מאמר שיטה

בידוד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות שמקורן בתאי גזע מזנכימליים מדגימות בנפח גדול עם תאימות ל-GMP לניסויים קליניים

DOI:

10.3791/67644

⸱

28 במרץ 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Southwest Hospital/Southwest Eye Hospital, Third Military Medical University (Army Medical University), 2Key Lab of Visual Damage and Regeneration & Restoration of Chongqing, 3Department of Nephrology, First Affiliated Hospital, Third Military Medical University (Army Medical University), 4Institute of Pathology and Southwest Cancer Center, Southwest Hospital, Third Military Medical University (Army Medical University) and Key Laboratory of Tumor Immunopathology, 5Army 953 Hospital, Shigatse Branch of Xinqiao Hospital, Third Military Medical University (Army Medical University), 6Jinfeng Laboratory, 7Department of Trauma Medical Center, Daping Hospital, State Key Laboratory of Trauma and Chemical Poisoning, Army Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות שמקורן בתאי גזע מזנכימליים (MSC-sEVs) הודגשו כשיטת טיפול נטולת תאים עם תופעות לוואי מינימליות. מחקר זה מספק פרוטוקול המשלב המודיאליזה עם אולטרה-צנטריפוגה, מפחית משמעותית את הזמן המושקע בתהליך כולו ומבטיח עמידה בתקני GMP (תנאי ייצור נאותים).

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEV) שמקורן בתאי גזע מזנכימליים (MSC-sEVs) הודגשו כשיטת טיפול נטולת תאים עם תופעות לוואי מינימליות. לעומת זאת, שיטות מיצוי מסורתיות כגון אולטרה-צנטריפוגה וכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל מוגבלות על ידי עוצמת הזמן, העלות והמדרגיות שלהן. כדי להתגבר על מגבלות אלה, אנו מציעים שיטה המשלבת המודיאליזר ואולטרה-צנטריפוגה. גישה זו משתמשת במכשיר המודיאליזה עם ממברנת חיתוך משקל מולקולרי (MWCO) של 100 kDa, המרכזת באופן סלקטיבי sEVs תוך סינון שפע של חלבונים, ובכך משפרת את התפוקה והטוהר של sEVs. שלב הטיהור הראשוני הזה מלווה באולטרה-צנטריפוגה כדי לחדד עוד יותר את הכנת ה-sEV. השילוב של שתי הטכנולוגיות הללו לא רק הפחית משמעותית את הזמן המושקע בתהליך כולו אלא גם הבטיח עמידה בתקני תנאי ייצור נאותים (GMP). השיטה כאן מדגימה יעילות גבוהה בבידוד sEVs מנפח גדול של דגימות, ומציעה התקדמות משמעותית על פני שיטות מסורתיות. פרוטוקול זה טומן בחובו הבטחה להאצת התרגום של טיפולים מבוססי EV לפרקטיקה קלינית על ידי מתן פתרון מדרגי, חסכוני ותואם GMP.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות שמקורן בתאי גזע מזנכימליים (MSC-sEVs) הן שלפוחיות הטרוגניות המועשרות ברכיבים מרובים כגון mRNA, מיקרו-RNA, ציטוקינים, ליפידים ומטבוליטים1. בשנים האחרונות, מחקרים רבים הדגישו את הפוטנציאל הטיפולי העצום של MSC-sEVs כשיטת טיפול נטולת תאים עם תופעות לוואי מינימליות2, והראו הבטחה בטיפול בספקטרום של מצבים, כולל הזדקנות, ניוון רקמות, סרטן והפרעה דלקתית 3,4,5,6 . עם זאת, אתגר קריטי נמשך במיצוי sEV בקנה מידה גדול, כאשר שיטות מסורתיות מוכיחות את עצמן כעתירות זמן או בלתי אפשריות מבחינה כלכלית. יתר על כן, הבטחת שחזור היא בעלת חשיבות עליונה ליישום קליני ותרגום של טיפולים מבוססי EV7. חוקרים זקוקים נואשות לשיטת טיהור שהיא לא רק פשוטה ויעילה אלא גם תואמת לתקני GMP (תנאי ייצור נאותים)8.

שיטות הטיהור הקונבנציונליות, כולל אולטרה-צנטריפוגה, אולטרה-סינון, כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל, אימונואפיניות ומשקעי פולימרים, יושמו בהרחבה במחקרים קודמים9. באופן כללי, שיטות מסורתיות לבידוד sEV מציגות מגבלות כגון שיעור תפוקה נמוך, טוהר פגום ואתגרים בעמידה בתקנים אספטיים מחמירים. יתר על כן, מחקרים קודמים דיווחו על הפוטנציאל של טכניקות מבטיחות כמו מערכות מיקרופלואידיות10,11, בידוד מגנטי ללא תוויות12 ובידוד כימי קוולנטי13 להשגת ביצועים יוצאי דופן. עם זאת, הדרישה לציוד מיוחד הופכת את הטכניקות המתקדמות הללו למאתגרות עבור רוב צוותי המחקר. לסיכום, השיטה היעילה לבודד רכבי EV בדרגת GMP מנפח גדול של דגימות נותרה מכשול קריטי, המגביל את התקדמותם של צוותים רבים הן במחקר והן ביישומים קליניים.

אולטרה-צנטריפוגה היא השיטה המאומצת ביותר לבידוד sEV ומוכרת כשיטת תקן הזהב14,15. זוהי טכניקה הממנפת הבדלים בצפיפות ובגודל כדי לבודד רכבי EV. sEVs מבודדים נשטפים בדרך כלל עם מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) כדי לסלק מזהמים שיוריים. לאחר מכן, בדרך כלל משתמשים בנפח מתאים של PBS כדי להשעות מחדש את ה-sEVs השטופים וניתן לקצור ריכוזים צפויים שונים של sEVs על ידי שליטה בנפח ה-PBS. יתר על כן, דווח כי נראה כי הטוהר של sEVs בפלזמה המתקבלים על ידי אולטרה-צנטריפוגה טוב יותר מזה של sEVs בפלזמה המבודדים על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC), ול-sEVs המתקבלים על ידי אולטרה-צנטריפוגה יש זיהומים נמוכים יותר של חלקיקים חוץ-תאיים שאינם שלפוחית (NVEPs). זה גם הופך את האולטרה-צנטריפוגה לשימוש הנפוץ ביותר וקשה להחלפה בטיפולים רבים הדורשים ריכוזים גבוהים של sEVs. עם זאת, בנוסף לאיכות וטוהר, יעילות היא גם גורם שאי אפשר להתעלם ממנו במיצוי sEV בנפח גדול. עד כה, סבב יחיד של אולטרה-צנטריפוגה יכול לתמוך בנפח דגימה של עד כ-600 מ"ל, מה שקובע שקשה לענות על הביקוש למיצוי בקנה מידה גדול על ידי אולטרה-צנטריפוגה16 בלבד.

מכשיר המודיאליזה מורכב ממודול מבוסס ממברנה המאכלס אלפי סיבים חלולים. דם מסתובב דרך סיבים אלה בתוך תא גלילי סגור17. מרכיבי הדם יכולים לעבור באופן סלקטיבי דרך הממברנות הללו על סמך גודלם המולקולרי וריכוזם היוני. במרפאה נעשה בו שימוש נרחב ככליה מלאכותית להסרת פסולת ועודפי נוזלים מדמם של חולים 18,19,20. במילים אחרות, להמודיאליזר יש גם פוטנציאל לרכז דגימות בנפח גדול, תוך הסתמכות על תהליך הדומה לסינון זרימה משיק (TFF). בהנחיה האחרונה שפורסמה על ידי האגודה הבינלאומית לשלפוחיות חוץ-תאיות (ISEV), תרכיזי sEV נחשבים מתאימים לדגימות בנפח גדול, כגון מדיום תרבית תאים. לאחר עשרות שנים של פיתוח, המודיאליזרים אומצו באופן נרחב בבתי חולים, נתמכים על ידי שפע של חומרים מתכלים בוגרים ומאגר של מפעילים מיומנים, מה שמקל על שמירה על הדגימה סטרילית.

מחקר זה מציג שיטת טיהור sEV המבוססת על המודיאליזר ואולטרה-צנטריפוגה התואמים ל-GMP. כאן, אנו בוחרים בדיאליזרים של חיתוך משקל מולקולרי של 100 kDa (MWCO), שהוכח כיעיל לוכד sEVs ולסנן חלבונים רבים22. אולטרה-צנטריפוגה מספקת גם שלב לטיהור נוסף. העבודה מדגימה כי ההמודיאליזר מתאים באותה מידה לריכוז ה-sEVs. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לבודד sEVs מדגימות בנפח גדול ביעילות. רשמנו את הניסוי הקליני ברישום הניסויים הקליניים הסיני (ChiCTR, NO. ChiCTR2200059018), שעדיין מתבצע ועדיין לא הושלם. למרות שנתונים קליניים אינם זמינים לפרסום כרגע, שיטה אמינה, בקנה מידה גדול, יעילה ותואמת לייצור sEVs כפי שדווח בפרוטוקול זה היא תנאי מוקדם לביצוע ניסויים פרה-קליניים וקליניים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול אושר ונערך בהתאם לוועדת האתיקה של מחקר אנושי של בית החולים הדרום-מערבי.

1. הסרת פסולת תאים ממדיום התרבות

הערה: יש להפעיל את הנהלים שלהלן בסביבה תואמת GMP, במיוחד כאשר הדגימות עשויות להיות חשופות ישירות לסביבה.

  1. בהתחשב בדרישה ללא מיקרוביוטה, ודא שהמסנן וצינור הגומי עוברים חיטוי לעיקור יעיל. ודא שכל החומרים המתכלים האחרים שעלולים להיתקל במדיום התרבות הם סטריליים ובאריזה אטומה. בצע את תהליך הסרת פסולת התאים בארון זרימה למינרית.
  2. הרכיבו את קרום הסינון של 0.45 מיקרומטר ו-0.22 מיקרומטר למנגנון המסנן. חבר משאבה פריסטלטית (ראה טבלת חומרים) ואת מכשיר המסנן עם צינור הגומי. מקם את הממברנה של 0.45 מיקרומטר מעל הממברנה של 0.22 מיקרומטר; אחרת, זה עלול להפחית את יעילות הסינון (איור 1). שימו לב להבחנה בין הצד הקדמי והאחורי של קרום המיקרו-סינון.
  3. הפעל את המשאבה הפריסטלטית לסינון. מופעל על ידי המשאבה, המדיום הבסיסי של תאי גזע מזנכימליים (MSCBM) עם תוספת של 5% (ראה טבלת חומרים) עובר דרך המסנן מקצה אחד, וניתן להשיג את מדיום התרבית המסונן בקצה השני של המסנן, כפי שמוצג ב (איור 1). אוספים את מדיום התרבות המסונן בשקית ניקוז עם תעלות כפולות. שמור על שלמות מערכת הסינון על ידי אופטימיזציה של מהירות המשאבה הפריסטלטית והחלפת קרום הסינון לפי הצורך.
  4. לאחר השלמת הסינון, סגור את שסתום הכניסה על שקית הניקוז ואטום אותו עוד יותר עם פרפילם (ראה טבלת חומרים). המשך לשלב הבא או אחסן באופן זמני את מדיום תרבית התאים המסונן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

2. ריכוז מדיום התרבות המסונן עם המודיאליזר

הערה: הימנע משימוש במדיום הנשר השונה (DMEM) של Dulbecco המכיל פנול אדום בתרבית תאים, מכיוון שגלאי דליפת הדם בהמודיאליזר יופעל או יכבה את גלאי דליפת הדם בהגדרת ההמודיאליזר.

  1. הכן את החומרים המתכלים.
    1. הכינו קווי דם, ממברנות פוליסולפון בשטף גבוה של 100 kDa MWCO, דיאליזה בדם, ערכת עירוי, תמיסת מלח פיזיולוגית, שקית עירוי, תמיסת יוד וצמר גפן לפני הריכוז (ראה טבלת חומרים).
  2. הפעל את המערכת ובדוק את עצמך.
    1. בדוק את החיבור של כבל החשמל של המודיאליזר והפעל את החשמל הראשי.
    2. המתן עד שהמכשיר ישלים את כל הליך האבחון העצמי.
  3. התקן את קווי הדם והדיאליזה.
    1. ודא את תאריכי התפוגה של קווי הדם החד פעמיים ודיאליזר הדם, ודא את שלמות האריזה החיצונית שלהם ובדוק אם יש נזק לקווים.
    2. התקן את הצינור באותו כיוון כמו זרימת הדם במעגל החוץ-גופני, וסגור ברצף את שסתומי הענף ליצירת זרימת לולאה סגורה.
  4. התחל את הליך השטיפה.
    1. השתמש בערכת עירוי כדי לחבר את תמיסת המלח הפיזיולוגית (ללא הפרין) מצינור לפני המשאבה למעגל הדיאליזה. חבר את אתר האיסוף הוורידי לשקית נוזל הפסולת.
      הערה: מי המלח הפיזיולוגיים לא צריכים להכיל הפרין או כל נוגדי קרישה אחרים.
    2. חבר את קווי האספקה/החזרה של הדיאליזה לדיאליזה.
    3. הפעל את ההמודיאליזר והגדר את קצב הזרימה ל-80-100 מ"ל/דקה. הוצא את כל האוויר ממעגל הדיאליזה ומהדיאליזה כדי להבטיח שכל מערכת הצינורות מלאה בנוזל.
    4. כוונן את מישור הנוזל בתאי העורקים והוורידים לכ-2/3 מלא. מי המלח זורמים ברצף דרך קו העורקים, הדיאליזה, הקו הוורידי ושקית נוזל הפסולת.
  5. התחל את ריכוז האולטרה-סינון.
    1. לאחר סיום הליך השטיפה, תלו את שקית הניקוז המכילה את מדיום התרבות המסונן על מעמד העירוי, חטאו את תעלת הפלט עם צמר גפן ספוג יוד, וחברו את תעלת הפלט של שקית הניקוז ליציאת משאבה מוקדמת באמצעות ערכת עירוי.
    2. הצטרף לפתח העורקי ולנמל הוורידי של קווי הדם. הקמת מעגל דיאליזה אולטרה-סינון מבודד (ISO-UF, אולטרה-סינון ללא זרימת דיאליזה) (איור 1).
    3. כוונן את נפח יעד האולטרה-סינון במכונת הדיאליזה כך שיתאים לנפח הכולל של הנוזל הקיים בשקית הניקוז. הגדר את זמן הדיאליזה של האולטרה-סינון לזמן הפעולה המינימלי של המערכת. לאחר הגדרת הפרמטרים בהצלחה, התחל את האולטרה-סינון.
      הערה: בשל חישוב מערכת ההמודיאליזה, זמן הדיאליזה לא יהיה קצר מדי אלא יישמר בקצב מתון יותר.
  6. השג את הנוזל המרוכז.
    1. לאחר השגת נפח ההתייבשות המטרה, סגור את המהדק העורקי וחבר את הפתח הוורידי לשקית עירוי סטרילית.
    2. פתח את יציאת המשאבה המוקדמת של קווי הדם החד פעמיים המצוידים במסנן אוויר. הפעל את משאבת הדם במהירות של כ-50 מ"ל לדקה, מה שמאפשר לנוזל בתוך קווי הדם להסתובב שוב מקו העורקים לקו הוורידי. החזר את כל הנוזל המרוכז, כ -158 מ"ל, מהמעגל בחזרה לשקית העירוי הסטרילית.
    3. בשלב המאוחר של הריכוז, אסוף את הנוזל המבוזבז מקו החזרת הדיאליזה. החל תהליכים עוקבים זהים לאלה של מדיום התרבית המרוכז על דגימת הנוזל המבוזבז כדי לנטר כל אובדן מקרי של sEVs שעלול להתרחש במהלך הריכוז.
    4. סגור את כל השסתומים והסר את שקית העירוי, הדיאליזה וכל הקווים. כבה את אספקת החשמל וחטא את המכונה על ידי ניגובה.

3. הפרדת ה-sEVs עם אולטרה-צנטריפוגה

  1. העבירו את מדיום התרבות המרוכז לצינורות אולטרה-צנטריפוגה ואז אזנו אותם.
  2. צנטריפוגה באולטרה-צנטריפוגה בדרגה קלינית (ראה טבלת חומרים) ב-110,000 × גרם למשך 70 דקות, לאחר מכן שטפו את הגלולה בתמיסת מלח סטרילית והמשיכו בצנטריפוגה שנייה ב-110,000 × גרם למשך 70 דקות נוספות.
  3. השעו מחדש את ה-sEVs הגלולים בכמות מתאימה של תמיסת מלח סטרילית.
  4. העבירו את הרכבים החשמליים לצינור סטרילי לבדיקה נוספת או אחסנו אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.

4. אפיון של sEVs שהושגו

  1. ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA)
    1. לדלל את ה-sEVs המתקבלים (1 מיקרוליטר) עם PBS (1 מ"ל) (ראה טבלת חומרים). התאימו את מספר רכבי ה-SV הנראים בשדה הראייה הנוכחי כך שיהיה בין 50 ל-200.
    2. הזרקו בזהירות את הדגימה המדוללת לבאר הדגימה, הימנעו מהכנסת בועות אוויר.
    3. בצע את המדידה כאשר מספר החלקיקים בשדה הראייה גבוה ויציב ככל האפשר לכל העמדות. פרמטרי הניתוח הם כדלקמן: שטח מקסימלי: 1000, שטח מינימום: 10, בהירות מינימלית: 30, אורך עקבות: 15, טמפרטורה: 25 מעלות צלזיוס, רגישות: 75.
    4. מדוד כל דגימה לפחות שלוש פעמים.
  2. ניתוח כתמים מערביים
    1. דילול פתרון sEVs ב-PBS. השתמש בערכת בדיקת חלבון של חומצה ביצינצ'ונינית (BCA) (ראה טבלת חומרים) כדי למדוד את ריכוז החלבון.
    2. הרתיחו את ה-sEVs במאגר הדגימה ב-100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    3. הכן ג'ל אלקטרופורזה של ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE) 12% (ראה טבלת חומרים). הרכיבו את מנגנון האלקטרופורזה של הג'ל. טען כמויות שוות של חלבון מכל דגימה לבארות הג'ל SDS-PAGE. הגדר את מתח האלקטרופורזה ל-80 וולט לריכוז ו-100 וולט להפרדה.
    4. הפעל את ממברנת הפוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF) (ראה טבלת חומרים) עם מתנול למשך דקה אחת, ולאחר מכן השרו את קרום ה-PVDF במאגר העברה לפני שתמשיך בהעברה ב-100 וולט למשך שעה.
    5. טבלו את קרום ה-PVDF במאגר TBST (20 מ"מ טריס, 150 מ"מ NaCl ו-0.1% טווין 20) המכיל 5% אלבומין בסרום בקר (BSA; ראה טבלת חומרים) ולאחר מכן חסמו למשך 30 דקות.
    6. דגרו את קרום ה-PVDF עם הנוגדן העיקרי למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס על שייקר. הנוגדנים העיקריים המשמשים הם כדלקמן: אנטי-CD63 אנושי (דילול 1:1000), אנטי-CD9 אנושי (דילול 1:1000) ואנטי-HSP70 אנושי (דילול 1:1000) (ראה טבלת חומרים).
    7. למחרת, שטפו את קרום ה-PVDF בתמיסת TBST חמש פעמים למשך 5 דקות כל אחת ולאחר מכן דגרו עם נוגדן משני מצומד HRP (דילול של 1:10000) (ראה טבלת חומרים) בטמפרטורת החדר (RT) למשך שעה.
    8. לאחר שטיפה עם TBST חמש פעמים, השתמש במגיב לזיהוי כימילומינסנציה להדמיה במערכת כימילומינסנציה.
  3. מיקרוסקופ אלקטרונים שידור
    1. הוסף טיפת דגימה מדוללת PBS של 20 מיקרוליטר לנייר שעווה. לאחר מכן, הנח רשת נחושת (ראה טבלת חומרים) על הטיפה כך שטיפה הדגימה תוכל לכסות את רשת הנחושת ותן לה לעמוד ב-RT למשך 20 דקות.
    2. ספוג עודפי נוזלים עם נייר פילטר. לאחר מכן, תקן את הדגימות בתמיסה של 20 מיקרוליטר של 2% פרפורמלדהיד, 2% גלוטראלדהיד ו-0.05 M פוספט למשך 2 דקות.
    3. שטפו את רשת הנחושת שלוש פעמים במים מזוקקים כפולים, ולאחר מכן צבעו ב-20 מיקרוליטר של 2% חומצה פוספוטונגסטית (PTA) למשך דקה אחת ב-RT.
    4. ספוג נוזל מיותר עם נייר פילטר. יבש את הרשתות למשך הלילה לפני ניתוח על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (ראה טבלת חומרים).
      הערה: ההגדרות המומלצות עבור TEM הן כדלקמן: חשיפה: 1.0 שניות, HT Voltage 100.00 kV, זרם קרן: 50 μA, גודל נקודה: 1, מצב: TEM. הגדרות אלה עשויות להשתנות בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת החומרים).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפיון מורפולוגי של sEVs
בשלב הריכוז הסופי נאסף גם הנוזל המבוזבז כמתואר. המדיום המרוכז והנוזל המבוזבז היו אולטרה-צנטריפוגה, בהתאמה. אספנו את המשקעים לניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה (TEM). כצפוי, מספר משמעותי של ננו-שלפוחיות בצורת נצפה בקבוצת המדיום המרוכז (איור 2A,B). עם זאת, חלקיקי sEV אופייניים לא זוהו בקבוצת הנוזל המבוזבז. ממצאים אלה מספקים ראיות לכך שהפרוטוקול מסוגל להפריד sEVs מבלי לחוות אובדן משמעותי במהלך שלב הריכוז...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטות מסורתיות לבידוד של sEVs כוללות אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית, כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל ומשקעי PEG, כל אחת עם היתרונות והחסרונות שלה. בעוד שמיזוג של טכניקות שונות אלה עשוי לשפר את התפוקה או הטוהר של sEVs, צעדים נוספים מציגים לעתים קרובות הזדמנויות נוספות לזיהום דגימה. ישנן מערכות משולבות המתיימרות להפיק רכבי EV בכמויות גדולות ולעמוד בתקני GMP הופיעו בשוק21. עם זאת, האימוץ הנרחב שלהם מהווה אתגר כלכלי משמעותי, במיוחד עבור המספר ההולך וגדל של צוותי מחקר EV. י...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מימון מהקרן הלאומית למדע של סין (822101167, ל-BB) והקרן למדעי הטבע של צ'ונגצ'ינג (CSTB2022NSCQ-MSX0020 ל-BB), פרויקט המחקר המדעי של צ'ונגצ'ינג "דרך הרכבת" של סין (CSTB2022BSXM-JCX0031 ל-BB) והקרן הלאומית למדע של סין (82271132 ל-YL). אנו אסירי תודה על הסיוע של המחלקה לנפרולוגיה, בית החולים המסונף הראשון, האוניברסיטה הרפואית הצבאית השלישית (האוניברסיטה הרפואית הצבאית), והמכון לפתולוגיה ומרכז הסרטן הדרום-מערבי, בית החולים הדרום-מערבי, האוניברסיטה הצבאית השלישית לרפואה (האוניברסיטה הרפואית הצבאית) על הציוד והתמיכה הטכנית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Anti-CD63SBI System BiosciencesEXOAB-CD63A-11:1000 דילול
Anti-CD9SBI System BiosciencesEXOAB-CD9A-11:1000 דילול
Anti-HSP70SBI System BiosciencesEXOAB-Hsp70A-11:1000 דילול
ערכת בדיקת חלבון חומצה ביסינצ'וניניתBeyotimeP0012
BloodlinesFresenius Medical CareAP16641
אלבומין סרום בקר 5%Solarbio9048-46-8
תוסף תרבית תאיםHeliosHPCPLCGL055% (v/v) במצע תרבית תאים
רשת נחושתPreciseRGRS  GP-SMPG-1
דיאלייזרהליקסוןFX8100 kDa MWCO
שקית ניקוזCZRUIDEYLD-01
עז  נגד ארנב  HRPSBI System BiosciencesEXOAB-CD63A-11:10000 דילול
עז  נגד ארנב  HRPSBI System BiosciencesEXOAB-CD9A-11:10000 דילול
עז  נגד ארנב  HRPSBI System BiosciencesEXOAB-Hsp70A-11:10000 דילול
תאי גזע מזנכימליים מדיום בסיסי (MSCBM)DakeweDKW34-BM20500
ממברנת מיקרו-סינוןשנגחאיWKLM-50-100.45 μ m ו- 0.22 μ מ 
ParafilmFisher Scientific1337416
משאבה פריסטלטיתLongerPumpYZ1515x
מאגר פוספט מי מלחSolarbioP1022-500 מ"ל
Immun-Blot PVDF ממברנהBIO-RAD1620177
SDS-PAGE ג'ל ערכת הכנה מהירהBeyotimeP0012AC
SDS-PAGE מאגר טעינת מדגםBeyotimeP0015A
Super ECL Plus Western Blotting SubstrateBIOGROUNDBG0001
TBST מאגרSolarbioT1081
צינורות אולטרה-צנטריפוגה 38.5 מ"לבקמן344058
Bio-Rad ChemiDoc MP מערכת הדמיהBIO-RAD
המודיאליזרNIKKISODBB-27
ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקיםZetaViewPMX120למדידת גודל חלקיקים
התפלגות וריכוז חלקיקים
מיקרוסקופ אלקטרוניםשידור JEOLJEM-1400PLUSהגדרות מומלצות? חשיפה: 1.0 שניות, HT וולטאפה 100.00 קילו וולט, קור קרן: 50 μ A, גודל נקודה: 1, מצב: TEM.
אולטרה-צנטריפוגהBECKMAN COULTEROPTIMA XPN-100SW 28Ti רוטור דלי מתנדנד

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tan, F., et al. Clinical applications of stem cell-derived exosomes. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 17(2024).
  2. Xia, Y., Zhang, J., Liu, G., Wolfram, J. Immunogenicity of extracellular vesicles. Adv Mater. 36 (33), e2403199(2024).
  3. Andaloussi, S. E. L., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: Biology and emerging therapeutic opportunities. Nat Rev Drug Discov. 12 (5), 347-357 (2013).
  4. Harrell, C. R., Jovicic, N., Djonov, V., Arsenijevic, N., Volarevic, V. Mesenchymal stem cell-derived exosomes and other extracellular vesicles as new remedies in the therapy of inflammatory diseases. Cells. 8 (12), 1605(2019).
  5. Lin, Z., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes in cancer therapy resistance: Recent advances and therapeutic potential. Mol Cancer. 21 (1), 179(2022).
  6. Matsuzaka, Y., Yashiro, R. Therapeutic strategy of mesenchymal-stem-cell-derived extracellular vesicles as regenerative medicine. Int J Mol Sci. 23 (12), 6480(2022).
  7. Syromiatnikova, V., Prokopeva, A., Gomzikova, M. Methods of the large-scale production of extracellular vesicles. Int J Mol Sci. 23 (18), 10522(2022).
  8. Chen, J., et al. Review on strategies and technologies for exosome isolation and purification. Front Bioeng Biotechnol. 9, 811971(2021).
  9. Stam, J., Bartel, S., Bischoff, R., Wolters, J. C. Isolation of extracellular vesicles with combined enrichment methods. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1169, 122604(2021).
  10. Bajo-Santos, C., et al. Extracellular vesicles isolation from large volume samples using a polydimethylsiloxane-free microfluidic device. Int J Mol Sci. 24 (9), 7871(2023).
  11. Shin, S., et al. Separation of extracellular nanovesicles and apoptotic bodies from cancer cell culture broth using tunable microfluidic systems. Sci Rep. 7 (1), 9907(2017).
  12. Zeng, L., et al. Extraction of small extracellular vesicles by label-free and biocompatible on-chip magnetic separation. Lab Chip. 22 (13), 2476-2488 (2022).
  13. Dong, J., et al. Coupling nanostructured microchips with covalent chemistry enables purification of sarcoma-derived extracellular vesicles for downstream functional studies. Adv Funct Mater. 30 (49), 2003237(2020).
  14. Meng, Y., et al. Direct isolation of small extracellular vesicles from human blood using viscoelastic microfluidics. Sci Adv. 9 (40), eadi5296(2023).
  15. Martins, T. S., Vaz, M., Henriques, A. G. A review on comparative studies addressing exosome isolation methods from body fluids. Anal Bioanal Chem. 415 (7), 1239-1263 (2023).
  16. Börger, V., Staubach, S., Dittrich, R., Stambouli, O., Giebel, B. Scaled isolation of mesenchymal stem/stromal cell-derived extracellular vesicles. Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e128(2020).
  17. Mohajerani, F., Clark, W. R., Ronco, C., Narsimhan, V. Mass transport in high-flux hemodialysis: Application of engineering principles to clinical prescription. Clin J Am Soc Nephrol. 17 (5), 749-756 (2022).
  18. Zawada, A. M., et al. Impact of hydrophilic modification of synthetic dialysis membranes on hemocompatibility and performance. Membranes (Basel). 12 (10), 932(2022).
  19. Ghannoum, M., Roberts, D. M. Management of poisonings and intoxications. Clin J Am Soc Nephrol. 18 (9), 1210-1221 (2023).
  20. Khan, M. S., et al. Managing heart failure in patients on dialysis: State-of-the-art review. J Card Fail. 29 (1), 87-107 (2023).
  21. Chen, Y., et al. Exosome detection via the ultrafast-isolation system: Exodus. Nat Methods. 18 (2), 212-218 (2021).
  22. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (misev2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  23. Koch, L. F., et al. Novel insights into the isolation of extracellular vesicles by anion exchange chromatography. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1298892(2023).
  24. Akbar, A., Malekian, F., Baghban, N., Kodam, S. P., Ullah, M. Methodologies to isolate and purify clinical grade extracellular vesicles for medical applications. Cells. 11 (2), 186(2022).
  25. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  26. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).
  27. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

EV
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים