הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מיפוי מכני של ספרואידים באמצעות ספקטרוסקופיית ברילואין

2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67538

⸱

12 בדצמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for the Cellular Microenvironment, Advanced Research Centre, 11 Chapel Lane, University of Glasgow, 2LightMachinery Inc.

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מתאר פרוטוקול לאפיון מכני של ספרואידים חיים בתוך מטריצה תלת-ממדית באמצעות מיקרוספקטרוסקופיית ברילואין. שיטה אופטית מלאה זו מאפשרת ויזואליזציה ספרואידית ברזולוציה מיקרוסקאלית ותכונות מכניות כמותיות. גישה זו משפיעה על פנוטיפינג מכני; לדוגמה, קביעת מצבים פתולוגיים של ספרואידים גידוליים בתוך מיקרו-סביבה תלת-ממדית.

תקציר

ספקטרוסקופיית ברילואן, טכניקה מתפתחת שזכתה לעניין רב במדעי הביו-רפואה, מאפשרת לחוקרים לאסוף מידע הקשור למכניקה ולמבנה על ידי חקירת תכונות ויסקואלסטיות ואדריכליות של דגימות באופן לא הרסני וללא מגע. גישה זו מעריכה את התכונות המכאניות של דגימות תלת-ממדיות על ידי מדידת האינטראקציה של אור נראה עם גלים/פונונים אקוסטיים מונעים תרמית. המידע שספקטרוסקופיית ברילואין מספקת טומן בחובו פוטנציאל להערכה ביופיזיקלית ב-in vivo ולאבחון אפשרי של פתולוגיות מחלות. יתרון משמעותי של ספקטרוסקופיית ברילואן הוא היכולת להעריך את המכניקה בקנה מידה מיקרו בתוך דגימה ביולוגית; טכניקות קונבנציונליות אחרות שיכולות להשיג רזולוציה זו, כמו מיקרוסקופיית כוח אטומי, יכולות לבדוק דגימות רק בדו-ממד כי הן דורשות מגע ישיר. עבודה זו מתארת את יישום מיקרוספקטרוסקופיית ברילואין לחקר הביומכניקה של ספרואידים חיים המוטמעים במטריצת הידרוג'ל תלת-ממדית. קיפוזציה של ספרואידים תאיים בתוך מיקרו-סביבה תלת-ממדית יוצרת מערכת ספרואידית שמסכמת מקרוב את הממשק בין התאים למטריצה החוץ-תאית ב-vivo. בפרוטוקול שלנו, אנו מתארים הכנת דגימות ספרואידי ומדידות של ספקטרום ברילואין באמצעות הדמיית פלואורסצנציה סדרתית. בנוסף, אנו דנים בנהלים לניתוח נתונים ספקטרליים ובפרטים טכניים על המערכת האופטית.

מבוא

גידול תאים במודלים תלת-ממדיים הוא יתרון בהשוואה לשיטות תרבית תאים דו-ממדיות טיפוסיות, שכן הוא משחזר טוב יותר את מבני הרקמה ואת האינטראקציות בין תא לתא שנמצאים ב-vivo. ספרואידים הם אגרגטים תלת-ממדיים של תאים שמאפשרים אינטראקציות מורכבות בין תאים; אינטראקציות אלו נפגעות בתאים שגדלו כמונולייר על פלסטיק לתרבות רקמות. ספרואידים יכולים לגדול בתוך פיגום המדמה את המיקרו-סביבה שממנה הגיע התא. לדוגמה, הידרוג'לים הם חומר ביולוגי פופולרי המשמש לתרבות תאים/ספרואידים, שכן הם מאפשרים שליטה מדויקת על פרמטרים כמו קשיחות, התכלות, גודל נקבוביות ושילוב גורמי גדילה1 (איור 1A). רמזים מכניים לעיתים קרובות קודמים לשינויים ביוכימיים בפתולוגיות מחלה כגון סרטן ופיברוזיס 2,3, ולכן רכישת החתימה הביומכנית במודלים תלת-ממדיים קליניים רלוונטיים של מחלות היא חיונית לפיתוח התערבויות אבחנתיות להנחיית הפרקטיקה הטיפולית ולהבנת הפתופיזיולוגיה הבסיסית4.

