הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודל עכברי של אימונומודולציה המושרה אפיעורית

836 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67578

⸱

24 ביוני 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, 2Department of Clinical Immunology, Wroclaw Medical University, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

המחקר מדגים את תפקידו של העור בוויסות התגובות החיסוניות בעכברים באמצעות חיסון אפיעורי (EC). חיסון EC עם אנטיגן חלבון יכול לדכא תגובות חיסוניות ברגישות יתר למגע או להפוך דיכוי המושרה על ידי העור בשילוב עם דפוסים מולקולריים הקשורים לפתוגן. חיסון EC מראה הבטחה כגישה יעילה ונטולת מחטים לאימונותרפיה.

תקציר

העור, כאיבר הגדול ביותר בגוף האדם בממשק עם הסביבה החיצונית, ממלא תפקידים פיזיולוגיים חיוניים, כולל (1) הגנה על האורגניזם מפני קסנוביוטיקה ומיקרואורגניזמים, (2) הקלה על ויסות חום, (3) שמירה על איזון מים ואלקטרוליטים, (4) סינתזה של ויטמין D ו-(5) השתתפות במערכת החיסון. מאמר זה מדגיש את מעורבותו המרכזית של העור במנגנונים חיסוניים, ומציג את יכולתו לבצע אימונומודולציה על ידי דיכוי או הגברת התגובה החיסונית. ממצאים קודמים מראים כי בעכברים, חיסון אפיעורי (EC) עם אנטיגן, לבד או בשילוב עם דפוסים מולקולריים הקשורים לפתוגן (PAMPs), יכול לדכא או להגביר תגובות חיסוניות, בהתאמה. באופן ספציפי, נצפה כי חיסון EC עם אנטיגן יכול לדכא תגובות חיסוניות במודלים שונים של עכברים של מחלות אוטואימוניות או דלקת עור ממגע אלרגית. התוצאות מצביעות על כך שחיסון EC עם אנטיגן בשילוב עם PAMPs יכול לשמש כאסטרטגיה יעילה לחיזוק החסינות נגד פתוגנים או להקלה על אלרגיות התלויות בלימפוציטים מסוג 2 (Th2). פרוטוקול זה מתאר שיטה להשראת דיכוי העור באמצעות מריחה אפיעורית של אנטיגן במודל עכברי של רגישות יתר למגע אלרגי אנושי (ACD) בתיווך תאי Th1. עם זאת, ניתן ליישם אותו גם על מודלים שונים של הפרעת עכברים. המאמר מציג אימונומודולציה המושרה על ידי EC כמודל עכברי אטרקטיבי לאימונותרפיה ללא מחטים בהפרעות שונות.

מבוא

מאמר זה מציג שיטה להשראת סבילות (המכונה 'דיכוי' לאורך טקסט זה) במודל עכבר של רגישות יתר למגע (CHS) ולהיפוך סובלנות זו (המכונה 'דיכוי נגד' לאורך טקסט זה) באמצעות יישום אפיעורי (EC) של אנטיגן לבד או בשילוב עם ליגנדים לקולטני זיהוי פתוגנים (PRRs), בהתאמה1. בפרוטוקול המתואר (א) אימונוגלובולינים של עכברים (TNP-Ig) משמשים כאנטיגן לדיכוי רגישות יתר למגע או (ב) אנטיגן עם דפוסים מולקולריים הקשורים לפתוגן (PAMPs), ליגנדים לקולטנים דמויי טול (TLR) וקולטנים דמויי חלבון המכילים תחום אוליגומריזציה קושר נוקלאוטידים (NOD) (NLRs), כדי להפוך דיכוי המושרה על ידי העור 2,3,4. הממצאים מצביעים על כך שאימונומודולציה המושרה על ידי EC מתווכת על ידי תאי מדכאי T (T) לא ספציפיים לאנטיגן ותאי מדכאי T (Tcs) ספציפיים לאנטיגן. ניתן לבחון תאים אלה במודל עכבר של העברת תאים מאמצים כדי לקבוע את מנגנון התגובות שנבדקו. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שני מודלים של העברת תאים, "העברה מאמצת פנימה" ו"העברה מאמצת OUT". העברה מאמצת IN שימושית לבדיקת האימונומודולציה בשלבים הנכנסים והזורמים של CHS. מצד שני, "העברה מאמצת OUT" משקפת את השפעת האימונומודולציה רק בשלב השפעת CHS.

המאמר מתאר שיטה של דיכוי המושרה על ידי העור באמצעות מריחה אפיעורית של אנטיגן במודל עכברי של דרמטיטיס מגע אלרגי אנושי (ACD) - רגישות יתר למגע (CHS) בתיווך לימפוציטים מסוג T helper type 1 (Th1)5. עם זאת, גישה זו נבדקה גם על יעילותה בוויסות (דיכוי, סבילות) מודלים ניסיוניים של CHS 6,7 בתיווך לימפוציטים ציטוטוקסיים מסוג T (Tc1), מחלות אוטואימוניות כגון דלקת מפרקים הנגרמת על ידי קולגן (CIA)8,9, דלקת מוח אוטואימונית ניסיונית (EAE)10,11 וקוליטיס כיבית12. יתר על כן, הפרוטוקול מתאר את השיטה של דיכוי קונטרה המושרה על ידי העור (דיכוי הפוך) באמצעות יישום EC של אנטיגן יחד עם ליגנדים PRR במודל עכברי של CHS 13,14,15,16. התוצאות המוצגות מצביעות על כך שניתן להפוך דיכוי אנטיגן לא ספציפי המושרה על ידי EC על ידי טיהור ליגנדים TLR2, TLR3, TLR4, TLR9 ו-NOD2. השיטה של דיכוי הנגדה הנגרמת על ידי העור שימשה גם במודל בעלי חיים של אטופיק דרמטיטיס (AD), והראתה כי טיפול EC באנטיגן בנוכחות מולקולות DNA חד-גדיליות סינתטיות המכילות אוליגודאוקסינוקלאוטידים לא מתיליים (CpG) - ליגנד עבור TLR9 יכול לדכא תגובות בתיווך Th2 באופן ספציפי לאנטיגן (מעביר את התגובה החיסונית לכיוון פנוטיפ Th1/Th17)17. השיטה המתוארת נבדקה גם בדלקת ריאות פנאומוקוקית, והדגימה כי חיסון EC עם פוליסכריד פנאומוקוק מצומד לאלבומין בסרום בקר (PC-BSA), יחד עם CpG, יכול לשפר את החסינות לסטרפטוקוקוס פנאומוניה18.

היבט מרכזי של אימונומודולציה המושרה על ידי EC הוא בחירת המודל ואופי האנטיגן. המאמר כולל טבלה המפרטת את האנטיגנים המשמשים, משך החשיפה לאנטיגן וספציפיות תאי ה-T של המודלים שנבדקו (ראה טבלה 1). השיטה המתוארת לאימונומודולציה מכוונת למחלות הכוללות לימפוציטים מסוג T ספציפיים לאנטיגן. יעילותה של שיטה זו הוערכה על ידי שימוש באנטיגן תואם המיושם על ידי EC בתהליך. התאימות של האנטיגן חיונית כדי להבטיח שהוא מקיים אינטראקציה יעילה עם לימפוציטים מסוג T המעורבים בתהליך המחלה. מריחת מדבקת חלבון או פפטיד על עור שלם מקלה על חדירת אנטיגן דרך האפידרמיס19,20. חדירת אנטיגן מוגברת זו מיוחסת להזעה מוגברת מתחת לתחבושת. שינויים בחדירות האפידרמיס מתרחשים תוך 4-10 שעות מיישום המדבקה, בעוד שאימונומודולציה המושרה על ידי EC עשויה להישאר יעילה עד שבועיים 5,14.

למרות שטיפול ב-EC נמצא בשימוש נרחב, קיומן של וריאציות רבות של שיטה זו עלול לעורר שאלות. ההבנה הנוכחית מצביעה על כך שהיקף הנזק לאפידרמיס לפני מתן אנטיגן עשוי להשפיע על אופי התגובה החיסונית הנובעת מכך21. נזק אפידרמיס שטחי מעורר שחרור של ציטוקינים אנטי דלקתיים על ידי תאי לנגרהנס, ומעדיף את התחלת תגובת Th222. לעומת זאת, נזק נרחב יותר לאפידרמיס מקדם שחרור של ציטוקינים פרו-דלקתיים ומקל על העברת אנטיגן לתאים דנדריטיים עוריים23. הפרוטוקול המוצג מדגיש (א) את ההכרה באתגרים בעת יישום שיטה זו בבעלי חיים קטנים ופעילים, במיוחד בעכברים; (ב) התחשבות בגורמים כגון מצב העור לאחר גילוח גילוח, מגע נכון של חומרים עם העור, זמן החשיפה ותנאים היגייניים של העור במהלך טיפול EC שיכולים לקבוע את יעילות הטיפול. חשוב לקחת בחשבון את שיטת הסרת העור, בין אם פיזית או כימית, לפני מריחת אנטיגן, שכן תכשירי עור שונים יכולים להשפיע על מצב העור בדרכים שונות. ידוע כי כל ההליכים הללו יכולים להפעיל תאי חיסון של העור, מה שעלול להוביל לזיהומי עור או להשפיע על התקדמות המחלה. תופעות הלוואי הפוטנציאליות על מצבי עור לאחר האפילציה צריכות להיות שיקול עיקרי בבחירת שיטת האפילציה. החוקרים תיארו שיטה של דיכוי חיסוני בתיווך תאי T המושרה באמצעות יישום EC של אנטיגן על עור גב מגולח בתער, והדגימה את השפעתו על מודלים שונים של תגובות חיסוניות בעכברים. יישום ה-EC של האנטיגן, יחד עם PAMPs, גורם לתאים מדכאי T ספציפיים לאנטיגן. יתר על כן, השיטה המוצגת ליישום EC, במיוחד עם חשיפה חוזרת ונשנית לאנטיגנים או PAMPs, אינה גורמת לתופעות לוואי מדאיגות.

הפרוטוקול המתואר מדגיש את חשיבותם של גורמים שונים בהשגת תוצאות אמינות וחוזרות על עצמן בשיטה זו, במיוחד בבעלי חיים קטנים כמו עכברים. האופי הלא פולשני של גישה זו מביא בדרך כלל לסיכון נמוך יותר לתגובות שליליות (כגון כאב, זיהום או צלקות) בהשוואה לטכניקות חיסון תוך עוריות או הניתנות להזרקה. חיסון אפיעורי הוא ידידותי למשתמש וניתן בקלות במסגרות לא קליניות, ומשפר את הנגישות והתאימות בהשוואה לשיטות פולשניות יותר.

טבלה 1: אפנון המושרה על ידי EC של תגובה חיסונית במודלים שונים של מחלות עכברים. קיצורים: ACD = דלקת עור ממגע אלרגית; AD = אטופיק דרמטיטיס; Ag = אנטיגן; CIA = דלקת מפרקים הנגרמת על ידי קולגן; CHS = רגישות יתר למגע; CFA = השלם את האדג'ובנט של פרוינד; COLL II = קולגן מסוג II; DNFB = 2,4-דיניטרופלואורובנזן; DNP-BSA = דיניטרופניל מצומד לאלבומין בסרום בקר; EAE = דלקת מוח אוטואימונית ניסיונית; EC = אפיעור; LPS = ליפופוליסכריד; OVA = ovalbumin; PAMP = דפוס מולקולרי הקשור לפתוגן; PC-BSA = פוליסכריד פנאומוקוק מצומד לאלבומין בסרום בקר; Th1 = לימפוציט מסוג 1 מסייע T; Tc1 = לימפוציט ציטוטוקסי מסוג 1 T; TNCB = 2,4,6-טריניטרוכלורובנזן; TNP-Ig = 2,4,6-אימונוגלובולינים מצומדים של עכברים טריניטרופניל; Ts = תאים מדכאי T; Tcs = תאים מדכאים T. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים המוצגים במאמר זה אושרו ונערכו בהתאם להנחיות של ועדת האתיקההמקומית הראשונה והשנייה לניסויים בבעלי חיים בקרקוב, פולין. הנהלים תאמו את ההמלצות המקומיות, במיוחד בנוגע למתן קטמין/קסילזין או איזופלורן כחומרי הרדמה, גילוח עור העכבר באמצעות סכיני גילוח, מריחת חומרים/הפטנים על העור המגולח ושני צידי האוזניים, ואיסוף איברי חיסון היקפיים. המחקר השתמש בעכברים זכרים ונקבות CBA/J (H-2k), בני 6-12 שבועות, עם משקל גוף שנע בין 20-25 גרם. פרטים על הריאגנטים והציוד המשמשים מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת בעלי חיים

  1. עכברי בית יחד; חשוב למנוע את ההשפעות השליליות של הבידוד על מצב הרוח שלהם. למובהקות סטטיסטית, השתמש ב-10-12 בעלי חיים לקבוצה.

2. הכנת אזור ההפעלה

  1. נקו את שולחן הניתוחים בתמיסת אתנול של 70% לפני ואחרי כל ההליכים. אם השימוש בעכברים דורש תנאים סטריליים, בצע את כל הפעולות בתוך ארון בטיחות ביולוגית.

3. אינדוקציה של תאים מדכאים (Ts) לתגובת CHS בתיווך Th1

הערה: הליך זה מתואר באיור 1A.

  1. ביום "0" יש להרדים את העכברים עם 30% איזופלורן בפרופילן גליקול. החזק את העכבר ביד שמאל וחשוף את הצד הגבי של גופו. ביד ימין יש להקציף את הסבון האפור במים בשפע ולמרוח אותו על העור.
    1. בעזרת סכין גילוח סטרילי, גלחו בעדינות אזור עור בגודל 2 ס"מ רבוע. הימנע מפגיעה בעור. כל נגע בעור יפסול את העכברים מהליכים נוספים.
      הערה: הסבון האפור הוא מוצר טבעי והיפואלרגני העשוי מבסיס צמחי עדין. הוא מחדש ומעניק לחות ביעילות לעור יבש ורגיש. סבון זה אינו מכיל צבעי מאכל מלאכותיים, חומרי ריח סינתטיים או מרכיבים שמקורם מן החי. המרכיבים כוללים נתרן פלמט, נתרן קרנלאט, מים, גליצרין, תמצית פרחים/עלים/גבעול שן הארי (Taraxacum officinale), חומצת דקלים, חומצת גלעיני דקל, סודיום כלוריד, פרופילן גליקול, טטרסודיום EDTA, חומצה אטידרונית. הסבון האפור מיועד לעור רגיש ועדין הנוטה לגירוי ופסוריאזיס. הוא מנקה ביעילות עור בעייתי תוך מניעת יובש יתר ותחושת מתיחה. סבון זה גם מרגיע גירויים, מעניק לחות ומקדם התחדשות מהירה יותר של העור. חשוב לציין, זה לא פוגע במחסום המגן של העור.
  2. הכניסו את העכברים לכלוב. לאחר הגילוח יש להמתין לפחות שש שעות לפני מריחת האנטיגן כדי לאפשר לעור להתייבש ולנקות אותו על ידי בעל החיים.
  3. ביום "+1", הכינו תמיסה של 1 מ"ג/מ"ל של אימונוגלובולין עכבר מצומד אנטיגן 2,4,6-טריניטרופניל (TNP-Ig), בתמיסת מלח סטרילית עם פוספט (DPBS). הכן את נפח האנטיגן 1200 מיקרוליטר לעשרה עכברים. מערבבים את התמיסות ממש לפני השימוש בבקבוקון של 2 מ"ל. הגן על TNP-Ig מפני אור על ידי כיסוי הבקבוקון בנייר אלומיניום.
    הערה: כלול קבוצת ביקורת CHS של עכברים שטופלו רק ברכב (DPBS) כדי להעריך תגובות דלקתיות לא ספציפיות הנגרמות מגילוח ומריחת הממס על המקום המגולח. יש להשתמש בסוג אחר של אנטיגן לאינדוקציה של Ts כדי לבדוק את ספציפיות האנטיגן שלהם. אימונוגלובולינים של עכברים (Ig) הוכנו מנסיוב עכבר וצומדו עם TNP hapten (קובץ משלים 1). נעשה שימוש בתכשיר יחיד עם רמת החלפה של 40 TNP לכל מולקולת Ig (TNP40-Ig) לאורך24,25.
  4. באותו יום יש להרדים עכברים עם 30% איזופלורן בפרופילן גליקול. מרחו את האנטיגן על המקום שגולח בעבר על ידי הנחת מדבקת גזה בגודל 1 ס"מ2 ספוגה ב-100 מיקרוליטר של האנטיגן (הוכן בשלב 3.3). כסו אותו במדבקת פלסטיק דקה (2 ס"מ) ואבטחו אותו עם סרט דבק מבד. בקבוצת הבקרה CHS, החל DPBS בלבד.
    הערה: ניתן להשתמש בשרוולי מסמכים שקופים של 30 מיקרומטר עבור תיקון הפלסטיק. סרט ההדבקה מבד צריך להיות נשלף בקלות, גמיש, להתאים לצורות הגוף ולאפשר חדירות אדי אוויר ומים.
  5. ביום "+5", הרדימו את העכברים עם 30% איזופלורן בפרופילן גליקול. חותכים בזהירות את המדבקה עם מספריים בטיחותיים עם פינות מעוגלות, ואז מסירים בעדינות את סרט ההדבקה. אפשרו לעכברים לנוע בחופשיות ולנקות את עורם באופן טבעי למשך 4 שעות לפחות. במידת הצורך, גלח את כל השיער שצמח מחדש במקום מריחת האנטיגן, אם כי בדרך כלל זה לא נדרש.
    הערה: חותכים את סרט ההדבקה רק באזור מתן האנטיגן (אזור גזה ופלסטיק), שם הוא נצמד בחוזקה רק בשולי התחבושת. המתן לפחות 4 שעות לפני מריחת האנטיגן כדי לאפשר לעור להתייבש ולנקות אותו על ידי בעל החיים.
  6. ביום "+5", חזור על שלב 3.3 ושלב 3.4.
  7. ביום "+8", חזור על שלב 3.5. זה מסמן את השלמת חשיפת העור לאנטיגן למשך שבוע. לאחר תקופה זו, השתמש בעכברים כדי לבדוק את דיכוי תגובת CHS - מודלים פעילים in vivo (שלב 6) או המתת חסד שלהם כדי לשמש כתורמים של תאי T ב"העברה מאמצת IN" (שלב 8) או ב"העברה מאמצת OUT" (שלב 9).

4. אינדוקציה של תאי T מדכאים (Tcs) לתגובת CHS בתיווך Th1

הערה: הליך זה מתואר באיור 1B.

  1. ביום "0" בצע את השלבים 3.1-3.2.
  2. ביום "+1", הכינו תערובת של 100 מיקרוגרם אנטיגן TNP-Ig ו-100 מיקרוגרם LPS (דוגמה ל-PAMP) ב-100 מיקרוליטר DPBS. הכן את התמיסה מיד לפני השימוש בבקבוקון של 2 מ"ל והגן עליו מפני אור על ידי עטיפת הבקבוקון בנייר אלומיניום אם האנטיגן רגיש לאור.
    הערה: כדי להעריך דיכוי נגד (היפוך של דיכוי המושרה על ידי העור), יש לכלול בקרה לדיכוי (קבוצת ביקורת Ts), כאשר עכברים מטופלים רק באנטיגן TNP-Ig. יתר על כן, יש לכלול עכברים שטופלו אך ורק ב-DPBS (בקרת CHS) ו-LPS בלבד (בקרת PAMP) כדי לקבוע את מידת האפנון הלא ספציפי של תגובות חיסוניות. LPS הוא דוגמה לחלקיק מעורר חיסון26. המאפיינים הספציפיים של כל ממריץ חיסוני תלויים במודל העכבר בו נעשה שימוש, בסוגי תאי החיסון המעורבים בתגובה החיסונית הנחקרת ובפרמקוקינטיקה של החומרים הנחקרים.
  3. באותו יום יש להרדים עכברים עם 30% איזופלורן בפרופילן גליקול. הניחו מדבקתגזה בגודל 1 ס"מ על העור המגולח הקודם, רוויה בתמיסה המכילה 100 מיקרוליטר מהתערובת (הוכנה בשלב 4.2). אבטח את הגזה בעזרת טלאי פלסטיק דק (2 ס"מ) והצמד אותו למקומו באמצעות טיח דבק מבד. בקבוצות הביקורת, החל DPBS (בקרת CHS) או LPS (בקרת PAMP), או TNP-Ig בלבד (קבוצת ביקורת Ts).
    הערה: ניתן להשתמש בשרוולי מסמכים שקופים של 30 מיקרומטר עבור תיקון הפלסטיק. סרט ההדבקה מבד צריך להיות נשלף בקלות, גמיש, להתאים לצורות הגוף ולאפשר חדירות אדי אוויר ומים.
  4. ביום "+5", בצע את שלב 3.5.
  5. ביום "+5", חזור על שלבים 4.2-4.3.
  6. ביום "+8", חזור על שלב 3.5. שבוע של חשיפת העור לאנטיגן מעורבב עם LPS הסתיים. לאחר תקופה זו, בדוק עכברים בתגובת CHS - מודלים פעילים in vivo (שלב 6), או המתת חסד כדי לשמש כתורמים של תאי Tcs ב"העברה מאמצת OUT" (שלב 10).

5. אינדוקציה של תאי אפקטור T (Teff) לתגובת CHS בתיווך Th1 (שלב רגישות של CHS)

  1. ביום "0", גלחו את החזה והבטן של העכברים (שטח של 2 × 2 ס"מ) באמצעות סבון אפור עם מים ואחריו סכין גילוח. הניחו לעור לנוח במשך 6 שעות לפני מריחת הפטן כדי להבטיח היעדר גירוי.
  2. באותו יום, ממש לפני השימוש, מכינים את תמיסת הפטן (5%) בבקבוקון זכוכית ומכסים אותה בנייר אלומיניום כדי להגן עליה מפני אור: 2,4,6-trinitrochlorobenzene (TNCB) בתערובת אצטון-אתנול (יחס 1:3).
  3. באותו יום, יש לעורר רגישות לעכברים על ידי מריחת 150 מיקרוליטר של הפטן על המקום שגולח בעבר. החל את הרכב לבד (תערובת אצטון-אתנול) בקבוצת הביקורת השלילית כדי להעריך את התגובה הדלקתית הלא ספציפית. לפני החזרת החיה לכלוב, המתן 30 שניות כדי לתת לעור להתייבש.
    זהירות: השתמש בכפפות; TNCB גורם לתגובות אלרגיות חמורות אצל רוב האנשים.

6. מודל פעיל: בדיקת תאי Ts או Tcs ב-CHS בתיווך Th1

הערה: הליך זה מתואר באיור 2.

  1. השראת תא Ts או Tcs על ידי ביצוע שלב 3 ושלב 4. הליך זה יימשך מיום "0" עד יום "+8".
  2. ביום "+8", התחל להשרות תאי טף על ידי ביצוע שלב 5.
  3. ארבעה ימים לאחר מכן, העריכו את תגובת ה-CHS על ידי ביצוע שלב האתגר. בקצרה, מרחו TNCB על שני צידי האוזניים. לאחר מכן, כמת את עובי האוזניים על ידי מדידתן במיקרומטר. תיאור מפורט של בדיקה זו ונקודות קצה אפשריות אחרות מדווח במקום אחר (Zemelka-Wiacek, M. et al.27).

7. בידוד של תאי Teff, T או Tcs מעכברים תורמים

  1. עקר את שולחן הניתוחים בתמיסת אתנול של 70% לפני ואחרי כל הליך. בצע את כל ההליכים בתוך ארון בטיחות ביולוגית כדי לשמור על סטריליות ולהשתמש במכשירים מעוקרים. כדי לבודד תאי Ts, Tcs ו-Teff ביום "+8", השתמשו בעכברים שחוסנו ב-EC המתוארים בשלבים 3, 4 ו-5, בהתאמה.
    הערה: הקפידו על יחס תורם למקבל של 1:1.
  2. להרדים את התורמים באמצעות הזרקה תוך-צפקית (i.p.) של תערובת של קטמין (90-120 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (5-10 מ"ג/ק"ג). ודא שהעכבר מורדם לחלוטין למשך 5 דקות לפחות.
  3. יש לחטא את כל אזור הבטן של העכבר המורדם באתנול של 70%, ואז לחתוך את שכבת הבטן (3-4 ס"מ) כדי לחשוף את חלל הצפק. בודד את בלוטות הלימפה העזר והמפשעתיות (ALNs) והטחול (SPL) עם המלקחיים הסטריליים לצינורות מלאים ב-DPBS סטרילי בתוספת סרום בקר עוברי (FBS) 1%. אסוף את ה-ALNs מכל התורמים בבקבוקון אחד ו-SPLs בבקבוקון אחר והשאיר את הבקבוקונים על הקרח. כל בית שחי מכיל שתי בלוטות לימפה בבית השחי, ואילו בלוטת לימפה מפשעתית אחת ממוקמת באזור הירך הסמוך לשלושה כלי דם. SPLs ממוקמים בצד שמאל של הגוף, מאחורי המעי והקיבה.
    הערה: עבוד עם כלים סטריליים מתחת לארון הבטיחות הביולוגית כדי לשמור על תנאים סטריליים. לאחר הליך זה, יש להמית עכברים בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד.
    1. מועכים רקמה בין הקצוות החלביים של שתי שקופיות מיקרוסקופ. מסננים את מתלה התאים דרך מסננת תאים בגודל נקבוביות של 70 מיקרומטר.
  4. שוטפים את התאים עם 30 מ"ל DPBS בתוספת 1% FBS. צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את כדור התא ב-1-5 מ"ל של DPBS.
  5. ספרו את כדאיות התא באמצעות המוציטומטר וטריפן כחול. מערבבים 10 מיקרוליטר של תרחיף תאים עם 90-990 מיקרוליטר של טריפן כחול, תוך התאמת עוצמת הקול על סמך ספירת התאים. שלב גורם דילול זה בחישוב הכדאיות.
  6. הכינו תערובת של ALNs ו-SPLs (יחס 1:1). הקפידו על מספר התאים: השתמשו ב-1 עד 5 x 107 תאי Ts או Tcs לכל נמען ב-1 מ"ל DPBS בתוספת 1% FBS ו-7 x 107 תאי Teff לנמען ב-1 מ"ל DPBS. שמור על יחס תורם-מקבל עבור כל אוכלוסיות התאים 1:1 וגם על יחס תורם-DPBS 1:1. שמור את הבקבוקונים עם תאים על הקרח.
    הערה: ביצוע ניסויים נוספים במבחנה מחייב גידול פרופורציונלי במספר תורמי התאים.
    הערה: בנוסף, תאי Teff, T ו-Tcs מבודדים יכולים לעבור טיהור או ניתוחים נוספים באמצעות ציטומטריית זרימה, כגון פנוטיפ או הערכת הפרשת ציטוקינים. ניתן גם ליזום תרביות תאים כדי לחקור את יכולת התפשטות התאים או לכמת את רמות הציטוקינים בתרבית-על. עריכת ניסויים נוספים מחייבת גידול יחסי במספר תורמי התאים.

8. העברה מאמצת IN: בדיקת Ts ב-CHS בתיווך Th1

הערה: הליך זה מתואר באיור 3. עבוד סטרילי והשתמש בתמיסת אתנול 70% לפני ואחרי כל הליך. ודא שכל פעולות התא מתבצעות בתוך ארון בטיחות ביולוגית כדי לשמור על סטריליות ולהשתמש במכשירים מעוקרים.

  1. לגרום ולבודד תאי T (תורמים) על ידי ביצוע שלב 3 ושלב 7. שוטפים את התאים עם 30 מ"ל DPBS. צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את גלולת התא ב-200 מיקרוליטר של DPBS לכל נמען (יחס תורם-מקבל 1:1).
  2. מושתלים (עכברים סינגניים נאיביים): מרדימים את המושתלים באמצעות הזרקה תוך-צפקית (i.p) של תערובת של קטמין (90-120 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (5-10 מ"ג/ק"ג). ודא שהעכבר מורדם לחלוטין למשך 5 דקות לפחות.
  3. לתת זריקה תוך ורידית (i.v.) של תערובת מוכנה של 1-5 x 107 תאי Ts (שלב 8.2) ב-200 מיקרוליטר לתוך המקבל המורדם
  4. באותו יום, לגרום לתגובת CHS בתיווך Th1. בקצרה, לגרום לתא טף (שלב רגישות) המתואר בשלבים 5.1-5.3). ארבעה ימים לאחר מכן העריכו את תגובת CHS על ידי ביצוע שלב האתגר המתואר בשלב 6.3.

9. העברה מאמצת OUT: בדיקת Ts ב-CHS בתיווך Th1

  1. לגרום ולבודד תאי Ts ו-Teff (תורמים) על ידי ביצוע שלבים 3, 5 ו-7. שמור את ה-T והטף המבודדים בשני בקבוקונים נפרדים. חלקו את תאי הטף לשני בקבוקונים: אחד עבור "קבוצת הבדיקה Ts" ואחד עבור "בקרת CHS".
    הערה: עבוד סטרילי והשתמש בתמיסת אתנול של 70% לפני ואחרי כל הליך. ודא שכל פעולות התא מתבצעות בתוך ארון בטיחות ביולוגית כדי לשמור על סטריליות ולהשתמש במכשירים מעוקרים. כלול קבוצת ביקורת של נמענים אליהם יינתנו רק תאי טף ("בקרת CHS"). עבור קבוצה זו, יש להשתמש בתורמים נוספים כדי לדבוק ביחס תורם-מקבל של 1:1. כדי לשפר את איכות התוצאות, יש להוסיף מושתלים המקבלים תאי ביקורת שהועברו מתורמים שטופלו ב-EC בתמיסת ממס. ההחלטה להוסיף כל קבוצה נוספת של נמענים ותורמים צריכה להיות מתוכננת בקפידה, מכיוון שגישה זו דורשת עכברים רבים, שאינם עומדים בעיקרון 3Rs (הפחתה, חידוד, החלפה).
  2. הוסף תאי Ts לתאי Teff עבור "קבוצת הבדיקה Ts". הוסף DPBS מתאים לתאי Teff בבקבוקון "בקרת CHS".
    הערה: שמור את המספר של 1-5 x 107 תאי Tf ו-7 x 107 תאי Teff לכל נמען.
  3. מערבבים את כל הבקבוקונים בעדינות. שמור את הבקבוקונים באמבט המים (37 מעלות צלזיוס) למשך 30 דקות, ערבב בעדינות כל 5 דקות.
  4. שטפו כל בקבוקון תאים עם 30 מ"ל DPBS בתוספת 1% FBS. צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לשפוך את הסופרנטנט ולהשעות מחדש את גלולת התאים ב-200 מיקרוליטר של DPBS/מקבל.
  5. העבירו כל תרחיף תאים דרך מסננת תאי נקבוביות של 70 מיקרומטר. במידת הצורך, כוונן את עוצמת הקול של 200 מיקרוליטר של DPBS/נמען.
  6. מושתלים (עכברים סינגניים נאיביים): מרדימים את המושתלים באמצעות הזרקה תוך-צפקית (i.p) של תערובת של קטמין (90-120 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (5-10 מ"ג/ק"ג). ודא שהעכבר מורדם לחלוטין למשך 5 דקות לפחות.
  7. לתת זריקה תוך ורידית (IV) של תאים מוכנים.
  8. באותו יום, עורר את שלב הגירוי של CHS (אתגר) המתואר בשלב 6.3. כלול "שליטה שלילית", כאשר התנהלות רק אתגר CHS.

10. העברה מאמצת OUT: בדיקת Tcs ב-CHS בתיווך Th1

  1. לגרום ולבודד תאי T, Tcs ו-Teff (תורמים) על ידי ביצוע שלבים 3-5 ושלב 7.
    הערה: עבוד סטרילי והשתמש בתמיסת אתנול של 70% לפני ואחרי כל הליך. ודא שכל פעולות התא מתבצעות בתוך ארון בטיחות ביולוגית כדי לשמור על סטריליות ולהשתמש במכשירים מעוקרים. כלול שתי קבוצות ביקורת של מקבלים: "בקרת CHS" שבה יינתנו רק תאי טף ו"בקרת Ts" שבה תאי טף יודגרו אך ורק עם תאי T. עבור קבוצות אלה, השתמש בתורמים נוספים כדי לדבוק ביחס תורם-מקבל של 1:1.
  2. שמור את תאי ה-T וה-Tcs המבודדים בבקבוקונים נפרדים. חלקו את תאי ה-Teff לשלושה בקבוקונים: אחד עבור "קבוצת הבדיקה Tcs", אחד עבור "בקרת Ts" ואחד עבור "בקרת CHS".
  3. דגירה ראשונה: עבור (א) "קבוצת בדיקת TCS" הוסף תאי Tcs לתאי Teff. עבור (ב) "בקרת Ts" ו-(ג) "בקרת CHS", הוסף כמות מספקת של DPBS לתאי Teff (ראה טבלה 2).
    הערה: שמור את המספר של 1-5 x 107 תאי Tcs ו-7 x 107 תאי Teff לכל נמען.
  4. מערבבים את כל הבקבוקונים בעדינות. שומרים באמבט המים (37 מעלות צלזיוס) למשך 30 דקות, מערבבים בעדינות כל 5 דקות.
  5. שטפו כל בקבוקון תאים עם 30 מ"ל DPBS בתוספת 1% FBS. צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. יש לשפוך את הסופרנטנט ולהשעות מחדש את כדור התאים ב-1 מ"ל של DPBS בתוספת 1% FBS לכל מקבל. שמור על יחס תערובת תאים-DPBS 1:1.
  6. דגירה שנייה: עבור (א) "קבוצת הבדיקה Tcs" הוסף תאי T לתערובת של תאי Teff ו-Tcs שהודגרו מראש. עבור (ב) "בקרת Ts", הוסף תאי T לתערובת של תאי Teff מודגרים מראש עם DPBS. עבור (ג) "בקרת CHS", הוסף DPBS מתאים לתאי הטף המודגרים מראש.
    הערה: שמור על המספר של 1-5 x 107 תאי Ts לכל נמען. בצע דגירה בכל קבוצות הניסוי (a, b ו-c) כדי להבטיח אחידות באובדן התאים במהלך הליכי השטיפה והצנטריפוגה.
  7. מערבבים את כל הבקבוקונים בעדינות. שומרים באמבט המים (37 מעלות צלזיוס) למשך 30 דקות, מערבבים בעדינות כל 5 דקות.
  8. שוטפים כל בקבוקון תאים עם 30 מ"ל DPBS. צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לשפוך את הסופרנטנט ולהשעות מחדש את גלולת התאים ב-200 מיקרוליטר של DPBS/מקבל.
  9. העבירו כל תרחיף תאים דרך מסננת תאי נקבוביות של 70 מיקרומטר. במידת הצורך, כוונן את עוצמת הקול של 200 מיקרוליטר של DPBS/נמען.
  10. מושתלים (עכברים סינגניים נאיביים): מרדימים את המושתלים באמצעות הזרקה תוך-צפקית (i.p) של תערובת של קטמין (90-120 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (5-10 מ"ג/ק"ג). ודא שהעכבר מורדם לחלוטין למשך 5 דקות לפחות.
  11. לתת זריקה תוך ורידית (IV) של תאים מוכנים.
  12. באותו יום, עורר את שלב הגירוי של CHS (אתגר) המתואר בשלב 6.3. כלול "שליטה שלילית", כאשר התנהלות רק אתגר CHS.

טבלה 2: לוח זמנים של דגירות תאים במהלך "העברת OUT" של Tcs. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מחקר זה בוחן האם אנטיגנים המיושמים דרך העור בלבד או בשילוב עם PAMP יכולים לגרום לתאי Ts או Tcs, בהתאמה, המווסתים את תגובת CHS. חיסון עכברי CBA/J באמצעות EC עם 100 מיקרוגרם של TNP-Ig או TNP-Ig בתוספת 100 מיקרוגרם של LPS גורם לתאי Ts או Tcs, בהתאמה. העכברים עברו רגישות עם 5% TNCB ואותגרו עם אותו הפטן 4 ימים לאחר מכן. התגובה הוערכה על ידי מדידת נפיחות באוזניים לפני ואחרי האתגר. לכל ניסוי יש בקרה שלילית, המשמשת להערכת התגובה הדלקתית הלא ספציפית, ובקרת CHS, המאמתת את השראת ת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

המחקרים נערכו על מודלים רבים ושונים של בעלי חיים והשתמשו בזני עכברים רבים כמו BALB/c, C57BL/6, HLADR4-Tg, DBA 1 ו-B10.PL ו-SJL מוכיחים כי חיסון EC עם אנטיגן מוקצה יכול לשמש כאמצעי רב-תכליתי ופוטנציאלי בלתי מוגבל ליצירת סבילות ושליטה בתגובות חיסוניות לא רצויות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שני מודלים להעברת תאים: (1) 'העברה מאמצת IN', השימושית להערכת אימונומודולציה הן במהלך השלב הנכנס והן במהלך השלב הנכנס של CHS, ו-(2) 'העברה מאמצת OUT', המעריכה באופן ספציפי את השפעותיו בשלב הזורם. בנוסף, הוכח כ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לסופרים אין מה לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהוועדה הפולנית למחקר מדעי 3 PO5B 091 25, 2PO5A 204 29 ומהמרכז הלאומי למדע N N401 3554 33 ל-M.S. הגרפים צוירו באמצעות תוכנת GraphPad Prism 10.2.3, והאיורים 1-3 נוצרו ב-BioRender. זמלקה-ויאצ'ק, מ. (2025): (1) https://BioRender.com/3ux2px ; (2) https://BioRender.com/s0y8zs7 ; (3) https://BioRender.com/0qziglw. המחברים מודים לדורוטה ווז'ניאק על הטיפול במושבות העכברים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2,4,6-טריניטרוכלורובנזן (TNCB)טוקיו תעשיית הכימיקלים בע"מ, יפןC0307
אימונוגלובולין עכבר 2,4,6-טריניטרופניל-קונוגט (TNP-Ig)יו"ר מדעי הביו-רפואה, הפקולטה למדעי הבריאות, הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת יגיילון, קרקוב, פולין
אצטון (מגיב ACS, ≥ 99.5%)מרק KGaA, דרמשטאדט, גרמניה179124
נייר אלומיניוםמרק KGaA, דרמשטאדט, גרמניהZ185140   
איזון אנליטי  Sartorius Weighing Technology GmbH, גטינגן, גרמניהPRACTUM224-1, 29105177
אלבומין סרום בקר (BSA)מרק KGaA, דרמשטאדט, גרמניהA9418
CBA/J (H-2k) יחידת רבייה של קתדרה למדעי הביו-רפואה, הפקולטה למדעי הבריאות, הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת יגיילון, קרקוב, פולין
מסננת תאים, גודל נקבובית 70 ו-mu; mביולוגיקס, סין15-1070
נפח פיפטות חד-פעמיות: 5 מ"ל, 10 מ"ל, 25 מ"למרק KGaA, דרמשטאדט, גרמניהZ740301, Z740302, Z740303
Dulbecco ו-Prime; סליין-מלח עם בופר פוספט (DPBS)ThermoFisher Scientific,  וולת'ם, מסצ'וסטס, ארה"ב14190144
צינורות נעילה בטוחים של אפנדורף 1.5 מ"לאפנפורף, גרמניה30120086
צינורות מנעול בטוח אפנדורף, 2.0 מ"לאפנפורף, גרמניה30120094
אתנול 100% (אלכוהול מוחלט)מרק KGaA, דרמשטאדט, גרמניה1.07017
אתנול 96%מרק KGaA, דרמשטאדט, גרמניה1.59010
סרום בקר עוברי (FBS)ThermoFisher Scientific,  וולת'ם, מסצ'וסטס, ארה"בA3160802
שקופיות זכוכית מיקרוסקופ (חול מטושטש בודד)תרמוסנטיפיק, פורטסמות', ניו המפשייר, ארה"ב421-004T
פריזמת משטח הגרףGraphPad Software Inc.v. 10.2.3
סבון אפור (סבון ביאלי ילן)Pollena Ostrzeszó w, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., פולין163057
המוציטומטרVWR, אבנטור, ארה"ב612-5719
חממה Heracell 150iתרמו אלקטרון  LED Gmbh, גרמניה41071068
איזופלוראן (Aerrane)בקסטר, דירפילד, אילינוי, ארה"ב8AGG9623
קטמין 100 מ"ג/מ"ל, תמיסה להזרקהBiowet Pulawy Sp. z o.o., פולאבי, פוליןקט.# לא זמין
צנטריפוגת המעבדה (Fresco Heraeus 21)תרמו סיינטיפיק, גרמניה75002425
צנטריפוגה מעבדה (Heraeus Megafuge 1.0R)  תרמו סיינטיפיק, גרמניהB00013899
ליפופוליסכריד (LPS)מרק KGaA, דרמשטאדט, גרמניהL-8274
מסכה (FFP2)VWR, רדנור, פנסילבניה, ארצות הברית111-0917
מיקרומטרמיטוטויו, טוקיו, יפן193-111
מיקרוסקופ עם מטרותלייקה מיקרוסיסטמס CMS GmbH, גרמניהDM1000, 294011-082007
פרופילן גליקול  Chempur, Piekary figure-materials-1 פולין114489005
להב גילוחVWR, רדנור, פנסילבניה, ארצות הבריתPERS94-0462
עטיפות מסמכים שקופות 30 ומיקרו; mSCHEMAT5906961126542
טרייפן בלומרק KGaA, דרמשטאדט, גרמניהT8154
צינורות 15 מ"ל סטרילייםמרק KGaA, דרמשטאדט, גרמניהCLS430055 (קורניניג)
צינורות 50 מ"ל, סטרילייםמרק KGaA, דרמשטאדט, גרמניהCLS430290 (קורנינג)
בקבוקונים, מכסה בורג, זכוכית שקופה (רק בקבוקון) 22 מ"למרק KGaA, דרמשטאדט, גרמניה27173
ויסקופלסט פולוביס, דבק משי, 5x0.0125 מטר3M פולין, נדרזין, פולין7100231620
אמבט מים  AJL אלקטרוניקה, פוליןLW102
תמיסת זילזין (xylapan 20 mg/mL) להזרקהVetoquinol Biowet Sp. z o.o., גורז'וב ויילקופולסקי, פוליןקט.# לא זמין

מקורות

  1. Szczepanik, M., Majewska-Szczepanik, M. Transdermal immunotherapy: Past, present and future. Pharmacol Rep. 68 (4), 773-781 (2016).
  2. Majewska-Szczepanik, M., et al. Epicutaneous immunization with hapten-conjugated protein antigen alleviates contact sensitivity mediated by three different types of effector cells. Pharmacol Rep. 64 (4), 919-926 (2012).
  3. Majewska, M., et al. Role of TLR ligands in epicutaneously induced contrasuppression. Pharmacol Rep. 61 (3), 539-549 (2009).
  4. Ptak, W., et al. Toll-like receptor ligands reverse suppression of contact hypersensitivity reactions induced by epicutaneous immunization with protein antigen. Int Arch Allergy Immunol. 139 (3), 188-200 (2006).
  5. Szczepanik, M., et al. Epicutaneous immunization induces alphabeta T-cell receptor CD4 CD8 double-positive non-specific suppressor T cells that inhibit contact sensitivity via transforming growth factor-beta. Immunology. 115 (1), 42-54 (2005).
  6. Majewska-Szczepanik, M., Zemelka-Wiącek, M., Ptak, W., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with DNP-BSA induces CD4+ CD25+ Treg cells that inhibit Tc1-mediated CS. Immunol Cell Biol. 90 (8), 784-795 (2012).
  7. Zemelka-Wiącek, M., Majewska-Szczepanik, M., Ptak, W., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with protein antigen induces antigen-non-specific suppression of CD8 T cell mediated contact sensitivity. Pharmacol Rep. 64 (6), 1485-1496 (2012).
  8. Marcińska, K., Majewska-Szczepanik, M., Maresz, K. Z., Szczepanik, M. Epicutaneous Immunization with Collagen Induces TCRαβ Suppressor T Cells That Inhibit Collagen-Induced Arthritis. Int Arch Allergy Immunol. 166 (2), 121-134 (2015).
  9. Marcińska, K., et al. Epicutaneous (EC) immunization with type II collagen (COLL II) induces CD4(+) CD8(+) T suppressor cells that protect from collagen-induced arthritis (CIA). Pharmacol Rep. 68 (2), 483-489 (2016).
  10. Majewska, M., et al. Epicutaneous immunization with myelin basic protein protects from the experimental autoimmune encephalomyelitis. Pharmacol Rep. 59 (1), 74-149 (2007).
  11. Tutaj, M., Szczepanik, M. Epicutaneous (EC) immunization with myelin basic protein (MBP) induces TCRalphabeta+ CD4+ CD8+ double positive suppressor cells that protect from experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). J Autoimmun. 28 (4), 208-215 (2007).
  12. Majewska-Szczepanik, M., et al. Epicutaneous immunization with protein antigen TNP-Ig alleviates TNBS-induced colitis in mice. Pharmacol Rep. 64 (6), 1497-1504 (2012).
  13. Majewska, M., et al. TCRalphabeta + CD8+ and TCRgammadelta+ lymphocytes inhibit the capability of peritoneal macrophages to induce contact hypersensitivity. Folia Biol (Krakow). 57 (1-2), 23-27 (2009).
  14. Ptak, W., et al. Epicutaneous immunization with protein antigen in the presence of TLR4 ligand induces TCR alpha beta+CD4+ T contrasuppressor cells that reverse skin-induced suppression of Th1-mediated contact sensitivity. J Immunol. 182 (2), 837-850 (2009).
  15. Majewska-Szczepanik, M., Strzepa, A., Marcińska, K., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with TNP-Ig and Zymosan induces TCRαβ+ CD4+ contrasuppressor cells that reverse skin-induced suppression via IL-17A. Int Arch Allergy Immunol. 164 (2), 122-136 (2014).
  16. Majewska-Szczepanik, M., Dorożyńska, I., Strzępa, A., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with protein antigen TNP-Ig and NOD2 ligand muramyl dipeptide (MDP) reverses skin-induced suppression of contact hypersensitivity. Pharm Rep. 66 (1), 137-142 (2014).
  17. Majewska-Szczepanik, M., Askenase, P. W., Lobo, F. M., Marcińska, K., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with ovalbumin and CpG induces TH1/TH17 cytokines, which regulate IgE and IgG2a production. J Allergy Clin Immunol. 138 (1), 262-273 (2016).
  18. Majewska-Szczepanik, M., Yamamoto, N., Askenase, P. W., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with phosphorylcholine conjugated to bovine serum albumin (PC-BSA) and TLR9 ligand CpG alleviates pneumococcal pneumonia in mice. Pharmacol Rep. 66 (4), 570-575 (2014).
  19. Tan, G., et al. Hydration effects on skin microstructure as probed by high-resolution cryo-scanning electron microscopy and mechanistic implications to enhanced transcutaneous delivery of biomacromolecules. J Pharm Sci. 99 (2), 730-740 (2010).
  20. Mondoulet, L., et al. Epicutaneous immunotherapy on intact skin using a new delivery system in a murine model of allergy. Clin Exp Allergy. 40 (4), 659-667 (2010).
  21. Strid, J., Hourihane, J., Kimber, I., Callard, R., Strobel, S. Disruption of the stratum corneum allows potent epicutaneous immunization with protein antigens resulting in a dominant systemic Th2 response. Eur J Immunol. 34 (8), 2100-2109 (2004).
  22. Callard, R. E., Harper, J. I. The skin barrier, atopic dermatitis and allergy: a role for Langerhans cells. TRENDS Immunol. 28 (7), 294-298 (2007).
  23. Eidsmo, L., Martini, E. Human Langerhans Cells with Pro-inflammatory Features Relocate within Psoriasis Lesions. Front Immunol. 22 (9), 300(2018).
  24. McKinney, M. M., Parkinson, A. A simple, non-chromatographic procedure to purify immunoglobulins from serum and ascites fluid. J Immunol Methods. 96 (2), 271-278 (1987).
  25. Methods in Immunology and Immunochemistry by: Curtis A Williams Merrill W. Chase vol. 2 Physical and chemical methods. , Academic Press. Now York. 359(1968).
  26. Wang, G., Wang, Y., Ma, F. Exploiting bacterial-origin immunostimulants for improved vaccination and immunotherapy: current insights and future directions. Cell Biosci. 14 (1), 24(2024).
  27. Zemelka-Wiacek, M., Majewska-Szczepanik, M., Gajdanowicz, P., Szczepanik, M. Contact Hypersensitivity as a murine model of allergic contact dermatitis. J Vis Exp. 26 (187), e64329(2022).
  28. Thomas, W. R., Watkins, M. C., Asherson, G. L. Differences in the ability of T cells to suppress the induction and expression of contact sensitivity. Immunology. 42 (1), 53-59 (1981).
  29. Walczak, A., Siger, M., Ciach, A., Szczepanik, M., Selmaj, K. Transdermal application of myelin peptides in multiple sclerosis treatment. JAMA Neurol. 70 (9), 1105-1109 (2013).
  30. Juryńczyk, M., et al. Immune regulation of multiple sclerosis by transdermally applied myelin peptides. Ann Neurol. 68 (5), 593-601 (2010).
  31. Beaujean, M., et al. The immunological effects of intradermal particle-based vaccine delivery using a novel microinjection needle studied in a human skin explant model. Vaccine. 41 (13), 2270-2279 (2023).
  32. Prins, M. L. M., Prins, C., de Vries, J. J. C., Visser, L. G., Roukens, A. H. E. Establishing immunogenicity and safety of needle-free intradermal delivery by nanoporous ceramic skin patch of mRNA SARS-CoV-2 vaccine as a revaccination strategy in healthy volunteers. Virus Res. 334, 199175(2023).
  33. Brough, H. A., et al. Epicutaneous sensitization in the development of food allergy: What is the evidence and how can this be prevented. Allergy. 75 (9), 2185-2205 (2020).
  34. Paris, J. L., Vora, L. K., Torres, M. J., Mayorga, C., Donnelly, R. F. Microneedle array patches for allergen-specific immunotherapy. Drug Discov Today. 28 (5), 103556(2023).
  35. Bartnikas, L. M., et al. Epicutaneous sensitization results in IgE-dependent intestinal mast cell expansion and food-induced anaphylaxis. J Allergy Clin Immunol. 131 (2), 451-460 (2013).
  36. Leyva-Castillo, J. M., et al. Mechanical skin injury promotes food anaphylaxis by driving intestinal mast cell expansion. Immunity. 50 (5), 1262-1275 (2019).
  37. Amberg, N., Holcman, M., Stulnig, G., Glitzner, E., Sibilia, M. Effects of depilation methods on imiquimod-induced skin inflammation in mice. J Invest Dermatol. 137 (2), 528-531 (2017).
  38. He, X., Jia, L., Zhang, X. The effect of different preoperative depilation ways on the healing of wounded skin in mice. MDPI Animals. 12 (5), 581(2022).
  39. Liu, I. -L., Wang, L. -F. Epicutaneous sensitization with protein antigen. Dermatol Sinica. 30, 154-159 (2012).
  40. Zemelka-Wiącek, M., Majewska-Szczepanik, M., Pyrczak, W., Szczepanik, M. Complementary methods for contact hypersensitivity (CHS) evaluation in mice. J Immunol Methods. 387 (1-2), 270-275 (2013).
  41. Majewska-Szczepanik, M., et al. Obesity aggravates contact hypersensitivity reaction in mice. Contact Dermatitis. 87 (1), 28-39 (2022).
  42. SanMiguel, A. J., Meisel, J. S., Horwinski, J., Zheng, Q., Grice, E. A. Topical antimicrobial treatments can elicit shifts to resident skin bacterial communities and reduce colonization by Staphylococcus aureus competitors. Antimicrob Agents Chemother. 61 (9), e00774-e00817 (2017).
  43. Strzępa, A., Majewska-Szczepanik, M., Lobo, F. M., Wen, L., Szczepanik, M. Broad spectrum antibiotic enrofloxacin modulates contact sensitivity through gut microbiota in a murine model. JACI. 140 (1), 121-133.e3 (2017).
  44. Meisel, J. S., et al. Commensal microbiota modulate gene expression in the skin. Microbiome. 6 (1), 20(2018).
  45. Arildsen, A. W., Zachariassen, L. F., Krych, L., Hansen, A. K., Hansen, C. H. F. Delayed gut colonization shapes future allergic responses in a murine model of atopic dermatitis. Front Immunol. 12, 650621(2021).
  46. Griffin, M. F., desJardins-Park, H. E., Mascharak, S., Borrelli, M. R., Longaker, M. T. Understanding the impact of fibroblast heterogeneity on skin fibrosis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), dmm044164(2020).
  47. Majewska-Szczepanik, M., Strzępa, A., Marcińska, K., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with TNP-Ig antigen induces CD11c+IL-10+ dendritic cells that promote suppression of Th1-mediated contact hypersensitivity in humanized HLA-DR4 transgenic mice. Int Immunopharmacol. 119, 110281(2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

חיסון אפי-cutaneousפרוטוקול של אימונומודולציהרגישות יתר במגעתאי T מדכאיםתאי T אפקטוריםהעברה אדופטיביתחסינות העורדרמטיטיס אלרגית ממגעתבניות מולקולריות מזוהות עם פתוגנים
מודל עכברי של אימונומודולציה המושרה אפיעורית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.