) עם מדיה תאית סטנדרטית כדי לקדם את התקשרות התאים ולשמור באינקובטור מבוקר לחות CO2.
      הערה: עבור פיברובלסטים שטוחים וגדולים וניסויים חד-תאיים, 5000 תאים; המספרים תלויים בסוג התא ובניסוי עצמו.
    5. לאחר דגירה של 20-30 דקות (בדוק את חיבור התא הראשוני), הוסף בעדינות מדיה של 500 מיקרוליטר על גבי התאים. הכניסו בחזרה לאינקובטור כדי לאפשר התפשטות נוספת של התאים.
      הערה: זמן הזריעה תלוי בסוג התא ובדרישות הניסוי; היווצרות חד-שכבתי עם דגירה לילית אפשרית גם כן. יש להתאים את נפח אמצעי הגידול בהתאם. צביעת תאים משנית: לאחר החיבור, ניתן לצבוע תאים בצבע כגון SpyDNA (ראו טבלת חומרים) כדי להמחיש את הגרעינים (איור משלים 5) או צביעה אחרת כדי להמחיש כל מבנה מעניין. היזהר תמיד כי צביעת תאים חיים או ביטוי יתר של חלבון על ידי טרנספקציה יכולים להשפיע על תגובת התא למתיחה, במיוחד בקליפת התא, בקרום הפלזמה או בחלבונים/מבנים רגישים למכניקה.
    6. החלף למדיה בלתי תלויה ב-CO2 והשתמש מיד במכשיר המתיחה.
      הערה: כעת, הדגימה מוכנה לניסוי מתיחה.
  3. ניסוי מתיחת תאים: דוגמה למחזור שחרור מתיחה יחיד והדמיה של קרום פלזמה (PM) כדי ללכוד שיפוץ PM דינמי של פיברובלסטים.
    1. התקן את טבעת המתיחה על המיקרוסקופ stage כמו בסעיף 6, שלב 6.2.
    2. מצאו תא מעניין, רשמו את מיקומו וצלמו תמונה של התא המתוח מראש (איור 4B).
    3. החל את הוואקום הרצוי שעל פי עקומת הכיול תואם את זן המצע הרצוי.
    4. כדי למצוא את התא המתוח, תחילה התמקד מחדש ב- Z ולאחר מכן עבור בכיוון X-Y כדי לחפש ולמרכז את התא בחזרה לשדה הראייה.
    5. הקלט תמונות במהלך משך הזמן הרצוי (איור 4B).
      הערה: בדרך כלל יש צורך בניסויים ראשוניים כדי לקבוע את תגובת התא למתח מתיחה בהתאם לסוגו (בממוצע). מתחו את התאים בזני מצע שונים כדי לקבוע את העומס המרבי שהם יכולים לשאת. קרע בקרום הפלזמה יתרחש, כפי שמוצג דרך סמן הממברנה הפלואורסצנטית של קרום הפלזמה, אם המתח מוגזם עבור התא.
    6. לשחרור תאים, חזור למיקום התא במנוחה והפעל את מצב הרכישה של המיקרוסקופ כדי להבטיח שהרכישה תוכל להתחיל ברגע שהדגימה התמקדה מחדש.
    7. שחרר את המתיחה והתמקד מחדש במהירות באופן ידני ב-Z.
    8. הקלט תמונות של התא המשוחרר למשך הזמן הרצוי (איור 4B). בשל האופי הגמיש של קרום ה-PDMS, הדגימה מתמקדת בקלות עם הזמן. לכן, התאם ידנית את המיקוד לאורך רכישת התמונה.
      הערה: כדי להתמקד מחדש בהצלחה במהלך ההדמיה לאחר השחרור, יש לדמיין תמונות לעתים קרובות מספיק; הדמיית וידאו של 3-5 דקות כל 3 שניות היא סבירה. מצע ה-PDMS אינו תואם למערכת המיקוד המושלמת של המיקרוסקופ, ולכן בדרך כלל נדרשת התאמה ידנית על ידי המשתמש לרכישה מהירה. מיקוד התוכנה עשוי להיות מיושב, אך היזהר משגיאות אפשריות ותנועת במה גדולה שעלולה לפגוע במטרה על ידי פגיעה בחלק של עמוד מתיחה. המשתמש יכול להחליט לבצע מתיחות מרובות של הדגימה בהתאם לניסוי.
  4. לאחר עיבוד: יישר את התמונות באמצעות פיג'י
    1. פתחו את התמונות במנוחה והתאמצו.
    2. השתמש בהתאמת תבנית התוסף של פיג'י ובחר אזור בתא ליישור (איור 4C).
      הערה: תזוזות יחסיות של תמונת המתח המיושר מעובדות על-ידי פיג'י, והתמונות נחתכות ומיושרות. הורד את התוסף template_matching מקישור זה : https://sites.google.com/site/qingzongtseng/template-matching-ij-plugin

8. זריעת תאים על מצע מתוח מראש

  1. הרכיב את הטבעת המתוחה המצופה בחלבון ההדבקה במכשיר המתיחה.
  2. מתחו את מצע ה-PDMS לרמת המתח הרצויה.
  3. זרע את התאים כמו בסעיף 7.
    הערה: בניסוי זה, הזריעה אינה מתבצעת בתנאים סטריליים, ולכן ייתכן שהפרוטוקול לא יתאים לכל סוגי התאים.
  4. לאחר שהתאים נדבקו, החלף את המדיה למדיה בלתי תלויה ב-CO2.
    הערה: בחר תאים נצמדים במהירות כדי למזער את זמן ההדבקה.
  5. לאחר זמן הדגירה הרצוי, שחרר את המתיחה ודמיין תא מעניין.
    הערה: בשלב זה, קשה למצוא את אותו תא לאחר שחרור מתיחה, מכיוון שמיקום התא במנוחה אינו ידוע, ותנועת מצע ה-PDMS אינה ניתנת לחיזוי בקלות.

9. תיקון תאים מתוחים או רגועים

  1. תיקון תאים במצבים מתוחים (עבודה תחת מכסה מנוע כימי)
    הערה: פרפורמלדהיד (PFA) הוא חומר קיבוע סטנדרטי; השתמש בו חם ב-37 מעלות צלזיוס כדי להבטיח קיבוע מהיר. לחלופין, תמיסת גליוקסל22 מאפשרת קיבוע דגימה מהיר עם שימור דגימה טוב.
    1. הכן חומר קיבוע.
    2. תאי זרע על הטבעות בעקבות שלב 7.2.
    3. התקן את עמוד המתיחה והבקר בתוך מכסה המנוע הכימי והתחבר לאספקת הוואקום.
    4. הניחו את הטבעת עם תאים זרועים בעמוד המתיחה.
    5. כדי לתקן את המצב המתוח, יש למתוח למתח הרצוי. הסר את אמצעי תרבית התאים ותקן על ידי הוספת תמיסת PFA 4% לתאים למשך 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן שטפו עם PBS, תמיד החזיקו את המתיחה. שחרר לאט את הוואקום ושטוף עם עוד PBS.
      הערה: אל תשכח להכין מצב בקרה שאינו מתיחה (לשם כך ניתן לחתוך ולייבש חתיכת PDMS קטנה עם כמות קטנה של תמיסת אתנול 96% מתחת, על גבי כיסוי זכוכית). כדי לצלם את הדגימה הקבועה, מומלץ למתוח את הדגימה בחזרה לאותו גודל. מכיוון ש-PFA רעיל, יש לנקוט באמצעי זהירות נאותים בשלב זה. נוח להשתמש בתנור קטן שניתן לשמור מתחת למכסה המנוע, ראה טבלת חומרים).
    6. דמיין את הדגימה, רצוי למרוח את הוואקום שוב, באותה רמה המשמשת בעת הקיבוע, מה שמבטיח "שיטוח מחדש" של הדגימה (איור 4D).
  2. תקן תא לאחר שחרור מתיחה (עבד מתחת למכסה המנוע הכימי).
    1. מותחים את התאים למתח ולזמן הרצויים. רגע לפני שחרור מתיחה, הסר את רוב המדיה מבלי לייבש לחלוטין את הדגימה ושחרר את המתח. לחלופין, החל מתיחה מחזורית של משך זמן מסוים.
    2. הסר במהירות מדיה ותקן מיד עם תמיסת הקיבוע למשך 10 דקות. שטפו עם PBS ותמונה.
      הערה: ניתן לזרוע את הדגימה גם על מצע מתוח מראש, ולאחר זמן זריעה מוגדר על ידי המשתמש, לתקן שחרור לאחר מתיחה כמו בשלב 9.2.2.
