מאמר שיטה

מבחני אימונופלואורסצנציה אוטומטיים מרובים בתפוקה גבוהה למחקר תרגומי

DOI:

10.3791/67584

⸱

10 ביוני 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ultivue, Inc.

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דוח זה מתאר פרוטוקול אוטומטי לבדיקות אימונופלואורסצנטיות מרובות (mIF) על מכתים שקופיות אוטומטי. זה מדגים את יכולת השחזור הגבוהה של פרוטאומיקה מרחבית על צביעות רקמות סטנדרטיות בתפוקה גבוהה ומצלמות פלואורסצנטיות שלמות, שהיא אידיאלית עבור מבחני mIF מותאמים אישית על פני מספר רב של שקופיות רקמה במחקר תרגומי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אימונופלואורסצנציה מולטיפלקס (mIF) היא טכניקה מתקדמת המאפשרת ניתוח מפורט ונפתר מרחבית של דגימות רקמה על ידי הדמיה של סמנים ביולוגיים מרובים של חלבונים בתוך קטע אחד. עם זאת, רוב טכנולוגיות ה-mIF מתמודדות עם פשרות משמעותיות בין רגישות לתפוקה בעת ריבוב, מה שמציב מגבלה קריטית לזיהוי חזק של סמנים ביולוגיים בשפע נמוך על פני מקטעי רקמה מרובים. גישה חדשה ל-mIF משתמשת בברקודי DNA ייחודיים המקושרים לנוגדנים, המוגברים באמצעות מנגנון הגברה מקביל של מולקולה אחת. שיטה זו משיגה איכות צביעה הדומה מאוד לאימונוהיסטוכימיה בדרגה קלינית (IHC) תוך מתן יכולות ריבוב גבוהות והדמיה של שקופיות שלמות בתפוקה גבוהה. בדיקה זו כוללת הגברה של קוקטייל של נוגדנים מקודדים ב-DNA על הרקמה, ואחריו סבבים עוקבים של שלבי זיהוי כדי לדמיין ארבעה אוליגונוקלאוטידים בעלי תווית פלואורסצנטית בכל מחזור. תהליך זה מאפשר זיהוי של שמונה סמנים ביולוגיים או יותר לכל דגימת רקמה. השלבים העיקריים בשיטה זו כוללים הכנת רקמות אוטומטית, יישום נוגדנים ראשוניים מצומדים עם ברקודי DNA, הגברת אותות ומחזורים איטרטיביים של זיהוי, הדמיה והסרת אותות. רכישת תמונות מלווה ברישום תמונה וניתוח תא בודד באמצעות פלטפורמת מדעי נתונים מרחבית משופרת בינה מלאכותית. עבור מחקר זה, הפרוטוקול יושם על מיקרו-מערכים רב-רקמתיים (TMAs) קבועים בפורמלין, משובצים בפרפין (FFPE), כולל ליבות שקדים, מלנומה, מעי גס ובלוטות לימפה בטריפליקט. טכנולוגיות mIF מתקדמות מספקות תובנות נוספות לגבי תגובת הגידול, מיקרו-סביבת הגידול והנוף החיסוני. על ידי התגברות על הפשרות המובנות בין רגישות, יכולות ריבוב ותפוקת הדמיה, חוקרים יכולים כעת לשאוף להבין את ההטרוגניות של חתימות מולקולריות מאתגרות וסמנים ביולוגיים של תגובות טיפוליות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אימונופלואורסצנציה מרובת מאוד (mIF) היא טכניקה מתקדמת המחוללת מהפכה בתחום ניתוח הרקמות בכך שהיא מאפשרת הדמיה בו-זמנית של סמנים ביולוגיים מרובים של חלבונים בתוך קטע רקמה יחיד 1,2. יכולת זו מספקת רמת פירוט ורזולוציה מרחבית שאין שני לה, שלעתים קרובות חיונית להבנת האינטראקציות בין סוגי תאים עם מורפולוגיות מורכבות בתוך מיקרו-סביבת הרקמה על פני קני מידה מרחביים מרובים3. הטכניקה חשובה במיוחד במחקר אונקולוגי, שם ניתן להשתמש בה כדי למקם סמנים ביולוגיים של גידול, מטרות תרופות חלבון, מצב החיסון המקומי ונקודת הביקורת, האינטראקציות בין סוגי תאים שונים, ואפילו דפוסי הקולוקליזציה התת-תאיים הקשורים למטבוליזם של התרופהבתוך הרקמה 4,5,6.

למרות הפוטנציאל שלה, רוב טכנולוגיות ה-mIF עדיין מתמודדות עם אתגרים משמעותיים, במיוחד באיזון בין רגישות ותפוקה לבין יכולות ריבוב. מגבלה זו קריטית במיוחד לאיתור סמנים ביולוגיים קליניים שיכולים להראות ביטוי נמוך מאוד כגון HER2 ו-PD-L1 7,8,9. כדי להבין מדוע זה כך, חיוני להבין שיטות אחרות של mIF. שיטות מסורתיות אלו סללו את הדרך לפלטפורמות mIF מתוחכמות יותר, אך הן מגיעות עם סטים משלהן של יתרונות ומגבלות.

אימונופלואורסצנציה ישירה (DIF) משתמשת בנוגדנים המצומדים ישירות לפלואורופורים, או לאוליגונוקלאוטיד המסוגל לגייס פלואורופורים10. שיטה זו פשוטה לריבוי אך סובלת מרגישות נמוכה יותר וקושי בפתרון אות מרקע רקמות או חפצי צביעה.

אימונופלואורסצנציה עקיפה (IIF) משתמשת בנוגדנים משניים שנקשרים לנוגדנים הראשוניים. זה הגדיל את האות בהשוואה ל-DIF מבוסס ראשוני. בשילוב עם עיצובים משופרים של תאי זרימה, IIF רציף יכול לזהות עד 40 סמנים ביולוגיים בבדיקה אחת 2,11. עם זאת, אלה עדיין סובלים מחוסר רגישות יחסי בהשוואה לאסטרטגיות מבוססות אנזימים להגברת אותות, כמו אלה שנמצאות בטכניקות אימונוהיסטוכימיה (IHC).

אימונופלואורסצנציה מבוססת קטליזה של אנזים נראית לרוב בשיטות IHC המשתמשות בחזרת פרוקסידאז (HRP) לתצהיר צבע כרומוגני (DAB) או פלואורסצנטי (למשל, הגברת אות טירמיד (TSA)). מכיוון שבדיקות אלו מבוססות על אותו אנזים קטליטי, רגישות הזיהוי שלהן דומה, מה שהופך את מבחני mIF מבוססי TSA רב-ספקטרליים למתאימים ליישומים קליניים 2,12. היתרון של הגברת אותות מבוססת DNA הוא דרגת הריבוב הגבוהה האפשרית תוך שמירה על הגברת אותות ומודולריות מצוינים. לעומת זאת, שיטות מבוססות HRP הן פחות מודולריות וקשות לאופטימיזציה, ודורשות מחזורי פיתוח ובדיקה נוספים של פאנלים.

אימונופלואורסצנציה של נוגדנים ברקודים ב-DNA
בדיקת ה-mIF המודגמת כאן משתמשת ב-DNA פולימראז כדי להגביר בו זמנית נוגדנים מקודדים ב-DNA, ואחריהם מחזורים של צביעה והימנעות של בדיקה מדווחת באמצעות ארבעה אוליגונוקלאוטידים פלואורסצנטיים לכל סבב הדמיה (איור 1).

figure-introduction-1
איור 1: איור גרפי של פרוטוקול בדיקת אימונופלואורסצנציה מרובה. נוגדנים מצומדים לברקוד מתווספים בשלב אחד, והברקודים מוגברים בו זמנית. קבוצות של ארבעה בדיקות פלואורסצנטיות מתווספות בכל מחזור, ומאפשרות לדמיין ארבעה סמנים בבת אחת. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תוספת נוגדנים חד-סיבובית זו והגברה חד-שלבית מפשטת מאוד את פרוטוקול הבדיקה. התהליך מתאפשר על ידי מערכות צביעה וסריקה אוטומטיות בתפוקה גבוהה, המבטיחות תוצאות הניתנות לשחזור משקופית לשקופית ומאצווה לאצווה על פני מספר רב של דגימות המשמשות במחקרים קליניים13.

אחד היתרונות העיקריים של טכנולוגיה זו הוא יכולתה לשמור על רגישות גבוהה תוך מתן אפשרות לריבוב נרחב2. זרימת העבודה גם מבטיחה שתפוקת ההדמיה תישאר גבוהה, ובכך נותנת מענה לאחת המגבלות העיקריות של טכנולוגיות mIF מרובות מאוד (למשל, > 8 סמנים ביולוגיים) למחקרים קליניים. זה חשוב במיוחד במחקר קליני, שבו וריאציות עדינות ביעדי התרופות בשפע נמוך (למשל, HER2 נמוך) בין מטופלים יכולות לספק תובנות קריטיות לגבי התגובה הטיפולית.

בנוסף לתכונות מפתח אלה, בדיקה זו מספקת גם יכולת תצורה של פאנל, יכולות הדמיה של שקופיות שלמות בתפוקה גבוהה ורזולוציה אופטית הנחוצה לחקירת תהליכים ותאים תת-תאיים, כמו גם בליטות תאיות הקשורות למקרופאגים ותאים דנדריטיים. היכולת לחקור פנוטיפים תאיים מורכבים על פני קני מידה מרחביים מרובים היא יתרון קריטי של הדמיה אופטית לעומת שיטות מבוססות ציטומטריית מסה הדמיה (IMC)2.

בעבודה זו מוצג פרוטוקול לבדיקת mIF 8-plex באמצעות מכתים אוטומטיים וסורק שקופיות שלמות. בדיקה זו כוללת פאנל של שמונה נוגדנים עיקריים: CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3, PD-1, PD-L1 ופאן-ציטוקרטין14. פאנל סמנים זה יאפשר פרופיל חיסוני של רקמת הגידול וזיהוי תאים הנמצאים בסביבת הגידול או הסטרומה. פרוטוקול זה משתמש במכתים שקופיות אוטומטי עבור סבבי צביעה והחלפת בדיקה ראשוניים, וניתן להשלים את הצביעה וההדמיה תוך יומיים. מוצגות גם שיטות לאימות בדיקת mIF וביצוע ניתוח של התמונות המתקבלות.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים חייבים לעמוד בהנחיות ועדת האתיקה המוסדית של מחקר אנושי. כל חלקי הרקמות המשמשים בפרוטוקול זה התקבלו מספק רקמות חיצוני.

1. הכנת דגימת רקמות

  1. בחר בלוק רקמות FFPE להכתמה באמצעות בדיקת mIF. אם אתה משתמש בשקופיות רקמות FFPE, ודא שהדגימות בעובי של בין 3-5 מיקרומטר, מותקנות על שקופיות זכוכית טעונות חיובית, וללא קמטים או קרעים אחרים שעלולים להשפיע לרעה על התוצאות הסופיות.
    הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, הימנע מכתמים של דגימות רקמה שנחתכו יותר מחודשיים לפני כן. בנוסף, הימנע מבלוקים שאוחסנו יותר מ-10 שנים או שנראים יבשים מבחינה ויזואלית.
  2. אם עובדים עם גושי רקמות FFPE, השתמש במיקרוטום כדי לחתוך את המספר הנדרש של שקופיות רקמה בעובי של 4 מיקרומטר, והרכיב את השקופיות על מגלשת זכוכית טעונה חיובית. כדי להשיג את התוצאות העקביות ביותר, הרכיב את כל השקופיות באותו כיוון. ודא שהרקמה נקייה מקמטים וקרעים.
  3. אם אין להכתים דגימות באופן מיידי, אחסן אותן בקופסת שקופיות מתחת לחנקן עד חודשיים.

