אנו מתארים פרוטוקול פשוט להסרת הסטטוסיסט והרקמות הנלוות ב-ctenophore Mnemiopsis leidyi, הניתן להדמיה חיה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הסרה כירורגית של איבר חישה מורכב בקטנופורים רגנרטיביים מאוד
במאמר זה
סיכום
תקציר
ctenophore Mnemiopsis leidyi הוא מודל חייתי קלאסי של התחדשות כל הגוף. יכולת המשיכה המוגברת של טכניקות מעבדה רבות ומיקומם הפילוגנטי כקבוצת האחות הסבירה לשאר המטזואה הובילו לאחרונה לחידוש העניין המדעי בעבודה עם ctenophores. הם יכולים לחדש כל איבר או סוג תא חסר, כולל התחדשות מלאה של כל הגוף משבר קטן עד ~15% מהגוף, במהלך מספר ימים. כמו רוב הקטנופורים, ל-M. leidyi יש איבר חישת כבידה הממוקם במיקום אבורי המקשר בין קלט חושי לפלט מוטורי כדי לשלוט במיקום הגוף ובהתמצאות שלו. פרוטוקול זה מדגים הסרה כירורגית של קומפלקס האיברים האבורליים (AO) והמבנים הקשורים ב-M. leidyi יחד עם שיטות תרבית, טיפול והרכבה המתאימות להדמיית תהליכי ריפוי והתחדשות הפצעים המתרחשים בשעות עד הימים הבאים. טכניקות פשוטות אלה ניתנות להתאמה רחבה לפרדיגמות ניסיוניות והקשרי מעבדה שונים.
מבוא
Ctenophores, הידועים גם בשם ג'לי מסרק, הם קוסמופוליטיים לסביבות הימיות של כדור הארץ ויכולים להיות שחקנים מרכזיים במערכות אקולוגיות, במיוחד כחלק משרשרת המזון. ctenophore Mnemiopsis leidyi הוא מודל בעל חיים היסטורי ופופולרי יותר ויותר של התחדשות כל הגוף 1,2. היכולת שלהם לחדש כל איבר או סוג תא חסר מתעוררת לקראת סוף העובר ונמשכת לאורך כל חייהם הפוסט-עובריים 3,4 (~0.1 עד >1,000 מ"מ בגודל גוף). הם גם שקופים לאורך כל חייהם ומתאימים לטכניקות הדמיה חיות וקבועות מגוונות. לאב הקדמון המשותף האחרון של כל הקטנופורים היו סוגי תאים רבים ואיברים מורכבים; לרוב הקטנופורים הקיימים יש את רוב אלה במהלך שלב חיים אחד לפחות: איבר אבורלי, חישת כבידה (שנקרא היסטורית האיבר האפיקלי וכאן נקרא האיבר האבורלי, AO), מבנים תנועתיים מיוחדים המורכבים ממקרוציליה מאורגנת מאוד שפועמת באופן מתואם (שורות מסרק), זרועות הזנה נשלפות, ופוטוציטים שזוהרים ביולוגית בתגובה לגירויים מזיקים (איור 1).
למרות סוגי התאים הרבים וההתנהגויות המורכבות ותלויות ההקשר, גוף חזק של נתונים גנומיים תומך במיקום של ctenophores כקבוצת האחות הסבירה לכל שאר בעלי החיים 5,6,7,8. הבדלים עיקריים בבסיס התאי והתפקודי של מערכת העצבים ctenophore מבעלי חיים אחרים בעלי מערכת עצבים (bilaterians ו-cnidarians) הציעו את ההשערה שמערכת העצבים ctenophore מייצגת מקור עצמאי; עם זאת, זה עדיין לא ודאי 9,10,11,12.
קומפלקס איברי החישה האבורליים כולל את הסטטוסיסט, הכולל סוגי תאים רבים, כולל סוגים מרובים של תאים נוירו-חושיים משוערים 13,14,15,16,17,18, ונמצא בתחזוקה מתמדת בקטנופורים לא מניפולטיביים. תאים מכניים-חושיים נושאים צרורות ריסניים גדולים, המוסטים על ידי סטטוליט המורכב מתאים ביו-מינרליים (הנקראים ליתוציטים) כדי לזהות כוח משיכה. שני "שדות קוטביים", המכילים מבנים חושיים משוערים בעלי תפקוד לא ידוע14 ותאים פוטו-סנסוריים סבירים16, סמוכים לסטטוסיסט.
