מאמר שיטה

בידוד אוכלוסיות תאים מיאלואידיים ואפיתל חיים מריאת העכבר

2.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67648

⸱

31 בינואר 2025

 , 
1Department of Immunology, Harvard Medical School, 2Department of Stem Cell and Regenerative Biology, Harvard University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מפרט את הבידוד של אוכלוסיות חיסוניות ולא מחוסנות מריאות העכבר במצב יציב ובעקבות זיהום בשפעת. הוא גם מספק אסטרטגיות שער לזיהוי תת-קבוצות של תאים אפיתל ומיאלואידים.

תקציר

הריאה חשופה באופן רציף לפתוגנים ולגירויים סביבתיים מזיקים אחרים, מה שהופך אותה לפגיעה לנזק, תפקוד לקוי והתפתחות מחלות. מחקרים המשתמשים במודלים של עכברים של זיהום בדרכי הנשימה, אלרגיה, פיברוזיס וסרטן היו קריטיים לחשיפת מנגנוני התקדמות המחלה וזיהוי מטרות טיפוליות. עם זאת, רוב המחקרים המתמקדים בריאות העכבר נותנים עדיפות לבידוד של תאי חיסון או תאי אפיתל, ולא שתי האוכלוסיות בו זמנית. כאן, אנו מתארים שיטה להכנת תרחיף מקיף של תא בודד של אוכלוסיות חיסוניות ולא חיסוניות כאחד המתאים לזרימה ציטומטרית ומיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטי. אוכלוסיות אלו כוללות תאי אפיתל, תאי אנדותל, פיברובלסטים ומגוון תת-קבוצות של תאים מיאלואידים. פרוטוקול זה כרוך בשטיפת סימפונות וניפוח הריאות לאחר מכן עם דיספאז. לאחר מכן הריאות מתעכלות בתערובת ליבראז. שיטת עיבוד זו משחררת מגוון סוגי תאים מגוונים ומביאה לתרחיף תא בודד שאינו דורש דיסוציאציה ידנית כנגד מסנן, מקדם את הישרדות התאים ומניב מספר גבוה של תאים חיים לניתוחים במורד הזרם. בפרוטוקול זה, אנו מגדירים גם תוכניות שער עבור תת-קבוצות של תאים אפיתל ומיאלואידים הן בריאות נאיביות והן בריאות נגועות בשפעת. בידוד סימולטני של תאים חיסוניים ולא חיסוניים חיים הוא המפתח לחקירת דיבור בין-תאי והשגת הבנה מעמיקה יותר של הביולוגיה של הריאות בבריאות ובמחלות.

מבוא

הריאה מורכבת מדרכי הנשימה, הנאדיות והאינטרסטיציום. תאים חיסוניים ולא חיסוניים שוכנים בתוך תאים אלה כדי לתרום הן לתפקוד הריאות ההומאוסטטי (חילופי גזים) והן להגנה על המארח מפני עלבונות סביבתיים, כגון זיהום ויראלי. דרכי הנשימה הגדולות והקטנות, או הסמפונות והסימפונות, מרופדות בתאי אפיתל. תאי האפיתל השולטים באזורים אלה הם תאים מועדונים וריסים האחראים על הפרשת מולקולות הגנה והקלה על פינוי רירית1. הנאדיות הן המבנים הדיסטליים ביותר בריאה, מרופדות על ידי שני סוגי תאי אפיתל, תאים מכתשית מסוג I (ATIs) ותאי מכתשית מסוג II (ATIIs). ATIs אחראים על חילופי גזים, ו-ATIIs מפרישים וממחזרים חומרים פעילי שטח כדי להבטיח מתח פנים מתאים 2,3. ATIIs מתחדשים מעצמם ויכולים גם להתבדל ל-ATIs, תפקיד רלוונטי במיוחד לאחר נזק לריאות4. בנוסף, ATIIs מספקים נישה תומכת לסוג התאים החיסוניים העיקריים המאכלס את הנישה המכתשית, מקרופאגים מכתשית (AMs)5,6. מעבר לאפיתל, פיברובלסטים, תאי אנדותל ומקרופאגים אינטרסטיציאליים (IMs) (שיכולים להיות קשורים הן לעצבים והן לכלי דם) מהווים את האינטרסטיציום 7,8,9,10. בתגובה לזיהום ופציעה, תאי ריאה רבים מתים, ותאי חיסון, כולל מונוציטים ונויטרופילים, חודרים לרקמה11,12. מונוציטים חודרים לריאות מתמיינים למקרופאגים ויכולים לתרום לתא המקרופאגים לטווח ארוך13.

השיטות הנוכחיות להכנת תרחיפים חד-תאיים מריאת העכבר מבוססות בדרך כלל על קולגנאז ודורשות דיסוציאציה פיזית של רקמה14. זה יכול לגרום למספר נמוך של אוכלוסיות תאים לא חיסוניות. חלק מהפרוטוקולים לבידוד תאי אפיתל מבוססים על דיספאז ומניבים פרופורציות גבוהות יותר של תאי אפיתל חיים; עם זאת, פרוטוקולים אלה בדרך כלל אינם חוקרים את תפוקת תאי החיסון ואת כדאיות 15,16,17. ציטומטריית זרימה היא שיטה נפוצה המשמשת להבחנה בין אוכלוסיות תאים בתוך רקמה מעוכלת. בנקודת ההתחלה, שער זרימה ציטומטרית עבור AMs, IMs, מונוציטים ונויטרופילים מוגדר בבירור. עם זאת, במהלך דלקת, תהליך השער הופך למשתנה ומאתגר לפירוש בשל הרצף בביטוי סמני פני השטח של מונוציטים חודרים המתמיינים למקרופאגים. לכן, הפרוטוקול המוצג כאן מתאר גם אסטרטגיות שער לזיהוי אוכלוסיות תאים מיאלואידים מעניינות לאחר הדבקה.

דיסוציאציה חזקה של תאי אפיתל ומיאלואידים של הריאות חיונית כדי להבחין בתפקודיהם ההומאוסטטיים והדלקתיים. שיטה לבודד את תאי התאים הללו במקביל תאפשר ניתוחים במורד הזרם של סוגי תאים מרכזיים שגם שומרים על הבריאות וגם מניעים מחלות. סקירה סכמטית של זרימת העבודה של פרוטוקול זה ניתן למצוא באיור 1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה תואם את ההנחיות של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בבית הספר לרפואה של הרווארד (מספרי מענקים: R35GM150816 ו-P30DK043351). נקבות עכברי C57BL/6J בגילאי 8-12 שבועות שימשו לניסויים. פרוטוקול זה מתאים גם לעכברים זכרים. פרטי הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מסופקים בטבלת החומרים.

1. הכנת חומרים

  1. להפשיר אנזימים נחוצים על קרח, כולל דיספאז, ליבראז ו-DNAse.
  2. הכן ריאגנטים נחוצים אחרים. מלאו מזרק של 10 מ"ל ב-5 מ"ל של 2 מ"מ EDTA ב-DPBS והתאימו אותו עם מחט של 27 גרם. מלאו את המזרק של 1 מ"ל ב-DPBS והצמידו את הקטטר.

