מאמר שיטה

הקפאה וצביעה חיסונית של רקמת האוזן הפנימית של עכבר: משלב עוברי לשלב בוגר

DOI:

10.3791/67647

⸱

11 באפריל 2025

 , 
1Department of Biology, Georgetown University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה, המיועד למשתמשים מתחילים ברקמת האוזן הפנימית של העכבר, מפרט באופן מקיף שלבים לעיבוד אוזניים פנימיות של עכבר בשלבי התפתחות שונים לצביעה חיסונית של חתך.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מפרט שיטות היסטולוגיה כלליות להכנת דגימות אוזן פנימית מעכברים עובריים, יילודים ובוגרים. מטרת פרוטוקול זה היא לספק שיטה פשוטה וסטנדרטית לעיבוד רקמת האוזן הפנימית לחוקרים, אולי חדשים בתחום, המעוניינים לעבוד עם שבלול העכבר. כלולים כאן פרוטוקולים לדיסקציה, קיבוע, הטבעה, הקפאה וצביעה חיסונית. צביעה חיסונית של חתך היא אחת השיטות הטובות ביותר לבחינת תאים בודדים בהקשר של השבלול כולו.

השלבים העיקריים כוללים ניתוח האוזן הפנימית הרחק מהגולגולת, קיבוע הרקמה באמצעות 4% פרפורמלדהיד, הטמעה בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית, הקפאה וצביעה חיסונית עם נוגדנים המכוונים לחלבונים ספציפיים המתבטאים על ידי השבלול.

השיטות שלנו כוללות שיקולים מיוחדים שנעשו עבור השבלול בהתחשב בכך שהוא
צורה ומבנה. יש צורך בכישורי מיקוד ודיסקציה טובים למדי, מכיוון שנזק לרקמות יכול להשפיע על איכות הצביעה החיסונית והעקביות בין הדגימות. עם זאת, עם הנהלים שאנו מתארים, ניתן להכשיר את רוב המשתמשים תוך מספר שבועות לבצע הכנות יפות. בסך הכל, פרוטוקול זה מציע דרך חשובה לקדם מחקר להבנת התפתחות שמיעה, תפקוד ומחלות במודלים של עכברים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבנת ההתפתחות והתפקוד השמיעתי חיונית לאפיון וטיפול בצורות שונות של ליקוי שמיעה. גורמי הסיכון לאובדן שמיעה הם רבים וכוללים סוכרת 1,2, יתר לחץ דם 3,4,5, מחלות אוטואימוניות 6,7, דלקת קרום המוח החיידקית 8,9 ומספר הפרעות ניווניות 10,11,12,13. בנוסף, תרופות מסוימות, כגון אנטיביוטיקה ותרופות כימותרפיות, יכולות גם הן להשפיע לרעה על השמיעה14. מעבר לאתגרים המיידיים של לקות שמיעה, ליקוי שמיעה יכול להשפיע לרעה על התפקוד הקוגניטיבי ולהגביר חרדה ומתח, מה שיכול להיות בקורלציה עם ליקוי קוגניטיבי וירידה בבריאות הנפש 11,15,16. על ידי פרסום פרוטוקול זה, אנו שואפים להקל על כל המחסומים לכניסה למחקר שמיעתי, במיוחד עבור אלה ללא ניסיון קודם בעבודה עם השבלול. מדריך זה מסביר כיצד להכין דגימות אוזן פנימית מעכברים עובריים, צעירים (יילודים) ובוגרים. מטרת פרוטוקול זה היא לספק גישה פשוטה לעיבוד רקמת האוזן הפנימית, תוך הבטחת שחזור ועקביות בין ניסויים. צביעה חיסונית של חתך היא אחת השיטות הטובות ביותר לבחינת סוגי תאים שונים בהקשר של השבלול כולו; בנסיבות אחרות, צביעה חיסונית מלאה עשויה להיות מועילה יותר (למשל, בחינת מורפולוגיה של סטריאוציליה של תאי שיער או לוקליזציה של חלבונים).

הרציונל לכך נובע מאתגרים בעבודה עם שבלול העכבר. גודלו הקטן, הסליל הייחודי והמבנה העדיןשלו דורשים טכניקות מיוחדות לדיסקציה מדויקת, קיבוע, הטבעה, הקפאה וצביעה חיסונית. הצורה הספירלית של השבלול פירושה שההטמעה דורשת תשומת לב קפדנית לכיוון כדי להבטיח שכל סיבוב של השבלול נשמר, וזה חיוני להשגת חתכים עקביים. בנוסף, ככל שהשבלול מתבגר, הוא עובר אוסיפיקציה18, כלומר הוא הופך בהדרגה לעצם, מה שעלול לסבך את שימור הרקמות ולחייב הסרת אבנית. צביעה חיסונית בהקפאה מציעה מספר יתרונות על פני תכשירים חלופיים (כגון צביעה חיסונית שלמה). היתרונות העיקריים של הקפאה הם שימור כללי של חלבונים וחומצות גרעין, והחתכים הדקים יחסית, ~2D, מאפשרים מדידות עקביות ומדויקות. בנוסף, הוא מאפשר לשמר ולהמחיש את כל סוגי תאי השבלול, והוא יכול לשפר את איכות הצביעה החיסונית. בניגוד לתכשירים רבים של שבלול שלם, הקפאה משמרת מבנים הכוללים את הרצועה הספירלית, כלי הדם של סטריה, קרום רייסנר והממברנה הטקטוריאלית. ראה את הפרסומים הקודמים הבאים לדוגמאות של צביעה חיסונית איכותית של אוזניים פנימיות עובריות 19,20,21, יילודים 22,23,24 ואוזניים פנימיות בוגרות 25,26.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת ג'ורג'טאון. כל העכברים במחקר זה נשמרו בהתאם לוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת ג'ורג'טאון (פרוטוקול #1147). בשבוע הראשון שלאחר הלידה, מכיוון שמבני העצם הטמפורליים אינם מפותחים במלואם, אין צורך בהסרת אבנית. עם זאת, שבלול מעכברים בני P6 ומעלה דורש הסרת אבדן ושיטת דיסקציה שונה. בפרוטוקול שלנו, נעשה שימוש בעכברי NCI Cr:NIH(S) (NIH SWISS) זכרים ונקבות, וב-E16.5, P0 ו-P30. עבור כל סעיף, אנו מציינים בסוגריים כמה זמן צפוי לקחת כל צעד למתחילים. רבים מהצעדים יהפכו מהירים יותר עם התרגול.

1. איסוף דגימות אוזן פנימית עוברית וצעירה (~75 דקות)

  1. המתת חסד ועריפת ראשים של עכברים בהתאם לפרוטוקול מחקר מאושר בבעלי חיים.
  2. בעזרת מספריים לחיתוך עדין, בצע בזהירות חתך בקו האמצע לאורך הקרקפת, החל מהצוואר ונמשך לכיוון החוטם, תוך דחיפה של העור הצידה (חתך ראשון).
  3. הנח את להב המספריים התחתון במגנום הנקב ואת להב המספריים העליון בגולגולת. חותכים את החצי העליון של הגולגולת עד האף (חתך שני).
  4. החזר את המספריים מהראש החתוך חלקית, ואז הנח את להב המספריים התחתון בתחתית הגולגולת ואת קצה המספריים העליון במגנום הנקב. חותכים את החצי התחתון של הראש עד האף (חתך שלישי).
    הערה: חשוב שלהבי המספריים יחתכו ממש דרך קו האמצע ויחתכו בקלות במאמץ מועט. זה יבטיח שלהבי המספריים יחתכו ממש בין האוזן הפנימית השמאלית והימנית.
  5. בשלב זה, ראש העכבר מחולק לשניים לאורך ציר הרוסטרל-זנב. בעזרת מלקחיים עדינים ומספריים, נתק בזהירות את כל הרקמות הרכות המקיפות את העצם הטמפורלית, כגון מוח, שרירים ורקמת חיבור. הימנע מפגיעה בעצם או במבנים שמסביב.
  6. הנח את חצאי ראשי העכבר בבארות של צלחת 24 בארות המכילה טמפרטורת החדר 1x PBS. לאחר עיבוד כל ראש, החלף את תמיסת ה-PBS 1x בתמיסת PFA של 4% (לקיבוע) ודגירה למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר (בדרך כלל 20 מעלות צלזיוס).
    הערה: זמן הקיבוע עשוי להשתנות בהתאם לחלבונים שיש לזהות ו/או ליעילות הקישור של נוגדנים שונים.
  7. לאחר 45 דקות, יש לשטוף את הטישו למשך 3 x 5-10 דקות עם PBS אחד.
  8. אחסן את הדגימות ב-1x PBS ב-4 מעלות צלזיוס או עבור לשלב הבא ונתח אותן. לאחסון לטווח ארוך, יש לאחסן ב-1x PBS המכיל 0.1% נתרן אזיד ב-4 מעלות צלזיוס.
  9. השלך את כל רקמת העכבר שנותרה בהתאם להנחיות המוסד לסילוק מפגעים ביולוגיים/רקמות.

