הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הכנת תסנין תרבית Mycobacterium tuberculosis להבנת פתוגנזה של שחפת

1.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67540

⸱

28 במרץ 2025

 , 
1CSIR-Centre for Cellular and Molecular Biology (CSIR-CCMB), 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), 3National Institute of Immunology

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מדגימים את ההכנה של תסנין תרבית Mtb (CF), שהוא מצע הגידול החיידקי המורכב מחלבונים המופרשים על ידי החיידקים. Mtb מפריש חלבונים כדי לווסת את איתות המארח ואת התגובה החיסונית, החיוניים לפתוגנזה. ה-CFs שהוכנו מנותחים על ידי ספקטרומטריית מסה כדי לזהות את כל גורמי ההפרשה.

תקציר

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) מפריש חלבונים רבים למארח כדי לווסת תהליכים תאיים שונים, כגון איתות מארח, תגובה חיסונית, אפופטוזיס וכו', כדי לשפר את ההישרדות. בעוד שתפקידם של כמה גורמי הפרשה הובהר, רבים עדיין לא אופיינו. לפיכך, חקירת החלבון המפריש Mtb היא תחום מחקר חיוני. Mtb מפריש חלבונים לחלל החוץ-ציטופלזמי בעזרת שלוש מערכות הפרשה שונות: כללית, תאום-ארגינין ומערכת הפרשה מיוחדת מסוג VII. יש להכין את הסקרטום לזיהוי מולקולות הפרשה חדשות ולאפיון תפקודי של הגורמים הידועים. כאן, אנו מתארים את השיטה להכנת הסקרטום והכנת הדגימה לספקטרומטריית מסה. הכנת הפרשה דורשת זהירות מירבית כדי למנוע זיהום של חלבונים ציטוזוליים, אותם ניתן לנטר על ידי בדיקה עם נוגדנים כנגד חלבונים ממברניים, מפרישים וציטוזוליים מאופיינים היטב. ניתן להשתמש במסנן התרבית שהוכן כך למטרות שונות, הכוללות חקירת תכונות אימונומודולציה של המארח.

מבוא

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), אחד הפתוגנים הקטלניים ביותר בעולם, מדביק אנשים בריאים באמצעות אירוסולים המועברים מאדם נגוע בזמן התעטשות או שיעול1. ברגע שהוא נכנס לריאות, הוא נבלע על ידי המקרופאגים המכתשית, וחוטף את מערכת החיסון המארחת כדי לשרוד. בין מנגנוני אפנון המארח השונים שיש ל-Mtb להישרדות, גורמי אלימות מפרישים הם אחד מהם. החלבונים המופרשים למצע התרבות על ידי הבצילים במהלך צמיחתו נקראים חלבוני תסנין תרבות (CF)2. חלבוני סינון תרבית אלה מסייעים לחיידקים לשרוד בתנאים קשים בתוך תאי המארח. Mtb מצויד בשלושה סוגים שונים של מערכות הפרשה: מערכת הפרשה מיוחדת מסוג VII (T7SS), מערכת הפרשה כללית Sec (מערכת Sec) ומערכת הפרשת ארגינין כפולה (מערכת Tat). T7SS היא מערכת ההפרשה הבלעדית ביותר באקטינובקטריה, בניגוד לסוג I-VI בחיידקים גראם-שליליים3. הפרשת החלבון הנפרש על פני הממברנה מעורבת בעיקר במערכת Sec, והחלבונים מזוהים על ידי רצף אותות N-terminal 4,5. חלבונים מקופלים או מקופלים חלקית מועברים דרך מערכת Tat, המזוהים על ידי רצף אותות N-terminal עם מוטיב ארגינין כפול 6,7. כיצד מערכת Sec ו-Tat מווסתת את הפרשת החלבון טרם נקבעה.

כמה חלבוני סינון תרבית ידועים ב-Mtb המסייעים לעמוד ולשרוד את מתקפת החמצון של המארח על זיהום הם אנזימים כגון KatG ו-SodA 8,9, הנחוצים לפירוק מיני חמצן תגובתיים. בנוסף, CFP10-ESAT6, קומפלקס חלבונים הטרודימרי, ממלא תפקיד חיוני בוויסות תגובות ציטוקינים, בריחת חיידקים, ייצור ROS וכו'.10. לוקוס RD1 מעורב בוויסות מערכת ההפרשה מסוג VII, הכוללת הפרשת CFP10-ESAT6, והמחיקה הגנטית של cpf10-esat6 פוגעת בהישרדות החיידקים במודלים של זיהום ex vivo ו-in vivo. מיקובקטריום בוביס זן החיסון BCG חסר מוקד RD1 האחראי על הפרשת גורמי אלימות ולכן יכול לשמש כחיסון חי מוחלש11. תהליכים תאיים שונים שלא נחקרו מווסתים היטב את תהליך ההפרשה. חלבוני תסנין התרבית מכילים גורמים מקדמי החייאה (RpFs) המסייעים לחיידקים לצמוח מחדש מהמצב הסמוי. גורמים מקדמי החייאה (Rpfs) הם אנזימי הידרוליזה פפטידוגליקניים הידועים כממלאים תפקיד בתרדמה. Mtb מקודד לחמישה גנים דמויי rpf (rpf A-E) המסייעים לחיידקים לצמוח מחדש מתרדמה לבד או על ידי אינטראקציה עם חלבונים אחרים12. Rpfs נמצאים בתסנין תרבית חיידקים וידועים כמעורבים באלימות Mtb ובחסינות המארח13,14. הגנים rpf שנחקרו באופן נרחב rpfE ו-rpfB מראים חסינות מגנה במבחנה13 ומשפרים את התגובות החיסוניות in vivo. לפיכך, rpfE ו-rpfB יכולים לשמש כמועמדים לחיסון Mtb.

זרחון הפיך15 הוא שינוי לאחר תרגום המשנה תהליכים תאיים שונים, הומאוסטזיס תאים, חלוקת תאים וכו'. לדוגמה, זרחון של CFP10 ממלא תפקיד רגולטורי חשוב, כאשר מוטציות פוספואבלטיביות ומימטיות של CFP10 אינן מצליחות לשחזר את הפנוטיפ הנצפה בזן מחיקת CFP10-ESAT6 16. SecA2, לעומת זאת, הוא חלבון מפריש המעורב בנזק ל-DNA של התא המארח17. ההפרשה של מוטנט SecA2 מספיקה כדי לשנות את התגובה החיסונית של המארח ואת מפל האיתות18,19. לפיכך, חיוני ומרגש לחקור את ההפרשה של H37Rv ומוטציות Mtb, כאשר הגנים של החלבונים המפרישים נמחקים (נתונים שלא פורסמו), כדי לקבל תובנות לגבי האופן שבו הם משפיעים על אימונומודולציה והישרדות של המארח.

דוח זה מתמקד בשלושה היבטים: השלבים הכרוכים בהכנת תסנין תרבית Mtb , עיבוד הדגימות לספקטרומטריית מסה וביצוע ניסויים מחוץ לגוף עם תסנני תרבית לבחינת תפקודים אימונומודולטוריים. מחקרים קודמים הראו זיהוי של חלבוני סינון תרבית על ידי אלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל ואחריה ניתוח ספקטרומטרי מסה8. חלבוני תסנין תרבית מזנים רגישים ועמידים לתרופות זוהו באמצעות ספקטרומטריית מסה כדי לקבל תובנות לגבי שינויי ההפרשה ולזהות גורמי אלימות שעשויים למלא תפקיד בעמידות לתרופות20. חקרנו בעבר את ה-secretome וה-phosphosecretome של Mtb בעזרת ספקטרומטריית מסה16. טכניקות כגון אלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל הן בעלות תפוקה נמוכה ואינן משמשות לחקירת שינויים גלובליים בפרוטאום או בהפרשה. חלבוני הסינון של התרבית ישתנו מזני חיידקים, שלבי התאים הגדלים ואפילו בתנאי עקה שונים. בהתאם למצבים שונים, השינוי במאגרי החלבון המפרישים בתוך התאים יציע לחקור את כל ההפרשה באופן הוליסטי ולספק מידע נוסף על מערכת הפרשת החיידקים להתערבויות טיפוליות. זה יהיה אפילו יותר אטרקטיבי להסתכל על ה-secretome בנוקאאוט או בזני הדלדול של מערכות ההפרשה כדי לקבל תובנות נוספות לגבי המסלולים והמטרות של כל נתיב הפרשה. טיפול בתאים עם חלבוני סינון תרבית במקום חיידקים משנה את רמות הציטוקינים וגורמים אימונומודולטוריים אחרים17. בעזרת מחקר ההפרשה ניתן לזהות גורמי אלימות חדשים ותפקידם באלימות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: כאן, אנו משתמשים בזן המעבדה הפתוגני H37Rv של Mtb. יש לבצע את הצעדים הנדרשים לגידול תרבית החיידקים ולבודד את התרבית במעבדה לבטיחות ביולוגית ברמה 3 (BSL-3). מהחייאת התרבית ועד הכנת הסינון, נעשה שימוש במתקן BSL-3.

1. חיסון של תרבות Mtb

  1. הכנת אזור עבודה ב- BSL-3
    1. הפעל את נורת ה-UV של ארון הבטיחות הביולוגית למשך 10 דקות לפני השימוש. נקה את ארון הבטיחות הביולוגית עם 75% אתנול לפני ואחרי השימוש. השלך את החומרים המשמשים לפחי אשפה מתאימים בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית.
  2. הכנת תרביות Mtb H37Rv ראשוניות ומשניות
    1. קח את ציר הגליצרול מ -80 מעלות צלזיוס והפשיר את הציר בטמפרטורת החדר. השתמש בארבעה זנים עצמאיים עבור רביעיות ביולוגיות.
    2. קח 10 מ"ל של מדיום 7H9 (טבלה 1) המכיל 10% ADC (9 מ"ל של 7H9 בינוני ו-1 מ"ל ADC) בבקבוק חרוטי חיטוי של 100 מ"ל עם מכסה בורג.
      הערה: 7H9 + ADC: 7H9 היא מדיה עשירה בחומרים מזינים המתקבלת באופן מסחרי, אליה אנו מוסיפים ADC (ADC: אלבומין, דקסטרוז וקטלאז; טבלה 2). ניתן להשתמש גם ב-ADC וגם ב-OADC כדי לגדל את התרבות. צלוחיות חרוטיות מספקות יותר אוורור לתרבות; עם זאת, אפשר גם להשתמש בבקבוק תרבית רקמה כדי לגדל את תאי החיידקים.
    3. חסנו את כל מלאי הגליצרול לתקשורת כדי להחיות את התרבות, שהופכת לתרבות העיקרית. קח תרבית Mtb גדלהשל 600 ~ 0.8 לייצור מלאי גליצרול. מערבבים 15% גליצרול ותרבית ה-Mtb הגדלה בקריוביאל ומאחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
    4. דגרו את צלוחיות התרבות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בשייקר אינקובטור למשך 3-4 ימים ב 100 סל"ד.
    5. ביוםהחמישי , מדדו את הספיגה ב-600 ננומטר (A600). כאשר התרביות מגיעות ל-A600~0.8-1, השתמש בתרבית לחיסון תרבית משנית ב-A600 ~ 0.2 ב-100 מ"ל של 7H9 +10% מדיה ADC בבקבוק של 500 מ"ל. בצע את אותם שלבים עבור השכפולים.
      1. מדוד את ה-A600 של התרבות הראשונית. אם ה-A600 הוא ~ 0.8, גלול את התרבית על ידי צנטריפוגה ב-2100 x גרם למשך 10 דקות. השליכו את ה-supernatant, השעו מחדש את הגלולה ב-5 מ"ל של 7H9 + 10% מדיית ADC, ומדדו את ה-A600. חשב כמה חיסון יתווסף ל-100 מ"ל של תרבית משנית של A600 ~ 0.2. לדוגמה, אם משתמשים ב-A600 ~ 4, אז יש להוסיף 5 מ"ל מאותה תרבית ל-100 מ"ל של תרבית משנית 7H9 + 10% ADC טרייה של A600 ~ 0.2.
    6. גדלו אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בשייקר אינקובטור ב-100 סל"ד למשך 2-3 ימים עד ל-ODA 600 ~ 0.8.
    7. משוך 10 מיקרוליטר באמצעות איש פיפטה המצויד בקצה מסנן ואתר את התרבית על צלחת LB Agar שאינה מכילה אנטיביוטיקה במכסה המנוע של החיידקים. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12-16 שעות כדי לדמיין את הזיהום החיידקי (אם קיים). השליכו את התרביות והחיו את התרביות החדשות של הניסוי אם יתגלה זיהום חיידקי כלשהו.
  3. גידול חיידקים במדיה של סאוטון
    1. ב-A600~0.8, יש לחסן חיידקים ב-A600 ~ 0.2 ב-100 מ"ל של המדיה של סאוטון בבקבוק של 500 מ"ל (טבלה 3) ולגדול במשך 3-4 ימים לאחר שה-OD מגיע ל-~0.8.
    2. השתמש בתרביות שגדלו עד A600 ~ 0.8 במדיה של סאוטון (התרבית העיקרית של סאוטון) לחיסון תרביות שישמשו להכנת תסנין תרבית.
      הערה: 7H9 + ADC היא מדיה עשירה בחומרים מזינים המכילה אלבומין. לא ניתן להשתמש באלבומין בניתוח הפרשה מכיוון שאלבומין יכול להסוות את חלבוני הסינון של התרבית. לפיכך, המדיה של סאוטון משמשת להכנת סינון תרבית. המדיה של סאוטון מוכנה על ידי בנייה מחדש של הרכיבים המוזכרים בטבלה 3.

2. הכנת חלבוני סינון תרבית Mtb

  1. צנטריפוגה לתרבית סופרנט
    1. השתמש בתרבית העיקרית של סאוטון לחיסון 300 מ"ל של התרבית המשנית של סאוטון ב-A600 ~ 0.2. לגדל תרביות עד ש-ODA 600 הוא ~0.4-0.5. השתמש בגידול פעיל של תרביות שלב העץ המוקדמות כדי למנוע זיהום מתאים מתים.
      1. מדוד את ה-OD של התרבות המשנית. אם ה-OD מגיע ל-A600 ~ 0.8, גלול את התרבית על ידי צנטריפוגה ב-2,100 x גרם למשך 10 דקות. השליכו את הסופרנטנט, השעו מחדש את הכדור ב-10 מ"ל של המדיה של סאוטון, וקחו מחדש את ה-OD. חשב כמה חיסון יתווסף לתרבית של 300 מ"ל של 0.2 OD מה-OD הנמדד. לדוגמה, אם ה-OD הוא 8, יש להוסיף 7.5 מ"ל מאותה תרבית ל-300 מ"ל של מדיה טרייה של סאוטון של 0.2 OD.
        הערה: היצמד ל-OD שהוזכר כדי להפחית את ליזיקת התאים וזיהום GroEL. GroEL הוא מלווה ומתבטא באופן מכונן בתאי החיידקים. חלק מהספרות הראתה נוכחות של GroEL בתסנני תרבית בגלל לחץ במהלך הגדילה. כאן, אנו משתמשים במדיה של סאוטון להכנת תסנין תרבית, המספקת לחץ קל לתאים; לפיכך, GroEL עשוי להופיע במסנן התרבית. בנוסף, אם ה-OD של התרבית הוא יותר מ-1, תתרחש ליזה של תאים, מה שיוביל לזיהום GroEL בתסנין תרבית.
    2. גלולה 300 מ"ל של תרביות גידול ב-6, 50 מ"ל צינורות ב-2,100 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס (איור 1A).
    3. משוך 45 מ"ל של סופרנטנט, והשאיר את הכדור ללא מגע, עם פיפטה סרולוגית של 25 מ"ל לצינור חדש בכל מקרה. שמור את הגלולה בצד להכנת ליזאט תא שלם (WCL).
    4. חזור על הצנטריפוגה ב-2,100 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. משוך 40 מ"ל של סופרנטנט (משאיר 5 מ"ל תרבית ללא נגיעה) עם פיפטה סרולוגית של 25 מ"ל לצינור חדש וחזור על שלב הצנטריפוגה.
    5. משוך 35 מ"ל של הסופרנטנט לתוך צינור טרי וסנן את הסופרנטנט התרבית באמצעות מסנן מזרק של 0.2 מיקרומטר. מסננים לתוך צינור טרי כדי למנוע זיהום חיידקי פתוגני. מ-300 מ"ל תרבית, 210 מ"ל של תסנין תרבית לכל שכפול משוחזרים.
      הערה: המסנן ששימש כאן לסינון תסנין תרבית הוא מסנן מזרק סטרילי של 0.22 מיקרומטר (סוג SY25PL-S).
    6. לאחר סינון תסנין התרבית, יש לחסן 1 מ"ל של תסנין התרבית המסוננת על צלחת אגר ולדגור בחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שבועות כדי להבטיח נוכחות של זיהום חיידקי פתוגני אחר בתסנין התרבית. קח 1 מ"ל מינון מהליזאט של התא השלם (WCL) ופעל לפי אותם אמצעי בטיחות.
    7. נגב את צינורות הדגימה עם 75% אתנול והוציא אותם מ-BSL-3 דרך תיבת מעבר.
  2. הכנת ליזאט תא שלם (WCL)
    1. השעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של 1x PBSG המכיל פניל-מתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF), קוקטייל מעכב פרוטאז 1x, והעבירו את הליזאט לצינורות הכאת חרוזי הברגה של 2 מ"ל המכילים 1/3 נפח של חרוזי זירקוניה 0.1 מ"מ.
      הערה: ה-1x PBSG מורכב מ-1x PBS + 5% גליצרול. קח יחס משקל גלולה למאגר של 1:3.
    2. לייז את הדגימות על ידי הכאת חרוזים במקצף חרוזים מיני: דקה אחת של הכאת חרוזים ואחריה 2 דקות של דגירה על קרח. חזור על זה 8x.
    3. צנטריפוגה את הצינורות ב-18,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. אספו את הסופרנטנט בצינור מיקרו-צנטריפוגה טרי של 1.5 מ"ל ושמרו אותו על קרח.
    4. חזור על שלב הצנטריפוגה. העבירו את הסופרנטנט דרך מסנן מזרק של 0.2 מיקרומטר כדי למנוע זיהום חיידקי פתוגני.
      הערה: המסנן המשמש כאן לסינון תסנין תרבית הוא מסנן מזרק סטרילי של 0.22 מ"מ (סוג SY25PL-S).
    5. נגב דגימות עם 75% אתנול והוציא אותן מ-BSL-3 דרך קופסת מעבר. בדוק את ריכוזי הליזטים באמצעות ערכת בדיקת BCA, כפי שצוין להלן. אחסן את הליזטים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  3. רכז את חלבוני סינון התרבות באמצעות יחידות סינון צנטריפוגליות.
    1. תרכז 210 מ"ל של חלבוני סינון תרבית Mtb בעזרת יחידות סינון צנטריפוגליות. השתמש בצינורות יחידת סינון צנטריפוגליים של 3 kDa 15 מ"ל (צנטריקונים) כדי לרכז את תסנין התרבית ל-~1 מ"ל (איור 1A). צינורות יחידת הסינון הצנטריפוגליים של 3 kDa שומרים על חלבונים באותו גודל או גדולים מ -3 kDa.
    2. הוסף כ-15 מ"ל מכל שכפול של תסנין תרבית בצינור צנטריקון אחד וצנטריפוגה ב-2,100 x גרם למשך שעה אחת ב-4 מעלות צלזיוס.
    3. השלך את הזרימה לפי הנורמות, וחזור על שלב 2.3.2 למשך 15x-16x עד 210 מ"ל של תרכיז תסנין התרבית ל-~1 מ"ל.
    4. Aliquot 100 מיקרוליטר של התרבית המרוכזת מסננים חלבונים לעשרה צינורות מיקרוצנטריפוגה קושרים חלבון נמוך ומעריכים את ריכוז החלבון באמצעות ערכת BCA.
  4. הערכת חלבונים מרוכזים
    1. העריכו את ריכוז החלבון ביחס ל-BSA כסטנדרט. השתמש ב-1 מיקרוגרם, 2 מיקרוגרם, 3 מיקרוגרם ו-4 מיקרוגרם של BSA בנפח של 25 מיקרוליטר בכפילויות. אם הדגימה לא הייתה מדוללת, השתמש בדגימה מדוללת פי 5 (ב-PBS) בנפח של 25 מיקרוליטר בכפילויות לצורך ההערכה. ההערכות מבוצעות ב-96 לוחות באר. השתמש בפקד ללא דגימה (ריק) המכיל 25 מיקרוליטר של PBS.
    2. הוסף 175 מיקרוליטר של ריאגנט מעורב לפי הוראות היצרן. מערבבים דגימות בעזרת פיפטה רב ערוצית ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. מדוד את הקריאות ב-562 ננומטר באמצעות קורא ELISA. נכה את הערכים מהערכים הריקים כדי לקבל ערכים עבור BSA והדגימות.
    3. התאם את העקומה הסטנדרטית לעקומת הרגרסיה הליניארית והעריך את הדגימות ביחס לתקן. עקבו אחר ערכת ה-BCA למדריך להערכת חלבון.

3. אישור חלבוני תסנין תרבית באמצעות סמנים שונים

  1. זיהוי חלבונים על ידי צביעת Coomassie
    1. כדי לאשר את נוכחות החלבונים בתסנין תרבית, קח 30 מיקרוגרם חלבון ופתור על 10% נתרן דודציל סולפט - אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE; טבלה 4).
      הערה: עקוב אחר תיאור הטבלה כדי להפוך את SDS-PAGE, Coomassie לצביעה ופתרונות הימנעות למאגרים.
    2. הוסף 20 מ"ל של תמיסת צביעה של Coomassie (טבלה 5) לג'ל ודגר למשך 30 דקות על נדנדות בטמפרטורת החדר. השלך תמיסת מכתים.
    3. הוסף לג'ל 30 מ"ל תמיסת עיכוב (טבלה 6) ודגר למשך 30 דקות על נדנדה בטמפרטורת החדר. השליכו את תמיסת העיכוב והוסיפו תמיסת עיכוב טרייה. חזור על הפעולה עד שהג'ל נמחק כראוי.
    4. בדוק את פס החלבון על תאורת הטרנס (איור 1B). מאחר שחלבון תסנין התרבית מכיל כמה חלבונים, אפשר לראות פס של רצועות חלבון בג'ל אחרי הצביעה (איור 1B).
  2. אישור כתם מערבי לסמן חלבון מופרש
    1. השתמש בנוגדנים של החלבון המופרש כדי לבדוק את נוכחות החלבון המופרש בתסנין תרבית. Ag85B (ab43019) הוא חלבון ידוע המופרש Mtb בתסנין תרבית וקיים בציטוזול; נוגדן Ag85B (ריכוז 5 מ"ג/מ"ל) (דילול של 1:5000 ב-5% BSA) משמש כבקרה חיובית לחלבון המופרש.
    2. טען WCL עם חלבוני סינון התרבית כדי להבדיל בין שברי החלבון הציטוזוליים/ממברניים לבין חלקי החלבון המופרשים. Ag85B הוא ציטוזולי ומופרש, ולכן זה צריך להיות נוכח בשני השברים; מצד שני, ידוע כי PknB ממוקם לממברנה ואינו קיים בתסנין התרבית.
    3. קבע את ריכוז החלבונים ב-WCL/תסנין תרבית בעזרת ערכת BCA. מערבבים 30 מיקרוגרם של WCL/תסנין תרבית עם מאגר 2x-lamelli בנפח של 30 מ"ל (טבלה 7). פתור את הדגימות ב-10% SDS-PAGE עבור PknB ו-12% SDS-PAGE עבור Ag85B עד שחזית הצבע תגיע לתחתית באמצעות מאגר ג'ל SDS (טבלה 8). אל תתנו לצבע הקדמי לנגר מהג'ל.
      הערה: הגודל של ה-Ag85B הוא ~35 kDa, כך שנעשה שימוש ב-12% SDS-PAGE.
    4. חותכים קרום ניטרוצלולוזה בגודל 9 ס"מ על 6 ס"מ 0.2 מיקרומטר להעברה (טבלה 9) של החלבון מהג'ל אל הממברנה. הגדר את ההעברה באמצעות קלטת העברה, והשרה של הקסטות, רפידות הקצף, נייר הספיגה, הג'ל והממברנה במאגר העברה קר כקרח.
    5. מניחים את כרית הקצף בצד אחד של הקסטה, ואז מניחים נייר סופג, מניחים את הג'ל, מניחים קרום ניטרוצלולוזה על גבי הג'ל, מניחים שוב נייר סופג, ולבסוף, מניחים כרית קצף נוספת וסוגרים את מחזיק הקלטת. הנח את מחזיק הקסטה במיכל ההעברה כך שצד הממברנה פונה לכיוון האנודה וצד הג'ל פונה לכיוון הקתודה.
    6. חבר את כבל הקתודה והאנודה למיכל כדי לסגור את ההתקנה והגדר אותו על זרם של 120 mA למשך 120 דקות. התחל להריץ את ההעברה בחדר קר.
    7. הניחו את הממברנה בקופסת פלסטיק קטנה לאחר סיום ההעברה. חסום את הממברנה באמצעות 10 מ"ל של תמיסת BSA 5% המיוצרת ב-1x PBST20 כדי להפחית את הקישור הלא ספציפי למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר על הנדנדה.
    8. הסר את תמיסת החסימה, הוסף 5-10 מ"ל של נוגדן ראשוני, שהוא נוגדן Ag85B נגד עכבר (1:5,000 דילולים בתמיסת BSA של 5%), ודגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה בנדנדה. אחסן את הנוגדן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס ועשה שימוש חוזר עד פי 3.
    9. הסר את הנוגדן הראשוני, הוסף 5-10 מ"ל של 1x PBST20, ושטוף את הממברנה במשך 8 דקות בטמפרטורת החדר על ידי ניעור נמרץ. הסר את הכביסה הראשונה, הוסף שוב 5-10 מ"ל של 1x PBST20 ושטוף. חזור על זה פעמיים.
    10. הוסף 5-10 מ"ל של 1x PBST20 המכיל נוגדן משני, שהוא נוגדן מצומד נגד עכבר חמצון חיזור פרוקסידאז (HRP) (דילול של 1:10,000), ודגירה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר על נדנדה.
    11. שטפו את הממברנה לאחר הנוגדן המשני לאחר שלב 3.2.9. הוסיפו כמות שווה של מצע HRP ומשפר כדי לפתח את הממברנה מתחת לכימילינומטר (איור 1C).
      הערה: כדי לאשר את היעדר זיהום חלבון ציטוזולי, חקרנו את הכתם המערבי עם נוגדן אנטי-PknB (איור 1C). הנוגדן הועלה במכון הלאומי לאימונולוגיה, מתקן לבעלי חיים, כנגד התחום החוץ-ציטופלזמי המטוהר של PknB. ניתן לראות את פס ה-PknB ב-WCL, לא בתסנני התרבית, ו-PknB הוא אך ורק ציטוזולי וקשור לממברנה ואינו אמור להיות נוכח בתסנין התרבית.

4. הכנת דגימות לספקטרומטריית מסה

  1. בצע עיכול חלבון בתמיסה על ידי טריפסין.
    1. קח 100 מיקרוגרם של חלבון מסנן תרבית, הוסף פי 6 נפח של אצטון קר כקרח ושמור אותו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
      הערה: השתמש בכלי זכוכית כדי להכין את כל הריאגנטים לספקטרומטריית המסה דגימה. השתמש בצינורות מיקרו-צנטריפוגות קשירה דלי חלבון ובקצות קשירה דלי חלבון. אל תשתמש בחומר פלסטי כדי למנוע זיהום פולימרי בניתוח ספקטרומטריית מסה.
    2. לזרז את החלבונים על ידי צנטריפוגה ב-18,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. השליכו את הסופרנטנט.
    3. שטפו את הגלולה עם 500 מיקרוליטר אצטון, גלולה למטה ב-18,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט. הסר את שאריות האצטון בעזרת רכז ואקום.
    4. הוסף 20 מיקרוליטר של 8 M אוריאה מומסת ב-25 מ"מ אמוניום ביקרבונט (2 M מלאי מוכן במים בדרגת MS). מערבלים את הדגימות ודוגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. עד 60 מיקרוליטר של אמוניום ביקרבונט 25 מ"מ לדילול 8 מ' אוריאה ל -2 מ. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה. הוסף 4 מיקרוליטר של TCEP (ריכוז סופי של 10 מ"מ המיוצר ב-25 מ"מ אמוניום ביקרבונט) ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, תוך ניעור ב-1,800 x גרם.
    6. הוסיפו 4 מיקרוליטר של IAA (ריכוז סופי של 25 מ"מ המיוצר ב-25 מ"מ אמוניום ביקרבונט) ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, תוך ניעור ב-1,800 x גרם בחושך. הוסף 110 מיקרוליטר של 25 מ"מ אמוניום ביקרבונט.
    7. הוסף טריפסין (1:20; טריפסין: חלבון במיקרוגרם) לתמיסה ושומר אותה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, מנער ב-300 סל"ד, לעיכול לילה (איור 2). עצור את תגובת העיכול על ידי הוספת 10% TFA (חומצה אצטית טריפלואורו). שואב את הדגימות במהירות לייבוש.
  2. התפלת המדגם
    1. הוסף 100 מיקרוליטר של 5% ACN + 0.1% TFA לפפטידים המעוכלים. מערבולת למשך 30 דקות ב-1,500 סל"ד בטמפרטורת החדר.
    2. צנטריפוגה ב-18,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. קח את הסופרנטנט (פפטיד) מבלי לגעת בכדור לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגה טריים והמשך בהתפלה. הכינו את כל תמיסות הכביסה והשטיפה לפני שלב ההתפלה.
    3. אזן את קצה העמודה C-18 עם 100 מיקרוליטר של 100% ACN + 0.1% TFA על ידי פיפטינג של התמיסה וחזרה על התהליך פי 5.
    4. הוסף 100 מיקרוליטר של 50% ACN + 0.1% TFA וחזור על התהליך פי 5. הוסף 100 מיקרוליטר של 5% ACN + 0.1% TFA וחזור על התהליך פי 5.
    5. אפשר לקשירת הפפטיד להתרחש בקצה העמודה C-18 על ידי פיפטינג פי 30. שמור את התמיסה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לעיבוד הדגימה לספקטרומטריית מסה. כעת, הפפטיד קשור לעמודת C-18.
    6. שטפו את עמודת ה-C-18 עם 100 מיקרוליטר מים בדרגת MS + 0.1% TFA על ידי פיפטינג וחזרו על התהליך פי 5.
    7. שטפו את עמודת ה-C-18 עם 100 מיקרוליטר של 5% ACN + 0.1% TFA על ידי פיפטינג וחזרו על התהליך פי 5. סילוק הפפטידים מעמודת C-18 ב-100 μL של 50% ACN + 0.1% TFA על ידי פיפטינג פי 30 (איור 2).
      הערה: לאחר השטיפה, ניתן לאחסן את קצה העמודה C-18 בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לסיום ספקטרומטריית המסה.
    8. שואבים במהירות את הפפטיד המנומק לחלוטין ומאחסנים אותו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד שהדגימה ניתנת לספקטרומטריית מסה.
  3. הזרקת דגימות הפפטיד לספקטרומטריית מסה.
    1. הוסף 20 מיקרוליטר של תמיסה A (המסופקת על ידי מתקן ספקטרומטריית המסה) לדגימות הפפטיד המיובשות. מערבולת הדגימות למשך 30 דקות וצנטריפוגה למשך 90 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    2. הזרקו 20 מיקרוליטר מהדגימה למכונת ספקטרומטריית המסה לריצת שיפוע של 90 דקות.

5. ניתוח נתונים עבור חלבונים המופרשים הנמצאים בתסנין תרבית

  1. זיהוי חלבונים
    1. נתח דגימות פרוטאומיקה באמצעות ספקטרומטר המסה המרובע. בצע שאילתה על הספקטרום שהושג מול מסד הנתונים Mtb H37Rv UniprotKB.
    2. הגדר את סובלנות המסה של המבשר והמקטע ב-10 ppm ו-0.5 Da. הגדר את האנזים לטריפסין עם ערך מחשוף מקסימלי של שניים.
    3. השתמש בתוכנת הפרוטאום עם Sequest כאלגוריתם החיפוש עם קרבמידומתילציה של ציסטאין כשינוי קבוע.
    4. זהה את כל התאמות ספקטרום הפפטידים (PSM) בשיעור גילוי שגוי של 1%. החל הגדרות ברירת מחדל עבור כל הפרמטרים האחרים.
    5. מפה את קבצי ספקטרומטריית המסה הגולמיים של רצף הפפטידים עם מזהה UniProt של חלבוני ה-Mtb המתאימים. רשום את כל חלבוני ה-Mtb, מזהי ה-Uniprot שלהם וסיווג פונקציונלי באמצעות מסד הנתונים של Mycobrowser.
    6. לניתוח נוסף, מפה את מזהי ה-UniProt של חלבונים שזוהו למספר ה-Rv המתאים להם. הפקידו את נתוני הסקרטומה של ספקטרומטריית המסה לקונסורציום ProteomeXchange באמצעות שותף PRIDE .

6. טיפול ב-H37Rv עם חלבון מסנן תרבית כדי לבדוק את השינוי באיתות המארח

  1. בידוד מקרופאגים צפקיים מעכברים.
    הערה: עקוב אחר הפניה21 לבידוד מקרופאגים צפקיים, זריעת התאים וזיהום.
    1. להזריק לעכברי Balb/c (גיל 4-6 שבועות) 1 מ"ל של 4% תיוגליקולט ולבודד מקרופאגים צפקיים מהצפק של העכבר ביוםהרביעי להדבקה21 (איור 3).
    2. אסוף את תאי המקרופאגים על ידי הזרקת 1x PBS לצפק העכבר. צנטריפוגה של התאים ב-1,800 x גרם למשך 5 דקות, השליכו את הסופרנטנט והוסיפו 5 מ"ל של מדיה של 1640-RPMI בתוספת 10% FBS (סרום בקר עוברי; מדיה מלאה) ו-1x עט-סטרפטוקוקוס (אנטיביוטיקה).
    3. זרע 3 x 105 תאים לבאר ב -24 צלחות באר ודגר את הצלחות בחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, החלף את המדיה למדיה טרייה ושלמה, והתאים יהיו מוכנים לזיהום או לטיפול בחלבוני תסנין תרבית.
  2. טיפול במקרופאגים צפקיים עם חלבוני תסנין תרבית
    1. קח את תאי המקרופאגים ל-BSL-3 ושמור אותם באינקובטור. טפלו בתאים עם חלבוני סינון תרבית של 1 מ"ג/מ"ל (איור 3). קצור את התאים בנקודות זמן שונות של 4 שעות, 24 שעות ו-48 שעות לאחר טיפול בתסנין תרבית.
      1. זרעו את תאי המקרופאגים המבודדים ב-24 צלחות באר בשלוש פעמים בכל נקודת זמן. טפל בתאים עם 1 מ"ג/מ"ל של חלבוני סינון תרבית ודגירה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס בנוכחות CO2. קצרו את התאים בשלוש נקודות זמן, 4 שעות, 24 שעות ו-48 שעות לאחר הטיפול.
      2. טפל בתאים עם i) מאגר 2x-lamella כדי לגרום לתאי המקרופאגים ליזאטים ולבדוק אם יש סמנים שונים של תא מארח על ידי ביצוע Western Blotting, ו-ii) מאגרים שונים עבור הבדיקות האימונולוגיות המסופקות על ידי היצרנים יחד עם הערכות.
    2. הכן ליזטים של תאים של המארח ובדוק אם יש סמנים שונים, פרופיל ציטוקינים של תאי המארח וביטויי חלבון מסלול איתות שונים על תאי מקרופאגים שטופלו בתרבית.
      הערה: אם למעבדה יש מוטציה של החלפת גנים של חלבון מסלול הפרשה, ניתן להשתמש בתסנני תרבית שהוכנו מ-Mtb H37Rv ומוטנט Mtb כדי להעריך את השפעתם על פרמטרים אימונומודולטוריים של המארח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בפרוטוקול הזה הדגמנו בידוד של חלבוני סינון תרבית ממיקובקטריות (איור 1A). לאחר מכן נבדקו חלבוני תסנין התרבית עבור הסמנים השונים כדי לאשר את בידוד תסנין התרבית. כפי שהוזכר בפרוטוקול, בוצעה צביעה של Coomassie כדי לבדוק את העמסת החלבון. אפשר לראות פס חלבון מפוספס במקטע WCL (בנתיב האחרון איור 1B), בעוד שבנתיבי CF (תסנין תרבית), כל החלבונים לא נראו, ועומס החלבון בכל הנתיבים היה שווה. כתמים מערביים בוצעו עם נוגדנים שונים כדי לבדוק אם יש שברים שונים שבודדו. Ag8...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אחד מתחומי המחקר הקריטיים נוגע להבנת פתוגנזה של Mtb ופיתוח אבחון וחיסונים יעילים 22,23. בידוד חלבוני תסנין תרבית ממצע תרבית Mtb הוא תהליך המאפשר זיהוי גורמי האלימות המופרשים על ידי הפתוגן. חקירת תפקידם של חלבוני הפרשה בוויסות פתוגנזה של Mtb מניבה תובנות מכניסטיות ועשויה גם לספק מועמדים להתערבות טיפולית. מחקרים הראו כי תסנין תרבית H37Rv מכיל חלבונים המווסתים את ההומאוסטזיס של תאי המארח, תהליכים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.2 ומיקרו; מסנני מזרק mSYPL0601MNXX204
0.2 ומיקרו; m ממברנת ניטרוצלולוזהאמרשם10600001
37% HClMerckH1758
אצטוןEMPLURA MERCKSL9F690866
אצטוניטריהסיגמא-אולדריץ'34851-2L
אקרילאמידBIORAD1610107
אלבומיןביו בייסיק קנדהמס' חתול: AD0023
Amicon Ultra-15Merck, MilliporeUFC900396
אמוניום ביוקרבונטסיגמא-אולדריץ'09830-500G
אמוניום פרסולפהטסיגמא-אולדריץ'A3678-100G
אנטי-Ag85BAbcamAB43019
נוגדן משני מצומד HRP מצומדתרמו פישר62-6520
אספרגיןסיגמא-אולדריץ'A0884-500G
ביס-אקרילאמידSIGMA146072-500G
BSAMerckMB083-500G
C-18 עמודהתרמו פישרSEM SS18V
קטלאז סיגמא-אולדריץ'C1345
חומצת לימוןסיגמא-אולדריץ'C0759-500G
דקסטרוזסיגמא-אולדריץ'G7021-1KG
Difco Middle brook 7H9 מרק   Fisher Scientific271310
ברזל אמוניום (III) ציטראטסיגמא-אולדריץ'F5879-100G
חומצה פורמית 98-100%MerckZ0823704246
חומצה אצטית קרחונית 100%MerckCD0C700160
גליציןסיגמא-אולדריץ'G8898-1KG
גליציןSIGMAG8898-1KG
GycerolSigma-AldrichG5516
Immobilion Western Chemiluminescent HRP substrateMerckWBKLS0500
IodoacetamideAmershamRPN6302V
מגנזיום גופרתיSigma-AldrichM7506-500G
Mycobroswer
חומצה אולאיתסיגמאCat מס': O1008
ערכת בדיקת חלבון Pierce BCAThermo Fischer23225
Pierce Trypsin ProtaseThermo Fischer90058
Proteome Discoverer 2.0Thermo Fischer Scientific
Q-Exactive HF (Thermo Scientific) (ניסויי פרוטאומיקה - ריצוף פפטידים, זיהוי וכימות חלבונים)Thermo Fischer Scientific
נתרן כלוריסיגמאחתול מס': S3014
נתרן כלוריסיגמא-אולדריץ'S7773-1KG
נתרן דודציל סולפטסיגמא-אולדריץ'L3771-1KG
TCEPסיגמא-אולדריץ'C4706-25
טמדסיגמא-אולדריץ'T9281-100 מ"ל
טריס בסיסBioRad161-0719
Tris-HClAMRESCO0234-500G
Tween 80Sigma-AldrichP1754
UniProt בסיס
UreaMP Bio194857
נתונים של חלבון

מקורות

  1. Campbell, I. A., Bah-Sow, O. Pulmonary tuberculosis: diagnosis and treatment. Br Med J. 332 (7551), 1194-1197 (2006).
  2. Sonnenberg, M. G., Belisle, J. T. Definition of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate proteins by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, N-terminal amino acid sequencing, and electrospray mass spectrometry. Infect Immun. 65 (11), 4515-4524 (1997).
  3. Burts, M. L., Williams, W. A., DeBord, K., Missiakas, D. M. EsxA and EsxB are secreted by an ESAT-6-like system that is required for the pathogenesis of Staphylococcus aureus infections. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (4), 1169-1174 (2005).
  4. Braunstein, M., Brown, A. M., Kurtz, S., Jacobs, W. R. Jr Two nonredundant SecA homologues function in Mycobacteria. J Bacteriol. 183 (24), 6979-6990 (2001).
  5. Feltcher, M. E., et al. Label-free quantitative proteomics reveals a role for the Mycobacterium tuberculosis SecA2 pathway in exporting solute binding proteins and Mce transporters to the cell wall. Mol Cell Proteomics. 14 (6), 1501-1516 (2015).
  6. McDonough, J. A., Hacker, K. E., Flores, A. R., Pavelka, M. S. Jr, Braunstein, M. The twin-arginine translocation pathway of Mycobacterium smegmatis is functional and required for the export of mycobacterial beta-lactamases. J Bacteriol. 187 (22), 7667-7679 (2005).
  7. Saint-Joanis, B., et al. Inactivation of Rv2525c, a substrate of the twin arginine translocation (Tat) system of Mycobacterium tuberculosis, increases beta-lactam susceptibility and virulence. J Bacteriol. 188 (18), 6669-6679 (2006).
  8. Braunstein, M., Espinosa, B. J., Chan, J., Belisle, J. T., Jacobs, W. R. Jr SecA2 functions in the secretion of superoxide dismutase A and in the virulence of Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol. 48 (2), 453-464 (2003).
  9. Zulauf, K. E., Sullivan, J. T., Braunstein, M. The SecA2 pathway of Mycobacterium tuberculosis exports effectors that work in concert to arrest phagosome and autophagosome maturation. PLoS Pathog. 14 (4), e1007011(2018).
  10. Guinn, K. M., et al. Individual RD1-region genes are required for export of ESAT-6/CFP-10 and for virulence of Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol. 51 (2), 359-370 (2004).
  11. Lewis, K. N., et al. Deletion of RD1 from Mycobacterium tuberculosis mimics bacille Calmette-Guerin attenuation. J Infect Dis. 187 (1), 117-123 (2003).
  12. Kana, B. D., et al. The resuscitation-promoting factors of Mycobacterium tuberculosis are required for virulence and resuscitation from dormancy but are collectively dispensable for growth in vitro. Mol Microbiol. 67 (3), 672-684 (2008).
  13. Russell-Goldman, E., Xu, J., Wang, X., Chan, J., Tufariello, J. M. A Mycobacterium tuberculosis Rpf double-knockout strain exhibits profound defects in reactivation from chronic tuberculosis and innate immunity phenotypes. Infect Immun. 76 (9), 4269-4281 (2008).
  14. Biketov, S., et al. The role of resuscitation promoting factors in pathogenesis and reactivation of Mycobacterium tuberculosis during intra-peritoneal infection in mice. BMC Infect Dis. 7, 146(2007).
  15. Verma, R., et al. Quantitative proteomic and phosphoproteomic analysis of H37Ra and H37Rv strains of Mycobacterium tuberculosis. J Proteome Res. 16 (4), 1632-1645 (2017).
  16. Malakar, B., et al. Phosphorylation of CFP10 modulates Mycobacterium tuberculosis. mBio. 14 (5), e0123223(2023).
  17. Lochab, S., Singh, Y., Sengupta, S., Nandicoori, V. K. Mycobacterium tuberculosis exploits host ATM kinase for survival advantage through SecA2 secretome. Elife. 9, e51466(2020).
  18. Kurtz, S., McKinnon, K. P., Runge, M. S., Ting, J. P., Braunstein, M. The SecA2 secretion factor of Mycobacterium tuberculosis promotes growth in macrophages and inhibits the host immune response. Infect Immun. 74 (12), 6855-6864 (2006).
  19. Sullivan, J. T., Young, E. F., McCann, J. R., Braunstein, M. The Mycobacterium tuberculosis SecA2 system subverts phagosome maturation to promote growth in macrophages. Infect Immun. 80 (3), 996-1006 (2012).
  20. Putim, C., et al. Secretome profile analysis of multidrug-resistant, monodrug-resistant and drug-susceptible Mycobacterium tuberculosis. Arch Microbiol. 200 (2), 299-309 (2018).
  21. Naz, S., Dabral, S., Kumar, D., Nandicoori, V. K. Protocol for ex vivo competition and sequencing of Mycobacterium isolated from infected guinea pigs. STAR Protoc. 3 (4), 101804(2022).
  22. Xu, D. D., et al. Discovery and identification of serum potential biomarkers for pulmonary tuberculosis using iTRAQ-coupled two-dimensional LC-MS/MS. Proteomics. 14 (2-3), 322-331 (2014).
  23. Prasad, T. S., et al. Proteomic analysis of purified protein derivative of Mycobacterium tuberculosis. Clin Proteomics. 10 (1), 8(2013).
  24. Miller, B. K., et al. Mycobacterium tuberculosis SatS is a chaperone for the SecA2 protein export pathway. Elife. 8, e40063(2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

חלבונים הפרשתייםמערכות הפרשהספקטרומטריית מסותריכוז חלבוןגורמי virulent של חיידקיםאימונומודולציה של המארחצנטריפוגציה
הכנת תסנין תרבית Mycobacterium tuberculosis להבנת פתוגנזה של שחפת
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.