Method Article

זיהוי מולטיפלקס של ביטוי גנים במוח הדרוזופילה השלם באמצעות פלואורסצנציה איטרטיבית בסיוע הרחבה בהכלאה באתרה

DOI:

10.3791/67656

⸱

May 2nd, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Project Technical Resources, Janelia Research Campus, Howard Hughes Medical Institute, 2Project Pipeline Support', Janelia Research Campus, Howard Hughes Medical Institute

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Expand-Assisted Fluorative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) היא טכניקה חזקה המשלבת מיקרוסקופ הרחבה עם הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) כדי לזהות ביטוי של גנים מרובים ברקמה עבה. פרוטוקול זה מתאר את ההתקדמות האחרונה בשיטה ואת התאמתה לתיוג מערכת העצבים המרכזית של דרוזופילה השלמה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבנת ביטוי גנים חיונית לפענוח תפקודים תאיים. עם זאת, שיטות לניתוח הביטוי של גנים רבים באתרם בתוך רקמה נתונה נותרו מוגבלות. פרוטוקול EASI-FISH המתואר כאן הותאם לאיתור ביטוי של עשרות גנים במערכת העצבים המרכזית (CNS) הבוגרת השלמה של דרוזופילה באמצעות ריאגנטים זמינים מסחרית. פרוטוקול זה כולל נוסחת ג'ל חדשה המשפרת את חוסן הג'ל, מאפשרת סבבים מרובים של הכלאה ומאפשרת הטמעה של מוחות מרובים בכל ג'ל. שיפור זה מגדיל את התפוקה, מאפשר השוואה אופטימלית של תנאי הניסוי ומפחית את עלויות הריאגנטים. בנוסף, על ידי שימוש במערכת GAL4-UAS לזיהוי משותף של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), ניתן לדמיין ביטוי גנים בסוגי תאי עצב או גליה ספציפיים. יש לציין כי הרזולוציה הגבוהה המושגת באמצעות מיקרוסקופ הרחבה, בשילוב עם רגישות השיטה, מאפשרת זיהוי של תעתיקי RNA בודדים. גישה זו משלבת ביעילות איכות תמונה גבוהה עם תפוקה גבוהה, מה שהופך אותה לכלי רב עוצמה לחקר ביטוי גנים ברחבי מוח הזבוב השלם.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FISH שימש לראשונה בדרוזופילה לפני למעלה מ-40 שנה כדי למפות גנים על כרומוזומי פוליטן1,2. כיום, FISH חד-מולקולה הוא תקן הזהב לאיתור וכימות מרחבי של תעתיקי mRNA ברקמה שלמה3. עם זאת, בשל בעיות של שלמות הדגימה ואובדן RNA, טכניקות FISH של מולקולה בודדת שלמה בדרוזופילה הוגבלו למספר קטן בלבד של גנים שניתן לנתח באותו דגימה4,5,6,7. בעוד שהפיתוח האחרון של ברקוד (למשל8,9,10) מגדיל את מספר התעתיקים שניתן לזהות עד כמה מאות אפילו ברקמות עבות11,12, הקמת פרוטוקולים כאלה דורשת השקעה ניכרת של משאבים, מה שעלול להוות מכשול ליישום. ואכן, טכניקות טרנסקריפטומיות מרחביות המצאתיות רבות לעולם אינן מתפשטות מעבר למוסדות המוצא שלהן13. לכן, שיטה פשוטה וזולה יחסית לאיתור ביטוי של עשרות גנים באותו מוח שלם תקל על מטרות מחקר שונות: אימות נתוני RNA ואטלס תאים, מיפוי סוגי תאים מולקולריים על פני מערכת העצבים המרכזית, כימות הבדלים התפתחותיים, ספציפיים למין או למין בביטוי גנים, או מדידת שינויים בביטוי גנים הנגרמים על ידי המגוון הגדול של הפרעות גנטיות או סביבתיות הזמינות בדרוזופילה.