2. דיסקציה של דגימת אוזן פנימית עוברית וצעירה (3 - 5 דקות כל דגימה)

  1. אתר את העצם הטמפורלית/קפסולת האוזן הפנימית בתוך חצי ראש העכבר. הוא תופס את אותו מיקום כמו האוזן החיצונית אך ממוקם בתוך עצם הגולגולת. בעזרת מלקחיים עדינים, נתק בזהירות את כל הרקמות הרכות המקיפות את קפסולת האוזן הפנימית. לאחר שחרור קפסולת האוזן הפנימית, התחל לחתוך את הרקמה סביב קפסולת האוזן הפנימית.
  2. לאחר שקפסולת האוזן הפנימית השתחררה ברובה מרקמת הגולגולת, הפעל בעדינות לחץ על האזור שמסביב לקפסולת האוזן הפנימית באמצעות מלקחיים כדי לשחרר אותה לחלוטין.
    הערה: הפעל לחץ הדרגתי כדי לשחרר את קפסולת האוזן הפנימית מהחיבורים הסובבים אותה. הימנע מפגיעה בקפסולת האוזן הפנימית. מכיוון שהאוזן הפנימית המתפתחת מוקדם היא רכה למדי, הימנע ממגע ישיר עם המלקחיים שלך.
  3. אחסן את דגימות האוזן הפנימית כמו בשלב 1.8 והשליך את כל הפסולת שנותרה מרקמת הראש הקבועה.

3. איסוף ודיסקציה של דגימות האוזן הפנימית למבוגרים (~75 דקות + 2 - 3 ימים של טיפול EDTA)

  1. המתת חסד ועריפת ראשים של עכברים על פי פרוטוקול מחקר מאושר בבעלי חיים.
  2. בעזרת מספריים חדים, בצע בזהירות חתך בקו האמצע לאורך הקרקפת, החל מהצוואר ונמשך לכיוון החוטם. קפלו את העור לאחור כדי לחשוף את הגולגולת (חתך ראשון).
  3. הנח את להב המספריים התחתון במגנום הנקב ואת להב המספריים העליון בגולגולת. חותכים את החצי העליון של הגולגולת עד האף (חתך שני).
    הערה: במהלך שלב זה, תבחין ב"ריסוק "מתון של להבי המספריים; זה נורמלי.
  4. החזר את המספריים מהראש החתוך חלקית, ולאחר מכן הנח את להב המספריים התחתון בתחתית הגולגולת ואת להב המספריים העליון במגנום הנקב. חותכים את החצי התחתון של הראש עד האף (חתך שלישי), והקפידו ללכת ימינה לאורך קו האמצע כדי להבטיח שהלהבים מפספסים את האוזניים הפנימיות.
    הערה: אל תכריח את המספריים דרך הרקמה; ייתכן שהדבר מעיד על פגיעת הלהבים באחת האוזניים הפנימיות.
  5. עבור כל חצי ראש, בעזרת מלקחיים ומספריים, נתק כל רקמה רכה המקיפה את העצם הטמפורלית, כגון המוח, השרירים ורקמת החיבור.
    הערה: היזהר כדי להימנע מפגיעה בעצם הטמפורלית או במבנים שמסביב.
  6. לאחר שהרקמה שמסביב נקייה, "סלסול הפוך" של רקמת הגולגולת באצבעות והשתמש באגודל כדי להפעיל לחץ בעדינות על החלק התחתון של העצם הטמפורלית. הפעל לחץ הדרגתי תוך שחרור העצם מהחיבורים הסובבים אותה.
    הערה: כאשר מופעל לחץ, קפסולת האוזן הפנימית נפרדת בהדרגה מעצמות הגולגולת שמסביב. עם מניפולציה עדינה, העצם צריכה לצוץ החוצה בקלות יחסית.
  7. לאחר הסרת קפסולת האוזן הפנימית, שטפו אותה עם 1x PBS.
  8. ממלאים צלחת סילגרד ב -4% PFA ומניחים אותה מתחת למיקרוסקופ. מניחים אוזן פנימית אחת קופצת בצלחת הסילגארד.
  9. בדוק את האוזן הפנימית לאיתור רקמות רכות או עצם מחוברות והסר בעדינות כאלה.
  10. מצא את החלון הסגלגל והסר בעדינות את הסטפס בעזרת מלקחיים.
  11. מצא את החלון העגול ותקע חור קטן כדי לוודא שאף רקמה מסביב לא סותמת אותו.
  12. פתח חור קטן בקודקוד בעזרת מלקחיים עדינים. שטפו את השבלול עם פיפטה P20 מלאה ב-4% PFA לתיקון. הקפד לדמיין נוזל (דם מדולל, אנדולימפה/פרילימפה) יוצא מהחלון הסגלגל.
  13. מניחים את השבלול הקבוע בצלחת של 24 בארות מלאה ב-4% PFA. סמן את השעה. דגירה 30-60 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה (נדנדה או נוטר), ולאחר מכן שטפו את הדגימה למשך 3 x 5-10 דקות עם תמיסת PBS 1x.
  14. לאחר השטיפה האחרונה, הניחו את הרקמה ב-1.25 מ"מ EDTA והניחו לה להתנדנד במשך 2-3 ימים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  15. השלך את רקמת העכבר הנותרת כראוי בהתאם להנחיות המוסד לסילוק מפגעים ביולוגיים/רקמות.
  16. לאחר הטיפול ב-EDTA, יש לשטוף את הטישו למשך 3 x 5 דקות עם 1x PBS.
  17. אחסן את הדגימות ב-1x PBS ב-4 מעלות צלזיוס או עבור לשלב הבא ונתח אותן. לאחסון לטווח ארוך, אחסן את הדגימות ב-1x PBS המכיל 0.1% נתרן אזיד ב-4 מעלות צלזיוס.

4. הכנת דגימת אוזן פנימית להקפאה (~24 שעות)

  1. הניחו את קפסולת האוזן הפנימית המנותחת בסוכרוז 10% (ב-1x PBS) ותנו לה לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעתיים לפחות.
    הערה: כאשר הדגימות התייצבו במלואן, הן ישקעו לתחתית הצינור.
  2. השליכו את תמיסת הסוכרוז של 10%, הוסיפו 20% סוכרוז ב-1x PBS, ואפשרו שעתיים נוספות של דגירה בטמפרטורת החדר.
  3. השליכו את תמיסת הסוכרוז של 20%, הוסיפו 30% סוכרוז ב-1x PBS ודגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה (מינימום).
    הערה: ניתן לצמצם שלב זה לשעתיים, אך דגירה למשך הלילה מניבה את התוצאות הטובות ביותר. ניתן להשאיר את הרקמה בכל אחוז סוכרוז למשך זמן ממושך.
    1. הוציאו מחצית מתמיסת הסוכרוז של 30% ומלאו את החלל בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT). תן לו להתנדנד למשך 30 דקות לפחות ומקסימום שעתיים.
      הערה: השארת הדגימות ב-OCT לזמן ממושך תגרום להתכווצות הרקמה.
  4. העבירו את הדגימות לתבניות קריולוגיות מסומנות הממולאות ב-OCT.
  5. בדוק את כיוון השבלול מתחת למיקרוסקופ בבלוק הקריובלוק המוטמע. עבור חתכי שבלול "סטנדרטיים", ודא שהצד הקעור של האוזן הפנימית פונה לצדדים הצרים של הקריומולט.
  6. מניחים קרח יבש בכלי קטן ומוסיפים 5-10 מ"ל אתנול או דימתילבוטאן. הנח את התבניות + OCT + דגימה על קרח יבש מבעבע כדי להקפיא במהירות את הבלוק.
  7. אחסן את הדגימות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

5. חיתוך אוזניים פנימיות (~ 25 דקות לכל דגימה)

  1. העבירו את הבלוקים לחדר של קריוסטט מקורר מראש ל-20 מעלות צלזיוס. אפשר לדגימות להתייצב שם למשך 30-60 דקות.
  2. בעזרת עיפרון, סמנו את הצד של בלוק הקריובלוק המתאים למיקום השבלול כדי להבטיח כיוון נכון לחתך.
  3. הוסף מאגר קטן של OCT לצ'אק והניח עליו את הקריובלוק, הצד הרחב (ללא סימן העיפרון) כלפי מטה.
  4. הנח את הצ'אק + OCT + דגימה בתא הקריוסטט המצונן, ואפשר ל-OCT לקפוא לחלוטין. לאחר מספר דקות, הנח את הצ'אק + הדגימה על מחזיק הצ'אק כשסימן העיפרון מצביע ימינה או שמאלה.
  5. חתוך את הבלוק עד שהרקמה נראית לעין (השתמש ב-40 מיקרומטר כהגדרת החיתוך).
  6. לאחר שהרקמה נראית לעין, קצרו קטע של 12 מיקרומטר עם שקופיות המיועדות להקפאה ובדקו את מיקום החיתוך במיקרוסקופ.
  7. אם מתקרבים לסיבובי השבלול, קצרו מקטעים של 12 מיקרומטר, ובדקו את המיקום מדי פעם, עד שעברו את כל הסיבובים.
    הערה: מספר הקטעים בכל שקופית יכול להשתנות, אך בדרך כלל אנו מקבלים 8-10 מקטעים לכל שקופית, וכ-6 שקופיות לכל שבלול.
  8. אחסן את השקופיות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

6. צביעה חיסונית (~1 - 3 ימים)

  1. הסר את השקופיות מהמקפיא -80 מעלות צלזיוס והניח להן להתייבש באוויר למשך כ-10 דקות.
  2. בעזרת עיפרון, סמן את השקופיות עם הנוגדנים שישתמשו בהם.
  3. עקבו אחר הקצוות באמצעות סמן הידרופובי (למשל, עט מחסום הידרופובי פרוקסידאז-אנטיפרוקסידאז (PAP)).
  4. החזר את הדגימות ב-1x PBS למשך 5 דקות.
  5. השלך את ה-1x PBS מהשקופיות והוסף 1x PBS + 0.1% Triton X-100 (0.1% PBSTx) לשקופיות למשך 20 דקות כדי לחלחל.
  6. הסר 0.1% PBSTx מהשקופית והוסף 200 מיקרוליטר מתמיסת החסימה לדגירה של 1-2 שעות בטמפרטורת החדר.
    הערה: חסימה היא שלב מכריע בטכניקות צביעה חיסונית כמו אימונוהיסטוכימיה ואימונופלואורסצנטיות, שם היא מונעת קשירה לא ספציפית של נוגדנים לרקמות או לתאים. למידע נוסף, עיין במדריך של לואיס לבחירת ריאגנטים לבקרה וחסימה27. פתרון חוסם נפוץ הוא 10% סרום חמור רגיל ב-0.5% PBSTx, אך זה תקף רק כאשר משתמשים בנוגדנים משניים שמקורם בחמור.
  7. בצע שטיפה מהירה עם 1x PBS, הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית המורכבת מ-0.5% PBSTx, ודגירה למשך שעה בטמפרטורת החדר או לילה ב-4 מעלות צלזיוס. עבור הנוגדנים העיקריים המוצגים באיור 1, השתמש בדילולים הבאים: 1:200 עבור Plexin-B1, 1:200 עבור Sox2, 1:1,000 כל אחד עבור Tuj1, Myo6 ו-Myo7A (ראה גם רשימת חומרים).
    הערה: כל נוגדן ראשוני מתנהג אחרת בהתאם למאפייני קשירת האפיטופ שלו ויכולתו לחדור לדגימות רקמה.
  8. לאחר הטיפול בנוגדנים ראשוניים, יש לשטוף במשך 4 x 30 דקות ב-PBSTx, להוסיף 200 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים משנית המורכבת מ-0.5% PBSTx (רשימת חומרים), ולדגור למשך שעה בטמפרטורת החדר.
    הערה: לפעמים זה יכול להיות מועיל לסובב תמיסות נוגדנים משניות במהירות מלאה ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לגלול כל משקע לא רצוי. אם התמיסות המשניות עברו צנטריפוגה, הימנע מלגעת בתחתית הצינור עם קצה הפיפטה.
  9. שטפו במשך 4 x 30 דקות ב-PBSTx (או שטפו למשך הלילה), ולאחר מכן הרכיבו את השקופיות באמצעות אמצעי הרכבה המסייע במניעת פוטו-הלבנה (למשל, Fluoromount).
  10. הוסף כיסוי בגודל מתאים בעובי המתאים להגדרת ההדמיה (לדוגמה, כיסוי מס' 1, בעובי של 0.13-0.16 מ"מ).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים דוגמאות מהמעבדה שלנו של הקודקוד והסיבוב הבסיסי של שבלול עכבר עוברי 16.5 (E16.5) והסיבוב הבסיסי מהיום שלאחר הלידה 0 (P0) ושבלול P30. דגימות אלה נחתכו ונצבעו באמצעות סמנים לתאי שיער (Myo7A ו-Myo6), נוירונים של גנגליון ספירלי (SGNs; Tuj1), תאי גליה ותאי תמיכה (Sox2), ו-Plexin-B1, המסמן את קרום הבסיס סביב צינור השבלול ו-SGNs. חתכי השבלול בשלבי התפתחות שונים חושפים הבדלים משמעותיים במורפולוגיה ובארגון התאי, המשקפים את התבגרות השבלול.