  3. אימונופלואורסצנציה של דגימה קבועה: עקוב אחר הפרוטוקולים הסטנדרטיים לאימונופלואורסצנציה במתיחה או בשחרור; חסימה עם ג'לטין דגים עדיפה על BSA17.
  4. דמיינו את המדגם (איור 4E).
  5. שימור לדוגמא
    1. הכן אמצעי הרכבה לשימור דגימה (Mowiol או Prolong).
    2. הסר את ה-PBS והוסף טיפה (כ-75 מיקרוליטר) של מדיית הרכבה.
    3. תפסו כיסוי בפינצטה והניחו אותו בעדינות מעל (הימנעו מבועות, שיפגעו בהדמיה).
    4. יבש לפחות 48 שעות בטמפרטורת החדר (RT).
    5. חתוך סביב הדגימה הקבועה של PDMS והרכיב על כיסוי זכוכית נוסף להדמיה מאוחרת יותר.
      הערה: שלב זה אינו תואם להדמיה לאחר הדמיה של הדגימה על הממברנה המתוחה שכן הרכבת קרום ה-PDMS על כיסוי עם אמצעי השימור כרוכה בשימור הממברנה במצבה הרגוע בלבד.

10. קיבוע עם הרשת להדמיית אותו אזור דגימה במצבים שונים - הדמיית SEM כדוגמה

הערה: ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לדמות את אותו תא בודד בשני מיקרוסקופים שונים, מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק, כפי שמוצג כאן. הדמיה קורלטיבית דורשת עיבוד תמונה מתקדם שאינו בתחום של פרוטוקול זה. יישומים שימושיים אחרים יכולים להיות, למשל, הדמיה של הדגימה במצב חי, קיבוע נוסף מתחת למכסה המנוע והדמיה של אותו תא לאחר צביעה חיסונית (הפרוטוקול המשמש עבור איור משלים 5).

  1. הכן טבעת מתיחה באמצעות לוחות PMMA המעוצבים מסעיף 4.
  2. זרעו את התאים כמו בשלב 7.2.
    הערה: היזהר כי יש ליישם בזהירות את תמיסת הציפוי כדי להבטיח כיסוי מלא של ה-PDMS, אפילו בחורי הרשת הקטנים.
  3. תקן כמתואר בסעיף 8 אך באמצעות קיבוע ופרוטוקול מתאימים התואמים לדגימה ולהדמיית מיקרוסקופ אלקטרונים.
    הערה: אם משתמשים בתערובת של PFA + glutaraldehyde (למשל, 2%-2.5%), היזהרו מאוטופלואורסצנטיות הנובעות מנוכחות של מגיב גלוטראלדהיד ובסופו של דבר בצעו את שלבהמרווה 23.
  4. דמיין את הדגימה במצב פלואורסצנטי ורשום את מיקום התא (הדפס את הרשת ורשום את המיקום עם צלב, למשל).
  5. לאחר צילום כל התמונות, הכן את הדגימה ל-EM על ידי חיתוך תחילה של ה-PDMS סביב הדגימה (קודם לכן הסרת חומר הסיכה).
  6. עבד את ממברנת ה-PDMS + דגימה לסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים (הכולל פרוטוקול סטנדרטי של התייבשות דגימה וקיזוץ מתכת)12.
  7. בעת הדמיה במיקרוסקופ SEM, מצאו את מיקומי הרשת וחפשו את התאים שצולמו בעבר במצב פלואורסצנטי (איור 4F,G).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כיול ורדיאליות
אפיון נכון של הזן המתקבל הוא ערובה לשחזור ובקרה של הניסויים. בעוד שניתן להוסיף חרוזים פלואורסצנטיים לכל דגימה כדי לתעד במדויק את המתח, שלב כיול קודם מבטיח תכנון נכון של הניסוי, תוך ידיעת גודל המתח שהנסיין רוצה להפעיל על הדגימה לפני המתיחה בפועל. המתח לא יהיה תלוי רק בוואקום המופעל אלא ישתנה בהתאם למידות טבעת המתיחה, הרכב ה-PDMS (תערובת שונה מ-1:10), עובי הממברנה והמתיחה המוקדמת של קרום ה-PDMS לפני ההידוק בטבעת. לכן, כל מערך ניסוי חייב להיות מכויל בנפרד. שימוש בתמונה הומוגנית של חרוזים פ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מספר רב של מכשירי מתיחה שימשו ליישום מתיחה מכנית על דגימות ביולוגיות, המחקות תנאים פיזיולוגיים בגוף 24,25. הגדרות רבות זמינות בספרות, ותצפית על תגובת הדגימה מתבצעת בדרך כלל על ידי צימוד התקני מתיחה לכוח אטומי26 או מיקרוסקופיה פלואורסצנטית 27,11.

התכנון והתפעול של מכשיר המתיחה המוצג כאן מאפשרים הקלטה של תמונות כאלה בתאים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איננו מצהירים על ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מימון מקרן "la Caixa" (מענק 406 LCF/PR/HR20/52400004 ל-X.T., J.V.R., ו-P.R.-C. ומלגות LCF/BQ/DR19/11740009 ל-407 I.G.-M. ו-LCF/BQ/DR19/11740009 ל-M.M.J.), משרד המדע והחדשנות הספרדי 408 (PID2022-142672NB-I00 ל-P.R.-C., PID2021-128635NB-I00 ל-X.T., ו-PID2022-141040NA-I00 409 ל-I.A.), ה-Generalitat de Catalunya (2021 SGR 01425 ל-X.T. ו-P.R.-C.), פרס "ICREA 410 Academia" למצוינות במחקר ל-P.R.-C., Fundació la Marató de TV3 (201936-30-31 עד 411 P.R.-C.), האיחוד האירופי (ERC, MECHANOSYNTH, מענק 101097753 ל-P.R-C. ו-ERC, Adv-412 883739 אפיפולד ל-X.T.). עם זאת, ההשקפות והדעות המובעות הן של המחברים בלבד ואינן משקפות בהכרח את אלה של האיחוד האירופי או הסוכנות המבצעת של מועצת המחקר האירופית. לא האיחוד האירופי ולא הרשות המעניקה לא יכולים לשאת באחריות להם. A.E.M.B. נתמך על ידי מלגת סר הנרי וולקאם (210887/Z/18/Z). המחברים מודים למימון ממלגת חואן דה לה סירבה הנתמכת על ידי MCIU/AEI/10.13039/501100011033 והקרן החברתית האירופית פלוס (FSE+) (JDC2023-051559-I to V.V). IBEC זכתה בפרס Severo 415 Ochoa למצוינות מ-MINCIN. אנו מודים ל-V González-Tarragó על הסיוע במערכת המתיחה ול-Evelyn Coderch על התמיכה הטכנית. ברצוננו גם להודות לתמיכה שניתנה על ידי ה-Unitat de Criomicroscòpia Electrònica TEM/SEM (Centers Científics i Tecnològics de la Universitat de Barcelona, CCiTUB) והמתקן לאפיון MicroFabSpace ומיקרוסקופיה, יחידה 7 של ICTS 'NANBIOSIS' מ-CIBER-BBN ב-IBEC. אנו מודים גם למריה גרסיה פאראג'ו על הקלת התקשורת עם הסדנה המכנית ICFO ו-Tecnifill על הסיוע החלק בהנדסת חלקים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מסכת אצטטג'יי.די פוטודאטה
אקרילאמידביורד161-0140תמיסת אקרילאמיד 40%
APSסיגמא אולדריץ'א3678אמוניום פרסולפט לאלקטרופורזה, ≥ 98%
אפטססיגמא אולדריץ'281778(3-אמינופרופיל) טריאתוקסילאן
משאבה מיקרופלואידית אוטונומיתElveflow קובלטקובלט כפולקובלט כפול
ביסקרילאמידביורד161-0142תמיסת ביס 2%
להבפישר סיינטיפיק11733919קבוצה דידקטית חוג'ה didá ctica X100 LAME BISTOURI STERILE N° 23  למד23 
קליפיםספרינטיסAKXX000001קליפס בול דוג, 32 מ"מ, עשוי מתכת, קיבולת 10 מ"מ, מצופה ניקל
מטפל בקורונהמוצרים אלקטרוטכנייםBD-20AC, מקט צג:12051Aמטפל בקורונה במעבדה BD-20AC
כוסותVWR611-1368VWR, כוסות, חד פעמי, 250 מ"ל
DAPIרוש10236276001צביעת DAPI
אתנול 96%Panreac Quí נציץ, SLU131085-1212אטנול 96% v/v paraá ליסיס, ACS- 2,5 ליטר
פיברונקטיןסיגמאF0895פיברונקטין, מפלזמה אנושית, נוזל  0.1%
FluoSpheres מיקרוספירות שעברו שינוי קרבוקסילט, 0.1 ומיקרו; mטכנולוגיית חייםF8801, F8803חרוזים פלואורסצנטיים צהובים, ירוקים ואדומים להערכת רזולוציה
FluoSpheres מיקרוספירות שעברו שינוי קרבוקסילט, 0.2 ומיקרו; mפישר סיינטיפיקF8809, F8810חרוזים פלואורסצנטיים צהובים, ירוקים ואדומים לכיול מתח
גלוטראלדהידסיגמא אולדריץ'G6403פתרון Glutaraldehyde 50% ב-H2O
אינטרפרומטרVeeco וויקו NT1100אינטרפרומטר למדידת עובי ממברנות PDMS
איזופרופנולPanreac Quí נציץ, SLUברקוד 131090-1212 2-פרופנול (Reag. Ph. Eur.) para aná lisis, ACS, ISO
לייטון שוקלבהתאמה אישית
טישו נטול מוךברקשיירDURX670, DR670090920מגבונים לא ארוגים
חומר סיכה (וזלין)סיגמא16415וזלין
קשתיות יישור מסכהSü ss MicroTec MJB4 קשתיות יישור מסיכה לפוטוליתוגרפיה על לוחות PMMA
מוביולקלביוכם - Merck475904מגיב MOWIOL 4-88
מיקרוסקופ NIKON מסתובב דיסק קונפוקליניקוןליקוי חמה Ti-E/Bמצויד ב-Nikon Ti-S-ER  במה
מיקרוסקופ NIKON זקוףניקוןליקוי חמה Ni-Eמצויד בשלב NI-SH-E של ניקון
אובייקטיבי 60xניקוןCFI Apo NIR 60X WNIR Apo 60X/1.0w DIC N2 WD 2.8
פתרון PBSג'יבקו14200067DPBS, פי 10
PDMSדאו קורנינג2401673921Sylgard - ערכת אלסטומר סיליקון 184 DN 109
כיסוי טבעת צלחת פטרי (גדול)פרוקינורט93060Plato de cultivo celular TPP מק"ט: 07177925 diametro 100
כיסוי טבעת צלחת פטרי (קטן)פרוקינורט93060Plato de cultivo celular TPP מק"ט: 07177924
מנקה פלזמההאריק PDC-002מחולל פלזמה חמצן
צלחות וטבעות PMMAראה טבלת מפרט Excel במסמכים משלימים
האריךInvitrogenP36930 /P36934מגיב נוגד דהייה זהב ProLong
דחייה-סילאןGE Healthcare17-1332-01PlusOne Repel-Silane ES
טבעות / טבעת גומיטכניפילבהתאמה אישית
ציפוי ספיןלורלWS-650Szציפוי ספין
SPY650-DNAספירוכרוםSC 501SPY650-DNA
כפית היגויVWR231-0416מרית חד פעמית קצרה אקולוגית, כף וכף כפולה, תוסף PP ו-EcoPure
שרף SU8 2100מיקרוכימיהY111075SU8-2100
SU8 - מפתחסיגמא-אולדריץ'484431פרופילן גליקול מונומתיל אתר אצטט
תמדסיגמא-אולדריץ'T9281-50 מ"לN,N,N',N'-טטרמתיל-אתילנדיאמין, ביו-ריאגנט suitab. מגיב אלקטרופורזה
טריכלורו (1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)סילאן סיגמא אולדריץ'448931  טריכלורו (1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)סילאן
פינצטהIESMATT5039 פינצטה HP Dumont 7 נירוסטה. קצה 0.17 x 0.10 מ"מ. (אגר סיינטיפיק בע"מ)
בקר ואקוםגרקאפ/פרקר  990-005203-005 Controlador de vacio 
בקר ואקום שוטףשוטףLU-FEZ-N800LineUp Flow EZ (n800mbar)
נייר ספסל לבןריימה931.1001  נייר Raima 42 x 52

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huang, L., Mathieu, P. S., Helmke, B. P. A stretching device for high-resolution live-cell imaging. Ann Biomed Eng. 38 (5), 1728-1740 (2010).
  2. Meza, D., Abejar, L., Rubenstein, D. A., Yin, W. A shearing-stretching device that can apply physiological fluid shear stress and cyclic stretch concurrently to endothelial cells. J Biomech. Eng. 138 (3), 4032550(2016).
  3. Constantinou, I., Bastounis, E. E. Cell-stretching devices: advances and challenges in biomedical research and live-cell imaging. Trends Biotechnol. 41 (7), 939-950 (2023).
  4. Trepat, X., et al. Viscoelasticity of human alveolar epithelial cells subjected to stretch. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287 (5), L1025-L1034 (2004).
  5. Kaunas, R., Nguyen, P., Usami, S., Chien, S. Cooperative effects of Rho and mechanical stretch on stress fiber organization. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (44), 15895-15900 (2005).
  6. Barbee, K. A., Macarak, E. J., Thibault, L. E. Strain measurements in cultured vascular smooth muscle cells subjected to mechanical deformation. Ann Biomed Eng. 22 (1), 14-22 (1994).
  7. Wipff, P. J., et al. The covalent attachment of adhesion molecules to silicone membranes for cell stretching applications. Biomaterials. 30 (9), 1781-1789 (2009).
  8. Wen, H., Blume, P. A., Sumpio, B. E. Role of integrins and focal adhesion kinase in the orientation of dermal fibroblasts exposed to cyclic strain. Int Wound J. 6 (2), 149-158 (2009).
  9. Chu, S. Y., et al. Mechanical stretch induces hair regeneration through the alternative activation of macrophages. Nat. Commun. 10 (1), 1524(2019).
  10. Le Roux, A. L., et al. Dynamic mechanochemical feedback between curved membranes and BAR protein self-organization. Nat. Commun. 12 (1), 6550(2021).
  11. Kosmalska, A. J., et al. Physical principles of membrane remodelling during cell mechanoadaptation. Nat. Commun. 6 (1), 7292(2015).
  12. Quiroga, X., et al. A mechanosensing mechanism controls plasma membrane shape homeostasis at the nanoscale. Elife. 12, e72316(2023).
  13. Casares, L., et al. Hydraulic fracture during epithelial stretching. Nat Mater. 14 (3), 343-351 (2015).
  14. Beedle, A. E. M., et al. Fibrillar adhesion dynamics govern the timescales of nuclear mechano-response via the vimentin cytoskeleton. bioRxiv. , (2023).
  15. Kechagia, Z., et al. The laminin-keratin link shields the nucleus from mechanical deformation and signalling. Nat Mater. 22 (11), 1409-1420 (2023).
  16. Andreu, I., et al. The force loading rate drives cell mechanosensing through both reinforcement and cytoskeletal softening. Nat. Commun. 12 (1), 4229(2021).
  17. Phuyal, S., et al. Mechanical strain stimulates COPII -dependent secretory trafficking via Rac1. EMBO J. 41 (18), e110596(2022).
  18. Oria, R., et al. Force loading explains spatial sensing of ligands by cells. Nature. 552 (7684), 219-224 (2017).
  19. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nat Protoc. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  20. Faure, M. L., Gómez-González, M., Baguer, O., Comelles, J., Martínez, E., Arroyo, M., Trepat, X., Roca-Cusachs, P. 3D Micropatterned Traction Force Microscopy: A Technique to Control 3D Cell Shape While Measuring Cell-Substrate Force Transmission. Advanced Science. 46, 2406932(2024).
  21. Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. Anti-fading media for live cell GFP imaging. PLoS One. 7 (12), 53004(2012).
  22. Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. EMBO J. 37 (1), 139-159 (2018).
  23. Kopek, B. G., et al. Diverse protocols for correlative super-resolution fluorescence imaging and electron microscopy of chemically fixed samples. Nat Protoc. 12 (5), 916-946 (2017).
  24. Balachandran, K., et al. Cyclic strain induces dual-mode endothelial to mesenchymal transformation of the cardiac valve. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (50), 19943-19948 (2011).
  25. Kamble, H., Barton, M. J., Jun, M., Park, S., Nguyen, N. T. Cell stretching devices as research tools: Engineering and biological considerations. Lab Chip. 16 (17), 3193-3203 (2016).
  26. Jorba, I., et al. Nonlinear elasticity of the lung extracellular microenvironment is regulated by macroscale tissue strain. Acta Biomater. 92, 265-276 (2019).
  27. Mayer, C. R., Arsenovic, P. T., Bathula, K., Denis, K. B., Conway, D. E. Characterization of 3D printed stretching devices for imaging force transmission in live-cells. Cell Mol Bioeng. 12 (4), 289-300 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PDMS

מאמרים קשורים