מאמר שיטה

הערכת איתות מוות תאי על ידי אימונופלואורסצנציה במודל חולדה של שבץ איסכמי

1.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67606

⸱

3 בינואר 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Physiology, West China School of Basic Medical Sciences and Forensic Medicine, Sichuan University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מודלים של חולדה in vivo הם כלים הכרחיים לחקירת המנגנונים הפתולוגיים והמטרות הטיפוליות לשבץ איסכמי. עבודה זו תתאר ביצוע צביעה אימונופלואורסצנטית בפרוסות מוח עם אוטם לאחר חסימת עורק המוח האמצעי (MCAO) בחולדות.

תקציר

שבץ מוחי הוא גורם מוביל למוות ונכות ברחבי העולם. רוב מקרי השבץ הם איסכמיים ונובעים מחסימה של עורק המוח האמצעי (MCA). הגישות הפרמקולוגיות הנוכחיות לטיפול בשבץ איסכמי מוגבלות; לכן, יש צורך דחוף בטיפולים חדשניים המספקים הגנה עצבית יעילה מפני פגיעה איסכמית לאחר שבץ מוחי. ברקמת המוח לאחר שבץ איסכמי, אזור הפנומברה האיסכמית ניתן להצלה אך נמצא בסיכון להתקדמות לנזק בלתי הפיך. האזור הפנומברלי המקיף את הליבה האוטמת הוא יעד רעיוני להגנה עצבית. מכיוון שזרימת הדם נשמרת חלקית באזור הפנומברלי, תאים עצביים ולא עצביים באזור זה שורדים באופן זמני לאחר שבץ מוחי, ותאים אלה שעדיין ברי קיימא עשויים להינצל על ידי התערבויות רפואיות מתאימות. הבנת הפתופיזיולוגיה של הפנומברה חשובה בפיתוח טיפולים נוירו-פרוטקטיביים מכיוון שמסלולי המוות התאי המופעלים בפנומברה האיסכמית עשויים להצביע על מטרות טיפוליות, כגון RUNX1 וקטפסינים. מטרות חלבון אלה המתפקדות כמתווכים של מוות תאי מתוכנת יכולות להיות מנוצלות עוד יותר במחקר תרגומי. עם גודל בינוני ודמיון למוח האנושי, מודל החולדה in vivo של חסימת MCA (MCAO) מחקה את השבץ האיסכמי האנושי ומציע כלי ישים לחקירת הפתולוגיה הפנומברלית, בחינת איתות המוות התאי והערכת ההשפעות של מטרות פוטנציאליות בהקשר של MCAO. כאן, אנו מתארים כיצד לגרום ל-MCAO בחולדות וכיצד לבצע צביעה אימונופלואורסצנטית לזיהוי איתות מוות תאי במוח החולדה בעקבות MCAO.

מבוא

שבץ מוחי הוא גורם מוביל למוות ונכות ברחבי העולם1. התמותה והתחלואה הגבוהות של שבץ מוחי גורמות לנטל עצום על בריאות הציבור ולהשלכות סוציו-אקונומיות חמורות. למרות ששיעור ההיארעות והתמותה של שבץ מוחי נותר יציב, מספר חולי השבץ ומקרי המוות הקשורים לשבץ מוחי גדל לאורך עשרות שנים 2,3. ניתן לסווג שבץ מוחי כאיסכמי או דימומי. רוב מקרי השבץ הם שבץ איסכמי הנגרם על ידי חסימה של עורק מוחי ראשי4. נכון להיום, מפעיל פלסמינוגן רקמות (tPA) היא התרופה היחידה שאושרה על ידי ה-FDA לשבץ איסכמי, אך יישומה מוגבל מאוד על ידי חלון הטיפול הצר, סיבוכים והתוויות נגד 5,6,7. לפיכך, דחוף לפתח אפשרויות טיפול חדשות עם חלון טיפולי רחב יותר כדי להפחית את השפעות השבץ.

מודלים ניסיוניים של חיות הם כלים שימושיים לחקר הפתופיזיולוגיה של שבץ איסכמי. ברוב החולים האנושיים, שבץ איסכמי נגרם על ידי חסימה של עורק המוח האמצעי (MCA)8. לכן, מודלים של מכרסמים של חסימת עורק המוח האמצעי (MCAO) פותחו כדי להידמות לאוטם מוחי אנושי. בעוד שישנן מספר גישות MCAO המשמשות במחקרים בבעלי חיים קטנים, השיטה הנפוצה ביותר היא מודל התפר התוך-לומינלי, הכולל החדרת חוט ניילון לעורק המוח האמצעי מעורקי הצוואר החיצוניים או הפנימיים, וכתוצאה מכך חסימה חולפת או קבועה של זרימת הדם 4,9. מודל זה מוביל לנפח גדול של אוטם מוחי ומאפשר בחינה של איתות מוות תאי ברקמת המוח האוטם בטכניקות אימונו-פלואורסצנטיות.