ב-E16.5, השבלול נמצא בשלב מוקדם של התפתחות, כאשר האיבר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ישנם מספר שלבים עיקריים להקפאה מוצלחת וצביעה חיסונית. קיבוע נכון של רקמת השבלול הוא חיוני, ומשך הקיבוע חשוב גם הוא, שיכול להשתנות בהתאם לנוגדן. בעוד שרוב הנוגדנים עובדים טוב יותר עם זמן קיבוע קצר יותר, כגון 45 דקות ב-PFA, חלק מאפיטופי המטרה יכולים לסבול קיבוע בן לילה. בהתבסס על הניסיון שלנו, קיבוע של 45 דקות מבטיח שימור נאות ותואם לרוב הנוגדנים העיקריים המשמשים בדרך כלל למחקר באמצעות תכשירי שבלול. בעת פתרון בעיות צביעה חיסונית (ראה טבלה 1), יש לקחת בחשבון זמני קיבוע שוני...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.A.D. ו-T.M.C. נתמכו על ידי מענקי NIH 5R01DC016595-07 (ל-T.M.C.) ו-5R01DC018040-05 (מייקל דינס, אוניברסיטת יוטה, PI). מיקרוגרפים לדוגמה באיור 1A-H נוצרו על ידי ד"ר קאידי ג'אנג.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Chemicals
Triton X-100Thermo Fisher Scientific, Inc.BP151-500
PBSקורנינג, בע"מ46-013-CM
EDTAסיגמא-אולדריץ', LLC.60-00-4
סוכרוז VWR אינטרנשיונל, בע"מ97061-432
נתרן אזיד אמרסקו, בע"מ0639-250G
Paraformaldehydeמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית15714
אתנולדקון מעבדות, בע"מv1001
דימתילבוטאן תרמו פישר סיינטיפיק, בע"מ19387-AP
תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT)VWR International, Inc.25608-930
<ציוד חזק>ספציפי
CryostatThermo Fisher Scientific, Inc.14-071-459
מלקחיים חיתוךמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית72700-DZ
מחסום הידרופובי עט פרוקסידאז-אנטיפרוקסידאז (PAP) מעבדות וקטור בע"מH-4000
מיקרוסקופ קונפוקליקרל זייס מיקרוסקופיה, LLC.LSM 880
P20 מיקרופיפטהגילסון, בע"מ
F144056M מספריים לנתיחהThermo Fisher Scientific, Inc.08-951-20
צלחת סילגארדמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית24236-10
צנטריפוגהEppendorf5424R
<חומרי הרכבה חזק>ים
Fluoromountמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית17984-25
Superfrost פלוס שקופיותThermo Fisher Scientific, Inc.1255015
<ריאגנטים חזקים>צביעה חיסונית
נורמליים סרום חמורJackson ImmunoResearch, Inc.017-000-121
קטעי FAB נגד עכברים ג'קסון ImmunoResearch, Inc.715-007-003
BlokHenAves labs, Inc.BH-1001
Tuj1 (בטא-III-טובולין) נוגדן חד שבטי לעכברBiolegend, Inc.MMS-435P
Sox2 נוגדן פוליקלונלי עיזיםR& די סיסטמס, בע"מAF2018
Myo6 ארנב נוגדן רב-שבטיProteus Biosciences25– 6791
Myo7A נוגדן רב-שבטי ארנבThermo Fisher Scientific, Inc.PA1-936
Plexin-B1 נוגדן פוליקלונלי עיזיםR& די סיסטמס, בע"מAF3749
נוגדנים משניים (מיוצרים בחמור; Alexa-488, Cy3, Cy5)Jackson ImmunoResearch, Inc.ראה קטלוג

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bainbridge, K. E., Hoffman, H. J., Cowie, C. C. Diabetes and hearing impairment in the United States: Audiometric evidence from the National Health and Nutrition Examination Survey, 1999 to 2004 . Ann Intern Med. 149 (1), 1-10 (1999).
  2. Baiduc, R. R., Helzner, E. P. Epidemiology of diabetes and hearing loss. Semin Hear. 40 (4), 281-291 (2019).
  3. Agarwal, S., Mishra, A., Jagade, M., Kasbekar, V., Nagle, S. K. Effects of hypertension on hearing. Indian J Otolaryngol Head Neck Surg. 65 (Suppl 3), 614-618 (2013).
  4. Przewoźny, T., Gójska-Grymajło, A., Kwarciany, M., Gąsecki, D., Narkiewicz, K. Hypertension and cochlear hearing loss. Blood Press. 24 (4), 199-205 (2015).
  5. Babarinde, J. A., Adeyemo, A. A., Adeoye, A. M. Hearing loss and hypertension: exploring the linkage. The Egyptian Journal of Otolaryngology. 37 (1), 1-6 (2021).
  6. Mijovic, T., Zeitouni, A., Colmegna, I. Autoimmune sensorineural hearing loss: the otology-rheumatology interface. Rheumatology (Oxford). 52 (5), 780-789 (2013).
  7. Mancini, P., et al. Hearing loss in autoimmune disorders: Prevalence and therapeutic options. Autoimmun Rev. 17 (7), 644-652 (2018).
  8. Persson, F., Bjar, N., Hermansson, A., Gisselsson-Solen, M. Hearing loss after bacterial meningitis, a retrospective study. Acta Otolaryngol. 142 (3-4), 298-301 (2022).
  9. Kutz, J. W., Simon, L. M., Chennupati, S. K., Giannoni, C. M., Manolidis, S. Clinical predictors for hearing loss in children with bacterial meningitis. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 132 (9), 941-945 (2006).
  10. Li, S., et al. Hearing loss in neurological disorders. Front Cell Dev Biol. 9, 716300(2021).
  11. Shen, Y., et al. Cognitive decline, dementia, Alzheimer's disease and presbycusis: Examination of the possible molecular mechanism. Front Neurosci. 12, 12(2018).
  12. Profant, O., et al. Auditory dysfunction in patients with Huntington's disease. Clin Neurophysiol. 128 (10), 1946-1953 (2017).
  13. Jafari, Z., Kolb, B. E., Mohajerani, M. H. Auditory dysfunction in Parkinson's disease. Mov Disord. 35 (4), 537-550 (2020).
  14. Rybak, L. P., Ramkumar, V. Ototoxicity. Kidney Int. 72 (8), 931-935 (2007).
  15. Demirhan, M. A., Celebisoy, N. Cognitive functions in episodic vestibular disorders: Meniere's disease and vestibular migraine. J Vestib Res. 33 (1), 63-70 (2023).
  16. Shoham, N., Lewis, G., Favarato, G., Cooper, C. Prevalence of anxiety disorders and symptoms in people with hearing impairment: a systematic review. Soc Psychiatry Psychiatr Epidemiol. 54 (6), 649-660 (2019).
  17. Manley, G. A., Gummer, A. W., Popper, A. N., Fay, R. R. The cochlea: What it is, where it came from, and what is special about it. Understanding the Cochlea. Springer Handbook of Auditory Research. 62, Springer. Cham. 17-32 (2017).
  18. Bai, J., et al. Three-dimensionally visualized ossification and mineralization process of the otic capsule in a postnatal developmental mouse. Laryngoscope Investig Otolaryngol. 8 (4), 1036-1043 (2023).
  19. Dabdoub, A., et al. Sox2 signaling in prosensory domain specification and subsequent hair cell differentiation in the developing cochlea. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (47), 18396-18401 (2008).
  20. Mann, Z. F., Chang, W., Lee, K. Y., King, K. A., Kelley, M. W. Expression and function of scleraxis in the developing auditory system. PLoS One. 8 (9), e75521(2013).
  21. Wang, Z., et al. The purinergic receptor P2rx3 is required for spiral ganglion neuron branch refinement during development. eNeuro. 7 (4), (2020).
  22. Matern, M., et al. Gfi1Cre mice have early onset progressive hearing loss and induce recombination in numerous inner ear non-hair cells. Sci Rep. 7, 42079(2017).
  23. Woods, C., Montcouquiol, M., Kelley, M. W. Math1 regulates development of the sensory epithelium in the mammalian cochlea. Nat Neurosci. 7 (12), 1310-1318 (2004).
  24. Zhang, K. D., Coate, T. M. Recent advances in the development and function of type II spiral ganglion neurons in the mammalian inner ear. Semin Cell Dev Biol. 65, 80-87 (2017).
  25. Brooks, P. M., et al. Pou3f4-expressing otic mesenchyme cells promote spiral ganglion neuron survival in the postnatal mouse cochlea. J Comp Neurol. 528 (12), 1967-1985 (2020).
  26. Zhang, Y., et al. Pericytes control vascular stability and auditory spiral ganglion neuron survival. Elife. 12, e83486(2023).
  27. Lewis, M. A guide to selecting control and blocking reagents. , https://www.jacksonimmuno.com/secondary-antibody-resource/technical-tips/controls-diluents-blocking/ (2018).
  28. Song, L., McGee, J., Walsh, E. J. Frequency-and level-dependent changes in auditory brainstem responses (ABRS) in developing mice. J Acoust Soc Am. 119 (4), 2242-2257 (2006).
  29. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole-mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. J Vis Exp. (107), e53561(2016).
  30. Driver, E. C., Northrop, A., Kelley, M. W. Cell migration, intercalation and growth regulate mammalian cochlear extension. Development. 144 (20), 3766-3776 (2017).
  31. Babola, T. A., et al. Purinergic signaling controls spontaneous activity in the auditory system throughout early development. J Neurosci. 41 (4), 594-612 (2021).
  32. Donadieu, E., et al. Improved cryosections and specific immunohistochemical methods for detecting hypoxia in mouse and rat cochleae. Acta Histochem. 109 (3), 177-184 (2007).
  33. Rio, C., Dikkes, P., Liberman, M. C., Corfas, G. Glial fibrillary acidic protein expression and promoter activity in the inner ear of developing and adult mice. J Comp Neurol. 442 (2), 156-162 (2002).
  34. Ahmad, S., Chen, S., Sun, J., Lin, X. Connexins 26 and 30 are co-assembled to form gap junctions in the cochlea of mice. Biochem Biophys Res Commun. 307 (2), 362-368 (2003).
  35. Li, X., et al. Spag6 mutant mice have defects in development and function of spiral ganglion neurons, apoptosis, and higher sensitivity to paclitaxel. Sci Rep. 7 (1), 8638(2017).
  36. Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology. Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).
  37. Goodyear, R. J., et al. Accelerated age-related degradation of the tectorial membrane in the Ceacam16βgal/βgal null mutant mouse, a model for late-onset human hereditary deafness DFNB113. Front Mol Neurosci. 12, 147(2019).
  38. Zupančič, D., Terčelj, M., Štrus, B., Veranič, P. How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section. Protoplasma. 254 (5), 1931-1939 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

OCT

מאמרים קשורים