מחקר ניסיוני של יכולת ההתחדשות של M. leidyi השתרע על פני בעלי החיים הקטנים ביותר במעבר מעובר לאבקוע (~100 מיקרומטר) לבוגרים מקרוסקופיים החיים חופשיים (>2 ס"מ). M. leidyi בקוטר גוף ~1 מ"מ גדולים מספיק כדי לאפשר מניפולציה כירורגית ידנית ללא מכשירים מיוחדים כגון מיקרומניפולטורים, אך הם קטנים מספיק כדי להיות מורכבים על שקופית מיקרוסקופ סטנדרטית להדמיה עם מטרות עוצמתיות. פרוטוקול זה מדגים הסרה כירורגית של איבר החישה האבורלי והמבנים הנלווים, יחד עם שיטות תרבית והדמיה המתאימות לתיעוד תהליכי ריפוי והתחדשות הפצעים המתרחשים בשעות עד הימים הבאים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכינו כלים וציוד
- בעזרת מבער בונסן רגיל, משוך ביד מחטי חיתוך זכוכית ממיקרופיפטות נימיות זכוכית. עבור בעלי חיים מעל 1 מ"מ, השתמש במיקרופיפטות זכוכית סודה ליים מכוילות המיועדות לטיפול בנוזלים.
הערה: גודל 100 מיקרוליטר עובד היטב על פני טווח המוקד של 0.5-3 מ"מ.- צור חרוט להבה כחול חד במבער הבונסן .
- החזק את נקודת המרכז של פיפטת הזכוכית בלהבה עד שהיא מתרככת מספיק כדי לנוע בלחץ עדין.
- הסר את הפיפטה מהלהבה ומשוך מיד את שני הצדדים ישר זה מזה ליצירת מחט קצרה וחזקה.
הערה: ניתן להמיס מחדש את מחט הזכוכית אם לא הושגה תוצאה משביעת רצון בניסיון הראשון, וניתן לשמור ולמשוך מחדש מחטים שבורות. ראה איור 2 לדוגמאות של מחטים שמישות ובלתי שמישות שנמשכו בשיטה זו.
אלטרנטיבה: מחטים בגודל 26 גרם 1/2 אינץ' גם עובדות היטב, במיוחד בקצה הגדול יותר של טווח גודל המוקד.
- הכן מי ים סטריליים על ידי העברת מי ים טבעיים או מלאכותיים דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר.
- צור פיפטות מדידה.
- בעזרת מספריים חדים או סכין גילוח, חותכים פיפטת העברה מפלסטיק כדי לייצר פתח בקוטר הפנימי בגודל המועדף. שמור מוכן לפחות פיפטה אחת לחלק העליון של הטווח הרצוי ואחת לתחתית הטווח הרצוי. ראה איור 3 לדוגמא סט של פיפטות מדידה.
הערה: פיפטות אלו עובדות היטב עד ~8 מ"מ. אפשר גם להעריך גודל בעזרת מיקרומטר או כלי מדידה מצילומים.
- בעזרת מספריים חדים או סכין גילוח, חותכים פיפטת העברה מפלסטיק כדי לייצר פתח בקוטר הפנימי בגודל המועדף. שמור מוכן לפחות פיפטה אחת לחלק העליון של הטווח הרצוי ואחת לתחתית הטווח הרצוי. ראה איור 3 לדוגמא סט של פיפטות מדידה.
2. הכינו בעלי חיים לניסוי
- בחר פרטים נורמליים מורפולוגית בגודל ובשלב הרצויים.
הערה: אנו מוצאים בעלי חיים בקוטר ~0.5-3 מ"מ כאופטימליים להרכבה על מגלשות. בדוק שבעלי חיים אינם מתאימים לפיפטה בגודל התחתון אך מתאימים בנוחות לפיפטה בגודל הגבוה ביותר. - להרעיב חיות ניסוי במשך 8-16 שעות.
הערה: בעוד ש-M. leidyi הם שקופים אופטית ואינם אוטו-פלואורסצנטיים במיוחד, המזון המסתובב במערכת העיכול שלהם הוא בדרך כלל אטום ולעתים קרובות אוטו-פלואורסצנטי.
3. בצע חתכים
- השתמש בצינור העברה רחב יותר מגודל הגוף של חיית הניסוי כדי להעביר אותו לצלחת פוליסטירן 35 מ"מ המכילה מי ים סטריליים.