האזור המקיף את הליבה האוטמת, המכונה פנומברה, הוא היעד לטיפולי שבץ פוטנציאליים10,11. מכיוון שזרימת הדם בפנומברה נשמרת חלקית, ניתן להציל נוירונים פגועים ותאים לא עצביים באזור זה על ידי עיכוב הפעלת איתות מוות תאי. התמקדות במסלולי מוות תאי עשויה להיות אסטרטגיה מבטיחה להגנה עצבית לאחר שבץ12. לכן, הערכת איתות מוות תאי היא חיונית למחקר שבץ ניסיוני. לאחרונה, הוכח כי קטפסין-B, פרוטאז ליזוזומלי, ממלא תפקיד בתיווך מוות תאי מתוכנת לאחר שבץ מוחי, והוא זכה לתשומת לב משמעותית בתחום הנוירולוגי13. קטפסין-B מייצג מטרה פוטנציאלית להגנה עצבית הראויה למחקר נוסף.

מאמר זה מדגים כיצד לגרום ל-MCAO באמצעות גישת התפר התוך-לומינלי בחולדות. אנו מראים גם כיצד לבצע צביעה של 2,3,5-triphenyltetrazalium chloride (TTC) כדי לקבוע את גודל האוטם ולזהות תאים אפופטוטיים באמצעות צביעת Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling (TUNEL).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה והניסויים המדווחים כאן אושרו על ידי ועדת האתיקה הרפואית של אוניברסיטת סצ'ואן. הטיפול והשימוש בבעלי חיים היו בהתאם לקריטריונים אתיים מקומיים ובינלאומיים.

הערה: במחקר זה נעשה שימוש בחולדות Sprague-Dawley זכרים בוגרים במשקל 250-280 גרם. החולדות שוכנו בתנאים סביבתיים סטנדרטיים (טמפרטורה של 20-22 מעלות צלזיוס, מחזור אור/חושך של 12 שעות), והוזנו בתזונה סטנדרטית של פורמולה לחולדות ומים בטוהר גבוה. ההליך הכירורגי בוצע בתנאים סטריליים.

1. דגם עכברוש של MCAO

  1. לגרום להרדמה ראשונית באמצעות איזופלורן 4% עם חמצן ב-1 ליטר לדקה. עקוב אחר עומק ההרדמה על ידי צביטת כף הרגל. בזמן שההרדמה מושגת, יש לתת משחה לעיניים למניעת יובש. יש להזריק לחולדה 1 מ"ל מי מלח תת עורית כחידוש נפח ועם 5 מ"ג/ק"ג קרפרופן ו-0.1 מ"ג/ק"ג בופרנורפין לשיכוך כאבים לפני הניתוח. הפחתת איזופלורן ל-3.5% בהתחלה ולאחר מכן ל-2% בהדרגה במהלך הניתוח.
  2. הנח את החולדה במצב שכיבה ושמור על טמפרטורת הגוף על 36.5 ± 0.1 מעלות צלזיוס על שטיח חום מווסת עם בדיקת ניטור טמפרטורת פי הטבעת. לגלח ולחטא את העור בצוואר בעזרת תמיסת חיטוי יודופור.
  3. בצע חתך בקו האמצע של 2 ס"מ בצוואר והחזיר את הרקמות הרכות כדי לחשוף את כלי הצוואר. השתמש במלקחיים כדי לבודד את עורק הצוואר המשותף הימני (CCA), עורק הצוואר החיצוני (ECA) ועורק הצוואר הפנימי (ICA).
  4. השתמש בתפרים כדי לקשור את ה-CCA הימני הפרוקסימלי ולהדק את ה-ICA וה-ECA הימניים עם מיקרו-קליפ במקורם.
  5. הכנס מונופילמנט ניילון מצופה בקצה סיליקון עגול ללומן של ה-CCA דרך חתך קטן וקשר קשר ב-CCA כדי למנוע דימום ותזוזה של מונופילמנט הניילון.
  6. פתח את המיקרו-קליפ הימני של ICA והכנס את מונופילמנט הניילון לעורק המוח האמצעי הימני (MCA) דרך גדם ה-ICA עד שקצה הסיליקון חוסם את מקור ה-MCA (~18-20 מ"מ).
  7. חותכים את החלק החשוף של מונופילמנט הניילון וסוגרים את חתך קו האמצע של הצוואר.
  8. לאחר חסימה של שעתיים של MCA, פתח את חתך הצוואר ושחרר את הקשר ב-CCA. לאחר מכן משוך את מונופילמנט הניילון כדי להחזיר את ה-MCA. קשרו את ה-CCA הימני הדיסטלי, וסגרו את חתך הצוואר עם תפרים רציפים או קטועים.
  9. לאחר הניתוח, יש לתת בופרנורפין בזריקה תת עורית כל 8 שעות, במינון של 0.03 מ"ג/ק"ג. התבונן בחולדות לאורך כל ההתאוששות מההרדמה בכלוב מחומם עם מחצלת חימום מווסתת טמפרטורה. כדי לעודד אכילה, הניחו צלחת פטרי עם פירה צ'או בכלוב. אכלס חולדה אחת לכל כלוב לאחר הניתוח.
  10. הכפיף את חולדות הדמה לאותו הליך ללא החדרת מונופילמנט.
    הערה: בסך הכל משתמשים ב-9 בעלי חיים בכל קבוצה למדידת גודל האוטם (n = 3), ניתוח אימונופלואורסצנטי (n = 3) וזיהוי אפופטוזיס (n = 3).
  11. העריכו את התפקוד הנוירולוגי לאחר שעתיים לאחר MCAO ו-22 שעות לאחר רפרפוזיה באמצעות סולם דירוג התנהגותי של Zea-Longa עם סולם 0-5 נקודות14. אל תכלול תעריפים עם ציון 0 או 4.

2. מדידת גודל האוטם (איור 1)

  1. הקריבו חולדות בהרדמה עמוקה (4% איזופלורן) על ידי גיליוטינה ובודדו בזהירות את כל המוח מהגולגולת.
  2. מקפיאים את המוח בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות וחותכים את המוח הקפוא לשש פרוסות עטרה עם מרחק של 2 מ"מ בין פרוסות. צבעו את פרוסות המוח ב-2% TTC למשך 15 דקות ב-37 מעלות צלזיוס בחושך.
  3. תקן פרוסות מוח עם 4% פרפורמלדהיד למשך 24 שעות בטמפרטורת החדר (RT). צלם את הפרוסות המוכתמות במצלמה דיגיטלית, עם הגדרת מצב אוטומטי לאובייקטים תקריב.
  4. העבירו את התמונות למחשב ומדדו את גודל האוטם באמצעות ImageJ. הציגו את גודל האוטם כיחס בין סכום אזור האוטם ב-6 פרוסות לסכום כל אזור המוח באותן פרוסות. בטא נתונים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM).

3. ניתוח אימונופלואורסצנטי על קריוסקציה של המוח (איור 2)

  1. לגרום להרדמה עם איזופלורן 4% וחמצן 1 ליטר לדקה. חותכים את העור ואת הרקמה התת עורית כדי לחשוף את הלב.
  2. הסר את קרום הלב ובצע חתך קטן באטריום הימני. הזרמת 200 מ"ל של מי מלח דרך החדר השמאלי, ואחריו 200 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד.
  3. פתח את הגולגולת והסר את המוח השלם.
  4. קבעו את המוח ב-4% פרפורמלדהיד ב-RT למשך יותר מ-24 שעות. לאחר מכן, יש לייבש אותו בסדרה של שיפועי תמיסת סוכרוז בריכוזים של 10%, 15% ו-30% עד שהרקמה שוקעת, כ-6-8 שעות לכל ריכוז.
  5. הטמיעו את המוח בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) והסירו בועות אוויר אם ישנן כאלה. לאחר מכן, הקפיאו את המוח בחנקן נוזלי ואחסנו אותו במקפיא של -80 מעלות צלזיוס.
  6. חתכו את המוח באמצעות קריוסטט בעובי של 5 מיקרומטר. לאורך כל החיתוך, ודא שטמפרטורת הארון נשארת בין -18 מעלות צלזיוס ל-20 מעלות צלזיוס. סמן את מיקום החיתוך על סמך אתר המודל ותנאי הניסוי. אחסן את החלקים במקפיא.
  7. אפשר לחלקים הקפואים להתייצב ב-RT למשך ~30 דקות כדי לבצע צביעה אימונופלואורסצנטית. לאחר מכן, יש להשרות את החלקים עם PBS סטרילי 3x למשך 5 דקות כל אחד.
  8. מתאר את הרקמה בעזרת עט אימונוהיסטוכימיה. דגירה עם 20 מיקרוגרם/מ"ל פרוטאינאז K (ללא RNase) ו-0.3% טריטון X-100 ב-RT למשך 10 דקות.
  9. משרים את החלקים עם PBS סטרילי 3x למשך 5 דקות כל אחד. יש למרוח 3% BSA על הרקמה המתוארת ולדגור ב-RT למשך שעה לחסימה.
  10. לאחר החסימה, יש להסיר את התמיסה, להוסיף את הנוגדן הראשוני המתאים (נוגדן קטפסין-B חד-שבטי רקומביננטי של ארנב, 1:200), ולדגור את החלקים למשך הלילה בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  11. הסר את הנוגדן העיקרי ושטוף את החלקים עם PBS סטרילי המכיל 0.1% Tween-20 3x למשך 5 דקות כל אחד.
  12. הוסף את הנוגדן המשני המתאים (Goat Anti-Rat IgG [H+L] [FITC conjugated], 1:200) עם הפלואורופור הנדרש, ודגר את החלקים בתא לח ב-RT למשך שעה, והגן עליהם מפני אור.
  13. לאחר דגירה משנית של נוגדנים, שטפו את החלקים עם PBS סטרילי המכיל 0.1% Tween-20 3x למשך 5 דקות כל אחד. מכתים את החלקים במדיום הרכבה המכיל DAPI ומכסים אותם בכיסוי.
  14. צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם ההגדרות הבאות: אורך גל עירור של 488 ננומטר, אורך גל פליטה של 520 ננומטר וזמן חשיפה של 500 אלפיות השנייה. אחסן את החלקים בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לשימור לטווח ארוך.

4. זיהוי אפופטוזיס על ידי צביעת TUNEL (איור 3)

הערה: ערכת בדיקת TUNEL מסחרית משמשת לצביעה של TUNEL. ערכת TUNEL זו כוללת פתרון עבודה של DNase I Buffer, מאגר שיווי משקל deoxynucleotidyl transferase (TdT), פתרון עבודה לתיוג ופתרון עבודה DAPI.

  1. לחלחל ולבודד את המוח באמצעות אותו הליך כמו לעיל (שלבים 3.2-3.3). טבלו את המוח ב-4% פרפורמלדהיד למשך 3-4 שעות לקיבוע.
  2. חותכים את המוח לפרוסות עטרה בעובי של כ-2 מ"מ, החל מהקצה הרוסטרלי ועד לקצה הזנב, וטובלים ב-4% פרפורמלדהיד למשך 12 שעות נוספות. לאחר הקיבוע יש לשטוף את פרוסות המוח במים זורמים למשך שעה.
  3. טבלו את פרוסות המוח בתמיסות אתנול בריכוזים של 50%, 70%, 80%, 90%, 95% ו-100% ברצף למשך 35-50 דקות כל אחת להתייבשות.
  4. טפלו בפרוסות המוח עם חומר ביולוגי שקוף מסוג TO-type I למשך 35-50 דקות, ולאחר מכן ניקוי חומר II למשך 35-50 דקות, עד שהרקמה שקופה לחלוטין.
  5. טבלו את פרוסות המוח ברצף בהטמעת מדיום I למשך 60 דקות, הטמעת מדיום II למשך 60 דקות, הטמעת מדיום III למשך 60 דקות והטמעת מדיום IV למשך 60 דקות.
  6. הניחו את פרוסות המוח בקלטת הטמעה. אטמו את הקסטה, סמנו אותה בבירור והניחו אותה בחדר אחסון קר להתמצקות.
  7. הגדר את המיקרוטום לעובי התחלתי של 10 מיקרומטר כדי לקצץ את גוש הרקמה. לאחר מכן, התאם את העובי ל -5 מיקרומטר לחיתוך.
  8. מחממים את אמבט המים ל-45 מעלות צלזיוס, מציפים את חלקי הרקמה על פני המים ומרימים אותם על מגלשות. לאחר כ-30 שניות, הסר את השקופיות, יבש אותן ב-RT ואחסן אותן בקופסת ייבוש.
  9. הפחיתו את חלקי המוח המאוחסנים על ידי טבילתם בחומר ניקוי למשך 2 מחזורים, 10 דקות כל אחד.
  10. כדי להחזיר את הלחות לחלקים, יש להשרות אותם באתנול נטול מים למשך 5 דקות, ולחזור על הפעולה 3 פעמים. העבירו את החלקים ל 90% אתנול למשך 3 דקות. יתר על כן, יש להשרות את החלקים באתנול 80% למשך 3 דקות. לבסוף, טבלו את החלקים באתנול 70% למשך 3 דקות.
  11. שוטפים את הדגימות ב-PBS 3x למשך 5 דקות כל אחת. הסר בעדינות עודף לחות באמצעות נייר פילטר.
  12. יש לתת 100 מיקרוליטר של תמיסת עבודה 1x פרוטאינאז K לכל דגימה ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר החדירה, שטפו את הדגימות ב-PBS 3x למשך 5 דקות כל אחת.
  13. הכן דגימות לבקרה חיובית.
    1. הוסף 100 מיקרוליטר של פתרון עבודה 1x DNase I Buffer (ערכת בדיקת TUNEL) לדגימה החדירה ואפשר לה להתאזן ב-RT למשך 5 דקות. הסר בזהירות את כל הנוזלים העודפים מהדגימה באמצעות נייר סופג.
    2. הוסף לדגימה 100 מיקרוליטר של תמיסת עבודה מדוללת של DNase I (200 U/mL) ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10-30 דקות. שוטפים את הדגימות ב-PBS 3x למשך 5 דקות כל אחת.
  14. הכן דוגמאות לבקרה שלילית.
    1. החל 100 מיקרוליטר של תמיסת עבודה 1x DNase I Buffer על הדגימה החדירה ושיווי משקל ב-RT למשך 5 דקות. דגרו את דגימת הבקרה השלילית עם DNase I Buffer ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10-30 דקות, והבטיחו שלא יתווסף אנזים DNase I. שוטפים את הדגימות ב-PBS 3x למשך 5 דקות כל אחת.
  15. החל 100 מיקרוליטר של מאגר שיווי משקל דאוקסי-נוקלאוטידיל טרנספראז (TdT) (ערכת בדיקת TUNEL) על כל דגימה ודגר בתא לח ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10-30 דקות. לאחר מכן, הסר את מאגר שיווי המשקל של TdT עם נייר סופג.
  16. הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת עבודה לתיוג (ערכת בדיקת TUNEL) לכל דגימה, ולאחר מכן דגר אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתא לח וחשוך למשך 60 דקות. אם עוצמת האות נמוכה, שקול להאריך את זמן התגובה של תיוג ה-DNA. לאחר מכן, שטפו את הדגימות ב-PBS 3x למשך 5 דקות כל אחת.
  17. לאחר ספיגת עודף לחות, יש למרוח את תמיסת העבודה DAPI (ערכת בדיקת TUNEL) ולדגור ב-RT בחושך למשך 5 דקות כדי להכתים את הגרעינים. לאחר מכן, שטפו את הדגימות ב-PBS 4x למשך 5 דקות כל אחת. הסר עודפי נוזלים עם נייר סופג, ואטום את השקופיות באמצעות מדיום הרכבה נגד דהייה.
  18. סרוק את השקופיות המוכתמות באמצעות מערכת ההדמיה המולטי-ספקטרלית Vectra Polaris ונתח נתונים באמצעות תוכנת המערכת.

5. ניתוח סטטיסטי

  1. הצג את תוצאות הניסוי כאמצעים ± SEM ונתח נתונים באמצעות מבחן t של סטודנט עבור השוואות קבוצתיות באמצעות תוכנת GraphPad Prism 10 (תוכנת GraphPad, סן דייגו, קליפורניה).
  2. הגדר ערך p קטן מ-0.05 כהפרש סטטיסטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

חולדות נתונות לאיסכמיה של 120 דקות במהלך MCAO ואחריה 22 שעות רפרפוזיה. שיעור התמותה היה מינימלי במהלך ניתוח MCAO ועמד על כ-25% בתקופת הרפרפוזיה. נזק מוחי משמעותי נצפה בקבוצת MCAO, בעוד שלא נצפה אוטם במוח של קבוצת Sham (24.87 ± 1.21% לעומת 0% מאזור האוטם לכל אזור המוח; MCAO [n = 3] לעומת Sham [n = 3], P < 0.001; איור 1A,B). בקבוצת MCAO, פעילות חיסונית של קטפסין-B הראתה עלייה ניכרת (איור 2) בליבה האיסכמית (עוצמת קטפסין-B המיוצגת כקפל ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

חסימה של עורק מוחי מובילה למחסור בחמצן ובתזונה, ואחריה הפעלה של מיני חמצן תגובתיים, עומס יתר של סידן תוך תאי, שחרור גלוטמט ואינדוקציה של תגובות דלקתיות15. סדרת אירועים זו גורמת למוות של תאים ולנזק בלתי הפיך לרקמות במוח האוטם. ניתן להציל את הפנומברה באמצעות התערבות רפואית בחלון טיפולי מתאים16. הטיפול היחיד המאושר לשבץ איסכמי הוא פקקת תוך ורידית עם tPA17; עם זאת, יישום הטיפול ב-tPA מוגבל לעד 5% מכלל המטופלים, בעיקר בשל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

Simiao Wu נתמך על ידי מחלקת המדע והטכנולוגיה של מחוז סצ'ואן (2024YFHZ0330) ובית החולים מערב סין של אוניברסיטת סצ'ואן. Weihong He נתמך על ידי המחלקה למדע וטכנולוגיה של מחוז סצ'ואן (2023YFS0297) ואוניברסיטת סצ'ואן. אנו מודים ל-Yi Zhang ו-Yue Li במתקן הליבה למחקר, בית החולים מערב סין באוניברסיטת סצ'ואן, על תמיכתם הטכנית בהדמיה וניתוח TUNEL.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Polarisאקויה ביוסיינסס(N/A) מערכת הדמיה מולטי-ספקטרלית של Vectra Polaris 
אתנול נטול מיםצ'נגדו ג'ינשאן ריאגנט כימי ושות'N/A
בופרנורפיןבית החולים מערב סיןN/A
קרפרופןבית החולים מערב סיןN/A
נוגדן קטפסין-BAbcamAb214428
CryostatLEICA LEICA CM 1950
מצלמה דיגיטליתOLYMPUSTG-7
עז נגד חולדה IgG (H+L) (מצומד FITC)Elabscience  E-AB-1021
סרום עיזיםSolarbioSL038
GraphPad Prism 10 תוכנהN/Ahttps://www.graphpad-prism.cn/?c=i&a=prismdownload_cn
ImageJN/Ahttps://imagej.net/ij/
עט אימונוהיסטוכימיהBiosharphttp://www.biosharp.cn/index/product/details/language/en/product_id/2828.html
תוכנת InFormתוכנת מערכת Akoya Biosciencesגרסה 2.6.0למערכת הדמיה מולטי-ספקטרלית 
פתרון חיטוי יודופורHuatian Technology Industry Co.
IsofluraneRWD Life Science Co.https://www.rwdstco.com/inhalation-anesthesia-solutions/
מדיום הרכבה המכיל DAPISolarbioS2110
מונופילמנט ניילוןRWD Life Science Co.https://www.rwdstco.com/
תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT)EprediaN/A
Paraformaldehyde BiosharpN/A
תמיסת חיץ פוספט (PBS)SolarbioN/A
PrismGraphPad גרסה 10
Proteinase KTiangenRT403-02
SalineKelun Co.N/A
Sprague-Dawley חולדותHuafukang Co.N/A
סוכרוזBioFroxx1245GR500
מכשירים כירורגייםRWD מדעי החיים ושות'N/A
TO&NBSP;  בייג'ינג Solarbio מדע & Tecnology Co., Ltd.http://www.solarbio.net/
תמיסת טריפנילטטרזוליום כלוריד (TTC)SolarbioG3005
Triton X-100BioFroxx1139ML100
ערכת TUNELElabscience  E-CK-A321
מערכת הדמיה מולטי-ספקטרלית של Vectra של חומר ביולוגי שקוף מסוג

מקורות

  1. Tsao, C. W., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2023 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 147 (8), e93-e621 (2023).
  2. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
  3. Hankey, G. J. Stroke. Lancet. 389 (10069), 641-654 (2017).
  4. Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathol. 133 (2), 245-261 (2017).
  5. Barthels, D., Das, H. Current advances in ischemic stroke research and therapies. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1866 (4), 165260(2020).
  6. Frank, D., Zlotnik, A., Boyko, M., Gruenbaum, B. F. The development of novel drug treatments for stroke patients: A review. Int J Mol Sci. 23 (10), 5796(2022).
  7. Wang, S. -N., et al. Humanized cerebral organoids-based ischemic stroke model for discovering of potential anti-stroke agents. Acta Pharmacologica Sinica. 44 (3), 513-523 (2023).
  8. Durukan, A., Tatlisumak, T. Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia. Pharmacol Biochem Behav. 87 (1), 179-197 (2007).
  9. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  10. Donnan, G. A., Baron, J. C., Ma, H., Davis, S. M. Penumbral selection of patients for trials of acute stroke therapy. Lancet Neurol. 8 (3), 261-269 (2009).
  11. Lo, E. H. A new penumbra: transitioning from injury into repair after stroke. Nat Med. 14 (5), 497-500 (2008).
  12. Datta, A., et al. Cell death pathways in ischemic stroke and targeted pharmacotherapy. Transl Stroke Res. 11 (6), 1185-1202 (2020).
  13. Gaire, B. P., Subedi, L., Teramoto, H., Hu, B. Cerebral Ischemia. , Exon Publications. Brisbane, Australia. (2021).
  14. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  15. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  16. Fisher, M. The ischemic penumbra: identification, evolution and treatment concepts. Cerebrovasc Dis. 17 Suppl 1, 1-6 (2004).
  17. Adams, H. P. Jr, et al. Guidelines for the early management of adults with ischemic stroke: A guideline from the American Heart Association/American Stroke Association Stroke Council, Clinical Cardiology Council, Cardiovascular Radiology and Intervention Council, and the Atherosclerotic Peripheral Vascular Disease and Quality of Care Outcomes in Research Interdisciplinary Working Groups: The American Academy of Neurology affirms the value of this guideline as an educational tool for neurologists. Circulation. 115 (20), e478-e534 (2007).
  18. Fonarow, G. C., et al. Timeliness of tissue-type plasminogen activator therapy in acute ischemic stroke: patient characteristics, hospital factors, and outcomes associated with door-to-needle times within 60 minutes. Circulation. 123 (7), 750-758 (2011).
  19. Yamori, Y., Horie, R., Handa, H., Sato, M., Fukase, M. Pathogenetic similarity of strokes in stroke-prone spontaneously hypertensive rats and humans. Stroke. 7 (1), 46-53 (1976).
  20. Bogousslavsky, J., Van Melle, G., Regli, F. The Lausanne stroke registry: analysis of 1,000 consecutive patients with first stroke. Stroke. 19 (9), 1083-1092 (1988).
  21. Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flow Metab. 1 (1), 53-60 (1981).
  22. Garcia, J. H., Liu, K. F., Ho, K. L. Neuronal necrosis after middle cerebral artery occlusion in Wistar rats progresses at different time intervals in the caudoputamen and the cortex. Stroke. 26 (4), discussion 643 636-642 (1995).
  23. Türeyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Ideal suture diameter is critical for consistent middle cerebral artery occlusion in mice. Neurosurgery. 56 (1 Suppl), discussion 196-200 196-200 (2005).
  24. Spratt, N. J., et al. Modification of the method of thread manufacture improves stroke induction rate and reduces mortality after thread-occlusion of the middle cerebral artery in young or aged rats. J Neurosci Methods. 155 (2), 285-290 (2006).
  25. Naqvi, S. A. R., et al. Biochemistry of Drug Metabolizing Enzymes. , Elsevier, Academic Press. (2022).
  26. Yadati, T., Houben, T., Bitorina, A., Shiri-Sverdlov, R. The ins and outs of cathepsins: Physiological function and role in disease management. Cells. 9 (7), 1679(2020).
  27. Liu, C. L., et al. Cysteine protease cathepsins in cardiovascular disease: from basic research to clinical trials. Nat Rev Cardiol. 15 (6), 351-370 (2018).
  28. O'Toole, D., et al. Signalling pathways linking cysteine cathepsins to adverse cardiac remodelling. Cell Signal. 76, 109770(2020).
  29. Luke, C. J., et al. Lysoptosis is an evolutionarily conserved cell death pathway moderated by intracellular serpins. Commun Biol. 5 (1), 47(2022).
  30. Xie, Z., et al. Cathepsin B in programmed cell death machinery: mechanisms of execution and regulatory pathways. Cell Death Dis. 14 (4), 255(2023).
  31. Nagakannan, P., Islam, M. I., Conrad, M., Eftekharpour, E. Cathepsin B is an executioner of ferroptosis. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1868 (3), 118928(2021).
  32. Conus, S., Simon, H. U. Cathepsins: key modulators of cell death and inflammatory responses. Biochem Pharmacol. 76 (11), 1374-1382 (2008).
  33. Bhoopathi, P., et al. Cathepsin B facilitates autophagy-mediated apoptosis in SPARC overexpressed primitive neuroectodermal tumor cells. Cell Death Differ. 17 (10), 1529-1539 (2010).
  34. Ding, X., Zhang, C., Chen, H., Ren, M., Liu, X. Cathepsins trigger cell death and regulate radioresistance in glioblastoma. Cells. 11 (24), 4108(2022).
  35. He, W., et al. Inhibition of myocardial cathepsin-L release during reperfusion following myocardial infarction improves cardiac function and reduces infarct size. Cardiovasc Res. 118 (6), 1535-1547 (2022).
  36. McCarroll, C. S., et al. Runx1 deficiency protects against adverse cardiac remodeling after myocardial infarction. Circulation. 137 (1), 57-70 (2018).
  37. Song, J., et al. Age-related promoter-switch regulates Runx1 expression in adult rat hearts. BMC Cardiovasc Disord. 23 (1), 541(2023).
  38. Riddell, A., et al. RUNX1: an emerging therapeutic target for cardiovascular disease. Cardiovasc Res. 116 (8), 1410-1423 (2020).
  39. Chen, H., et al. Pharmacological inhibition of RUNX1 reduces infarct size after acute myocardial infarction in rats and underlying mechanism revealed by proteomics implicates repressed cathepsin levels. Funct Integr Genomics. 24 (3), 113(2024).
  40. Petanceska, S., Burke, S., Watson, S. J., Devi, L. Differential distribution of messenger RNAs for cathepsins B, L and S in adult rat brain: an in situ hybridization study. Neuroscience. 59 (3), 729-738 (1994).
  41. Chaitanya, G. V., Babu, P. P. Activation of calpain, cathepsin-b and caspase-3 during transient focal cerebral ischemia in rat model. Neurochem Res. 33 (11), 2178-2186 (2008).
  42. Yuan, D., Liu, C., Wu, J., Hu, B. Inactivation of NSF ATPase leads to cathepsin b release after transient cerebral ischemia. Transl Stroke Res. 9 (3), 201-213 (2018).
  43. Hill, I. E., Preston, E., Monette, R., MacManus, J. P. A comparison of cathepsin B processing and distribution during neuronal death in rats following global ischemia or decapitation necrosis. Brain Res. 751 (2), 206-216 (1997).
  44. Kilinc, M., et al. Lysosomal rupture, necroapoptotic interactions and potential crosstalk between cysteine proteases in neurons shortly after focal ischemia. Neurobiol Dis. 40 (1), 293-302 (2010).
  45. Seyfried, D., et al. Cathepsin B and middle cerebral artery occlusion in the rat. J Neurosurg. 87 (5), 716-723 (1997).
  46. Saido, T. C., Yokota, M. Neurodegenerative diseases as proteolytic disorders: brain ischemia and Alzheimer's disease. Tanpakushitsu Kakusan Koso. 42 (14 Suppl), 2408-2417 (1997).
  47. Zuo, X., et al. Inhibition of cathepsins b induces neuroprotection against secondary degeneration in ipsilateral substantia nigra after focal cortical infarction in adult male rats. Front Aging Neurosci. 10, 125(2018).
  48. Zuo, X., et al. Inhibition of cathepsin b alleviates secondary degeneration in ipsilateral thalamus after focal cerebral infarction in adult rats. J Neuropathol Exp Neurol. 75 (9), 816-826 (2016).
  49. Pluta, R., Salínska, E., Puka, M., Stafiej, A., Lazarewicz, J. W. Early changes in extracellular amino acids and calcium concentrations in rabbit hippocampus following complete 15-min cerebral ischemia. Resuscitation. 16 (3), 193-210 (1988).
  50. Hatsuta, H., et al. Tau and TDP-43 accumulation of the basal nucleus of Meynert in individuals with cerebral lobar infarcts or hemorrhage. Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 49(2019).
  51. van Groen, T., Puurunen, K., Mäki, H. M., Sivenius, J., Jolkkonen, J. Transformation of diffuse beta-amyloid precursor protein and beta-amyloid deposits to plaques in the thalamus after transient occlusion of the middle cerebral artery in rats. Stroke. 36 (7), 1551-1556 (2005).
  52. Gómez-Sintes, R., Ledesma, M. D., Boya, P. Lysosomal cell death mechanisms in aging. Ageing Res Rev. 32, 150-168 (2016).
  53. Heimer, S., Knoll, G., Schulze-Osthoff, K., Ehrenschwender, M. Raptinal bypasses BAX, BAK, and BOK for mitochondrial outer membrane permeabilization and intrinsic apoptosis. Cell Death Dis. 10 (8), 556(2019).
  54. Elena-Real, C. A., et al. Cytochrome c speeds up caspase cascade activation by blocking 14-3-3ε-dependent Apaf-1 inhibition. Cell Death Dis. 9 (3), 365(2018).
  55. Linfante, I., et al. Clinical and vascular outcome in internal carotid artery versus middle cerebral artery occlusions after intravenous tissue plasminogen activator. Stroke. 33 (8), 2066-2071 (2002).
  56. Farges, M. C., et al. Increased muscle proteolysis after local trauma mainly reflects macrophage-associated lysosomal proteolysis. Am J Physiol Endocrinol Metab. 282 (2), E326-E335 (2002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

BTUNEL

מאמרים קשורים