2. קצירת הריאות

  1. המתת חסד של העכבר על ידי הזרקה תוך-צפקית של 400-500 מ"ג/ק"ג ו-25-100 מ"ג/ק"ג תערובת קטמין/קסילזין (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד). המשך בדיסקציה לאחר שהעכבר אינו מגיב לצביטה של כרית כף הרגל (~5 דקות).
    הערה: תערובת קטמין/קסילזין משמשת להמתת חסד במקום פחמן דו חמצני כדי למנוע דימום הנגרם מחנק וחדירת תאי חיסון שעלולים לבלבל את התוצאות.
  2. רססו את העכבר ב-70% אתנול. נתח את העכבר באמצעות מספריים כירורגיים עדינים ומלקחיים #7. בצע חתך בבטן בעזרת מספריים וחתך לרוחב דרך הצפק.
    1. בצע חתך קטן בסרעפת כדי לשחרר את הוואקום. חתכו את הסרעפת ואת כלוב הצלעות התחתון מחלל הגוף כדי לחשוף את הריאות והלב.
  3. לחלחל את הריאות עם 5 מ"ל של 2 מ"מ EDTA ב-DPBS במזרק 10 מ"ל המצויד במחט 27 גרם. הזלוף מתבצע על ידי כניסה לבסיס הלב עם המחט, מכוונת מימין לחדר השמאלי, והוצאת נוזלים לאט מהמזרק18.
    הערה: יש לבצע זלוף לאט כדי למנוע קרע בכלי הדם.
  4. פתח את כלוב הצלעות בעצם החזה על ידי חיתוך דפנות כלוב הצלעות, ולאחר מכן חתוך אנכית דרך עצם החזה כדי לחשוף את קנה הנשימה19. חתוך כמה שיותר שרירים ורקמות חיבור באמצעות מספריים עדינים ומלקחיים #7 מבלי לנקב את קנה הנשימה או הריאות.
  5. עטפו את קנה הנשימה בתפר (מידה 2-0) כאילו כדי לקשור אותו אך מבלי להדק. ניק קנה נשימה לרוחב והכנס את הקטטר. אבטח את התפר בחוזקה סביב הקטטר על ידי משיכת התפר בחוזקה. אין להכניס את הקטטר יותר מ-1 ס"מ לתוך הריאה.
  6. נפח ריאות עם 1 מ"ל DPBS. משוך החוצה את ה-DPBS על ידי משיכה איטית של המזרק. נפח מחדש את הריאות עם אותו DPBS ומשוך שוב את המזרק לאחור כדי לקצור נוזל שטיפת סימפונות (BALF).
  7. נתק את המזרק מהקטטר והשאיר את הקטטר מוכנס. יש להוציא את BALF לתוך שפופרת מיקרו-צנטריפוגה.
  8. מלאו את אותו מזרק של 1 מ"ל ב-1 מ"ל של דיספאז וחברו מחדש לקטטר. יש להוציא מזרק כדי לנפח את הריאות עם דיספאז. בזמן הסרת הקטטר, הדק את התפר סביב קנה הנשימה כדי למנוע דליפה של דיספאז.
  9. חותכים את קנה הנשימה לרוחב. הסר את הריאות מחלל הגוף על ידי חיתוך רקמת החיבור לאורך החלק האחורי של כלוב הצלעות תוך שימוש במלקחיים כדי למשוך את הריאות וקנה הנשימה כלפי מעלה.
  10. הסר את הלב מהריאות. הניחו את הריאות ב-5 מ"ל DPBS על קרח.
  11. בשלב זה, קח את ה-BALF המופרד וסובב כלפי מטה ב-400 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. ניתן לצרף את הסופרנטנט ולאחסן אותו לפי הצורך. צריכה להיות גלולת תא גלויה שניתן להשעות מחדש ב-100 מיקרוליטר של RPMI.
    הערה: ניתן להמתין עד שעתיים כדי להמשיך בעיכול, מה שמאפשר לקצור מספר עכברים בכל פעם.

3. עיכול הריאות

  1. מכינים את תערובת העיכול. הוסף 83 μg/mL liberase (תמיסת מלאי של 50 μL), ו-100 μg/mL DNAse (תמיסת מלאי של 15 μL) ב-3 מ"ל של RPMI לכל ריאה.
  2. לנתח את חמש האונות של הריאות ולהשליך כל רקמת חיבור19,20. קוצצים את הריאה במספריים למשך דקה על מגלשת זכוכית.
  3. מעבירים את הריאה הקצוצה לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל בעזרת מספריים לדיסקציה. הוסף כדור תא שהוחזר מ-BALF והושעה מחדש ב-RPMI לתוך צינור הצנטריפוגה. הוסף 3 מ"ל של תערובת עיכול לצינור המכיל את הדגימה באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל.
  4. תערובת עיכול ריאות פיפט למעלה ולמטה 2-3 פעמים. מניחים ב-37 מעלות צלזיוס בשייקר אורביטלי ב-140 סל"ד עם צינורות עיכול הממוקמים בזווית של 45 מעלות למשך 40 דקות.

