Method Article

מניפולציה של כוחות מכניים בלב דג הזברה המתפתח באמצעות חרוזים מגנטיים

DOI:

10.3791/67604

⸱

January 3rd, 2025

 ,  , 
1Department of Bioengineering, Imperial College London, 2The Francis Crick Institute, 3Institute of Advanced Medical Sciences, Tokushima University, 4Department of Cell Biology, National Cerebral and Cardiovascular Center Research Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתווה שיטה להשתלת חרוז מגנטי בלב דג הזברה המתפתח באמצעות מיקרו-כירורגיה, המאפשר מניפולציה של כוחות מכניים in vivo והפעלת זרם סידן תלוי גירוי מכני בתאים אנדוקרדיאלים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כוחות מכניים מספקים משוב רציף לתוכניות מורפוגנטיות של מסתם הלב. בדגי זברה, התפתחות מסתם הלב מסתמכת על התכווצות הלב וגירויים פיזיים הנוצרים על ידי הלב הפועם. המודינמיקה תוך-לבבית, המונעת על ידי זרימת הדם, מתגלה כמידע בסיסי המעצב את התפתחות הלב העוברי. במאמר זה אנו מתארים שיטה יעילה לתמרן כוחות מכניים in vivo על ידי השתלת חרוז מגנטי בקוטר 30 מיקרומטר עד 60 מיקרומטר בלומן הלב. החדרת החרוז מתבצעת באמצעות מיקרו-כירורגיה בזחלים מורדמים ללא הפרעה לתפקוד הלב ומאפשרת שינוי מלאכותי של תנאי הגבול ובכך לשנות את כוחות הזרימה במערכת. כתוצאה מכך, נוכחות החרוז מגבירה את הכוחות המכניים שחווים תאים אנדוקרדיאליים ויכולה להפעיל ישירות זרם סידן תלוי גירוי מכני. גישה זו מאפשרת לחקור מסלולי מכנוטרנסדוקציה השולטים בהתפתחות הלב ויכולה לספק תובנות לגבי תפקידם של כוחות מכניים במורפוגנזה של מסתם הלב.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאז הצגתו בסוף שנות השבעים1, דג הזברה (Danio rerio) התגלה כמערכת מודל רבת עוצמה לחקר המורכבות של התפתחות הלב והפרעות לב מולדות. בניגוד לרוב בעלי החוליות, כולל עוברי עכברים ואפרוחים, המסתמכים על מערכת לב וכלי דם מתפקדת ואינם יכולים לשרוד מומי לב מוקדמים, דגי זברה מספקים יתרון ייחודי בכך שהם מאפשרים חקירה של פנוטיפים חמורים של הלב. זאת בשל גודלם הקטן, המאפשר אספקת חמצן מספקת באמצעות דיפוזיה פסיבית, המאפשרת הישרדות גם בהיעדר התכווצות לב ומחזור דם פעיל 2,3,4. יתר על כן, בין התכונות המשמעותיות הרבות של דגי זברה היא....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נהלי העבודה עם עוברי דגי זברה המתוארים בפרוטוקול זה תואמים את הדירקטיבה האירופית 2010/63/EU ואת הנחיות משרד הפנים תחת PP6020928 רישיון הפרויקט.

1. השגת עוברים של דגי זברה להשתלת חרוזים

  1. חוצים את קו דגי הזברה הרלוונטיים ומגדלים את העוברים בתווך של דניאו בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס. לקבלת הוראות מפורטות יותר על חציית קווי דגי זברה, עיין במסד הנתונים לחינוך מדעי של JoVE27.
  2. טפל בעוברים עם 1-phenyl-2-thiourea (PTU) מ 24 שעות לאחר ההפריה (HPF) כדי לעכב היווצרות פיגמנט, באמצעות ריכוז של 0.003% PTU בתווך של Danieau.
  3. אם אתם משתמשים בקו מסומן פ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דוגמאות להשתלת חרוזים מוצלחת מוצגות באיור 3, וידאו 3 ווידאו 4. החרוז המגנטי מוקם כראוי בתוך האטריום של לב דג הזברה, ואיפשר זרימת דם ללא הפרעה וללא דימום שנצפה. נוסף על כך, קירות הלב שמרו על שלמותם המבנית מבלי להתמוטט (איור 3 ווידאו 3). לאחר 24 שעות, העובר לא הראה סימנים של בצקת קרום הלב, מה שמאשר עוד יותר את הצלחת הליך ההשתלה (וידאו 4).

אינדיקטורים אלה חיוניים להערכת .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלבים קריטיים בפרוטוקול ובפתרון בעיות

הרכבה של עוברי דגי זברה

כמות האגרוז המשמשת להרכבת העוברים חשובה. הכיפה שנוצרה לא צריכה להיות גדולה מדי, שכן זה יכול לעכב את המניפולציה של החרוז מפני השטח אל העוברים. לעומת זאת, זה לא צריך להיות קטן מדי; ריבוי חרוזים על גבי האגרוז, הממוקם קרוב לעוברים ולחלמון שלהם, עלול לגרום לבלבול. נפח של כ 350 μL מומלץ לכסות כראוי את העוברים תוך השארת כמה מילימטרים של.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לחברי מעבדת ורמוט על הדיונים וההערות על הפרוטוקול. אנו אסירי תודה לכל אנשי הצוות של מתקן הדגים אימפריאל קולג 'בלונדון. פרויקט זה קיבל מימון ממועצת המחקר האירופית (ERC) במסגרת תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי: GA N°682939, Additional Ventures (מספר פרס 1019496), MRC (MR/X019837/1) ו-BBSRC (BB/Y00566X/1). CV-P נתמך על ידי מלגה מחלקתית לביו-הנדסה (אימפריאל קולג 'לונדון). הקרן נתמכה על ידי JSPS KAKENHI (23H04726 ו- 24K02207), תוכנית JST FOREST (23719210), קרן הזיכרון אואהארה, הקרן לחקר מדעי התא, קרן המחקר הרפואי טקדה וקרן המחקר נוברטיס.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<חזק>חומרים
ציוד חיוני לגידול, גידול ואיסוף
צלחת עם תחתית זכוכית (35 מ"מ x 15  מ"מ)VWR International734-2905
בלוק חוםEppendorfEP5382000031Eppendorf ThermoMixer C
תכשיטנים מלקחייםSigma-AldrichF6521-1EADumont No. 5, L 4 1/4 אינץ', צינורות מיקרוצנטריפוגה מסגסוגת Inox
2 מ"לEppendorf30120094
Pasteur פיפטה
פטרי צלחת
סטריאומיקרוסקופ
<חזק>ריאגנטים
4 מ"ג/מ"ל תמיסת
המדיום של דניאו (תמיסת מלאי פי 60)
PureCube Glutathione MagBeadsCube Biotech32201
PTU (1-פניל-2-תיאוריאה)Sigma-AldrichP7629
UltraPure נקודת התכה נמוכה אגרוזInvitrogen16520-050
<חזק>בינוני של דניאו (תמיסת מלאי 60x)
34.8 גרם NaClSigma-AldrichS3014
1.6 גרם KClSigma-AldrichP9541
5.8 גרם CaCl2· 2H2Oסיגמא-אולדריץ'C3306
9.78 גרם MgCl2· 6H2O Sigma-Aldrich442611-M
ממיסים את החומרים ב-H2O לנפח סופי של 2 L. התאימו את ה-pH ל-7.2 באמצעות NaOH, ולאחר מכן חיטוי.
<חזק>4 מ"ג/מ"ל תמיסת מלאי טריקאין
400 מ"ג של אבקת טריקאין (מלח אתיל 3-אמינובנזואט מתאן סולפונט)Sigma-AldrichA5040
97.9 מ"ל מזוקק כפול H2O
2.1 מ"ל 1 M Tris (pH 9)
התאם את ה-pH ל-7, ולאחר מכן הוצא ואחסן ב-20 מעלות צלזיוס.
עוברים של דג זברהמלאי טריקאין

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
  2. Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Zebrafish HeartMechanical ForcesMagnetic BeadsHeart Valve DevelopmentCardiac MorphogenesisMechanotransduction PathwaysCalcium InfluxOptical ImagingMicrosurgeryCardiac Hemodynamics

Related Articles