מיקרוסקופיית ברילואן (BM) היא טכניקת הדמיה המאפשרת למדוד את התכונות המכאניות של חומרים ביולוגיים במישורים דו-ממדיים 5,6,7. ל-BM יתרונות מרכזיים על פני שיטות נפוצות יותר, כגון מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ואלסטוגרפיה. מתועד היטב ש-AFM יכול להגיע לרזולוציה מכנית מרחבית-זמנית גבוהה ושהאלסטוגרפיה יכולה לבדוק את המכניקה בתוך דגימות 8,9. BM אינו דורש מגע ישיר עם החומר הנחקר, מה שהופך אותו לטכניקה אידיאלית על פני AFM לדגימות/תאים שקשה להגיע אליהם, כמו ספרואידים בתוך הידרוגלים. יתרון מרכזי נוסף של BM הוא שהוא אינו דורש תיוג דגימות ויכול לספק רזולוציה בקנה מידה מיקרו בתוך דגימות ביולוגיות, ששיטות אלסטוגרפיה נפוצות אינן יכולות להגיעל-7; טכניקות אלסטוגרפיה אופטית מתקדמות יותר יכולות לפעול ברזולוציה בקנה מידה מיקרו10. יש לציין כי הרזולוציה המדויקת והיעילה בהדמיית ברילואין של דגימות ביולוגיות הטרוגניות אינה פשוטה להגדרה. ראשית, עבור אורך גל תאורה נתון, זה תלוי בתכונות האופטיות המתארות את גודל נקודת המוקד (צמצם נומרי, NA, של עדשת האובייקטיב ואטימות הדגימה). בנוסף, הדיוק שבו ניתן לבדוק את התכונות המכניות של הדגימה, כמו גם צורת ספקטרום ברילואן, מושפעים מהמאפיינים האקוסטיים של החומר (אורך גל פונון ואורך התפשטות)11,12. התופעה הבסיסית מאחורי ספקטרוסקופיית ברילואן היא פיזור ברילואן, שבו אור הלייזר המונוכרומטי הנכנס מתקשר עם פונונים אקוסטיים ספונטניים המושרים תרמית בתוך המדיום הביולוגי. זה גורם לפיזור לא אלסטי של אור ו-(הזזת תדר ברילואן, BFS) באיור 1B ובדרך כלל בסדר גודל של כמה GHz, ותלוי אם הפוטון מאבד או צובר אנרגיה, שיאי Brillouin Stokes ואנטי-סטוקס מזוהים בספקטרום האור המפוזר, בהתאמה. באמצעות תלותה במהירות הקול המקומית בתווך, ה-BFS קשור למודולוס האורכי האלסטי, אשר בתורו מקושר אמפירית למודול יאנג 7,13; עם זאת, יש להיזהר בהשוואות בין מודולי אלו, שכן (i) הם אינם קשורים ישירות, (ii) מודולוס יאנג בדרך כלל נמצא בטווח Pa-kPa עבור דגימות ביולוגיות וחומר רך, בעוד שהמודולוס האורכי המתקבל מברילואין נמצא בטווח GPa, ו-(iii) יש לקחת בחשבון פרמטרים כמו שינויים במקדם השבירה וצפיפות החומר.7. רוחב קו ברילואן (באיור 1B) הוא מדד נוסף שהושג מ-BM. הוא קשור למודולוס האובדן האורכי, ומספק תובנות לגבי צמיגות הדגימה; תכונות אלו ניתנות לקשר עם ויסקואלסטיות14. לכן, BM מאפשר הערכת תכונות הוויסקואלסטיות, כאשר BFS גדול יותר מרמז על חומר קשיח יותר, ורוחב קו גדול יותר מרמז על חומר צמיגי יותר (איור 1B). יש לציין כי פיזור אלסטי (ריילי), שבו הפוטונים אינם עוברים שינוי תדר, יש לו סיכוי גבוה משמעותית להתרחש בהשוואה לפיזור ברילואן. לכן, ספקטרומטרים של ברילואין חייבים להיות מצוידים לדיכוי אות ריילי.

BM שימש לאפיון תכונות מכניות של רקמות שונות, חומרים ביולוגיים ומודלים של תרבית תאים תלת-ממדית. לדוגמה, השתמשו ב-BM להבחנה בין מלנומה לרקמה הבריאה הסובבת, מה שהראה כי הרקמה הלא-סרטנית הייתה רכה משמעותית מהמלנומה15. Rad ואחרים הראו כי הגדלת ריכוז הפולימר של הידרוג'לים מובילה לעלייה ב-BFS וברוחב הקו. בריכוזי הפולימר הנמוכים ביותר, הידרוגלים עם תאים הראו ירידה גדולה יותר בשינויים בתדירות ברילואין במשך שבעה ימים בהשוואה להידרוג'לים ריקים, שהוצע כתוצאה משיפוץ תאי של ההידרוג'ל. זה לא נצפה בריכוז פולימרי של 10%, מה שהדגיש את היעדר אפשרי בחיוניות התאים שנמצאים בהידרוג'לים אלו.

הרלוונטי ביותר למחקר הנוכחי, BM שימש לחקר התכונות המכאניות של ספרואידים 17,18,19,20. בפרט, ניתן לזהות את השפעת המיקרו-סביבה המקומית על מכניקת הספירואיד באמצעות BM20. בהשוואה לספירואידים של גידול שגודלו בהידרוגלים תואמים, ספרואידים שגדלו בהידרוגלים קשיחים הראו BFS גבוה יותר, מה שמעיד על מוגבר במודולוס האלסטי20. שונות מרחבית של תכונות מכניות בתוך ספרואיד יכולה להיות מאופיינת גם ב-BM. לדוגמה, נמצא כי ה-BFS של ספרואידי הגידול עולה לכיוון ליבת הספרואידב-20,21. יתרה מזאת, ירידה ב-BFS קשורה לעלייה בפולשניות של ספרואידים של הגידול20. BM שימש לחקר השינויים המכניים של ספרואידים בגידול בתגובה לזעזוע אוסמוטי22. במחקר, נבדק צמיחת הספרואיד במשך 5 ימים, ונמצא כי ההבדלים המכניים הראשוניים בין סרטן לספרואידים בריאים שנצפו ב-BM אבדו עם הזמן. מחקר נוסף מצא עלייה ב-BFS של הספרואיד לאחר 7 ימים, שיוחסה לעלייה בגודל הספרואיד ובמספר התאים16.

יתרה מזאת, נערכו מחקרים רב-מודליים, תוך שימוש במיקרוסקופיית ברילואין לצד AFM וריאולוגיה, כדי לבדוק את התכונות המכניות של תאים והידרוג'לים 16,23,24. Rad ואחרים השתמשו בריאולוגיה כדי להקשר את המגמות שנמדדו באמצעות BM, וקבעו מתאם חיובי חזק בין מודולוס האורך למודול הגזירה של האחסון ביחס לריכוז הפולימרי של הידרוג'לים16. מיקרוסקופיית ברילואין ומיקרו-ריאולוגיה אופטית של פינצטה שימשו למדידת מכניקת תאי הסרטן שגודלו בהידרוג'לים תלת-ממדיים23. במחקר זה, נמצאה ירידה בהטרוגניות מכנית בין תאים בספרואידים לעומת תאים בודדים שגדלו תלויים בהידרוג'לים.