4. הכנת המתלה החד-תאי

  1. הסר את צינורות הצנטריפוגה בנפח 50 מ"ל משייקר המסלול והנח אותם על קרח. תערובת עיכול ריאות פיפטה למעלה ולמטה 5-6 פעמים. מסננים דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חדש של 50 מ"ל. שטפו את כל התאים שנותרו דרך המסנן ונטרלו אנזימים עם 10 מ"ל 5% FBS ב-RPMI.
  2. סובב במשך 5 דקות 4 מעלות צלזיוס בטמפרטורה של 600 x גרם. שאפו את הסופרנטנט באמצעות שואב ואקום או פיפטה. השעו מחדש ב-1 מ"ל של מאגר ליזה ACK ודגרו למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר כדי ליז כדוריות דם אדומות (RBCs). הוסף 9 מ"ל PBS ופיפטה למעלה ולמטה.
  3. יש לסובב במשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בטמפרטורה של 600 x גרם. שאפו סופרנטנט באמצעות שואב ואקום או פיפטה. השעו מחדש ב-1 מ"ל של חוצץ FACS (1% FBS ב-PBS) וסננו דרך רשת של 64 מיקרומטר לתוך שפופרת מיקרו-צנטריפוגה באמצעות פיפטה p1000.

5. ציטומטריית זרימה וניתוחים במורד הזרם

  1. אם מבצעים ציטומטריית זרימה או מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטי בצלחת של 96 בארות, יש לצבוע כ-1-2 מיליון תאים לבאר, או חלק של 8% מתרחיף הריאות.
  2. סובב את התאים כלפי מטה. יש לבצע את כל הסיבובים בצלחת של 96 בארות למשך 2.5 דקות (4 מעלות צלזיוס) בטמפרטורה של 600 x גרם. הסר את הסופרנטנט ושטוף את התאים פעם אחת על ידי השעיה מחדש של 200 מיקרוליטר של DPBS. סובב למטה והחליק.
  3. אם יש לצבוע תאים לניתוח ציטומטריית זרימה, המשך בהליך הצביעה הבא.
    1. השעו מחדש תאים בכתם זומבי חי/מת (1:150) ובלוק Fc (1:250) ב-25 מיקרוליטר של DPBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
    2. הכן את תערובת צביעת הנוגדנים בריכוז פי 2 במאגר ה-FACS.
      הערה: תערובת מכתים צריכה לכלול את כל הסמנים בלוח המיאלואיד (טבלה 1) או בלוח האפיתל (טבלה 2) בריכוזים המצוינים שלהם.
    3. הוסף 25 מיקרוליטר של תערובת מכתים ל-25 מיקרוליטר של תרחיף ריאות בצלחת ודגירה על קרח למשך 30 דקות בחושך. נפח הצביעה הכולל צריך להיות כעת 50 מיקרוליטר, והנוגדנים הראשוניים צריכים להיות בריכוז הצביעה הסופי שלהם פי 1.
    4. הוסף 150 מיקרוליטר של חוצץ FACS, סובב כלפי מטה למשך 2.5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ב-600 x גרם, והחלק את ה-supernatant. שטפו פעמיים ב-200 מיקרוליטר של מאגר FACS.
    5. אם נדרש צביעה תוך תאית, תקן את התאים בעזרת ערכת קיבוע תוך תאית. אם אין צורך בצביעה תוך-תאית, ניתן לתקן תאים למשך 20 דקות ב-4% PFA ב-DPBS.
    6. שטפו את הקיבוע עם 200 מיקרוליטר של מאגר FACS שלוש פעמים. ניתן לאחסן דגימות בתלייה ב-200 מיקרוליטר של מאגר FACS ב-4 מעלות צלזיוס בחושך למשך 2-3 ימים. לפני הפעלת דגימות, ניתן להוסיף חרוזי ספירת כדי לכמת את מספרי התאים.
  4. אם יש למיין תאים, המשך בהליך הצביעה הבא.
    1. השעו מחדש תאים בתערובת נוגדנים מכתים 1x עם בלוק Fc (1:250). דגירה למשך 30 דקות על קרח בחושך.
    2. הוסף 150 מיקרוליטר של חוצץ FACS, סובב כלפי מטה למשך 2.5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ב-600 x גרם, והחלק את ה-supernatant. שטפו שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר של מאגר FACS והשהו מחדש ב-200 מיקרוליטר של מאגר FACS לפני המיון.
      הערה: מומלץ להוסיף צבע כדאיות, כגון DAPI, לתאים לפני המיון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

