הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מניפולציה של כוחות מכניים בלב דג הזברה המתפתח באמצעות חרוזים מגנטיים

6.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67604

⸱

3 בינואר 2025

 ,  , 
1Department of Bioengineering, Imperial College London, 2The Francis Crick Institute, 3Institute of Advanced Medical Sciences, Tokushima University, 4Department of Cell Biology, National Cerebral and Cardiovascular Center Research Institute

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתווה שיטה להשתלת חרוז מגנטי בלב דג הזברה המתפתח באמצעות מיקרו-כירורגיה, המאפשר מניפולציה של כוחות מכניים in vivo והפעלת זרם סידן תלוי גירוי מכני בתאים אנדוקרדיאלים.

תקציר

כוחות מכניים מספקים משוב רציף לתוכניות מורפוגנטיות של מסתם הלב. בדגי זברה, התפתחות מסתם הלב מסתמכת על התכווצות הלב וגירויים פיזיים הנוצרים על ידי הלב הפועם. המודינמיקה תוך-לבבית, המונעת על ידי זרימת הדם, מתגלה כמידע בסיסי המעצב את התפתחות הלב העוברי. במאמר זה אנו מתארים שיטה יעילה לתמרן כוחות מכניים in vivo על ידי השתלת חרוז מגנטי בקוטר 30 מיקרומטר עד 60 מיקרומטר בלומן הלב. החדרת החרוז מתבצעת באמצעות מיקרו-כירורגיה בזחלים מורדמים ללא הפרעה לתפקוד הלב ומאפשרת שינוי מלאכותי של תנאי הגבול ובכך לשנות את כוחות הזרימה במערכת. כתוצאה מכך, נוכחות החרוז מגבירה את הכוחות המכניים שחווים תאים אנדוקרדיאליים ויכולה להפעיל ישירות זרם סידן תלוי גירוי מכני. גישה זו מאפשרת לחקור מסלולי מכנוטרנסדוקציה השולטים בהתפתחות הלב ויכולה לספק תובנות לגבי תפקידם של כוחות מכניים במורפוגנזה של מסתם הלב.

מבוא

מאז הצגתו בסוף שנות השבעים1, דג הזברה (Danio rerio) התגלה כמערכת מודל רבת עוצמה לחקר המורכבות של התפתחות הלב והפרעות לב מולדות. בניגוד לרוב בעלי החוליות, כולל עוברי עכברים ואפרוחים, המסתמכים על מערכת לב וכלי דם מתפקדת ואינם יכולים לשרוד מומי לב מוקדמים, דגי זברה מספקים יתרון ייחודי בכך שהם מאפשרים חקירה של פנוטיפים חמורים של הלב. זאת בשל גודלם הקטן, המאפשר אספקת חמצן מספקת באמצעות דיפוזיה פסיבית, המאפשרת הישרדות גם בהיעדר התכווצות לב ומחזור דם פעיל 2,3,4. יתר על כן, בין התכונות המשמעותיות הרבות של דגי זברה היא השקיפות האופטית של עובריהם, המאפשרת ניטור לא פולשני של הלב המתפתח 5,6,7,8.

כוחות מכניים מספקים משוב רציף לתוכניות מורפוגנטיות של מסתם הלב 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 וזרימת דם חריגה מוכרת באופן נרחב כגורם משותף להפרעות לב וכלי דם שונות23,24., בדגי זברה, התפתחות מסתם הלב מסתמכת על התכווצות הלב וכוחות מכניים הנוצרים על ידי הלב הפועם. מוטנטים רבים של דגי זברה הדגימו את חשיבותם של גירויים מכניים הנוצרים על ידי הלב בואלולוגנזה. למרבה הפלא, היעדר מוחלט של התכווצות הלב, וכתוצאה מכך, זרימת הדם עקב מוטציות של טרופונין T (tnnt2) בלב שקט (sih) מוטציות גורם להיעדר התכנסות רקמות וקיבוץ תאים אנדוקרדיאליים (EdC) במהלך השלבים המורפוגנטיים המוקדמים25.

המודינמיקה תוך-לבבית וכוחות מכניים הנוצרים על ידי זרימת הדם מופיעים כמרכיבים אפיגנטיים בסיסיים המעצבים את התפתחות הלב העוברי של דג הזברה. מחקרים רבים מצביעים על כך שמורפוגנזה לבבית תקינה בדגי זברה דורשת גירויי זרימה ברורים, וסטיות מהדפוסים הפיזיולוגיים הללו מובילות למומים במסתמי הלב 10,13,14,22,26. במאמר זה אנו מתארים שיטה יעילה, שאומצה מ-Fukui et al.13, לתמרן כוחות מכניים in vivo על ידי השתלת חרוז מגנטי בקוטר 30 מיקרומטר עד 60 מיקרומטר בתוך הלב הפועם של דג הזברה המתפתח. הטכניקה כוללת החדרה מיקרוכירורגית של חרוז לתוך לומן הלב של זחלים מורדמים מבלי להפריע לתפקוד הלב. נוכחותו של החרוז מובילה להגברת הכוחות המכניים שחווים EdCs, ומפעילה ישירות זרם סידן תלוי גירוי מכני13. גישה זו מאפשרת לחקור מסלולים מכנוטרנסדוקטיביים המווסתים מורפוגנזה של הלב ומציעה אמצעי להעמקת הבנתנו את תפקידם של כוחות מכניים ביצירת מסתמים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

נהלי העבודה עם עוברי דגי זברה המתוארים בפרוטוקול זה תואמים את הדירקטיבה האירופית 2010/63/EU ואת הנחיות משרד הפנים תחת PP6020928 רישיון הפרויקט.

1. השגת עוברים של דגי זברה להשתלת חרוזים

  1. חוצים את קו דגי הזברה הרלוונטיים ומגדלים את העוברים בתווך של דניאו בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס. לקבלת הוראות מפורטות יותר על חציית קווי דגי זברה, עיין במסד הנתונים לחינוך מדעי של JoVE27.
  2. טפל בעוברים עם 1-phenyl-2-thiourea (PTU) מ 24 שעות לאחר ההפריה (HPF) כדי לעכב היווצרות פיגמנט, באמצעות ריכוז של 0.003% PTU בתווך של Danieau.
  3. אם אתם משתמשים בקו מסומן פלואורסצנטית, בדקו את העוברים תחת סטריאוסקופ פלואורסצנטי לפני תחילת השתלת החרוזים, ובחרו 10-20 עוברים בריאים המציגים פלואורסצנטיות בהירה. יש לנטרל בעדינות את העוברים שנבחרו מראש מתחת לסטריאומיקרוסקופ באמצעות מלקחיים, כדי להבטיח שהעוברים לא יינזקו.

2. הרכבה של עוברי דגי זברה

  1. הכינו 20 מ"ל של מדיום Danieau המכיל 0.02% טריקאין.
  2. הכינו 2 מ"ל aliquots של 1% נקודת התכה נמוכה (LMP) agarose המכיל 0.02% tricaine ב 2 מ"ל צינורות microcentrifuge. הניחו את הצינורות בבלוק חום של 38 מעלות צלזיוס כדי לשמור על אגרוז LMP במצב נוזלי.
    הערה: ניתן להכין מראש את אגרוז LMP 1% לשימוש ביום ההרכבה וחריפת החרוזים.
  3. העבירו 3-6 עוברים דכוריוניים לצלחת פטרי המכילה את המדיום של דניו בתוספת 0.02% טריקאין.
  4. כאשר העוברים מורדמים, מעבירים אותם לצלחת זכוכית בגודל 35 מ"מ x 15 מ"מ עם תווך מינימלי. הוסף במהירות 300-400 μL של 1% LMP agarose המכיל טריקאין כדי ליצור כיפה. באמצעות מלקחיים, מקמו את העוברים כך שהם ישכבו ישרים, במגע עם הזכוכית, כשהצד הגחוני פונה כלפי מעלה, כפי שמוצג באיור 1. המתן ~ 4 דקות עד שהאגרוז יתמצק.
    הערה: כמות האגרוז המשמשת להרכבת עוברים חשובה מאוד. יש לכוון לכיפה של כ-350 מיקרוליטר, אשר אמורה לספק כיסוי מספיק תוך השארת מרווח של כמה מילימטרים מעל העוברים. למתחילים, הרכבת מספר קטן יותר של עוברים בכל פעם עשויה להיות גישה בטוחה יותר.

3. השתלת חרוזים

  1. לאחר האגרוז הוא מוצק, להפקיד כ 0.5 μL של חרוזים מגנטיים על גבי.
    הערה: השתמש בקצה פיפטה של 10 μL כדי להעביר את החרוזים המגנטיים. מדידה מדויקת של 0.5 μL אינה הכרחית, שכן החרוזים מרוכזים מאוד בהשעיה. פשוט להכניס את הקצה לתוך הבקבוקון לאחר מסתובב יהיה מספיק כדי לאסוף כמות מספקת של חרוזים.
  2. הוסיפו טיפה של המדיום של דניאו המכיל 0.02% טריקאין על גבי האגרוז והחרוזים.
  3. בחר את החרוז המתאים.
    הערה: שלב זה הוא קריטי. גודל החרוזים יכול להשתנות מעט, החל מקוטר של 30 מיקרומטר ועד 60 מיקרומטר, ולכן בחירת החרוז המתאים לפי עין, בהתבסס על הדגימה וגודל הלב, היא חיונית.
  4. לאחר בחירת החרוז המתאים, השתמשו בפינצטה כדי להניח אותו על גבי החלמון (איור 2A ווידאו 1).
  5. צרו נגע חלמון או "חור" במרכז החלמון באמצעות זרוע אחת של הפינצטה (איור 2B ווידאו 2).
    הערה: עומק הנגע לא צריך לחדור עמוק מדי לתוך החלמון; זה צריך להיות בערך ברמה עם הווריד הקרדינלי. קוטר החור שנוצר יתאים לקצה זרוע הפינצטה. ודא שהנגע נעשה בחלמון והימנע ממגע עם הוורידים הקרדינליים על ידי כיוון מתחתם. כמות קטנה של חלמון בדרך כלל תצא כאשר החור נוצר.
  6. הכניסו את החרוז לנגע שנוצר בשלב 3.5 ודחפו אותו בעדינות קדימה עד שהוא מגיע לקוטב הוורידי. שם, התכווצויות הלב ייצרו יניקה, וימשכו את החרוז לתוך לומן הלב (איור 2 ווידאו 2).
    הערה: דופן הווריד נפרצת במהלך החדרת החרוזים, והצפיפות הגבוהה של החלמון מסייעת למזער דימום נרחב. נגע החלמון נרפא בדרך כלל תוך מספר דקות לאחר החדרת החרוז. עוברים מסוימים עשויים להציג בצקת קרום הלב 20-24 שעות לאחר השתלת חרוזים.

4. פירוק עוברים של דגי זברה

  1. לאחר השתלת חרוזים מגנטיים בכל העוברים המותקנים יש להוסיף 1-2 מ"ל של המדיום של דניאו המכיל PTU בצלחת תחתית הזכוכית.
  2. באמצעות פינצטה, בעדינות לשבור את האגרוז LMP בזהירות להסיר את הדג, להבטיח כי לא נשאר agarose עליהם.
  3. בעזרת פיפטה של פסטר, מעבירים את העוברים לצלחת פטרי חדשה המכילה את התווך של דניאו עם PTU ומאפשרים להם להתאושש ולהתפתח ב-28.5 מעלות צלזיוס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

דוגמאות להשתלת חרוזים מוצלחת מוצגות באיור 3, וידאו 3 ווידאו 4. החרוז המגנטי מוקם כראוי בתוך האטריום של לב דג הזברה, ואיפשר זרימת דם ללא הפרעה וללא דימום שנצפה. נוסף על כך, קירות הלב שמרו על שלמותם המבנית מבלי להתמוטט (איור 3 ווידאו 3). לאחר 24 שעות, העובר לא הראה סימנים של בצקת קרום הלב, מה שמאשר עוד יותר את הצלחת הליך ההשתלה (וידאו 4).

אינדיקטורים אלה חיוניים להערכת ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שלבים קריטיים בפרוטוקול ובפתרון בעיות

הרכבה של עוברי דגי זברה

כמות האגרוז המשמשת להרכבת העוברים חשובה. הכיפה שנוצרה לא צריכה להיות גדולה מדי, שכן זה יכול לעכב את המניפולציה של החרוז מפני השטח אל העוברים. לעומת זאת, זה לא צריך להיות קטן מדי; ריבוי חרוזים על גבי האגרוז, הממוקם קרוב לעוברים ולחלמון שלהם, עלול לגרום לבלבול. נפח של כ 350 μL מומלץ לכסות כראוי את העוברים תוך השארת כמה מילימטרים של...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

תודות

אנו מודים לחברי מעבדת ורמוט על הדיונים וההערות על הפרוטוקול. אנו אסירי תודה לכל אנשי הצוות של מתקן הדגים אימפריאל קולג 'בלונדון. פרויקט זה קיבל מימון ממועצת המחקר האירופית (ERC) במסגרת תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי: GA N°682939, Additional Ventures (מספר פרס 1019496), MRC (MR/X019837/1) ו-BBSRC (BB/Y00566X/1). CV-P נתמך על ידי מלגה מחלקתית לביו-הנדסה (אימפריאל קולג 'לונדון). הקרן נתמכה על ידי JSPS KAKENHI (23H04726 ו- 24K02207), תוכנית JST FOREST (23719210), קרן הזיכרון אואהארה, הקרן לחקר מדעי התא, קרן המחקר הרפואי טקדה וקרן המחקר נוברטיס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>חומרים
ציוד חיוני לגידול, גידול ואיסוף
צלחת עם תחתית זכוכית (35 מ"מ x 15  מ"מ)VWR International734-2905
בלוק חוםEppendorfEP5382000031Eppendorf ThermoMixer C
תכשיטנים מלקחייםSigma-AldrichF6521-1EADumont No. 5, L 4 1/4 אינץ', צינורות מיקרוצנטריפוגה מסגסוגת Inox
2 מ"לEppendorf30120094
Pasteur פיפטה
פטרי צלחת
סטריאומיקרוסקופ
<חזק>ריאגנטים
4 מ"ג/מ"ל תמיסת
המדיום של דניאו (תמיסת מלאי פי 60)
PureCube Glutathione MagBeadsCube Biotech32201
PTU (1-פניל-2-תיאוריאה)Sigma-AldrichP7629
UltraPure נקודת התכה נמוכה אגרוזInvitrogen16520-050
<חזק>בינוני של דניאו (תמיסת מלאי 60x)
34.8 גרם NaClSigma-AldrichS3014
1.6 גרם KClSigma-AldrichP9541
5.8 גרם CaCl2· 2H2Oסיגמא-אולדריץ'C3306
9.78 גרם MgCl2· 6H2O Sigma-Aldrich442611-M
ממיסים את החומרים ב-H2O לנפח סופי של 2 L. התאימו את ה-pH ל-7.2 באמצעות NaOH, ולאחר מכן חיטוי.
<חזק>4 מ"ג/מ"ל תמיסת מלאי טריקאין
400 מ"ג של אבקת טריקאין (מלח אתיל 3-אמינובנזואט מתאן סולפונט)Sigma-AldrichA5040
97.9 מ"ל מזוקק כפול H2O
2.1 מ"ל 1 M Tris (pH 9)
התאם את ה-pH ל-7, ולאחר מכן הוצא ואחסן ב-20 מעלות צלזיוס.
עוברים של דג זברהמלאי טריקאין

מקורות

  1. Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
  2. Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84 (1), 4-16 (2012).
  3. Stainier, D. Y. Zebrafish genetics and vertebrate heart formation. Nat Rev Genet. 2 (1), 39-48 (2001).
  4. Brown, D. R., Samsa, L. A., Qian, L., Liu, J. Advances in the study of heart development and disease using zebrafish. J Cardiovasc Dev Dis. 3 (2), 13(2016).
  5. Hoo, J. Y., Kumari, Y., Shaikh, M. F., Hue, S. M., Goh, B. H. Zebrafish: A versatile animal model for fertility research. Biomed Res Int. 2016 (2016), 9732780(2016).
  6. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91 (2), 279-288 (2011).
  7. Briggs, J. P. The zebrafish: a new model organism for integrative physiology. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 282 (1), R3-R9 (2002).
  8. Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
  9. Duchemin, A. L., Vignes, H., Vermot, J. Mechanically activated piezo channels modulate outflow tract valve development through the Yap1 and Klf2-Notch signaling axis. Elife. 8, e44706(2019).
  10. Vignes, H., et al. Extracellular mechanical forces drive endocardial cell volume decrease during zebrafish cardiac valve morphogenesis. Dev Cell. 57 (5), 598-609.e595 (2022).
  11. Steed, E., et al. klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis. Nat Commun. 7, 11646(2016).
  12. Chow, R. W., et al. Cardiac forces regulate zebrafish heart valve delamination by modulating Nfat signaling. PLoS Biol. 20 (1), e3001505(2022).
  13. Fukui, H., et al. Bioelectric signaling and the control of cardiac cell identity in response to mechanical forces. Science. 374 (6565), 351-354 (2021).
  14. Vignes, H., Vagena-Pantoula, C., Vermot, J. Mechanical control of tissue shape: Cell-extrinsic and -intrinsic mechanisms join forces to regulate morphogenesis. Semin Cell Dev Biol. 130, 45-55 (2022).
  15. Juan, T., et al. Multiple pkd and piezo gene family members are required for atrioventricular valve formation. Nat Commun. 14 (1), 214(2023).
  16. Juan, T., et al. Control of cardiac contractions using Cre-lox and degron strategies in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (3), e2309842121(2024).
  17. Duchemin, A. L., Vignes, H., Vermot, J., Chow, R. Mechanotransduction in cardiovascular morphogenesis and tissue engineering. Curr Opin Genet Dev. 57, 106-116 (2019).
  18. Kalogirou, S., et al. Intracardiac flow dynamics regulate atrioventricular valve morphogenesis. Cardiovasc Res. 104 (1), 49-60 (2014).
  19. da Silva, A. R., et al. egr3 is a mechanosensitive transcription factor gene required for cardiac valve morphogenesis. Sci Adv. 10 (20), eadl0633(2024).
  20. Bartman, T., et al. Early myocardial function affects endocardial cushion development in zebrafish. PLoS Biol. 2 (5), E129(2004).
  21. Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis. Biochim Biophys Acta. 1863 (7 Pt B), 1760-1766 (2016).
  22. Vermot, J., et al. Reversing blood flows act through klf2a to ensure normal valvulogenesis in the developing heart. PLoS Biol. 7 (11), e1000246(2009).
  23. Bäck, M., Gasser, T. C., Michel, J. B., Caligiuri, G. Biomechanical factors in the biology of aortic wall and aortic valve diseases. Cardiovasc Res. 99 (2), 232-241 (2013).
  24. Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 53-62 (2009).
  25. Boselli, F., Steed, E., Freund, J. B., Vermot, J. Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart. Development. 144 (23), 4322-4327 (2017).
  26. Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
  27. JoVE Science Education database. Biology II: Mouse, zebrafish, and chick. Zebrafish breeding and embryo handling. JoVE. , (2023).
  28. Arrenberg, A. B., Stainier, D. Y., Baier, H., Huisken, J. Optogenetic control of cardiac function. Science. 330 (6006), 971-974 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

התפתחות מסתמי הלבמורפוגנזה של הלבנתיבי העברה מכנית (Mechanotransduction)זרימת סידןדימות אופטימיקרו-כירורגיההמודינמיקה של הלב
מניפולציה של כוחות מכניים בלב דג הזברה המתפתח באמצעות חרוזים מגנטיים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.