- דמיין את הדגימה באמצעות מיקרוסקופ הניתוח. גלגלו חיה אחת על צד הוושט שלה (איור 1). השקפה זו נותנת את הגישה הקלה ביותר להסרת האיבר האוראלי. התמקדו באיבר האבורלי.
הערה: ההגדלה השימושית ביותר עשויה להשתנות בהתאם לגודל החיה ולהעדפת המשתמש. בדרך כלל הגדלה של פי 12-20 עובדת היטב. - החזק בעדינות את החיה במקומה עם מחט זכוכית אחת באמצעות היד הלא דומיננטית.
- בעזרת היד הדומיננטית, הכנס את קצה המחט מעט מתחת לאיבר האוראלי. היכנס בצורה אלכסונית כדי לבצע חתך אחד מקצה גלוי אחד של האיבר האוראלי אל מתחת לבסיסו. משוך את המחט ובצע חתך שני כדי להסיר פיסת רקמה בצורת טריז המכילה את כל המבנים של האיבר האבורלי (ראה איור 4, פאנל עליון). בדוק היטב את החיה ואת הרקמה שנכרתה כדי לוודא שהניתוח הצליח.
- השתמש באותו צינור העברה כדי להעביר את החיה הטרייה שנחתכה לכלי טרי המכיל מי ים סטריליים.
הערה: הפצע ייסגר במהירות, כך שבהתאם למטרות הניסוי (כגון למספר דגימות מתחדשות סינכרוניות או להדמיית שלבים מוקדמים של ריפוי והתחדשות), יש לנוע במהירות כדי לייצר מספר דגימות. השתמש בטיימר כדי להגביל את זמן הניתוח כדי לשמור על קבוצות של בעלי חיים מתחדשים קרובים זה לזה.
4. בדוק שהחתכים נכונים
הערה: אפילו בדיקה מדוקדקת תחת המיקרוסקופ המנתח, לעיתים ניתן לפספס טעויות כירורגיות.
- בצע את שלבי ההרכבה שלהלן כדי להרכיב באופן זמני כל אדם לאחר ניתוח על מגלשת זכוכית כדי לבדוק תחת מיקרוסקופ מורכב עם DIC שכל המבנים המיועדים הוסרו כהלכה. בצע בדיקה זו גם אם אינך מבצע הדמיה נוספת בשלב זה.
הערה: יכולות הריפוי המצוינות של ctenophores מתאימות אותם היטב לניסויי השתלה; אנו תמיד מסירים את האיברים האבורליים שנכרתו מכלי התרבית כדי למנוע את האפשרות שהצדדים החתוכים של AO שהוסר ושאר החיה ממנה הוא הוסר עלולים להידבק זה לזה ולהתמזג.
אם אינך ממשיך ישירות להדמיה ארוכת טווח, אל תאטום את השקופית. זה יקל על ההחלמה המהירה והחזרה לתרבות של חיית ניסוי זו. מומלץ לבדוק את הדיוק הניתוחי בהגדלה גבוהה. בפרט, ניתן להפיל את הסטטוליט מהכיפה מבלי להשלים את הניתוח.
5. הדמיה חיה
- הרכבה
- טפל בשקופית מיקרוסקופ זכוכית רגילה עם חומר סילניזציה, כגון דוחה מים לטיפול בזכוכית, והניח להתייבש לחלוטין.
- העבירו חיה אחת לאחר הניתוח לשקופית מוכנה עם פיפטת העברה. ודא שחרוזי המים עולים עם החיה בפנים.
- הניחו כמות קטנה של חימר דוגמנות (~1.5 מ"ג) על כל פינה של זכוכית כיסוי ליצירת "רגליים" שישמשו כמרווח להרמת זכוכית הכיסוי הרחק מהחיה.
- הניחו בעדינות את זכוכית הכיסוי, חימר למטה, על גבי החיה. אוחזים בכל פינה של זכוכית הכיסוי, מגלגלים את החיה למקומה להדמיה. לחץ כלפי מטה כדי לדחוס מעט את החיה והחזק אותה במקומה. מקם מחדש את המדגם ככל שנדרש כדי להגיע לתצוגה משביעת רצון.
- להדמיה ארוכה מ~30 דקות, יש למרוח שכבה דקה של ג'לי נפט על כל קצה של זכוכית הכיסוי כדי למנוע ייבוש של הדגימה.
הערה: M. leidyi המורכב בדרך זו ניתן לשחזור בקלות לצורך תרבית נוספת או בדיקות אחרות. עם זאת, בעלי חיים בדרך כלל ישתחררו וימקמו את עצמם מחדש תוך 1-2 שעות, כך שצילום רציף של דולג זמן ארוך יותר משעתיים ידרוש גישת הדמיה שונה.
6. תרבות
- תנאי התרבות הקידיפידית
- תרבית מניפולציה כירורגית של בעלי חיים ובקרות במי ים טבעיים או מלאכותיים מסוננים בטמפרטורת החדר. השתמש בחממה המוגדרת ל-20-22 מעלות צלזיוס כדי להבטיח תוצאות עקביות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
M. leidyi בשלב Cydippid בדרך כלל משלים את סגירת הפצע תוך ~20 דקות לאחר הפציעה (איור 4 ואיור 5), בעוד שהתחדשות מלאה של האיבר יכולה לקחת 1-3 ימים. לתזמון הזה יש שונות ביולוגית מסוימת, אך הוא כמעט תמיד מסתיים עד 72 שעות לאחר הניתוח (איור 6).
הסרה כירורגית של תאים ומזוגלאה מקומפלקס האיברים האבורליים והרקמות הסמוכות, ואחריה סגירה מהירה של הפצע מביאה לקוטר גוף קטן יותר, כפי שמוצג בתמונות לפני ואחרי הני...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ניתן לבצע ניסויים דומים על כל גודל של M. leidyi הרצוי; המורפוגנזה של האיבר הושלמה במקביל לתחילת יכולת ההתחדשות4. ניתן לאסוף בעלי חיים מהטבע19 או לגדל במעבדה 20,21. אם רוצים גודל גוף מסוים, ניתן לאפשר לבעלי חיים להשריץ, ולהעלות את הצאצאים לגודל הרצוי. ניתן להעריך את גודל הגוף באמצעות פיפטות המדידה, המיוצרות בפרוטוקול שלב 1.3, חתוכות לקוטר הפנימי הרצוי (א...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.
תודות
המחברים מודים בהכרת תודה לג'וביטה ג'וזף.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.2 μ m מסנן מזרק SFCA | תרמו/נלג'ן | 723-2520 | צור מי ים סטריליים |
| צלחת פטרי פוליסטירן 35 מ"מ | פלקון/קורנינג | 351008 | לבצע חתכים; תרבות בעלי חיים קטנים |
| מזרק חד פעמי 60 מ"ל Luer-Lock | BH אספקה | BH60LL | צור מי ים סטריליים |
| צנרת זכוכית מכוילת, 100 μ L | דראמונד | 2-000-100 | בצע חיתוכים |
| משקפי כיסוי, #1.5, 18 מ"מ רבוע | VWR | 16004-326 | תושבת להדמיה |
| קטנופורים | דגימות מפרץ | בעלי חיים חיים | |
| מגלשות שקע זכוכית בחלל כפול, 1.3 מ"מ | VWR | 470200-930 | תושבת להדמיה |
| שקופיות מיקרוסקופ זכוכית | VWR | 16004-398 | תושבת להדמיה |
| מלח ים אינסטנט אוקיינוס | אינסטנט אושן | מדיום גידול בעלי חיים | |
| סרגל מיני | טד פלה | 13623 | מדידת פיפטות פלסטיק |
| חימר דוגמנות (פלסטלינה) | פפי פלסטילינה | תושבת להדמיה | |
| ג'לי פטרולום | וזלין | תושבת להדמיה | |
| פיפטות העברה מפלסטיק (גדלים שונים) | קול-פארמר | 06226-13, 06226-12, 06226-01 | להזיז בעלי חיים קטנים |
| טיפול בזכוכית Rain-X | גשם-X | סילן שקופיות מיקרוסקופ | |
| סרגל | ווסטקוט | 10564 | מדידת פיפטות פלסטיק |
| מספריים | אוקסו | חתוך פיפטות פלסטיק |
מקורות
- Edgar, A., Mitchell, D. G., Martindale, M. Q. Whole-body regeneration in the lobate ctenophore Mnemiopsis leidyi. Genes. 12 (6), 867(2021).
- Martindale, M. Q., Henry, J. Q. Ctenophora. Evolutionary Developmental Biology of Invertebrates 1. , Springer. 179-201 (2015).
- Martindale, M. Q. The onset of regenerative properties in ctenophores. Curr Opin Genet Dev. 40, 113-119 (2016).
- Martindale, M. Q. The ontogeny and maintenance of adult symmetry properties in the ctenophore, Mnemiopsis mccradyi. Dev Biol. 118 (2), 556-576 (1986).
- Dunn, C. W., et al. Broad phylogenomic sampling improves resolution of the animal tree of life. Nature. 452 (7188), 745-749 (2008).
- Ryan, J. F., et al. The genome of the ctenophore Mnemiopsis leidyi and its implications for cell type evolution. Science. 342 (6164), 1242592-1242592 (2013).
- Whelan, N. V., et al. Ctenophore relationships and their placement as the sister group to all other animals. Nat Ecol Evol. 1 (11), 1737-1746 (2017).
- Schultz, D. T., et al. Ancient gene linkages support ctenophores as sister to other animals. Nature. 618, 110-117 (2023).
- Burkhardt, P. Ctenophores and the evolutionary origin(s) of neurons. Trends Neurosci. 45 (12), 878-880 (2022).
- Sachkova, M. Y., et al. Neuropeptide repertoire and 3D anatomy of the ctenophore nervous system. Curr Biol. 31 (23), 5274-5285.e6 (2021).
- Moroz, L. L., et al. The ctenophore genome and the evolutionary origins of neural systems. Nature. 510 (7503), 109-114 (2014).
- Burkhardt, P., et al. Syncytial nerve net in a ctenophore adds insights on the evolution of nervous systems. Science. 380 (6642), 293-297 (2023).
- Tamm, S. L., Tamm, S. Novel bridge of axon-like processes of epithelial cells in the aboral sense organ of ctenophores. J Morphol. 254 (2), 99-120 (2002).
- Jager, M., et al. New insights on ctenophore neural anatomy: Immunofluorescence study in Pleurobrachia pileus (Müller, 1776). J Exp Zool B Mol Dev Evol. 316B (3), 171-187 (2011).
- Hernandez-Nicaise, M. -L. The nervous system of ctenophores III. Ultrastructure of synapses. J Neurocytol. 2 (3), 249-263 (1973).
- Schnitzler, C. E., et al. Genomic organization, evolution, and expression of photoprotein and opsin genes in Mnemiopsis leidyi: a new view of ctenophore photocytes. BMC Biol. 10 (1), 107(2012).
- Harrison, F. W., Westfall, J. A. Ctenophora. Microscopic Anatomy of Invertebrates. 2: Placozoa, Porifera, Cnidaria, and Ctenophora. , Wiley. New York. 359-418 (1991).
- Horridge, G. A. Presumed photoreceptive cilia in a ctenophore. J Cell Sci. S3-105 (71), 311-317 (1964).
- Ramon-Mateu, J., Edgar, A., Mitchell, D., Martindale, M. Q. Experimental methods to study ctenophore whole-body regeneration. Methods Mol Biol. 2450, 95-119 (2022).
- Soto-Àngel, J. J., et al. Stable laboratory culture system for the ctenophore Mnemiopsis leidyi. Methods Mol Biol. 2757, 123-145 (2022).
- Presnell, J. S., Bubel, M., Knowles, T., Patry, W., Browne, W. E. Multigenerational laboratory culture of pelagic ctenophores and CRISPR-Cas9 genome editing in the lobate Mnemiopsis leidyi. Nat Protoc. 17 (8), 1868-1900 (2022).
- Coonfield, B. R. Apical dominance and polarity in Mnemiopsis leidyi, Agassiz. Biol Bull. 70 (3), 460-471 (1936).
- Freeman, G. Studies on regeneration in the creeping ctenophore, Vallicula multiformis. J Morphol. 123, 71-84 (1967).
- Bading, K. T., Kaehlert, S., Chi, X., Jaspers, C., Martindale, M. Q., Javidpour, J. Food availability drives plastic self-repair response in a basal metazoan-case study on the ctenophore Mnemiopsis leidyi A. Agassiz. Sci Rep. 7 (1), 16419(2017).
- Mateu, J. R., Ellison, S. T., Angelini, T. E., Martindale, M. Q. Regeneration in the ctenophore Mnemiopsis leidyi occurs in the absence of a blastema, requires cell division, and is temporally separable from wound healing. BMC Biol. 17 (1), 80(2019).
- Mitchell, D. G., Edgar, A., Mateu, J. R., Ryan, J. F., Martindale, M. Q. The ctenophore Mnemiopsis leidyi deploys a rapid injury response dating back to the last common animal ancestor. Commun Biol. 7 (1), 203(2024).
- Jokura, K., Anttonen, T., Rodriguez-Santiago, M., Arenas, O. M. Rapid physiological integration of fused ctenophores. Curr Biol. 34 (19), R889-R890 (2024).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