עיכול מוצלח יביא לכ-20-25 מיליון תאים עם כדאיות של 90%-95%. אם מתווספים כ-25,000 חרוזי ספירה לחלק של 8% מהריאה, החרוזים אמורים לפגוע ב-1%-3% מהאירועים שנאספו. לאחר השער על סינגלים, כ-90%-95% מהתאים צריכים להיות שליליים ל-Zombie Aqua (מה שמעיד על כדאיות) (איור 2A, איור 3A).

מבין תאי CD45+, תאי CD64+F4/80+ מוגדרים כמקרופאגים (איור 2B). בנקודת ההתחלה, 80%-90% מכל המקרופאגים ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר עיכול ריאות של עכבר המבודד כ-20-25 מיליון תאים לעכבר עם כדאיות של 90%-95%. זה גם מאפשר איסוף של BALF לניתוח נוסף. תרחיף התאים המתקבל תואם למספר טכניקות מעבדה, כולל ציטומטריית זרימה ומיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטי לבידוד תאים לריצוף או תרבית תאים. בקצרה, לאחר הזילוף, נאסף BALF, והריאות מנופחות עם דיספאז. לאחר מכן קוצצים את הריאות ומתעכלים בתמיסת ליבראז/DNase. לאחר ליזה וסינון, ניתן להמשיך ביישומים במורד הזרם, כולל ניתוח ציטומטריית זרימה של תת-קבוצות מיאלואידיות ואפית...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (R35GM150816 ו-P30DK043351), קרן צ'ארלס ה. הוד ומכון תאי הגזע של הרווארד. אנו מודים לאלכסנדר מאן ולכל שאר חברי מעבדת פרנקלין על עזרתם ועצתם בתכנון ושכלול תוכניות השער והניתוחים של זרימה ציטומטרית. אנו מודים גם לליבת אימונולוגיה ציטומטריית זרימה בבית הספר לרפואה של הרווארד. ניתוח ציטומטריית זרימה בוצע באמצעות FlowJo. סכמות איורים נוצרו באמצעות BioRender.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מזרק 1 מ"ל עם קצה החלקהVWRBD309659
צינור מיקרוצנטריפוגה 1.7 מ"לDOT ScientificRN1700-GMT
10 מ"ל פיפטות (חד פעמיות)פישר סיינטיפיק12-567-603
מזרק 10 מ"ל עם קצה BD Luer-LokVWR75846-756
123 ספירת חרוזים ספירת חרוזיםתרמו סיינטיפיק01-1234-42
פיפטה 12 ערוצים (30-300ul)ארה"ב מדעי 7112-3300
16% פרפורמלדהידVWR100503-917
מחט 23 גרם עם שיפוע רגילVWR305194
מחט 27 גרם עם שיפוע רגילVWRBD305109
5 מ"ל פיפטות (חד פעמיות)תרמו פישר סיינטיפיק170373
50 מ"ל צינורות צנטריפוגהאולימפוס 28-108
צלחת תחתונה עגולה 96 בארותCorning3797
ACK מאגר ליסינגGibcoA100492-01
Alexa Fluor 488 נגד עכבר CD11cBioLegend117311
נוגדן חד שבטי נגד F4/80 חולדה (PE (Phycoerythrin)/Cy7)BioLegend123114
APC נגד עכבר CD64 (Fcγ RI)BioLegend139306
APC/Cyanine7 נגד עכבר CD45BioLegend103115