בעבודה זו, מפורט פרוטוקול לחקירת התכונות המכאניות של ספרואידים חיים המוטמעים בהידרוג'לים באמצעות מיקרוסקופ ברילואן מסחרי (איור 1). ברגהאוס ואחרים תיארו פרוטוקול שמפרט את השלבים לבניית ספקטרומטר ברילואין ברזולוציה גבוהה ושיטה לכיול שלו עם חומרי ייחוס25. בנוסף, פרוטוקול של שי ואחרים מתאר את השימוש במיקרוסקופיית ברילואין למעקב אחר השינויים בתכונות המכאניות של רקמת העובר26. אנו משתמשים בספרואידים של תאי גזע מזנכימליים (MSCs) בהידרוג'לים פולי(אתילן) גליקול (PEG)-מאלימיד כדי לחקות את נישת מח העצם ולחקור את התכונות המכאניות של הסביבה הזו. למודל תלת-ממדי זה יש פוטנציאל לחשוף את החתימה המכאנית של מחלות מח עצם, כולל לוקמיה, מיאלומה נפוצה וסרטן עצם משני. לכן, הפרוטוקול ניתן להעברה ישירה למודלים תלת-ממדיים של מחלות אחרות שבהן מכנוביולוגיה מופרעת עשויה למלא תפקיד חשוב בפתולוגיה. הכנת הספירואיד וההידרוג'ל, הדמיית פלואורסצנציה וטכניקות המיקרוסקופיה של ברילואין מפורטות במיוחד. ההליכים המומלצים, החסרונות האפשריים והשיפורים האפשריים בטכניקה נדונים. התיאור המפורט של הגדרת הניסוי מוצג באיור S1 ובסעיף חומרים משלימים ושיטות הקשור למערכת הניסוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תרבית תאים דו-ממדיים

הערה: כאשר אפשר, ודאו שכל עבודת תרבית התאים מתבצעת בסביבה סטרילית באמצעות מכסה זרימה למינרי סטנדרטי לתרבית רקמה כדי למנוע זיהום. בפרוטוקול הנוכחי נעשה שימוש ב-MSCs, אך ניתן להשתמש בסוגי תאים אחרים ליצירת ספרואידים, בהתאם למטרות הספציפיות של המחקר.

  1. תרבית MSCs במדיום תרבית התאים Modified Eagle Medium (DMEM) של Dulbecco, עם נפח מספיק לכסות את התאים, המכיל 4.5 גרם ל-L D-גלוקוז, + L-גלוטמין בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 100 מיקרומום נתרן פירובאט, 1% חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), 1% פניצילין וסטפטומיצין. דגרו תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2.
  2. תאי מעבר ב-70-80% קונגלונסיה, על ידי דגירה עם 0.05% טריפסין אתילנדיאמינטרטראאצטית (EDTA) (נפח הטריפסין שנוסף צריך להיות שליש מנפח ה-DMEM) למשך 3 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2 כדי להפריד תאים מהצלחת. כדי לעצור את התגובה, הוסיפו חומר תרבית המכיל FBS (לפחות תואם את נפח הטריפסין הנוסף). ספירת תאים באמצעות המוציטומטר.

2. הכנת ספרואידים

הערה: כאשר אפשר, ודאו שכל עבודת תרבית התאים מתבצעת בסביבה סטרילית באמצעות מכסה זרימה למינרי סטנדרטי לתרבית רקמה כדי למנוע זיהום. במחקר זה, לוחות מיקרווול שימשו ליצירת ספרואידים של MSC. לוחות אלו מורכבים מ-24 בארות, וכל באר מכילה 1200 מיקרובארות, בקוטר 400 מיקרון. דבר זה מאפשר הכנת מספר רב של ספרואידים (איור 2).

  1. להכנת לוח המיקרו-באר, יש לטפל בבארות מראש על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של תמיסת שטיפה נגד היצמדות לכל באר. צלחת צנטריפוגה ב-1,300 גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 20, בדוק אם יש בועות אוויר. אם יש, חזור על שלב הצנטריפוגה. הסר את תמיסת השטיפה נגד הדבקות.
  2. כדי לשטוף את הצלחת, הוסף 1 מ"ל של מי מלח עם בופר פוספט (PBS) ושאיף. עשו זאת פעמיים כדי לוודא שתמיסת השטיפה הוסרה לחלוטין.
  3. קבע את מספר התאים לכל ספרואיד ואת מספר הספרואידים לכל ג'ל. זה תלוי בשאלות המחקר האישיות. לדוגמה, השתמשנו ב-100 תאים לכל ספרואיד ו-100 ספרואידים לכל ג'ל. לכן, עבור פרוטוקול זה, נדרשה רק באר אחת של לוח המיקרו-באר, שכן זה יוצר בסך הכל 1200 ספרואידים. כדי לחשב את מספר התאים הנדרש לבאר אחת, ביצענו את החישוב הבא: 1200 x 100 = 1.2 x 105. חשב את נפח תליית התא המכיל 1.2 x10 5 תאים. צנטריפוגה את תליית התא ב-300 גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר והסרת הסופרנאנט.
  4. החזירו את התאים ל-1 מ"ל DMEM (+4.5 גרם לליטר D-גלוקוז, + L-גלוטמין) עם תוספת של 100 מיקרומום נתרן פירובאט, 1% NEAA, 1% פניצילין וסטפטומיצין. הוסף 1 מ"ל של תליית תא לבאר אחת של לוח המיקרווול ופיפט בעדינות למעלה ולמטה כדי לפזר תאים באופן שווה ברחבי הבאר. היזהר לא להכניס בועות אוויר. צנטריפוגה את הפלטה ב-100 גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: בשלב זה, איננו מוסיפים את FBS לתקשורת. המטרה היא למנוע מהתאים להיצמד לפלסטיק של תרבית הרקמה.
  5. התבונן בצלחת מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים מפוזרים באופן שווה ושוקעים לתחתית המיקרובארות. דגרו תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2. צפו ביצירת הספרואידים 24 שעות מאוחר יותר.
    הערה: ניתן להשאיר ספרואידים בצלחת עד 48 שעות, בהתאם לסוג התא ולקומפקטיות הרצויה של הספרואיד.
  6. כדי לקצור את הספרואידים מהצלחת, תחילה להסיר לאט ובעדינות את מדיום התרבות, במטרה לא להפריע לספירואידים. כדי למנוע מספרואידים להידבק לפלסטיק, ציפו את קצות וצינורות הפיפטה באמצעות PBS עם 1% FBS. כדי למנוע מהספרואידים להיתקע בקצות הפיפטות, חתכו את הקצה כדי להרחיב את הפתח. ניתן להשתמש בטיפים מקסימליים להתאוששות במהלך שלבים אלו כאמצעי נוסף למניעת אובדן ספרואידים. הוסף 500 מיקרוליטר PBS לכל באר של לוח המיקרווול ופיפטה למעלה ולמטה כדי להוציא את הספרואידים. אסוף את ה-PBS עם ספרואידים תלויים בצינור (איור 2).
  7. צפו בלוח תחת המיקרוסקופ בהגדלה של פי 20 וחזרו על השלב הזה עד שרוב הספרואידים הוסרו בהצלחה.
  8. כדי לספור את מספר הספרואידים במתלה, להעביר 50 מיקרוליטר מהמתלה לבאר של לוח עם 96 בארות. סופר את מספר הספרואידים ב-50 מיקרוליטר. כדי לסייע בספירה, ניתן לצייר צלב בתחתית הבאר באמצעות סימון קבוע. חשב את מספר הספרואידים באמצעות משוואה (1):
    figure-protocol-1

3. הכנת הידרוג'לים PEG

הערה: כאשר אפשר, ודאו שכל עבודת תרבית התאים מתבצעת בסביבה סטרילית באמצעות מכסה זרימה למינרי סטנדרטי לתרבית רקמה כדי למנוע זיהום. במחקר זה נעשה שימוש בהידרוג'לים מסוג PEG-מלימיד, אך ניתן להשתמש גם בסוגים אחרים. הידרוגלים PEG-מלימייד נוצרו באמצעות תגובת התוספת תיול-מיכאל27. הקרוסלינקרים ששימשו היו תערובת של PEG-דיתיול ופפטיד מתכלה על ידי פרוטאז, מוקפים בשני שאריות ציסטאין (פפטיד VPM, GCRDVPMSMRGGDRCG). הג'לים במחקר הנוכחי השתמשו ב-70% PEG-דיתיול ו-30% פפטיד VPM מתכלה.

  1. הכינו תמיסת 200 מ"ג/מ"ל של פפטיד VPM והוספו 2.4 מיקרוליטר פפטיד לכל ג'ל. הכינו תמיסת מאגר של 200 מ"ג/מ"ל של PEG-dithiol והוסיפו 5.6 מיקרולטר לג'ל.
  2. החזירו את הספרואידים ל-PBS לפני ערבוב עם הקרוסלינקרים (איור 2). מערבבים את המתלה הספרואידי עם PEG-דיתיול (5.6 מיקרוליטר לג'ל) ו-VPM (2.4 מיקרוליטר לג'ל). פתרון זה נקרא פתרון B.
    הערה: בפרוטוקול זה נוספו 100 ספרואידים לכל ג'ל.
  3. תכין תמיסת מקור של 250 מ"ג/מ"ל PEG-Maleimide. הוסף 50 מיקרוגרם פיברונקטין לכל ג'ל. מערבבים את תמיסת PEG-מאלימיד ופיברונקטין; תמיסה זו נקראת תמיסה A. תמיסת פיפטה A (40.3 מיקרוליטר לג'לים של 100 מיקרוליטר) על תחתית לוח תרבית רקמה עם 12 בארים. הוסף תמיסה B (59.7 מיקרוליטר לג'לים של 100 מיקרוליטר) ביחס מולרי של 1:1 מאלימיד:תיול כדי להבטיח קישור צולב מלא; ודא שהג'לציה מתרחשת באופן מיידי. הנפח הסופי של ההידרוגלים הוא 100 מיקרוליטר.
  4. דגרו ג'לים למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 כדי לאפשר ג'לציה. הוסיפו מדיום תרבית מלא (DMEM עם 10% FBS, 100 מיקרומום נתרן פירובאט, 1% NEAA, ו-1% פניצילין וסטפטומיצין) לבאר, כדי להבטיח שהג'ל יהיה טבול לחלוטין (איור 2). דגרו את הג'ל בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2 עד שהוא מוכן למדידות תחת מיקרוסקופ ברילואן.
    הערה: משך תרבית הספרואיד בתוך ההידרוגלים לפני מדידות ברילואין תלוי בסוג התא ובשאלת המחקר. לדוגמה, במחקר זה, הספרואידים בדרך כלל מגודלים בתוך הידרוג'לים למשך עד 7 ימים, שבמהלכם הספרואידים מנוטרים במיקרוסקופיית ברילואין. תכונות ויסקואלסטיות של ההידרוגלים עם/ללא עטיפת ספרואיד אופיינו ואינן מראות השפעה משמעותית של ספרואידים על מכניקת הג'ל (איור S2).

4. צביעת פלואורסצנציה והדמיה של ספרואידים בהידרוגלים

הערה: במחקר זה, גרעיני התאים וסיבי האקטין המרכיבים את שלד התא צולמו וצולמו פלואורסצנטית לפני מדידות ברילואין.

  1. כדי לצבוע אקטין, הוסיפו צבע אקטין חי למדיית התרבות בדילול של 1 ל-500 3 שעות לפני ההדמיה. שמור על הדגימה מחוץ לאור על ידי עטיפה בנייר כסף. דגרו את הג'ל בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
  2. כדי לצבוע את הגרעינים, הוסיפו 2 טיפות למ"ל של צבע גרעיני חי למדיה סביב הג'ל 40 דקות לפני ההדמיה. החזיר את הדגימות לאינקובטור.
  3. צלם תמונות פלואורסצנציה בהקדם האפשרי לאחר סיום זמן הצביעה. ודאו שהמסלול האופטי המתאים (חשיפת מצלמת המיקרוסקופ) ומיקום גלגל המסנן הנכון נבחרו. העמעם את האורות בחדר ותתפוס את הרקע. הפעל את מקור האור של דיודה פולטת אור (LED) ובחר את אורך הגל בהתאם לפרוטוקול הצביעה (כאן, 385 ננומטר שימש לגרעינים ו-621 ננומטר להדמיית אקטין). רכוש תמונות פלואורסצנטיות של ספרואידים בהגדלה של פי 20 באמצעות תוכנה מועדפת. כבה את מקור ה-LED כשסיימת.

5. מיקרוסקופיית ברילואין של ספרואידים

  1. הפעלת המכשירים ופליטת הלייזר
    1. הפעל את המכשירים: המחשב, הספקטרומטר, מצלמות המיקרוסקופ, המיקרוסקופ, מאוורר הקירור בלייזר, ופליטת הכדור על ידי הפעלת המפתח בשלט. ודאו שזה נעשה 15 דקות לפני אופטימיזציה של הספקטרומטר כדי לוודא שהלייזר התרמי. ודאו שהספק הלייזר הנפלט הוא כמצופה עם מד הספק (100 mW בניסוי שלנו).
  2. הפעל את יישום בקרת הטמפרטורה (ראה טבלת חומרים) וודא שטמפרטורת האטלון מותאמת על ידי מדידת עוצמת הקרן לאחר האטאלון. אם היא נמוכה משמעותית מהצפוי (לאחר התחשבות במסנן צפיפות האופטית (OD), שנו את טמפרטורת היעד ב-1 מעלות צלזיוס וצפו אם יש עלייה בהספק עם הזמן. אם יש ירידה, הפוך את כיוון השינוי. כאשר ההספק מתקרב למצופה, כוונן בקצבים קטנים (0.1 מעלות צלזיוס) עד שמגיעים למקסימום.
  3. הגדרת נקודת המוקד של עדשת המטרה בתוך קוביית האקריליק
    הערה: דיכוי הפיזור האלסטי והקישור מ"קוטל המשאבה" לספקטרומטר מותאם עם דגימה של חומר ייחוס קשיח והומוגני לפני כל ניסוי. במחקר זה נעשה שימוש בקוביית אקריליק.
  4. פתח את תוכנת SpectraLok וחכה עד שכל המכשירים יזוהו. בצד שמאל של החלון הראשי (איור 3), בחר את מצלמת הספקטרומטר.
    1. התקן את קוביית האקריליק על מחזיק הדגימה של המיקרוסקופ כשהצד השקוף פונה לעדשת האובייקטיבית. הורד את עדשת האובייקטיב כמה שיותר ומרכז את הקוביה מתחתיה. ודא שהמסלול האופטי במיקרוסקופ נבחר כך שמצלמת הספקטרומטר תהיה חשופה (הגדר את בורר הפורט הסיבובי ל-L).
      הערה: בהגדרה שלנו, יציאת L מחוברת למחזור המים הקונפוקלי, בעוד ש-R מחוברת ליציאת המצלמה של המיקרוסקופ.
    2. בחלון מצלמת SpectraLok, הגדר את זמן החשיפה של החיישן ל-500 מילישניות ואת הגיין התוכנה ל-100. הגדרת הרווח של התוכנה רק משפרת את הקונטרסט לצורכי ויזואליזציה.
  5. שחרר את תריס הלייזר.
    הערה: כשפליטת הלייזר פועלת, היזהר לא להכניס את הראש/העיניים למסלול קרן הלייזר.
    1. לחץ על תפוס, והזיז את עדשת המטרה כלפי מעלה. תהיה עלייה משמעותית בעוצמת האות, ודפוס רווי (איור 4A) יופיע. זה נגרם מהחזרה חזקה של אור לייזר בממשק האוויר-קוביית אקריליק. כאשר העדשה תעלה עוד יותר, עוצמת האות תפחת, ושיאי ברילואן יהיו ברורים. המשך למקם מחדש את עדשת האובייקטיב עד שעוצמת פסגות ברילואן תהיה קבועה (איור 4B). זה מתאים לנקודת המוקד שנמצאת כולה בתוך קוביית האקריליק.
  6. אופטימיזציה של לחץ האטלון כדי למזער אור מפוזר אלסטית שאריות
    הערה: מטרת השלבים הבאים היא לדכא את אות ריילי המפוזר אלסטית כך שרק אור ברילואין המוסט בתדר יגיע למצלמת הספקטרומטר.
  7. בתוכנת SpectraLok, פתח את חלון הבקרה של Pump Killer (PK) (איור 5).
  8. התקרב לאחת מהפקודות הבהירות ביותר של ברילואן וכוון את מיקום מפעיל הלחץ במרווחים של 100 מיקרון על ידי לחיצה על מרווח התנועה כדי למזער את עוצמת השיא של ריילי. אם אות ריילי עולה, הפוך את כיוון השינוי על ידי לחיצה על הפוך. לאחר מכן, כוונן את לחץ האתלון בקצב של 10 מיקרון.
    הערה: בקוביית האקריליק, ניתן לדכא לחלוטין את אור ריילי; ייתכן שזה לא המצב בדגימה ביולוגית הטרוגנית.
  9. אופטימיזציה של שכבת הפסים ל"פתיחה" נתונים ספקטרליים
    הערה: ההליך הבא מבטיח שקואורדינטות הפיקסלים (x, y) של חיישן המצלמה יומופו כראוי לאורך גל באמצעות יישום טבלת החיפוש LUT.
  10. בחלון המצלמה , התקרב לאחת מהזמנות ברילואן.
  11. לחץ על s כדי להמחיש פסים שעליהם מופעל ה-LUT על תמונת המצלמה (איור 6A). פתח את חלון ההגדרות ולחץ על כיול מהיר כדי לחשב מחדש את ההסטה האופקית האופקית האופטימלית של הפסים. אם החיישן רווי, הקטין את זמן החשיפה לפני שלב זה.
    1. בחלון המצלמה , ודאו שהפסים הסגולים מונחים היטב על האזור המרכזי של פסגות ברילואן (איור 6B).
  12. אופטימיזציה של קישור PK-ספקטרומטר
  13. כיוון צירי עדשת הקולימטור מאפשר למקסם את יעילות הקישור של האור מה-PK לספקטרומטר.
  14. פתח את חלון הספקטרום ולחץ על פתיחת העטיפה כדי לשלוף את הספקטרום (איור 7).
  15. פתח את חלון בקרת ה-PK . עם הגדלות של 0.0005°, כוונן באופן איטרטיבי את צירי הקולימטור 1 ו-2 כדי למקסם את אות ברילואן. במידת הצורך, ניתן לאופטימיזציה נוספת של בקרת לחץ האתלון. בקוביית אקריליק הומוגנית, ניתן לדכא לחלוטין את אות ריילי (איור 7A). בעוד שמדידות ברילואן מדויקות עם אות ריילי שארתי הן אפשריות (איור 7B), במקרים של דיכוי לקוי (איור 7C), אור מפוזר אלסטית מסתיר את אות ברילואן.
  16. ודאו שאות ברילואן שהושג דומה למשרעת ייחוס. לדוגמה, במערכת שלנו, בחשיפה של 500 מילישניות ועם OD 0.3, משרעת העוצמה השיא של ברילואן היא כ-3000 ספירות. כדי לשמור שינויים בפרמטרי PK בקובץ הקונפיגורציה, בחלון PK לחץ על רענון הכל ושמור הכל. יתרה מזאת, בחלון הראשי, לחץ על שמור בקטגוריית קלט/פלט של הקוביות.
  17. מעבר לתוכנת סריקה ואימות שהפרמטרים עדיין אופטימליים
  18. סגור את SpectraLok ופתח את תוכנת הסריקה. בפרוטוקול הנוכחי נעשה שימוש בתוכנה מבוססת LabVIEW ומתואר בפירוט רב יותר באיור S3. כדי להגדיר את גאומטריית הסריקה, ממשק משתמש קנייני זה משמש לשליטה בשלב התרגום Prior XY-Z; עם זאת, ניתן להשתמש בשיטות נוספות.
    1. התקן את צלחת הפטרי עם תחתית הזכוכית עם דגימת ההידרוג'ל-ספרואיד במקום קוביית האקריליק (איור 8). כדי למנוע התייבשות של הג'ל, האינקובטור מכוון ל-37 מעלות צלזיוס ולחות יחסית של 95%. הסר את מכסה צלחת הפטרי והוסיף מדיה כדי לטבול את הג'ל. הוסיפו כיסוי לחלק העליון של הג'ל כדי למנוע תנועה של הג'ל.
    2. אתר את הספרואיד. כאשר קרן הלייזר חסומה, החלף את המסלול האופטי של המיקרוסקופ לעינית. תדליק את האור הלבן. באמצעות הג'ויסטיק, שלט ידנית בשלב הדגימה, אתר והתמקד בספרואיד.
    3. רכוש תמונת שדה בהיר של הספרואיד. כוון את בהירות התאורה על ידי סיבוב גלגל הבקרה. כוון את המסלול האופטי ל-R, וכך חושף את מצלמת המיקרוסקופ. זמן החשיפה ניתן לכוונון לפי הצורך לקבלת תמונה בעלת ניגודיות גבוהה (כלומר, 50 מילישניות).
    4. ודאו שהספקטרומטר ופרמטרי הפתיחה עדיין אופטימליים. הגדר את יציאת המיקרוסקופ ל-L ותתפוס את הרקע כשהלייזר חסום. שחרר את החסימה של הלייזר על ידי סיבוב הגלגל לירי. בהתבסס על יחס האות לרעש הרצוי, בחר את זמן החשיפה. זמן החשיפה האופייני למדידות אלו הוא 200-500 מילישניות.
    5. אם עבר זמן (כלומר, כמה שעות) מאז הכיול הראשוני או שהייתה הפרעה מכנית במערכת, הגדרת לחץ האתלון או קישור הספקטרומטר PK עשויים כבר לא להיות אופטימליים. חזור על השלבים 5.3-5.5 כדי לייעל מחדש את הדברים שהוזכרו, אם צריך.
    6. מתוך הספקטרום הלא עטוף, בחר את טווח התאמת השיא של ברילואן. כוון את ערך הסף לכמחצית מהעוצמה של פסגות ברילואן. התעלמו מהפסגות של ברילואן עם עוצמה מתחת לסף זה. תקן את אורך הגל של הלייזר לפי כל זוגות השיא של ברילואן שזוהו.
  19. הגדרת גאומטריית הסריקה הרב-ממדית
  20. בחר את גאומטריית הסריקה הרסטרית על ידי התאמת רוחב אזור הסריקה וגודל הצעד.
    הערה: עבור ספרואידים בגודל של כ-70 מיקרון, לסריקה ברזולוציה נמוכה, אנו בדרך כלל משתמשים בשטח סריקה של 150 מיקרון × 150 מיקרון וגודל צעד של 10 מיקרון. זה מניב מפה דו-ממדית ברזולוציה נמוכה בכ-3.4 דקות.
    1. תתחיל את הסריקה.
  21. כיבוי מערכת ברילואן
    1. סגור את התוכנה וכבה את המחשב. כבה את פליטת הלייזר באמצעות המפתח שבשלט. השאירו את גלגל התריס במצב החסום . כבה את קירור מאוורר הלייזר. כבה את מצלמות המיקרוסקופ והספקטרומטר. לבסוף, כבה את המיקרוסקופ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

קבצים שמתקבלים לאחר סריקה כוללים ספקטרות, פרמטרי התאמת סריקה (.csv), פרמטרי סריקה וניתוח, מפות BFS ורוחב קווים, תמונת שדה בהיר עם אזור הסריקה מזוהה, וצילום מסך של חלון הממשק. לכל נקודה בסריקת ברילואן הרב-ממדית מתקבל ערך BFS. באיור 9 מוצגת דוגמה לסריקה ברזולוציה גבוהה לצד תמונת השדה הבהיר, ותמונות פלואורסצנציה המציגות סיבי אקטין וגרעינים. יש לשים לב שבמערכת שלנו, הפלואורסצנציה משמשת להנחיית הדמיה ופרשנות של מפות ברילואן, ולא לכימות מדויק, שכן המיקרוסקופ מצויד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הקמנו פרוטוקול לשימוש במיקרוסקופיית ברילואין להדמיה ביומכנית של ספרואידים המוטמעים בהידרוג'לים ברזולוציה מיקרו-בקנה מידה. ניתן להבחין בין ההידרוג'ל לבין הספרואיד החי על ידי הבדלים בערכי BFS המתקבלים. בתוצאות המייצגות, השתמשנו בספירואידים של MSC ובהידרוגלים PEG-מאלימיד; עם זאת, פרוטוקול זה רלוונטי באופן רחב לסוגי תאים אחרים (למשל, קווי תאים סרטניים). התאים במחקר זה צולמו חיים ובסביבה תלת-ממדית רלוונטית, מה שמדגים את היתכנות הפלטפורמה הזו בשילוב עם מודלים ביולוגיים רלוונטיים. ערכי הזזת ברי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מציינים ש-T. Allen ו-G. Wardle הם עובדים ב-LightMachinery, שמייצרת ומוכרת את ספקטרומטר ברילואן ששימש במחקר זה. החברה עשויה להפיק תועלת מפרסום עבודה זו. כל שאר המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

המחברים מודים במימון שהושג ממענק שלב 2 של MechanoMeds, UKRI/EPSRC, מספר מענק EP/X033554/1 לתמיכה בפיתוח שיטה זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
PEG-Maleimide בעל 4 זרועות (20 kDa)קריאייטיב PEGWorksPSB-455https://creativepegworks.com/product/4-arm-peg-mal-mw-20k
לוחות AggreWell 400טכנולוגיות STEMCELL34411http://stemcell.com/products/aggrewell400.html
אטלון מחלל אוויריLightMachineryHF-16074-660https://lightmachinery.com/spectrometers/brillouin-spectroscopy-excitation-laser-optimization/
תמיסת שטיפה נגד היצמדותטכנולוגיות STEMCELL7010https://www.stemcell.com/products/aggrewell-rinsing-solution.html
חממת שלב עליון של קו מודגשאוקולאבH301-NIKON-NZ100/200/500-Nhttps://www.oko-lab.com/live-cell-imaging/stage-top-digital-gas/chamber/nikon/h301-nikon-nz100-200-500-n
לייזר Cobolt Flamenco-100 660 ננומטרהובנר0660-05-01-0100-700https://hubner-photonics.com/products/lasers/single-frequency-lasers/05-01-series/
סירקולטור קונפוקליLightMachineryHF-13311לא זמין
מערכת התאורה הפלואורסצנטית D-LEDi  ניקוןMBF83000https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/light-sources/d-ledi
מודול EPI-FLניקוןTi2-LA-FL-3https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/accessories/intermediate-modules
פיברונקטין (אדם)YoProteins663https://www.yoproteins.com/fibronectin-human-5-mg-663.html
גיבקו דולבקו' s Modified Eagle Medium (DMEM)תרמופישר11965092https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965092
ספקטרומטר HyperFine BrillouinLightMachineryHF-8999-PK-660https://lightmachinery.com/spectrometers/brillouin-hyperfine-spectrometer/
קוביית פילטר רב-תחומי LED-DA/FI/TR/CY5-BניקוןMXR00753https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/accessories/fluorescent-filter-cubes
תאי גזע מזנכימליים (MSCs)פרומוסלC-12974https://promocell.com/us_en/human-mesenchymal-stem-cells-hmsc.html
שלב תרגום ממונע פריור סיינטיH117E2NNhttps://www.prior.com/imaging-components/motorized-stages?filter=MicroscopeBrand-33
NucBlue™ Live ReadyProbes™ ריאגנט (Hoechst 33342)תרמופישרR37605https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605
מטרה, S Plan Fluor 20X NA 0.45, אווירניקוןMRH08230https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/optics/selector/comparison/-1708
מצלמת ORCA-Fusion CMOSהמאמאצוC14440-20UPhttps://www.hamamatsu.com/eu/en/product/cameras/cmos-cameras/C14440-20UP.html
PEG-דיתיול, 2 קילו-דלטוןקריאייטיב PEGWorksPLS-613https://creativepegworks.com/product/hs-peg-sh-mw-2k-10g
מצלמת sCMOS  פתרונות טלדיין ויז'ן01-IRIS-15-USB-M-16-Chttps://www.teledynevisionsolutions.com/en-gb/products/iris/?model=01-IRIS-15-USB-M-16-C&vertical=tvs-photometrics&segment=tvs 
SPY555-actin ספירוכרוםCY-SC202https://spirochrome.com/product/spy555-actin/
TemperatureAppתוכנת בקרת טמפרטורה
פפטיד VPM, GCRDVPMSMRGGDRCGGenScriptלא זמיןלא זמין
מיקרוסקופ Eclipse Ti-2Aניקוןאקליפס Ti-2Ahttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/inverted-microscopes/eclipse-ti2-series 

מקורות

  1. Caleb, J., Yong, T. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, 33(2020).
  2. Walker, M., Gourdon, D., Cantini, M. Beyond static models: mechanically dynamic matrices reveal new insights into cancer and fibrosis progression. Curr Opin Biomed Eng. 33, 100570(2025).
  3. Walker, M., Morton, J. P. Hydrogel models of pancreatic adenocarcinoma to study cell mechanosensing. Biophys Rev. 16 (6), 851-870 (2024).
  4. Ryu, S., Martino, N., Kwok, S. J. J., Bernstein, L., Yun, S. H. Label-free histological imaging of tissues using Brillouin light scattering contrast. Biomed Opt Express. 12 (3), 1437-1448 (2021).
  5. Zhang, J., Scarcelli, G. Mapping mechanical properties of biological materials via an add-on Brillouin module to confocal microscopes. Nat Protoc. 16 (2), 1251-1275 (2021).
  6. Kabakova, I., et al. Brillouin microscopy. Nat Rev Methods Primers. 4, 8(2024).
  7. Prevedel, R., Diz-Muñoz, A., Ruocco, G., Antonacci, G. Brillouin microscopy: an emerging tool for mechanobiology. Nat Methods. 16 (10), 969-977 (2019).
  8. Czajkowsky, D. M., Iwamoto, H., Shao, Z. Atomic force microscopy in structural biology: from the subcellular to the submolecular. J Electron Microsc. 49 (3), 395-406 (2000).
  9. Glaser, K. J., Manduca, A., Ehman, R. L. Review of MR elastography applications and recent developments. J Magn Reson Imaging. 36 (4), 757-774 (2012).
  10. Jordan, J., et al. Rapid stiffness mapping in soft biologic tissues with micrometer resolution using optical multifrequency time-harmonic elastography. Adv Sci. 12 (8), e2410473(2025).
  11. Mattarelli, M., Vassalli, M., Caponi, S. Relevant length scales in Brillouin imaging of biomaterials: the interplay between phonons propagation and light focalization. ACS Photonics. 7 (9), 2319-2328 (2020).
  12. Caponi, S., Fioretto, D., Mattarelli, M. On the actual spatial resolution of Brillouin imaging. Opt Lett. 45 (5), 1063-1066 (2020).
  13. Wu, P. H., et al. A comparison of methods to assess cell mechanical properties. Nat Methods. 15 (7), 491-498 (2018).
  14. Rodríguez-López, R., et al. Network viscoelasticity from Brillouin spectroscopy. Biomacromolecules. 25 (2), 955-963 (2024).
  15. Troyanova-Wood, M., Meng, Z., Yakovlev, V. V. Differentiating melanoma and healthy tissues based on elasticity-specific Brillouin microspectroscopy. Biomed Opt Express. 10 (4), 1774-1781 (2019).
  16. Rad, M. A., et al. Micromechanical characterisation of 3D bioprinted neural cell models using Brillouin microspectroscopy. Bioprinting. 25, e00179(2022).
  17. Conrad, C., Gray, K. M., Stroka, K. M., Rizvi, I., Scarcelli, G. Mechanical characterization of 3D ovarian cancer nodules using Brillouin confocal microscopy. Cell Mol Bioeng. 12 (3), 215-226 (2019).
  18. Yan, G., Monnier, S., Mouelhi, M., Dehoux, T. Probing molecular crowding in compressed tissues with Brillouin light scattering. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (4), e2113614119(2022).
  19. Hilai, K., et al. Mechanical evolution of metastatic cancer cells in 3D microenvironment. Small. 21, 2403242(2025).
  20. Mahajan, V., et al. Mapping tumor spheroid mechanics in dependence of 3D microenvironment stiffness and degradability by Brillouin microscopy. Cancers. 13 (21), 5549(2021).
  21. Margueritat, J., et al. High-frequency mechanical properties of tumors measured by Brillouin light scattering. Phys Rev Lett. 122 (1), 018101(2019).
  22. Zhang, J., Nikolic, M., Tanner, K., Scarcelli, G. Rapid biomechanical imaging at low irradiation level via dual line-scanning Brillouin microscopy. Nat Methods. 20 (5), 677-681 (2023).
  23. Nikolić, M., Scarcelli, G., Tanner, K. Multimodal microscale mechanical mapping of cancer cells in complex microenvironments. Biophys J. 121 (19), 3586-3599 (2022).
  24. Scarcelli, G., et al. Noncontact three-dimensional mapping of intracellular hydromechanical properties by Brillouin microscopy. Nat Methods. 12 (12), 1132-1134 (2015).
  25. Berghaus, K. V., Yun, S. H., Scarcelli, G. High speed sub-GHz spectrometer for Brillouin scattering analysis. J Vis Exp. (106), e53468(2015).
  26. Shi, C., et al. Monitoring the mechanical evolution of tissue during neural tube closure of chick embryo. J Vis Exp. (201), e66117(2023).
  27. Trujillo, S., et al. Engineered 3D hydrogels with full-length fibronectin that sequester and present growth factors. Biomaterials. 252, 120104(2020).
  28. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  29. Chiu, C. L., Clack, N. Napari: a Python multi-dimensional image viewer platform for the research community. Microsc Microanal. 28 (S1), 1576-1577 (2022).
  30. Passeri, A. A., et al. Brillouin spectroscopy for accurate assessment of morphological and mechanical characteristics in micro-structured samples. J Phys Photonics. 6 (3), 035016(2024).
  31. Scarcelli, G., Yun, S. H. In vivo Brillouin optical microscopy of the human eye. Opt Express. 20 (8), 9197(2012).
  32. Pollard, T. D., Cooper, J. A. Actin, a central player in cell shape and movement. Science. 326, 1208-1212 (2009).
  33. Antonacci, G., Braakman, S. Biomechanics of subcellular structures by non-invasive Brillouin microscopy. Sci Rep. 6 (1), 37217(2016).
  34. Coker, Z. N., et al. Brillouin microscopy monitors rapid responses in subcellular compartments. PhotoniX. 5 (1), 9(2024).
  35. Yang, F., et al. Pulsed stimulated Brillouin microscopy enables high-sensitivity mechanical imaging of live and fragile biological specimens. Nat Methods. 20 (12), 1971-1979 (2023).
  36. Antonacci, G., et al. Recent progress and current opinions in Brillouin microscopy for life science applications. Biophys Rev. 12 (3), 615-624 (2020).
  37. Savitzky, A., Golay, M. Smoothing and differentiation of data by simplified least squares procedures. Anal Chem. 36, 1627-1639 (1964).
  38. Yan, G., et al. Evaluation of commercial virtually imaged phase array and Fabry-Pérot based Brillouin spectrometers for applications to biology. Biomed Opt Express. 11 (12), 6933-6944 (2020).
  39. Elsayad, K. Spectral phasor analysis for Brillouin microspectroscopy. Front Phys. 7 (62), 1-8 (2019).
  40. Mahmodi, H., et al. Principal component analysis in application to Brillouin microscopy data. J Phys Photonics. 6 (2), 025009(2024).
  41. Antonacci, G., Foreman, M. R., Paterson, C., Török, P. Spectral broadening in Brillouin imaging. Appl Phys Lett. 103 (22), 221105(2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מיפוי מכני של ספרואידים באמצעות ספקטרוסקופיית ברילואין
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.