2. רישום ריאגנטים נלווים ונוגדנים ראשוניים להגדרה ראשונית

  1. בתוך תוכנת הצביעה האוטומטית, נווט אל הכרטיסייה הגדרת מגיב בחלק העליון של המסך. לחץ על הוסף כדי להוסיף ריאגנטים חדשים.
  2. מבחני הצביעה וההחלפה ישתמשו בתשעה מיכלי ריאגנטים, בהתאם למידע שנמצא בטבלה 1. כדי להשתמש בהם, למשל, עבור המגיב הראשון בשם Wash Buffer, עם השם המקוצר ISPWsh1, בצע את השלבים. בחר את הסוג כעזר, ובדוק שגם *BWash וגם DI מופיעים תחת תפזורת תואמת. סמן את התיבה מועדף לפני השמירה.
  3. חזור על תהליך זה עבור הריאגנטים הנלווים הנותרים, תוך שימוש בשמות ובשמות המקוצרים שנמצאים בטבלה 1.
    1. מגיב תמיסת ההגברה (ULTAmp1) אינו תואם ל-Bond Wash. בחלון הגדרת הריאגנטים לשם כך, אנא בחר *BWash ולחץ על כפתור << כדי להעביר את המגיב הזה מרשימת הריאגנטים התואמים לקטע המגיב הזמין. אי הסרת Bond Wash כמגיב תואם למגיב תמיסת ההגברה עלול לגרום להפחתה משמעותית בביצועי הצביעה של הבדיקה.
  4. לאחר רישום כל מיכלי הריאגנטים, צור ערכת זיהוי מחקר לפני תחילת הריצה הראשונית. ערכת הזיהוי תזדקק למיכל טיטרציה אחד של 30 מ"ל.
  5. הוסף את מיכל הטיטרציה של 30 מ"ל לערכת הזיהוי. כדי למנוע הפרדה בין השניים, הדביקו את מיכל הטיטרציה לשרביט.
  6. סרוק את הברקוד בצד שמאל של ערכת הזיהוי. בחלון המוקפץ שלאחר מכן, תן שם לערכת הזיהוי (למשל, ערכת InSituPlex). הגדר את תאריך התפוגה ל-10 שנים מתאריך הרישום.
    הערה: תאריך התפוגה שנקבע כאן אינו התאריך הרשום על המגיב אלא הוא תאריך התפוגה של המגיב במיכל הטיטרציה. קביעת תאריך התפוגה בעתיד הרחוק מבטיחה שהערכה לא תפוג שלא לצורך.
  7. עבור מיקום המגיב הראשון של הערכה, בחר Wash Buffer כמגיב מהתפריט הנפתח.
  8. לחץ על שדה הברקוד עבור מיקום מגיב זה וסרוק את הברקוד של מיכל הטיטרציה המודבק של 30 מ"ל כדי לרשום מיכל זה כ-Wash Buffer ולקשר את מיכל המגיב לשרביט הזיהוי.
  9. לאחר שמיכל הטיטרציה מקושר לערכה, לחץ על כפתור הוספה כדי לשמור ולסגור את החלון המוקפץ.
  10. מלאו את מיכל הטיטרציה ב-30 מ"ל של 1x Bond Wash ואחסנו בקירור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בין ריצות הצביעה.

טבלה 1: ריאגנטים נלווים להגדרה. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

3. הגדרת פרוטוקול ראשונית

  1. לאחר רישום מוצלח של כל מיכלי הריאגנטים, נווט אל הכרטיסייה הגדרת פרוטוקול בחלק העליון של מסך תוכנת המכונה האוטומטי.
  2. ודא איזו גרסת תוכנה פועלת כעת על ידי לחיצה על הלוגו בפינה השמאלית העליונה של המסך. החלון המוקפץ שנוצר יציג את גרסת התוכנה המותקנת כעת תחת הכותרת מידע תוכנה.
  3. אם התוכנה היא גרסה 7.0 ואילך, תהיה תבנית מותקנת מראש של פרוטוקול הצביעה. בתחתית המסך, ודא שהבחירה סטטוס מועדף מוגדרת להכל. תן שם לפרוטוקול התבנית *ISP Staining Assay. עבור גרסאות קודמות של תוכנה, ניתן למצוא את הפרוטוקול בטבלה 2.
  4. לחץ לחיצה ימנית על *ISP Staining Assay והעתק את הפרוטוקול. בחלון המוקפץ שנוצר, שנה את שם הפרוטוקול Staining Assay 1 בשם המקוצר (ISP_IHC1)
  5. תחת מערכת הזיהוי המועדפת, בחר את המערכת שנוצרה במהלך הגדרת הריאגנט הראשונית בשלב 2.6.

טבלה 2: פרוטוקול לפרוטוקול צביעה אימונופלואורסצנטי מרובה. *MARKER מתאים לתמיסת הנוגדנים, ו-Wash Buffer מתאים לתמיסת BOND Wash. לכל שאר הריאגנטים הנלווים יש רכיבי ערכה בעלי שמות בהתאם. פרוטוקול זה תואם לתוכנה בגרסת 7.0 ומעלה, BXD 39 ומעלה. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

4. הגדרת מגיב

  1. הפשירו את כל ריאגנטים של הערכה למעט צימודי הנוגדנים, אנזים ההגברה, יוזם ההחלפה ומנטרל ההחלפה בטמפרטורת החדר. אחסן את שאר רכיבי הערכה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  2. אם עדיין לא נעשה, רשום מיכל טיטרציה חדש עבור כל אחד מהריאגנטים שהוגדרו בשלב 2.3. הנח תוספת טיטרציה חדשה לכל אחד מהם.
  3. קח את מערכת זיהוי המחקר הרשומה בשלב 2.6 וודא שמיכל חיץ הכביסה המשויך מלא עד 30 מ"ל עם תמיסת כביסה 1x בונד. הנח את מיכלי הטיטרציה עבור כל מגיב למערכת.
  4. הכן את מדלל הבטן במיכל המתאים. הנפח הנדרש הוא 350 + (150 מיקרוליטר x מספר שקופיות) והוא מורכב מדלל הנוגדנים כפי שסופק. מערבל את המאגר לערבוב לאחר ההפשרה.
  5. הכן את תמיסת צביעת הנוגדנים בתמיסת צביעת הנוגדנים מיכל 1. הוסף את כל הנוגדנים בדילול של 1:100 בדילול הנוגדנים המצורף. הנפח הנדרש הוא 350 + (150 מיקרוליטר x מספר שקופיות). אין לערבב את מלאי הנוגדנים או את תמיסת צביעת הנוגדנים המלאה, יש לערבב על ידי פיפטינג בלבד.
  6. הכן את תערובת ההגברה המוקדמת במיכל תערובת ההגברה המוקדמת. הנפח הנדרש הוא 350 + (150 מיקרוליטר x מספר שקופיות) והוא מורכב מתערובת הגברה מוקדמת כפי שסופק. מערבולת תמיסה זו לאחר ההפשרה.
  7. הכן את תמיסת ההגברה במיכל תמיסת ההגברה. הנפח הנדרש הוא 350 + (150 מיקרוליטר x מספר שקופיות), והוא מורכב מאנזים הגברה מדולל 1:10 במאגר הגברה. אין לערבב את אנזים ההגברה או תמיסת ההגברה שהושלמה, לערבב על ידי פיפטינג בלבד.
  8. הכן את כתם הנגד הגרעיני במיכל נגד גרעיני. הנפח הנדרש הוא 350 + (300 מיקרוליטר x מספר שקופיות) והוא מורכב מתמיסת הכתמים הגרעיניים המסופקת המדוללת 1:100 במים טהורים במיוחד. מערבבים על ידי מערבולת.
  9. הכן את תערובת הבדיקות הפלואורסצנטיות המתאימה לסבב ההדמיה הראשון במיכל הבדיקה הפלואורסצנטית. הנפח הנדרש הוא 350 + (450 מיקרוליטר x מספר שקופיות), המורכב מבדיקות פלואורסצנטיות 1 תמיסה מדוללת 1:20 בתוך מאגר הבדיקה. מערבולת את הרכיבים לאחר ההפשרה כמו גם את התערובת השלמה הסופית.
  10. לאחר שכל הריאגנטים מוכנים ומונחים במיכלים המתאימים להם, הנח את שרביט הריאגנט המלא לתוך התוכנה כדי לאפשר מדידת נפח המגיב.

5. הפעל את ההגדרה

  1. לאחר הכנת כל הריאגנטים, נווט אל הכרטיסייה הגדרת שקופיות בחלק העליון של התוכנה ובחר בלחצן מחקר חדש . הוסף מזהה מחקר, שם מחקר והערות למחקר כרצונך. עיין באיור 2 כדוגמה.
  2. תחת נפח החלוקה, בחר 150 מיקרוליטר ו -*הסרת שעווה 4 שלבים כפרוטוקול ההכנה. אם *שלבי Dewax 4 אינם מופיעים בתפריט הנפתח, אתר פרוטוקול זה בתפריט הגדרת פרוטוקול וסמן את התיבה מועדפת . לחץ על אישור.
  3. לאחר יצירת המחקר, בחר בלחצן הוסף שקופית בצד ימין של מסך הגדרת השקופיות. תחת הערות לשקופית, תן שם ייחודי לשקופית.
  4. עבור השדות הנוספים במסך זה, הגדר את סוג הרקמה לבדיקת רקמות והגדר את נפח החלוקה ל-150 מיקרוליטר כאשר מצב הצביעה הוא יחיד בתפריט הנפתח השמאלי ושגרה בתפריט הנפתח הימני. בתהליך, בחר IHC, כאשר הסמן הוא תמיסת צביעת נוגדנים.
  5. בתוך קטע הפרוטוקול של חלון הוסף שקופית, בחר בדיקת צביעה 1 לצביעה, * הסרת שעווה 4 שלבים כהכנה, ו -*HIER 20 דקות עם ER2 כ-HIER. פרוטוקול האנזים יישאר *----. לאחר השלמת הפעולה, לחץ על הוסף שקופית. עיין באיור 2 כדוגמה.
  6. חזור על תהליך זה לפי הצורך עבור מספר השקופיות שיופעל במחקר, וודא שהשדה הערות שקופיות מתעדכן עבור כל שקופית שנוספה כדי שניתן יהיה לזהות אותן באופן ייחודי מאוחר יותר. לאחר הוספת כל השקופיות, סגור את החלון הוסף שקופית והדפס את כל התוויות, והצמד אותן למקטעי הרקמה המתאימים.
  7. טען כל שקופית על המגש והנח אריחי כיסוי על גבי כל חלק לפני טעינת המגש על התוכנה. לאחר הוספת ריאגנטים ושקופיות, בחר את הצביעה האוטומטית המתאימה בצד ימין של התוכנה. לאחר בחירה זו, כל שלושת מגשי השקופיות והמידע עבור כל הריאגנטים בתוכנה יהיו גלויים, כולל ריאגנטים בתפזורת ואלה שנוספו במהלך הכנת ריאגנטים.
  8. ודא שמיכלי הריאגנטים בתפזורת מלאים, ולמיכלי הפסולת נותר מספיק נפח כדי להשלים את הריצה, ולאחר מכן לחץ על כפתור ההפעלה כדי להתחיל בריצה.
  9. כל ריצה אורכת כ-5 שעות ו-15 דקות. רשום את זמן העצירה וודא שהשקופיות מוסרות מהצביעה האוטומטית מיד לאחר סיום הפרוטוקול.

figure-protocol-1
איור 2: הנחיות עבור התוכנה. (A) הנחיית מחקר חדשה בתוכנת Autostainer, המציגה הגדרות נכונות עבור פרוטוקול צביעה אימונופלואורסצנטי מרובה (mIF). (ב) הוסף הנחיית שקופית בתוכנה, המציגה את ההגדרות הנכונות עבור פרוטוקול צביעת mIF. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

6. הדמיה

  1. לאחר השלמת פרוטוקול הצביעה, הסר שקופיות מוכתמות וכיסוי במדיום ההרכבה. אפשר למדיום ההרכבה להתרפא בחושך עד שהכיסוי מודבק היטב במקומו (בדרך כלל שעה או יותר, נקודת השהיה).
  2. תמונה שקופית על מיקרוסקופ פלואורסצנטי או סורק שקופיות שלם עם מסננים מתאימים לבדיקה. הצבעים המשמשים בבדיקה זו תואמים בדרך כלל למסננים עבור DAPI, FITC, TRITC, Cy5 ו-Cy7.
  3. התמונות ייראו דומות לאלה שבאיור 3A. ודא חזותית שכל אזורי הרקמה ממוקדים כראוי ושהאותות מופיעים ברמת עוצמה מתאימה (לא חשיפת יתר/תת-חשיפה). במידת הצורך, צור מחדש תמונה של שקופיות עם הגדרות חשיפה שונות.
  4. לאחר ההדמיה, אם יש צורך בסבב הדמיה נוסף, יש להשרות את השקופיות ב-1x PBS עד שהכיסויים נופלים מעצמם. (נקודת הפסקה)

7. הגדרה ראשונית של פרוטוקול Exchange

  1. אם התוכנה היא בגרסה 7.0 ואילך, תהיה תבנית מותקנת מראש של פרוטוקול הצביעה האוטומטית. בתחתית המסך, ודא שהבחירה סטטוס מועדף מוגדרת להכל. פרוטוקול התבנית ייקרא *ISP Signal Exchg. עבור גרסאות קודמות של תוכנה, ניתן למצוא את הפרוטוקול בטבלה 3.
  2. לחץ לחיצה ימנית על *ISP Signal Exchg והעתק את הפרוטוקול. בחלון המוקפץ שנוצר, שנה את שם הפרוטוקול Exchange Protocol 1 בשם המקוצר ISPEXCH1. ודא שהתיבה מועדפת מסומנת לפני שתמשיך והקצה את אותו שם ערכה כפי שנקבע בשלב 2.6.

טבלה 3: פרוטוקול לפרוטוקול חילופי אותות אימונופלואורסצנטי מרובה. Wash Buffer מתאים לפתרון BOND Wash. לכל שאר הריאגנטים הנלווים יש רכיבי ערכה בעלי שמות בהתאם. פרוטוקול זה תואם לתוכנה בגרסת 7.0 ומעלה, BXD 39 ומעלה. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

8. הגדרה והפעלה של פרוטוקול Exchange

  1. הפשירו את מאגר ההחלפה בטמפרטורת החדר. שמור את מנטרל ההחלפה ואת יוזם ההחלפה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש. יש צורך בשני מיכלי טיטרציה של ריאגנטים וערכת הזיהוי כדי לבצע את פרוטוקול ההחלפה.
  2. הכן את תמיסת ההחלפה במיכל המתאים. הנפח הנדרש הוא 350 + (450 מיקרוליטר x מספר שקופיות), והוא מורכב מיוזם החלפה מדולל 1:500 במאגר ההחלפה. אין לערבב את אנזים ההחלפה או את תמיסת ההחלפה שהושלמה, יש לערבב על ידי פיפטינג בלבד.
  3. הכן את תערובת הבדיקות הפלואורסצנטיות השנייה במיכל הבדיקות הפלואורסצנטיות 2. הנפח הנדרש הוא 350 + (450 מיקרוליטר x מספר שקופיות) והוא מורכב מתמיסת הבדיקות הפלואורסצנטיות 2 המדוללת 1:20 ומנטרל ההחלפה מדולל 1:40 בתוך מאגר בדיקה 2. תערובת הבדיקה הפלואורסצנטית ומאגר הבדיקה עשויים להיות מערבולים, אך יש לערבב רק את מנטרל ההחלפה והתמיסה המשולבת הסופית.
  4. לאחר הכנת כל הריאגנטים, הנח את השרביט המלא על הצביעה האוטומטית ואפשר למכונה לבדוק את הריאגנטים.
  5. הוסף את כל השקופיות לאחר שלב 5. במהלך הוספת שקופית, שנה את הסמן ל- *שלילי. עבור הכנה, HIER ואנזים, בחר באפשרות *----, מכיוון שאין צורך בהסרת שעווה או אחזור אנטיגן עבור פרוטוקול ההחלפה. לאחר השלמת הפעולה, לחץ על הוסף שקופית.
  6. חזור על תהליך זה לפי הצורך עבור מספר השקופיות שיופעל במחקר, וודא שהשדה הערות שקופיות מתעדכן עבור כל שקופית שנוספה כדי שניתן יהיה לזהות אותן באופן ייחודי מאוחר יותר.
  7. לאחר הוספת כל השקופיות, סגור את החלון הוסף שקופית והדפס את כל התוויות, והצמד אותן למקטעי הרקמה המתאימים.
  8. טען כל שקופית על המגש והנח אריחי כיסוי על גבי כל חלק לפני טעינת המגש על התוכנה.
  9. לאחר הוספת כל הריאגנטים והשקופיות, בחר את הצביעה האוטומטית המתאימה בתוכנה; זה יהיה בצד ימין. לאחר בחירה זו, כל שלושת מגשי השקופיות והמידע עבור כל הריאגנטים בתוכנה יהיו גלויים, כולל ריאגנטים בתפזורת ואלה שנוספו במהלך הכנת ריאגנטים.
  10. ודא שמיכלי הריאגנטים בתפזורת מלאים ולמיכלי הפסולת נותר מספיק נפח כדי להשלים את הריצה.
  11. לאחר אישור זה, לחץ על כפתור ההפעלה כדי להתחיל בריצה. השלמת הפרוטוקול אורכת כ-90 דקות. רשום את זמן העצירה וודא שהשקופיות מוסרות מיד לאחר השלמת הריצה.

9. הדמיה

  1. חזור על הדמיה עבור סבב הבדיקות החדש, כמו בשלב 5. התמונות יופיעו כמו באיור 3B.

10. ערימה (עבור >הדמיית חלבון 4-plex)

  1. תמונות מרובות יהיו קיימות כעת עבור אותה שקופית. שלב את התמונות בתוכנת הרישום המשותף של התמונה כדי ליצור תמונה מוערמת של 8 פלקס.
  2. רשום במשותף את התמונות של כל סיבוב כדלקמן.
    1. כל תמונה עגולה נקראת כך: _ כאשר הוא השם הייחודי של השקופית (ברקוד) ו- היא מחרוזת שכאשר היא ממוינת בסדר אלפביתי, תציב את התמונה העגולה 1 במקום הראשון, ואת התמונה העגולה 2 במקום השני. לדוגמה, עבור = 1234ABC, הקבצים עשויים להיקרא 1234ABC_Round1 ו-1234ABC_Round2, כאשר לכל הקבצים יש את הסיומת המתאימה (למשל, .czi) של הסורק. שים את כל התמונות העגולות בתיקייה אחת שנקראת למשל, תמונות מקור.
    2. בתוך תוכנת הרישום המשותף, לחץ על כפתור הגדר במקטע ספריית תמונות המקור של ממשק המשתמש וכאשר תתבקש, בחר את התיקיה שנוצרה למעלה.
    3. הגדר את סוג הקובץ במקטע תמונות מקור לסיומת של תמונות המקור (לדוגמה, .czi, .qtiff וכו'). התוכנה תציג כעת את שתי התמונות העגולות יחד בטבלה המראה כי בשקופית 1234ABC יש 2 תמונות עגולות.
    4. אם תרצה, הגדר את מיקום התמונות המוערמות של הפלט לספרייה שונה מתיקיית תמונות המקור באמצעות הלחצן Set במקטע ספריית התמונות המוערמות של ממשק המשתמש וכאשר תתבקש, בחר בתיקיית הפלט הרצויה . אחרת, תיקיית תמונות המקור תשמש כברירת מחדל.
    5. כברירת מחדל, נוצר רק ייצוג קובץ .afi של המחסנית. סמן את האפשרות לשמור קובץ OME.tif של כל המחסנית בקטע אפשרויות העיבוד של הממשק.
    6. על מנת לאמת את דיוק הרישום המשותף על פני כל המדגם, סמן את אימות אפשרות בקטע הפלט של הממשק.
    7. לחץ על כפתור START כדי להתחיל ברישום משותף של תמונה.

11. ניתוח תמונות

  1. לאחר הדמיית השקופיות, דמיין ונתח את השקופיות באמצעות כל שיטת ניתוח לבחירתך, כגון חבילת עיבוד התמונה STARVUE של Ultivue או QuPath15.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעקבות הפרוטוקול לעיל, רקמת FFPE תהיה מוכתמת במספר מטרות, והתקבלו תמונות באיכות גבוהה של כל הסמנים בקבוצות של ארבעה (איור 3A,B). תוכנת הרישום המשותף של התמונות תאפשר לשלב ולרשום תמונות מאותה שקופית, כפי שניתן לראות באיור 3C. תוצאות דומות מוצגות באיור 4 עבור שקופית רקמת סרטן המעי הגס (CRC).

יש לקבוע את הצלחת הפרוטוקול על ידי הערכת דפוס הצביעה הצפוי. בדוגמת ה-CRC המוצגת, כל אחת מהמטרות המוכתמות מתבטאת בתא התת-תאי הצפוי, למשל, FoxP3 גרעיני, CD3 קרומי, CD68 ציטופלזמי (איור 4B-D). כל אחת מהמטרות התפקודיות מתבטאת בסוג התא המתאים, כפי שמודגם על ידי הדוגמה של לוקליזציה משותפת של PD1 ו-CD3 או של PDL-1 ו-CD68, המראים תאי T מותשים ומקרופאגים מדכאי חיסון, בהתאמה. הערכה של יחס אות לרקע טוב, המאפשר הבחנה מוצלחת בין אות חיובי אמיתי לרעשי רקע פוטנציאליים, מבוצעת בדרך כלל באופן איכותי על ידי פתולוגים או מומחי ניתוח תמונה המאשרים את איכות הצביעה, ומאפשרים ניתוח תמונה מוצלח. כדי לאשר עוד יותר את איכות הצביעה והביצועים, ניתן להוסיף השוואה לתקן הזהב IHC (DAB כרומוגני) בחתכים טוריים (ראה דוגמה באיור 5), כמו גם דגימת רקמת בקרה חיובית כגון שקד אנושי אשר עבור רוב המטרות החיסוניות, יכולה להיות שימושית כדי לאשר את הצלחת ריצת הצביעה. שימו לב שסרטן עשוי להראות ביטוי נמוך יותר של מטרות מאשר שקדים אנושיים16.

לאחר אישור התוצאות באופן איכותי, ניתן לבצע ניתוח כמותי. בעבודה זו, זה מורכב בעיקר מחישוב צפיפות התאים של פנוטיפים שונים (מספר תאים/מ"מ 2) המבטאים מטרה או מטרות מסוימות, כמו גם חישוב רמות העוצמה הממוצעות של מטרות פונקציונליות שיכולות להראות טווח דינמי רחב של ביטוי. בעת הערכת הדיוק של מבחני mIF, חתכים טוריים המוכתמים באותם סמנים צריכים להראות אותות דומים בין שקופיות, אותם ניתן לראות באופן איכותי באיור 6. דוגמה לתוצאות כמותיות של צפיפות סמן בודד בסוגי רקמות שונים מוצגות באיור 7. ניתוח תמונה בתמונות אלה מאפשר לזהות תאים חיוביים, וניתן לחשב צפיפות תאים חיובית מתאימה עבור כל סמן, כמו גם את עוצמת האות הממוצעת לכל תא חיובי. זה מאפשר לחשב מקדם שונות (CV) עבור כל סמן כדי להעריך את הדיוק של בדיקת הריבוב (טבלה 4).

figure-results-1
איור 3: תמונות של ליבת מיקרו-מערך רקמות (TMA) המתקבלות מסבבים עוקבים של צביעה בפרוטוקול אימונופלואורסצנטי 8-plex. (A) תמונה שהתקבלה מסבב ההדמיה הראשון, הכוללת את הסמנים CD8, PD1, PD-L1 ו-CD68. לאחר פרוטוקול ההחלפה, (B) מציג את סבב ההדמיה השני באותה שקופית עבור הסבב השני של הסמנים CD3, CD4, FoxP3 ו-CK/SOX10, ו-(C) מציג תמונה שנרשמה במשותף המשלבת תמונות (A) ו-(B). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 4: צביעה מייצגת של רקמת סרטן המעי הגס (CRC) עם צביעה אימונופלואורסצנטית 8-plex. האיור מציג פנוטיפים תאיים שניתן לזהות על ידי מיקום משותף של מספר מטרות באותו תא. (למעלה) תמונת שקופית שלמה של רקמת CRC. (למטה) תצוגות מפורטות של אזורים של הדגשת רקמות (A) תאי T-reg (CD3+/CD4+/FOXP3+), (B) תאים המבטאים PD-1 ו-PD-L1 בתוך גידול וסטרומה, (C) תאי T ציטוטוקסיים מותשים (CD3+/CD8+/PD-1), (D) תאי גידול מתחמקים ממערכת החיסון (PD-L1+/CK+) ומקרופאגים מדכאי חיסון (CD68+/PDL1+). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 5: השוואה איכותית של צביעה אימונוהיסטוכימית (IHC) לצביעה אימונופלואורסצנטית (IF). חתכים סדרתיים מוכתמים בצביעה אימונוהיסטוכימית של סמן יחיד (DAB, שורה עליונה), אימונופלואורסצנציה של סמן יחיד (מונופלקס ISP), ותצוגה חד-ערוצית של אימונופלואורסצנציה מרובה (ISP multiplex) המדגימה התאמה איכותית בין שיטות הצביעה השונות. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 6: צביעת חתך טורי. (A) דיאגרמה המציגה את הפריסה של TMA רב-רקמות. (B) תמונות מייצגות של 8 פלקס של ליבות רקמה מכל סוג רקמה ב-TMA. (C) תמונות מייצגות של CD8 בליבת שקדים על פני שישה מקטעי TMA טוריים מוכתמים בריצה אחת. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 7: כימות צפיפות סמן יחיד לכל סוג רקמה הכלול ב-TMA. צפיפויות לרקמה הן הצפיפות הממוצעת על פני שלוש ליבות מייצגות של כל סוג רקמה בשקופית TMA. ציר ה-y מייצג את צפיפות הסמן הבודד בסוגי רקמות שונים על ציר ה-x, ביחידות של תאים חיוביים/מ"מ2. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 8: ניתוח אזור עניין (ROI) של אות פלואורסצנטי יחסי המשווה את ה-ISP mIF המוגבר המתואר בפרוטוקול זה ל-IF עקיף. (A) שקופית מייצגת מוכתמת עבור CK (משמאל) או PD-L1 (מימין) עם חמישה החזר ROI מצוין. (B) תמונות מייצגות של החזר ROI עבור CK (למעלה) ו-PD-L1 (למטה). עוצמת האות הממוצעת הושגה עם mIF מוגבר (סגול) ו-IF עקיף (כחול) עבור (C) CK ו-(D) PD-L1 על פני חמישה החזר ROI, כל אחד בגודל 100 מיקרומטר x 100 מיקרומטר ומכיל כ-200 תאים. ערכי ציר Y מראים יחידות פלואורסצנטיות שרירותיות ופסי שגיאה מראים סטיות תקן (n=3). (E) עוצמת האות היחסית שהושגה עם ספק שירותי אינטרנט מוגבר mIF (סגול) ו-IF עקיף (כחול) חושבה על ידי לקיחת היחס בין אות ה-mIF המוגבר הממוצע לאות ה-IF העקיף הממוצע בכל החזר ה-ROI. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 4: מקדם שונות מחושב (CV). CV של צפיפות תאים חיובית ועוצמת האות הממוצעת עבור תמונות השקדים מוצגים באיור 6. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דוח זה מתאר פרוטוקול להפעלת צביעה אימונופלואורסצנטית מולטיפלקס בעלת תפוקה גבוהה ורגישות גבוהה באמצעות צביעה אוטומטית. בעת ביצוע פרוטוקול זה, שלבי הכנת המגיב הם קריטיים וראויים לתשומת לב. יש לוודא שריאגנטים מעורבבים כראוי ונמדדים בצורה נכונה כדי למזער את שונות הצביעה בין שקופיות שונות באותה ריצה או בין ריצות שונות המשתמשות באותם רכיבים.

בעיות נפוצות בעת ביצוע פרוטוקול זה כוללות אי ערבוב ריאגנטים כראוי לפני הטעינה ופוטנציאל לאובדן רקמות עקב הליך החלקה לא תקין. בעוד שפרוטוקול צביעה זה חל על כל סוג רקמת FFPE, כולל סוגי סרטן, סוגי רקמות מסוימים עשויים לדרוש טיפול זהיר יותר (למשל, רקמות עם תכולת שומן גבוהה). כדי למנוע אובדן רקמות, אפשר לשקופיות החלקה של הכיסוי להשרות למשך זמן ארוך מספיק עד שהכיסוי יתנתק מעצמו. אל תכריח את הכיסוי לעקור או לחטט את הזכוכית.

מגבלה היא שבעוד שרבים מהמטרות הנפוצות ביותר באונקולוגיה חיסונית מאומתות ומוכנות לשימוש, יעדים מסוימים עשויים לדרוש פיתוח בדיקה לפני שהם נכללים בפאנל מולטיפלקס. למרות שתהליך זה מהיר יחסית, זה יכול לדרוש מספר שבועות נוספים לפני שתוכל להשתמש בפאנל מולטיפלקס מותאם אישית.

ישנם מספר הבדלים בין בדיקה זו לבין טכנולוגיות אימונופלואורסצנטיות אחרות. בהשוואה לטכנולוגיות מבוססות אימונופלואורסצנציה ישירה ועקיפה, לבדיקה המודגמת כאן יש רמת הגברה גבוהה משמעותית, המאפשרת שיפור משמעותי באות לרעש, במיוחד בערוצים הנוטים להראות אוטופלואורסצנטיות של רקמות, כגון ערוץ FITC. התוצאה היא אות חזק פי 30~ מאימונופלואורסצנציה ישירה ואות חזק פי 10~ מאימונופלואורסצנציה עקיפה כפי שכומת על ידי שימוש בניתוח עוצמת שקופית שלמה וניתוח ידני מבוסס ROI (איור 8). שיטה זו מאפשרת זיהוי חלבון מטרה רגיש הרבה יותר בזמני חשיפה נמוכים משמעותית ומבטלת את הצורך במניפולציה של תמונה, כולל חיסור רקע המסתכן בהסרת אותות בעוצמה נמוכה.

בהשוואה למבחני mIF המבוססים על הגברה מזורזת על ידי אנזימים, לבדיקה המודגמת כאן יש יכולת משופרת משמעותית לבצע ריבוב, בנוסף לזרימת עבודה פשוטה יותר וזמן ריצה קצר יותר בדרך כלל (איור 1). בבדיקה זו, נוגדנים מתווספים יחד בשלב אחד ומוגברים בו זמנית, מה שמפשט מאוד את פרוטוקול הבדיקה. יתר על כן, כמה טכנולוגיות מבוססות אנזימים, כגון הגברת אות טירמיד (TSA), יכולות להראות הפרעות בין נוגדנים שונים, במה שמכונה אפקט המטריה 12,17,18. טכנולוגיית ההגברה המשמשת כאן נמנעת מבעיה זו, ומאפשרת זיהוי של סמנים מרובים שעברו קו-לוקליזציה וביטוי משותף על אותו תא, כפי שניתן לראות באיור 4.

כ-90% ממקרי הסרטן בבני אדם נובעים מתאי אפיתל19. הסיבה לכך היא שלעתים קרובות הם מהווים את קו ההגנה הראשון מפני הסביבה החיצונית ומתרבים מהר יותר, מה שמוביל להצטברות מהירה יותר של מוטציות שעלולות להיות אונקוגניות. כאן, דלקת ממלאת תפקיד קריטי בגידול, התקדמות והפצה. במהלך העשור האחרון, טיפולים רבים המכוונים למעכבי מחסום חיסוני ותאים חיסוניים התגלו כארסנל רב עוצמה נגד סוגי גידולים רבים 5,20,21. עם זאת, חלק ניכר מהחולים עדיין לא מגיבים. סביר להניח שהמיקרו-סביבה של הגידול (TME) והנוף החיסוני המקומי ממלאים תפקיד קריטי. על ידי פרופיל חתימות מולקולריות של TME הקשורות לתגובה דיפרנציאלית לתרופות בקרב חולים רבים, ייתכן שניתן יהיה להגדיר טוב יותר סמנים ביולוגיים טיפוליים. דוח זה מדגים כי ניתן להשתמש בטכנולוגיית mIF כדי ליצור פרופיל של סמנים ביולוגיים מרובים של חלבונים במקביל, כולל סמנים עם ביטוי נמוך, על פני מאות שקופיות דגימה שלמות או מיקרו-מערכי גידולים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים K. H., A. Veith, L. D., D. W., G. C., Y. C., J. H. L. ו- A. Vasaturo הם עובדים של Ultivue, המייצרת את ערכות האימונופלואורסצנציה המולטיפלקס המשמשות בעבודה זו.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי Ultivue.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שיבוט אנטי-CD3UltivueBC33 (BioCare). חלק מ-ULT50801
Anti-CD4UltivueClone SP35 (Abcam). חלק משיבוט
אנטי-CD68UltivueULT50801 KP1 (BioCare). חלק משיבוט
אנטי-CD8UltivueULT50801 C8/144B (BioCare). חלק
אנטי-ציטוקרטין ULT50801 + אנטי-SOX10UltivueAE1/AE3 (Bethyl Labs) ו-BC34 (BioCare). חלק ULT50801, מסופק כתערובת
Anti-FOXP3UltivueClone 236A/E7 (תרמו). חלק מ-ULT50801
Anti-PD1UltivueClone CAL20 (Abcam). חלק מ-ULT50801
Anti-PDL1UltivueClone 73-10 (Abcam). חלק
ממיקרוסקופ ULT50801 Axioscan.Z1Zeissהנקרא מיקרוסקופ פלואורסצנטי בטקסט
Bond Dewax SolutionLeicaAR9222
Bond Epitope Retrieval Solution 2LeicaAR9640
Bond Open Containers, 30 מ"לLeicaOP309700
ערכת גילוי מחקר בונדLeicaDS9455
תוספות טיטרציה של בונדLeicaOPT9049
ערכת טיטרציהשל Leica LeicaOPT9719
Bond אוניברסלי CovertilesLeicaS21.4611
תמיסת שטיפת בונד 10x תרכיזLeicaAR9590
BondRX AutostainerLeicaנקרא "autostainer" בטקסט
תוכנתBondRXLeicaגרסה 6.0 ואילך
Coverslips, #1.5 עוביCorning2980-244
אתנול, 200 הוכחהVWR89370-084
FFPE רקמות גושי רקמותBioIVTמשתנים מבחן
OmniVUE 8-plex (CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3, PD-1, PD-L1, pan-Cytokeratin/SOX10)UltivueULT50801מכיל את כל שאר רכיבי Ultivue
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)Boston BioProductsC-9911F(pH 7.4 עם 2.7 מ"מ KCl ו-137 מ"מ NaCl)
ProLong Gold Antifade MountantThermoP10144נקרא "מדיום הרכבה" בטקסט
UltiAnalyzer.AIUltivue
UltiStacker.AIUltivue
Ultivue הגברה מאגרUltivueחלק מ-ULT50801
Ultivue נוגדנים מדללUltivueחלק מ-ULT50801
Ultivue Exchange BufferUltivueחלק מ-ULT50801
Ultivue Exchange InitiatorUltivueחלק מ-ULT50801
Ultivue Exchange NeutralizerUltivueחלק מ-ULT50801
Ultivue Fluorescent Probes 1Ultivueחלק מ-ULT50801
Ultivue Fluorescent Probes 2Ultivueחלק מ-ULT50801
Ultivue Pre-Amplification MixUltivueחלק מ-ULT50801
Ultivue Probe BufferUltivueחלק מ-ULT50801
UltrapureWater Sigma-AldrichW4502
משיבוטי, , , ,

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization. J Pathol. 254 (4), 405-417 (2021).
  2. Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Comm. 40 (4), 135-153 (2020).
  3. Huss, R., Schmid, C., Manesse, M., Thagaard, J., Maerkl, B. Immunological tumor heterogeneity and diagnostic profiling for advanced and immune therapies. Adv Cell Gene Ther. 4 (3), e113(2021).
  4. Singhal, S. K., et al. Kaiso (ZBTB33) subcellular partitioning functionally links LC3A/B, the tumor microenvironment, and breast cancer survival. Comm Biol. 4 (1), 1-13 (2021).
  5. Patil, N. S., et al. Intratumoral plasma cells predict outcomes to PD-L1 blockade in non-small cell lung cancer. Cancer Cell. 40 (3), 289-300.e4 (2022).
  6. Hong, D. S., et al. Autologous T cell therapy for MAGE-A4+ solid cancers in HLA-A*02+ patients: a phase 1 trial. Nat Med. 29 (1), 104-114 (2023).
  7. Robbins, C. J., et al. Multi-institutional Assessment of Pathologist Scoring HER2 Immunohistochemistry. Mod Pathol. 36 (1), 100032(2023).
  8. Ko, H., et al. Is HER2-Low a New Clinical Entity or Merely a Biomarker for an Antibody Drug Conjugate. Oncol Ther. 12 (1), 13-17 (2024).
  9. Fundytus, A., Booth, C. M., Tannock, I. F. How low can you go? PD-L1 expression as a biomarker in trials of cancer immunotherapy. Ann Oncol. 32 (7), 833-836 (2021).
  10. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An Introduction to Performing Immunofluorescence Staining. Method Mol Biol. 1897, 299-311 (2019).
  11. Sheng, W., et al. Multiplex Immunofluorescence: A Powerful Tool in Cancer Immunotherapy. Int Mol Sci. 24 (4), 3086(2023).
  12. Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. J ImmunoTher Cancer. 8 (1), e000155(2020).
  13. Myers, J. A review of automated slide stainers for immunohistochemistry and in situ hybridization. Medl Lab Obser. 40 (1), 41-44 (2008).
  14. Schwarze, J. K., et al. Intratumoral administration of CD1c (BDCA-1)+ and CD141 (BDCA-3)+ myeloid dendritic cells in combination with talimogene laherparepvec in immune checkpoint blockade refractory advanced melanoma patients: a phase I clinical trial. J ImmunoTher Cancer. 10 (9), e005141(2022).
  15. Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7 (1), 16878(2017).
  16. Koppel, C., et al. Optimization and validation of PD-L1 immunohistochemistry staining protocols using the antibody clone 28-8 on different staining platforms. Mod Pathol. 31 (11), 1630-1644 (2018).
  17. Parra, E. R., et al. Procedural Requirements and Recommendations for Multiplex Immunofluorescence Tyramide Signal Amplification Assays to Support Translational Oncology Studies. Cancers. 12 (2), 255(2020).
  18. Surace, M., et al. Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens. J Vis Exp. (143), e58390(2019).
  19. Hinck, L., Näthke, I. Changes in cell and tissue organization in cancer of the breast and colon. Curr Opin Cell Biol. 0, 87-95 (2014).
  20. Alturki, N. A. Review of the Immune Checkpoint Inhibitors in the Context of Cancer Treatment. J Clin Med. 12 (13), 4301(2023).
  21. Sun, Q., et al. Immune checkpoint therapy for solid tumours: clinical dilemmas and future trends. Signal Transduct Targeted Ther. 8 (1), 1-26 (2023).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNATMA

מאמרים קשורים