BD Insyte Autoguard Shielded IV צנתריםVWR381423
סגול מבריק 421 נגד עכבר I-A/I-E (MHC-II)BioLegend107632
סגול מבריק 421 נגד עכבר/אנושי CD11bBioLegend101235
מבריק סגול 605 נגד עכבר Ly-6CBioLegend128036
סגול מבריק 711 נגד עכבר CD45BioLegend103147
עכברי C57BL/6J Jackson Laboratories
Cd140a (PDGFRA) נוגדן חד שבטי (APA5), PE-Cyanine7, eBioscienceLife Technologies25-1401-82
CD170 (Siglec F) נוגדן חד שבטי (1RNM44N), PELife Technologies12170280
מסנני תאיםקורנינג352350
צנטריפוגהEppenodorf5910R
דאוקסיריבונוקלאז I מלבלב בקר (DNase)Millipore SigmaDN25-100MGמשוחזר ב-20 מ"ג/מ"ל ב-DPBS כתמיסת מלאי המאוחסנת ב-20 מעלות; C
DispaseVWR76176-668הופשר פעם אחת ומאוחסן כ-1 מ"ל ב-20 מעלות; C
מלקחיים לדיסקציה (Dumont #7)Fine ScienceTools 11297-00
מספריים לדיסקציהFine ScienceTools 14060-09
DPBSThermo Fisher Scientific14190250
ערכת קיבוע eBioscience LifeTechnologies00-5523-00
EDTALife TechnologiesAM9260G
אתנולVWRTX89125170HU
FBSGeminiBio100-106הופשר פעם אחת והושבת בחום לפני אחסון לטווח ארוך כציטוטים ב-20 מעלות; C
FITC נגד עכבר CD31 נוגדןBioLegend102406
Gibco RPMI 1640 MediumFisher Scientific11-875-093
מגלשות זכוכיתFisher Scientific12-552-3
מאגר בוגרארה"ב Scientific 1930-2235
דלי קרחקורנינג432128
הזרקת הידרוקולוריד קטמין (100 מ"ג/מ"ל)לשמור את תערובת המתת החסד של דקרה קטמין וקסיאלזין ב-30 מ"ג/מ"ל קטמין הידרוכלוריד ו-4.5 מ"ג/מ"ל קסילזין ב-DPBS סטרילי עד חודש.
LiberaseMillipore Sigma5401119001משוחזר ב-5 מ"ג/מ"ל ב-DPBS כתמיסת מלאי המאוחסנת ב-20 מעלות; C
מכסים לצלחות 96 בארותפישר סיינטיפיק07-201-731
חממה אורביטלית שייקרבארנסטד קו מעבדהSHKE4000
p1000 פיפטהאפנודורף3123000063
p1000 טיפיםארה"ב מדעי 1122-1830
p200 פיפטהEppenodorf3123000055
p200 טיפיםארה"ב מדעי 1110-1700
PE נגד עכבר CD326 (Ep-CAM)BioLegend118206
PerCP/Cyanine5.5 נגד עכבר CD104 נוגדןBioLegend123614
PerCP/Cyanine5.5 נגד עכבר Ly-6GBioLegend127616
Pipet-Aid Drummond4-000-101
מטוהר נגד עכבר CD16/32 BioLegend101302המכונה "בלוק FC" בטקסט
בקבוק ריסוסVWR23609-182
תפר (גודל 2-0)VWR100190-026
רפידות תחתונותVWR56617-014
Xysed (קסילזין 100 מ"ג/מ"ל)Pivetalראה הערות הידרוקולוריד קטמין למעלה. 
ערכת כדאיות ניתנת לתיקון זומבי אקווהBioLegend423102
ניתן

מקורות

  1. Wanner, A., Salathé, M., O'Riordan, T. G. Mucociliary clearance in the airways. Am J Respir Crit Care Med. 154 (6), 1868-1902 (1996).
  2. Mason, R. J., Williams, M. C. Type II alveolar cell. Defender of the alveolus. Am Rev Respir Dis. 115 (1), 81-91 (1977).
  3. Fehrenbach, H. Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited. Respir Res. 2 (1), 33-46 (2001).
  4. Basil, M. C., Alysandratos, K. -D., Kotton, D. N., Morrisey, E. E. Lung repair and regeneration: Advanced models and insights into human disease. Cell Stem Cell. 31 (4), 439-454 (2024).
  5. Hussell, T., Bell, T. J. Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context. Nat Rev Immunol. 14 (2), 81-93 (2014).
  6. Gschwend, J., et al. Alveolar macrophages rely on GM-CSF from alveolar epithelial type 2 cells before and after birth. J Exp Med. 218 (1), e20210745(2021).
  7. Gillich, A., et al. Capillary cell-type specialization in the alveolus. Nature. 586 (7831), 785-789 (2020).
  8. Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nat Commun. 10 (1), 3964(2019).
  9. Chakarov, S., et al. Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches. Science. 363 (6432), eaat3773(2019).
  10. Tsukui, T., et al. Collagen-producing lung cell atlas identifies multiple subsets with distinct localization and relevance to fibrosis. Nat Commun. 11 (1), 1920(1920).
  11. Aegerter, H., et al. Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection. Nat Immunol. 21 (2), 145-157 (2020).
  12. Johansson, C., Kirsebom, F. C. M. Neutrophils in respiratory viral infections. Mucosal Immunol. 14 (4), 815-827 (2021).
  13. Li, F., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages autonomously determine severe outcome of respiratory viral infection. Sci Immunol. 7 (71), eabj5761(2022).
  14. Moll, H. P., et al. Orthotopic transplantation of syngeneic lung adenocarcinoma cells to study PD-L1 expression. J Vis Exp. (143), e58101(2019).
  15. Warshamana, G. S., Corti, M., Brody, A. R. TNF-α, PDGF, TGF-β1 expression by primary mouse bronchiolar-alveolar epithelial and mesenchymal cells: TNF-α induces TGF-β1. Exp Mol Pathol. 71 (1), 13-33 (2001).
  16. Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 14 (3), 309-315 (1996).
  17. Quantius, J., et al. Influenza virus infects epithelial stem/progenitor cells of the distal lung: Impact on Fgfr2b-driven epithelial repair. PLoS Pathog. 12 (5), e1005544(2016).
  18. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. BIO Protoc. 11 (8), e3988(2021).
  19. Morton, J., Snider, T. A. Guidelines for collection and processing of lungs from aged mice for histological studies. Pathobiol Aging Age Relat Dis. 7 (1), 1313676(2017).
  20. Bijgaart, R. J. E., van den Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. Ex vivo live imaging of lung metastasis and their microenvironment. J Vis Exp. (108), e53741(2016).
  21. Shi, W., et al. Isolation and purification of immune cells from the liver. Int Immunopharmacol. 85, 106632(2020).
  22. Short, K. R., et al. Influenza virus damages the alveolar barrier by disrupting epithelial cell tight junctions. Eur Respir J. 47 (3), 954-966 (2016).
  23. Laidlaw, B. J., et al. CD4+ T cell help guides formation of CD103+ lung-resident memory CD8+ T cells during influenza viral infection. Immunity. 41 (4), 633-645 (2014).
  24. D'Agostino, M. R., et al. Protocol for isolation and characterization of lung tissue-resident memory T cells and airway-trained innate immunity after intranasal vaccination in mice. STAR Protoc. 3 (2), 101652(2022).
  25. Waal, A. M., de Hiemstra, P. S., Ottenhoff, T. H., Joosten, S. A., vander Does, A. M. Lung epithelial cells interact with immune cells and bacteria to shape the microenvironment in tuberculosis. Thorax. 77 (4), 408-416 (2022).
  26. Bhattacharya, J., Westphalen, K. Macrophage-epithelial interactions in pulmonary alveoli. Semin Immunopathol. 38 (4), 461-469 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים