שיטה יעילה להדמיית ריאות עכברים המשמרת דינמיקה מרחבית של נבגי פטריות בדרכי הנשימה

Summary

אנו מציגים שיטה למודל פתוגנזה פטרייתית המשמרת את המיקום הטבעי של נבגי פטריות בדרכי הנשימה של הריאות לניתוח באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

Abstract

פטריות מדביקות בני אדם כאשר נבגים סביבתיים נשאפים לריאות. הריאה היא איבר הטרוגני. דרכי הנשימה המוליכות, כולל הסמפונות והסימפונות, מסתעפות עד לסיומם במרחב האווירי המכתשית שבה מתרחשים חילופי גזים. זיהומים שמקורם בסימפונות או בנאדיות מעוררים תגובות מארח מובהקות וביטויי מחלה. לכן, הבנה מדויקת היכן נבגים מתמקמים באופן טבעי בריאות, במיוחד זמן קצר לאחר ההדבקה, מרחיבה את ההזדמנויות לחקירה של אינטראקציות מארח-פתוגן. כאן, אנו מפרטים ניתוח באתרו של ריאות מעכברים הנגועים ב-Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ arthroconidia. שיטות קונבנציונליות לשימור היסטולוגי כוללות ניפוח נוזלי של דרכי הנשימה עם תמיסה מקבעת, אשר מעבירה את המיקום הטבעי של חלקיקי פטרייה נשאבים, ודוחפת נבגים מהסימפונות הפרוקסימליים למרחבי האוויר הסופיים.

לעומת זאת, שיטה זו של ניפוח אוויר עם קיבוע זלוף כלי דם משמרת את המיקום הפיזיולוגי של נבגי פטריות בתוך הסימפונות. יתר על כן, אנו מתארים גישה פשוטה לשימור בהקפאה, הטמעה והדמיה של דגימות ריאה. אנו גם חולקים טכניקות חישוביות בעלות תפוקה גבוהה באמצעות תוכנת הקוד הפתוח QuPath כדי לנתח את ההתפלגות המרחבית של נבגי פטריות בתוך הריאה. השיטה המוצגת כאן היא פשוטה ומהירה, דורשת ציוד מינימלי לביצוע, וניתן להתאים אותה בקלות לשימוש עם מודלים רבים של זיהום פטרייתי בדרכי הנשימה.

Introduction

בני אדם יכולים לשאוף עד מיליארדי נבגים ביום ממגוון פטריות סביבתיות¹. כדי להבין את הגנות המחסום שלנו כנגד הנבגים הנשאפים האלה, עלינו להעריך את הסביבות המיקרואנטומיות המדויקות שבהן הנבגים האלה נוחתים בתוך דרכי הנשימה ופרנכימת הריאות. ההרכב התאי של דרכי הנשימה (כלומר, תאי אפיתל) משתנה באופן משמעותי לאורך קנה הנשימה, הסמפונות, הסימפונות והנאדיות. כל אחד מהאזורים השונים הללו מורכב מסוגי תאים שונים עם פונקציות נפרדות המועילות לארסנל של הגנות למניעת זיהום פתולוגי.

המיקום המדויק של שקיעת נבגים פטרייתית ריאתית יכול להשתנות בין לומן דרכי הנשימה של סימפונות מרופדים באפיתל עמודים, צינורות מכתשית או נאדיות². רוב מיני הפטריות הרלוונטיים מבחינה קלינית מייצרים נבגים בקוטר^של 1 מיקרומטר עד 10 מיקרומטר. שקיעת חלקיקי הנבגים הללו בריאה תלויה במספר גורמים, כגון אווירודינמיקה, צפיפות, מטען חשמלי וכוחות פורטיים, שיכולים להשפיע על מנגנון המשקע לאחר שאיפה⁴. בדרך כלל, חלקיקים גדולים (> 6 מיקרומטר) משקעים בדרכי הנשימה העליונות, חלקיקים בגודל בינוני (2-6 מיקרומטר) יכולים לשקע בדרכי הנשימה הקטנות יותר, וחלקיקים קטנים (<2 מיקרומטר) מגיעים לאזור המכתשית⁵. נבגי אספרגילוס (2-3 מיקרומטר) דווחו כמגיעים לחללים המכתשית, אך דיווחים פתולוגיים קליניים מצביעים גם על עומס משמעותי של מחלת הסימפונות^{והסימפונות 6}. יש גם הכרה הולכת וגוברת בזיהומים פטרייתיים אנדוברונכיאליים של Aspergillus fumigatus, Coccidioides immitis, מיני קנדידה, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum ו-Zygomycetes בשל הפופולריות הגוברת של ברונכוסקופיה גמישה⁷. ההתקדמות האחרונה בהדמיה מיקרוסקופית של זיהומי אספרגילוס בעכברים גילתה גם כי מרחבי אוויר פרוקסימליים יותר כגון סמפונות וסימפונות עשויים לשאת בנטל הגבוה ביותר לשגשוג פטרייתי פתולוגי⁸. מחקר על תגובת המארח לזיהומים פטרייתיים ריאתיים הראה כי גם תאי אפיתל ברונכיולר וגם תאי אפיתל מכתשית ממלאים תפקידים חשובים כזקיפים חיסוניים, כך שהבהרת האתרים המדויקים של שקיעת נבגים ואינטראקציה אפיתל תהיה חיונית לעבודה עתידית ^2,9,10.

חקר הדינמיקה של פתוגנזה של דרכי הנשימה הפרוקסימליות הללו קשה מכיוון שטכניקות סטנדרטיות של קיבוע ריאות והכנת חתכים יכולות לעקור נבגים מהמיקומים הפרוקסימליים הללו בדרכי הנשימה המרופדות באפיתל ולדחוף אותם לעבר אזורי המכתשית הסופית הדיסטלית. בדרך כלל, 10% פורמלין או 4% פרפורמלדהיד משמשים לניפוח הריאות ולחשיפה מהירה של הריאה כולה לקיבוע. בעת הכנת ריאות להקפאה, קבוצות מסוימות נותנות תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) לתוך הריאות כדי לשפר את ביצועי ההקפאה¹¹. שיטות אלה שימושיות בהקשר הנכון אך נמצאו על ידי המעבדה שלנו וקבוצות אחרות כעוקפות נבגים וחלקיקים ממיקומים פרוקסימליים, ובכך מפריעות לפרשנויות לגבי סוגי התאים החשופים לנבגים ותגובת המארח שלאחר מכן¹².

כדי לבסס במדויק את הלוקליזציה המיקרו-אנטומית של נבגי פטריות בשאיפה, פיתחנו שיטה מהירה ודלת משאבים לשימור המיקום של נבגי פטריות בדרכי הנשימה של עכברים. אימצנו שיטת קיבוע זלוף כלי דם של ניפוח אוויר בעכברים מ-Thomas et al. (2021), שם הפחתנו את כמות הציוד, הזמן והמיומנות הטכנית הנדרשים להשגת תוצאה משביעת רצון¹³. מהשיטה המתוארת כאן, ראינו כי Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ arthroconidia (בגודל 3-5 מיקרומטר) מצטבר בצורה קרובה יותר ממה שהוצג בעבר, כלומר בסימפונות דיסטליות וצמתים ברונכו-מכתשית ולא בנאדיות סופניות. מידע זה יכול למקד שאלות ביולוגיות הנוגעות לסוגי התאים הקריטיים הקשורים לאזורים אלה של הריאה והשפעתם על התגובות המוקדמות לנבגי פטרייה בשאיפה.

Protocol

כל השיטות המתוארות בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של מדעי הבריאות הביו-רפואית של ראטגרס.

1. סמן נבגים עם פלואורסצנטיות תוך תאית

1. כתם 1 x 10⁶ נבגים ב-carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), Cell Tracker Orange, או Cell Tracker Red (או צבע תוך-תאי לבחירה) ב-5 מיקרומטר למשך 30 דקות ב-30 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן שטפו עם PBS, וסובבו את הנבגים ב-12,000 x גרם. חזור על שטיפה זו פעם אחת.
2. הכן את חיסון הנבגים בריכוז המתאים כך ש-25 מיקרוליטר יכיל את מינון הנבגים המתאים לעכבר אחד.

2. חיסון עכבר בנבגים באמצעות שאיפת שאיפה באמצעות הרדמה איזופלורן

זהירות: איזופלורן הוא חומר הרדמה נדיף ויש להשתמש בו בתוך ארון בטיחות ביולוגית או קולט אדים.

1. להכנת צנצנת החשיפה לאיזופלורן, הניחו מפית מקופלת בצנצנת Nalgene עם הברגה של 1 ליטר והניחו עיגול רשת פלסטיק מעל המפית כפלטפורמה לעכברים. הוסף למפית 2 מ"ל איזופלורן, סגור את הצנצנת והמתן 1-2 דקות עד שהגז יתאזן במיכל.

איור 1: מכשיר לשיטת טיפה פתוחה איזופלורן לחיסון נבגים. מפית מקופלת מונחת בתחתית צנצנת בורג עליונה בנפח 1 ליטר, ואז מוכנסת רשת פלסטיק עגולה שתשמש כפלטפורמה לעכברים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

2. לפני חשיפת העכבר להרדמה, הכינו פיפט עם 25 מיקרוליטר של החיסון. הנח את העכבר במיכל האיזופלורן והטה את המיכל כדי לפקח על אובדן רפלקס היישור, שבו העכבר איבד את הכרתו והוא הפוך. זה בדרך כלל לוקח בערך 10 שניות.
3. עקוב אחר קצב הנשימה (RR) עד שהוא מאט ל-50-80 נשימות לדקה (bpm), כ-50% מה-RR במנוחה. זה בדרך כלל לוקח עוד 10 שניות. בשלב זה, הסר את העכבר מצנצנת האיזופלורן.
   הערה: זהו ריכוז גבוה של איזופלורן, שייצר אינדוקציה מהירה של הרדמה, ויש לעקוב מקרוב אחר העכבר. מנת יתר קטלנית של איזופלורן מהווה סיכון, מכיוון שריכוז האיזופלורן יכול להיות משתנה, ועקומת המינון-תגובה לאיזופלורן תלולה מאוד. אם קצב הנשימה יורד מתחת ל-50 פעימות לדקה ו/או אינו סדיר, הסר את העכבר מאיזופלורן, אפשר לו להתאושש למשך 3-5 דקות ונסה שוב (מקסימום שני ניסיונות חוזרים).
4. אשר את עומק ההרדמה על ידי חוסר תגובה לצביטה בבוהן. לאחר מכן, מקם את העכבר במצב שכיבה ביד אחת, ואפשר לעכבר לקחת 3-5 נשימות מתנשמות רגילות בקצב הולך וגובר (החל מ-50-60 פעימות לדקה) ומרץ. כשזה מתחיל, הנח את קצה הפיפט בחלק האחורי של האורופרינקס של העכבר ושחרר את החיסון במהלך שאיפה.
   הערה: התנשפויות אלה דרך הפה מטלטלות את הראש בצורה נחותה עקב גיוס שרירי עזר לנשימה. כאשר מחדירים את הפיפט במהלך ההתנשפויות הללו, הפה צריך להיפתח עם כל התנשמות. אם הפה לא נפתח, העכבר אינו מורדם מספיק וסביר להניח שלא ישאף תוכן מהלוע. הפיפט צריך ללחוץ על הלשון, לדחוף אותה לכיוון החלק התחתון והקדמי של הפה כדי למנוע בליעה של החיסון. כאשר הפיפט נמצא בפה והעכבר מורדם כראוי, העכבר יפתח את פיו בכל התנשמות.
5. כשהיד והאגודל מחזיקים את העכבר, יש לחוש פצפוצים בהיבטים האחוריים והקדמיים של בית החזה של העכבר כדי לאשר שאיפת החיסון.

3. המתת חסד של עכברים

1. הזריק לעכבר תוך הצפק קוקטייל של 200 מ"ג/ק"ג קטמין ו-24 מ"ג/ק"ג קסילזין 10 דקות לפני נקודת הזמן של ההקרבה.
2. המתן 10 דקות לאחר ההזרקה עד שהעכבר נכנס למישור כירורגי של הרדמה, שאושר על ידי חוסר תגובה לצביטה בבוהן.

4. זלוף ריאות עם PBS ופורמלין

1. רססו את העכבר המורדם ב-70% אתנול. השתמש במספריים כדי לחתוך לאחור את עור העכבר ולפרק את העור כדי לחשוף את הצפק מכל הצדדים. משוך את העור מהחצי העליון של העכבר מעל ראשו, ומשוך החוצה את הזרועות מהעור.
2. חותכים את קרום הצפק בעצם החזה ולאורך ההיבט התחתון של כלוב הצלעות, וחושפים את הצפק. לעקור את הכבד בצורה נחותה, לחשוף את הסרעפת. השתמש במספריים כדי לנקב בזהירות את הסרעפת הרחק מפרנכימת הריאות כדי למנוע ניקוב חור בריאות עצמן.
   הערה: ניקוב לא מכוון של הריאות יהפוך את ניפוח האוויר הבא לבלתי אפשרי.
3. לאחר ניקוב הסרעפת, אוויר נכנס לבית החזה וממוטט את הריאות. חותכים את כלוב הצלעות בצד שמאל כדי לחשוף את הלב. הזרקו 5-10 מ"ל PBS לחדר הימני עם מחט 30 גרם בקצב של 1 מ"ל ל-5 שניות (כדי למנוע נזק לכלי הדם), תוך הלבנה מהירה של הריאות.
   זהירות: פורמלין הוא חומר נדיף מסוכן שיש לטפל בו בתוך ארון בטיחות ביולוגית או קולט אדים.
4. בסיום, הסר את המחט והשתמש במחט חדשה כדי להזריק 5 מ"ל של 10% פורמלין ניטרלי (NBF) לחדר הימני באותו קצב.

5. ניפוח אוויר של הריאה המנופחת

1. הסר את החצי הקדמי של כלוב הצלעות. כדי לחשוף את קנה הנשימה, חותכים את הצלעות העליונות ועצמות הבריח מימין ומשמאל לצוואר. הקפד להימנע מחיתוך ליד קו האמצע שבו קנה הנשימה ישכב. בעזרת מלקחיים, הצמידו את הצלעות העליונות ועצמות הבריח הנותרות בקו האמצע של הצוואר ומשכו ביתר שאת עד שקנה הנשימה נחשף.
2. הכינו חוט תפר באורך 10 ס"מ, משכו אותו מתחת לקנה הנשימה וקשרו מראש קשר רופף בקצה התחתון של קנה הנשימה החשוף. הכן מזרק אוויר של 1 מ"ל עם קטטר 18 גרם. השתמש במחט 18 גרם כדי ליצור חור בקנה הנשימה בקצה העליון של האזור החשוף.
3. הכנס את הקטטר לתוך החור הזה, והבטח התאמה הדוקה יחסית כדי למנוע בריחת אוויר. הזריק לאט את 1 מ"ל האוויר לריאות במהלך 10 שניות, תוך שמירה על ניפוח הריאות של כל האונות. ניפוח מלא מביא לכך שהריאות עוטפות מעט את הלב וממלאות את הנפח שהן תופסות בסרעפת הלא מנוקבת.
4. משוך את הקשר בחוזקה סביב קנה הנשימה והסר את הקטטר. החזק את קנה הנשימה והשתמש במספריים קהים כדי להסיר את הריאות מהעכבר, והיזהר לא לנקב את הריאה.

6. קיבוע טבילה והתייבשות

1. הנח את הריאות על הקצה העליון של צינור חרוטי של 50 מ"ל מלא ב-20 מ"ל של 10% NBF. שמור את חוטי התפר מחוץ לחרוט, הברג את המכסה והפוך את החרוט כך שהריאות תלויות הפוכות ב-20 מ"ל של NBF. הניחו אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 24-48 שעות.
2. שטפו את הריאות ב-PBS, ולאחר מכן הניחו בתמיסת 30% סוכרוז-PBS (w/v) למשך 72-96 שעות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לייבש את הריאות כהכנה לשימור בהקפאה. הסר את הריאות מסוכרוז, הנח את הריאות בקריומולד עם מדיום טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT), והקפיא את הדגימה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

7. הקפאה

1. אזנו את הדגימות בקריובלוקים של OCT לטמפרטורת -20 מעלות צלזיוס של הקריוסטט למשך שעה אחת לפני החיתוך. חותכים את הבלוקים בעובי של 20-100 מיקרומטר.
   הערה: ניפוח אוויר עלול להוביל לשבריריות מוגברת של הדגימה, וחיתוך בעובי מוגבר יכול למנוע שבירת רקמות במהלך החיתוך.
2. אסוף חלקים על שקופיות זכוכית והניח להתייבש במשך 30 דקות עד שעה כדי להבטיח היצמדות רקמות למגלשה.
   הערה: ניתן להחזיק מגלשות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס בשלב זה.

8. הכנת שקופיות וחסימה

1. הניחו את השקופיות באמבט PBS (בצלחת או בצנצנת קופלין) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי להסיר OCT מהשקופיות.
   הערה: חלקים עבים יותר (40-100 מיקרומטר) עשויים שלא להיצמד למגלשות זכוכית כמו גם לחלקים דקים יותר, ולכן עדיף לשמור אותם שטוחים וזקופים בצלחת ולא להניח על צידם בצנצנת קופלין.
2. יבש את השקופיות לאחר ש-OCT התמוסס הרחק מהרקמה. השתמש במגבון כדי לייבש טיפות עודפות מהיקף המגלשה סביב דגימת הרקמה.
3. השתמש בעט פאפ הידרופובי כדי לצייר היקף סביב הדגימה, ותן לה להתייבש במשך 5 דקות.
4. הכן מאגר חסימה של תמיסת חסימה ללא בעלי חיים עם 0.3% Tween-20 ו-1:100 Fc Block ב-300 מ"ל לכל מגלשה.
   הערה: עבור מטרות תוך-תאיות, ניתן להשתמש ב-1% Tween-20. נפח של 300 מיקרוליטר מספיק בדרך כלל, אך הנפח הדרוש לכיסוי הרקמה תלוי לחלוטין בגודל ההיקף של הסמן ההידרופובי. הרקמה לא צריכה להתייבש מנקודה זו ואילך.
5. השאירו את פתרון החסימה על השקופיות למשך שעה אחת ב-RT.

9. צביעה חיסונית

1. שטפו את השקופית על ידי הוצאת הנוזל והוספת 300-500 מיקרוליטר PBS. חזור על הכביסה פעם אחת.
2. הכן נוגדן EpCAM מצומד נגד עכברים של AlexaFluor-647 (שיבוט G8.8) (סמן אפיתל של דרכי הנשימה) בתמיסת חוסם ללא בעלי חיים עם 0.33% Tween-20 (או 1% למטרות תוך-תאיות). הוסף 300 מיקרוליטר לכל שקופית של תמיסה זו והכתים למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
   הערה: יש לבדוק נוגדנים באופן אמפירי לריכוז הצביעה, הזמן והטמפרטורה. חלקים דקים (8-20 מיקרומטר) מוכתמים במשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס וחלקים עבים יותר (20-100 מיקרומטר) ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה באמצעות דילול של 1:100 עבור רוב הנוגדנים. אם משתמשים בנוגדנים לא מצומדים, יש לשטוף פעמיים (כנ"ל) ולמרוח נוגדן פלואורסצנטי משני לזמן וטמפרטורה שנקבעו אמפירית. בדרך כלל, צביעת נוגדנים משנית נעשית ב-RT למשך שעה אחת בדילול של 1:1000.
3. הסר את תמיסת הנוגדנים מהדגימה, ושטוף את השקופית עם 300 מ"ל PBS למשך 5 דקות. חזור על שטיפה זו פעם אחת. יבש את השקופיות, הסר את כל עודפי הנוזלים מהדגימה ומהזכוכית שמסביב.
4. הוסף טיפה אחת של מדיית הרכבה רכה RT (למשל, SlowFade Glass) לכל פיסת רקמה. הקפידו להימנע מבועות על ידי מתן הבקבוק לשקוע כשהוא הפוך והטלה איטית של כל טיפה על הממחטה. הנח פתק כיסוי בגודל מתאים כדי להרחיב מעבר להיקף הדגימה והסמן ההידרופובי.

10. הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית

1. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי רב-ערוצי כדי לסרוק קטעי ריאה שלמים בצורה לא מוטה באמצעות מטרה עם רזולוציה מספקת כדי לפתור נבגים בודדים ותאים מארחים (למשל, Zeiss Axioscan 7 באמצעות אובייקט שמן פי 20 עם NA = 0.8 או דומה).
   הערה: ודא שעוצמת הלייזר ו-PMTTAGהגבר מוגדרים כדי למקסם את יחסי האות לרעש של המטרה על פני הרקע שנקבעו עם בקרת פלואורסצנציה מינוס אחד (FMO).
2. אסוף מספיק אריחי תמונה כדי ללכוד את כל אונת הריאה (למשל, ~200 אריחים בגודל 400 מיקרומטר x 400 מיקרומטר). השתמש בתוכנת המיקרוסקופ (למשל, Zeiss ZEN 3.7 או דומה) כדי לייצא את תמונת האריח הממוזגת לעיבוד במורד הזרם.

11. ניתוח מרחבי באמצעות QuPath

1. ב-QuPath, תוכנת קוד פתוח^{חינמית 14}, צרו קובץ פרויקט והוסיפו את התמונות הפלואורסצנטיות לקובץ.
2. סווג את הפיקסלים של EpCAM+ כאפיתל על ידי לחיצה על אפשרות התפריט העליון סיווג, ולאחר מכן סיווג פיקסלים > צור סף. בחר את הרזולוציה, הערוץ, סיגמת ההחלקה וערך הסף המזהה בצורה הטובה ביותר את אזור היעד. שמור את המסווג תחת שם ייחודי ובחר צור אובייקטים.
3. בחלון החדש יצירת אובייקטים , בחר סוג אובייקט חדש כביאור. עבור אפיתל הריאות, הגדר את גודל האובייקט המינימלי ואת גודל החור המינימלי ל-100 מ"מ². אין צורך לבחור באפשרות Split Objects כאן. לאחר בחירת OK, ייווצרו הביאורים, וניתן לשנות אותם באמצעות העין באמצעות הכלי Brush באזור השמאלי העליון.
4. כדי לסווג נבגים, חזור על השלבים מ-11.3-11.4 באמצעות הערוץ שבו נלכדו הנבגים והפוך את סוג האובייקט החדש לזיהוי במקום ביאור. הגדר גודל אובייקט מינימלי וגודל חור מינימלי ל- 0 מ"מ², ובחר Split Objects.
5. כדי לבצע ניתוח מרחבי של הנבגים, בחר באפשרות התפריט העליון ניתוח מרחבי > > חשב מרחק חתום לביאורים דו-ממדיים. המרחקים לאפיתל EpCAM+ יחושבו עבור כל נבג שזוהה. ייצא אותם דרך אפשרות התפריט העליון מדידה > ייצוא מדידות.

Results

שיטה זו מייצרת בסופו של דבר תמונות אימונו-פלואורסצנטיות של ריאות עכברים תוך שימוש בניפוח אוויר פיזיולוגי כדי להשאיר את דרכי הנשימה ללא הפרעה. חשוב לציין, מספר נקודות ביקורת לאורך הדרך יאשרו שרכיבי הפרוטוקול בוצעו בהצלחה. במהלך החיסון, חשוב לוודא שהחיסון נשאף על ידי תחושת "פצפוצים" בדופן החזה האחורית של העכבר המעידים על כניסת הנוזל לדרכי הנשימה. אם אין תחושה של פצפוצים, יתכן שהעכבר בלע את החיסון. זלוף של ריאות עכברים עם PBS אמור לגרום לכתמים לבנים של הריאות ואחריהם הלבנה מלאה של הריאה כולה (איור 2A). אם יש הלבנה לא מלאה, זלוף הפורמלין שלאחר מכן לא יגיע לכל האזורים של פרנכימת הריאה (איור 2B). כאשר מנפחים את הריאה באוויר, הריאות צריכות להתרחב לאט עד שהן מגיעות לגודל פיזיולוגי. לאחר קשירת תפר קנה הנשימה כדי לאבטח את האוויר בתוך הריאות, הריאות לא אמורות להתכווץ בגודלן. אם כן, סביר להניח שהריאה נוקבה במהלך ההליך.

כאן, אנו מציגים תמונות מייצגות של קטעים עם נבגי Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ מסומנים (ירוק) ואפיתל סימפונות עמודי EpCAM+ (מג'נטה) הן בריאות מנופחות באוויר והן בריאות מנופחות בנוזל פורמלין (איור 3A,B בהתאמה). נבגים אלה מצטברים בעיקר בתוך הסימפונות הדיסטליות ובחללים המכתשית הסמוכים לסימפונות הדיסטליים הללו, ככל הנראה בתעלות המכתשית. הריאות המנופחות באוויר מכילות נבגים שמופיעים בתדירות גבוהה יותר בתוך הסימפונות ומתקבצים קרוב יותר לסימפונות (איור 3A), במקום הקיבוע הנוזלי שבו הנבגים נראים מעט יותר מפוזרים מאפיתל הסימפונות (איור 3B). באמצעות הניתוח המרחבי של QuPath, אנו מודדים את המרחק של נבגים בודדים לאפיתל הסימפונות EpCAM+ הקרוב ביותר כדי לציין את רמת הפיזור של הנבגים הרחק מהסימפונות ולתוך חללים מכתשית דיסטליים יותר. אנו מראים כי ניפוח נוזלים מפזר נבגים רחוק יותר מהסימפונות בהשוואה לניפוח אוויר פיזיולוגי (איור 4A,B). זלוף כלי הדם בניפוח האוויר שומר על המיקום הטבעי של נבגים אלה בסימפונות דיסטליים ומונע פיזור מלאכותי של נבגים אלה לחללים מכתשית דיסטליים יותר על ידי החדרת קיבוע תוך-קנה הנשימה.

איור 2: אינדיקציה להצלחה של זלוף ריאות. (A) ריאות שעברו החדרה מוצלחת יהיו לבנות לחלוטין. (B) ריאות לא מלאות ייראו ורודות או מנומרות במראה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: תמונות מייצגות של התפלגות נבגים בריאות מנופחות בפורמלין לעומת ריאות מנופחות פורמלין. נבגים פלואורסצנטיים תוך-תאיים (ירוק) נראים מופצים בסמיכות רבה יותר לאפיתל הסימפונות EpCAM+ (מג'נטה) בריאות מנופחות באוויר (A) מאשר בריאות (B) מנופחות פורמלין. התמונות התקבלו מקטעים בעומק של 1.2 מ"מ מהמשטח האחורי של האונות השמאליות של עכברים בכל קבוצת טיפול במיקרוסקופ פלואורסצנטי רב-ערוצי בהגדלה של פי 20, ואריחים נתפרו באמצעות תוכנת מיקרוסקופיה. סרגל קנה מידה = 800 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: השוואה של מרחק נבגים (מ"מ) לאפיתל הסימפונות בין ריאות שטופלו בנבגים מנופחים באוויר לבין ריאות מנופחות בנבגים. ריאות מ-3 עכברים בכל קבוצת טיפול נקצרו, עובדו ודוממו במשך 1.5 שעות לאחר החיסון עם 1 x 10⁶ Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ arthroconidia. ארבעה חלקים לכל עכבר נדגמו בעובי של 0.8 מ"מ, 1.2 מ"מ, 1.6 מ"מ ו-2.0 מ"מ מהמשטח האחורי של האונה השמאלית, מוכתמים וצולמו במיקרוסקופ פלואורסצנטי רב-ערוצי. כל הנבגים מכל קבוצה זוהו ונותחו מרחבית ב-QuPath כדי לקבוע את המרחק (A) לאפיתל הסימפונות העמודי הקרוב ביותר EpCAM+, ו-(B) מרווחי הסמך החציוניים ו-95% מוצגים ביחידות של מיקרומטרים. נבגי ניפוח אוויר, n = 11,673. נבגי ניפוח נוזלים, n = 9,837. מבחן מאן-וויטני בוצע עקב חוסר נורמליות, ו-p < 0.0001. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

הקמנו צינור לשאיפת נבגים וניתוח התצהיר המרחבי של הנבגים הנשאפים. צינור זה מספק מידע רב ערך לקביעת אזורי הסטרומה הרלוונטיים של הריאה המושפעים משאיפת Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ arthroconidia. ראינו כי נבגי Coccidioides וחלקיקים אינרטיים בגודל דומה (נתונים לא מוצגים) מצטברים באזורי הסימפונות הדיסטליים ובצמתים של הסימפונות-מכתשית במקום להתפזר במלואם לאורך לומן דרכי הנשימה המכתשית. מודל זה דורש רמה נמוכה יחסית של ציוד ומיומנות טכנית כדי לייצר קריוסקטורים לאימונופלואורסצנציה (או צינורות אחרים במורד הזרם כגון אימונוהיסטוכימיה [IHC]) השומרים על השלמות הפיזיולוגית של תוכן דרכי הנשימה תוך שמירה על מורפולוגיה טבעית של הריאות. ללא ניפוח אוויר, קריסת הנאדיות מעוותת את הארכיטקטורה הטבעית של פרנכימת הריאות סביב הסימפונות^13,15. אובדן נפח האוויר של הריאה במהלך העיבוד ההיסטולוגי צוין כ"בעיה רצינית" על ידי הצהרת מדיניות מחקר רשמית משותפת של האגודה האמריקאית לבית החזה והאגודה האירופית לנשימה בהגדרת סטנדרטים להערכה כמותית של מבנה הריאות¹⁶. יתר על כן, החדרה תוך-קנה של קיבוע עלולה לשבש את האופי והמיקום של רכיבים מולקולריים ותאיים של דרכי הנשימה הפרוקסימליים כגון מוצין, פעילי שטח וריסים בדרכי הנשימה 17,18,19. השיטה המתוארת כאן משמרת במידה מספקת הן את נפח האוויר של הריאה יחד עם המרכיבים המולקולריים והתאים לאורך דרכי הנשימה המקיימים אינטראקציה עם נבגי פטריות שנשאפו.

מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית מספקת כלי רב עוצמה לחקירת דינמיקה מרחבית של רכיבי ריאה, והיא נבדקת היטב^20,21. אין מגבלות על המטרות שניתן לצבוע באמצעות אימונופלואורסצנציה של קטעים אלה, מלבד העובדה שנוגדנים עם אפיטופים רגישים לקיבוע פורמלין עשויים שלא לקשור את מטרותיהם בצורה משביעת רצון. בעת שימוש בנוגדנים חדשים, עדיף להכין בקרת פלואורסצנטי מינוס אחד (FMO) כדי לקבוע אם הנוגדן מייצר אות כלשהו מעל הרקע. אם אתה משתמש בחומר משני, השתמש בקבוצת טיפול ללא הנוגדן הראשוני כדי לשלוט בקישור מחוץ למטרה של הנוגדן המשני. נוגדנים חד-שבטיים מצומדים ראשוניים הם ספציפיים מאוד, ולכן צביעה בטמפרטורות גבוהות יותר (37 מעלות צלזיוס) למשך זמן קצר יותר (30 דקות) היא נפוצה ובדרך כלל נקשרת במיוחד למטרה שלהם. מצד שני, נוגדנים רב-שבטיים לא מצומדים רגישים יותר לזיהוי אנטיגנים אך פחות ספציפיים, כך שדגירות ארוכות יותר (~16 שעות) בטמפרטורות קרות יותר (4 מעלות צלזיוס) מייעלות את יחס האות לרעש. כל הנוגדנים ידרשו אופטימיזציה אמפירית.

מודל הניתוח המרחבי המשמש במחקר זה ללוקליזציה של נבגים מודד את המרחק של נבגים בודדים לאפיתל הסימפונות הקרוב ביותר. זה דורש זיהוי מתאים של אפיתל הסימפונות באמצעות אות ה-EpCAM הגבוה שלו והמראה המובהק מבחינה מורפולוגית כמבנים דמויי צינור רירית אפיתל עמודים. EpCAM יכול להתבטא גם ברמות נמוכות יותר על ידי אפיתל המכתשית, ולכן חשוב לסף את אות ה-EpCAM ב-QuPath כדי להגביל את ההערות המוגדרות לאזורי סימפונות מאושרים מורפולוגית. מכיוון שלסימפונות יש גודל מינימלי אנטומי, אנו יכולים להגביל את הגדרת QuPath של אזורים אלה לשטח המינימלי של 100 מ"מ², כאמור בשלב 11.3. זה לא יכלול תאים מבודדים המבטאים EpCAM גבוה או חפצים ברחבי חללים מכתשית, כגון תאי אפיתל מכתשית מסוג II, מההערות של QuPath. שלבים אלה מאפשרים לנו להגדיר אך ורק את אפיתל הסימפונות כהערות QuPath ולקבוע את קרבתם של נבגים לאפיתל הסימפונות המוגדר הזה.

מודל הזיהום המתואר כאן משתמש בהרדמה איזופלורן כדי לגרום לתגובת התנשמות אוראלית בעכברים לשאיבת נבגי הפטרייה. שיטת הטיפה הפתוחה איזופלורן פותחה כטכניקה מהירה ודלת משאבים להשראת הרדמה לטווח קצר בעכברים ^9,22,23. שיטה זו דורשת תרגול מסוים כדי לבצע באופן עקבי. זמן ההרדמה חייב להיות ארוך מספיק כדי להרדים את העכבר מספיק כדי לשאוב את תוכן הלוע. אם העכבר אינו מורדם מספיק, הוא יכול לבלוע את החיסון במקום לשאוב אותו. הסימן להרדמה מספקת מושג כאשר העכבר מייצר נשימה אוראלית קבועה של מרץ גובר בקצב של כ-50-60 התנשמות לדקה. ראשו של העכבר השוכב צריך לנוע קדימה עם כל התנשמות. ניתן לקבוע הרדמה לא מספקת על ידי חוסר התנשמות או כל תנועה של שפם, לשון או גפיים. מומלץ ללחוץ על הלשון עם קצה הפיפט בזמן מתן החיסון כדי למנוע בליעה. מנת יתר של איזופלורן עלולה לגרום למותו של העכבר ויש למנוע אותה. כלל אצבע טוב למניעת זה הוא להסיר את העכבר מאיזופלורן לאחר אותו פרק זמן שלקח לעכבר לאבד את רפלקס היישור. לדוגמה, אם לעכבר לוקח 10 שניות לאבד את רפלקס היישור, הסר את העכבר לאחר 10 שניות נוספות. ככל שגז האיזופלורן בורח במהלך טיפולים מרובים בעכברים, מסגרת זמן זו עשויה להתארך. בידינו אנו יכולים לטפל ב-6-8 עכברים מבלי להוסיף עוד איזופלורן.

ישנן כמה מגבלות על רכיבי פרוטוקול זה. הליך החיסון משתמש בנבגים המרחפים ב-25 מיקרוליטר של מדיום PBS נוזלי, שהוא פחות פיזיולוגי מחיסון אירוסולי של נבגים. נותרה שאלה פתוחה האם השימוש בנוזל נשאף משנה את הלוקליזציה של נבגים/חלקיקים בהשוואה לשיטות חיסון אחרות, כגון שאיפת נבגים הנישאים באוויר. עם זאת, אינהלציה בתרסיס דורשת השקעת משאבים נרחבת ויש לה מגבלות אחרות (גודל חיסון מוגבל, חשיפה משתנה, סיכון תעסוקתי) שעשויות להיות לא אופטימליות בהתאם לאופי המחקר וסביבת המעבדה. מגבלה נוספת של פרוטוקול זה היא ששבריריות רקמות עלולה להתרחש במהלך הקפאה, מה שיכול לנבוע מנוכחות אוויר בכל הרקמה או מהיעילות המופחתת של קיבוע כלי הדם בהשוואה לקיבוע תוך-קנה הנשימה. ניתן להתגבר על שבריריות הקפאה זו על ידי חיתוך קטעים עבים יותר של 60-100 מיקרומטר ושימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לדמות מישורים דו-ממדיים (2D) בתוך הרקמה.

אנו מאמינים שהפשטות ויכולת ההסתגלות של שיטה זו יאפשרו לקבוצות אחרות למצוא תועלת עם פתוגנים בשאיפה שבחרו ותגובות מארח מעניינות.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 גרם, 1 1/2 מחט (305185)	פישר	305185
1 ליטר   צנצנת בורג  (נלג'ן)	Fisher Scientific	11-823-33
Air-Tite מזרקים לא סטריליים בתפזורת 10 מ"ל Luer Lock	Fisher	14-817-175
הזרקת AnaSed (תמיסה סטרילית קסילזין)	Akorn	59399-110-20
חוסם ומדלל ללא בעלי חיים, R.T.U.	וקטור	SP-5035-100
BD Insyte Autoguard צנתר IV מוגן מכונף עם חומר צנתר BD Vialon 18 גרם x 1.88	ב-BD	381547
BD Pharmingen חולדה מטוהרת נגד עכבר CD16/CD32 (עכבר BD Fc Block ™)	BD	553142
CellTracker כתום CMRA צבע	פישר מדעי	NC0873640
CFSE	Labviva	75003
Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3&דלתא;	BEI Resources	NR-166
מסנני קורנינג 70 מיקרון	VWR	10054-456
EpCAM AlexaFluor647 נוגדן חד שבטי	Biolegend	118211
Exel International מחטים היפודריות 30 גרם x 1/2 אינץ'	Labviva	EN3012
מזרקים סטריליים של Fisherbrand לשימוש חד פעמי (1 מ"ל, Leur Slip)פישר		14-955-462
גלוקוז מונוהידרט	אזר מדעי	ES17530-500G
	VWR	59344-055
Hoechst 33342 תמיסה 20 מ"מ (5 מ"ל)	ThermoFischer	62249
Isoflurane USP	Covetrus	29405
קטמין הידרוכלוריד	Dechra	1000001250
מגבי משימות עדינים של KIMWIPES (4.4 אינץ' x 8.4 אינץ')	VWR	21905-026
מספריים לתינוקות Lexer	FST	14078-10
מלקחיים מיקרו-אדסון	FST	11018-12
פורמלין ניטרלי חוצץ (10%) (Azer Scientific)	Fisher	22-026-350
Nunc EasYFlask צלוחיות תרבית רקמות, T75, כובעי פילטר	VWR	15708-134
PBS	VWR	45000-446
Peel-A-Way תבניות הטמעה	Sigma	E6032-1CS
QuPath 0.5.1 תוכנה	קוד פתוח	https://qupath.github.io/
חוט תפר משי גודל 3/0	FST	18020-30
שקופיותמיקרו שקופיות Superfrost Plus	VWR	48311-703
SlowFade זכוכית רכה תושבת אנטי-דהייה (2 מ"ל)	ThermoFischer	S36917
סוכרוז	סיגמא	S0389-500G
Tissue-Tek O.C.T. תרכובת, סאקורה פינטק	VWR	25608-930
טווין 20	ThermoFischer	J20605.
AP Vector Laboratories ImmEDGE סט עט מחסום הידרופובי של 2	של Fisher Scientific	NC9545623
VWR, מלבני (24 מ"מ x 40 מ"מ #1.5)	VWR	48393-230
רשת תיל פלסטיק לבן	MAPORCH	789862904922
תמצית שמרים	פישר	BP9727-500
Zeiss AxioScan 7	קרל זייס מיקרוסקופיה GmbH	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/imaging-systems/axioscan-for-biology.html	מיקרוסקופ פלואורסצנטי רב ערוצי
ZEN 3.7 תוכנה	קרל זייס מיקרוסקופיה GmbH	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/software/zeiss-zen.html	מיקרוסקופיה