מיקרוסקופ הרחבה היא טכניקה המאפשרת לחוקרים לצפות ברקמות ברזולוציה גבוהה יותר על ידי הרחבתן בהידרוג'ל14. EASI-FISH משלב מיקרוסקופ הרחבה ו-RNA FISH15, המשתמשת בתגובת שרשרת ההכלאה (HCR), טכניקה לא אנזימטית לזיהוי קשירת בדיקת אוליגו16. EASI-FISH פותחה לראשונה כגישה חלופית ל-FISH ברקמות דקות כדי למפות דפוסי ביטוי של עשרות גנים בפרוסות רקמה עבות (300 מיקרומטר) של עכבר היפותלמוס17. שיטה זו אידיאלית ליישום על מוחות זבובים בוגרים, בהתחשב בעובי של רקמה זו פחות מ-300 מיקרומטר, ולאחרונה תואר פרוטוקול EASI-FISH של זבוב אב-טיפוס 18. כאן, מוחות דרוזופילה מנותחים וקבועים משובצים בהידרוג'ל מתנפח, שבו mRNA וחלבונים מעוגנים קוולנטית לפולימר הג'ל עם חומרי האלקילציה Melphalan-X ו-Acryloyl-X (Ac-X), בהתאמה. לאחר עיכול חלבון, המאפשר התרחבות איזוטרופית של המוח, בדיקות אוליגו DNA ספציפיות לגן מוכלאות ל-mRNA ברקמה כדי לאתר תעתיקים מעניינים. לאחר מכן מתווספות סיכות שיער DNA מתויגות פלואורסצנטיות בשלב הכלאה שני. מולקולות סיכות ראש מרובות מתפלמרות בתגובת HCR ליצירת פולימרי DNA מטא-יציבים. זה מוביל להגברה של האות עבור תעתיקים בודדים, שניתן לזהות כנקודות בהירות על ידי יריעת אור או מיקרוסקופיה קונפוקלית.

העיגון הקוולנטי של mRNA וחלבון למטריצת הג'ל והעיכול הפרוטאוליטי של חלבונים לאחר היווצרות ג'ל יוצר סביבה שבה תעתיקי mRNA יציבים יחסית ועשויים להיות נגישים יותר לקשירת בדיקה. היציבות של mRNA והג'ל מאפשרת מספר סבבים של בדיקה חוזרת והדמיה, עם הפשטה של בדיקות DNA ותוצר HCR על ידי דגירה עם האנזים DNase1 בין סיבובים15,17. יתר על כן, הרחבת הדגימה מפחיתה את האוטופלואורסצנטיות ופיזור האור על ידי דה-צפיפות מולקולרית ומגדילה ביעילות את רזולוציית התמונה14. לכן, ניתן לפתור תעתיקי mRNA בודדים ביתר קלות.

GFP מקיים את ההליך מספיק כדי להישאר ניתן לזיהוי על ידי פלואורסצנציה או קשירת נוגדנים לאחר הרחבה. לכן, ניתן להשתמש בכתב זה כדי לסמן ולפלח סוגי תאים מעניינים. בשילוב עם קווי הנהג המפוצלים הרבים הספציפיים לנוירונים הזמינים (למשל, 19,20), זה פותח את האפשרות לקבל תובנה נוספת לגבי הזהות המולקולרית של סוג עצבי או לזהות תת-סוגים מולקולריים שלא ניתן להבחין בהם בקלות על ידי האנטומיה שלהם.

מתוארת כאן גרסה מעודכנת של אב הטיפוס של פרוטוקול EASI-FISH18 הכוללת שימור mRNA מעולה, הסרת קשיים טכניים וחוסן רב יותר של הג'ל. השינויים כוללים הגדלת ריכוז ה-PFA, הורדת טמפרטורת הקיבוע והקלה על הכנת הדגימה על ידי הרכבת המוח לפני הדגירה עם Melphalan-X ו-Ac-X. פרוטוקול זה משלב גם מתכון ג'ל חדש להגברת חוסן הג'ל, מה שמפחית ביעילות את נזקי הג'ל בעת ביצוע סבבים רבים של FISH והדמיה. שינויים אלה הופכים את הפרוטוקול לפשוט יותר לביצוע, מפחיתים הן את זמן העיבוד והן את השימוש במגיבים, ומגבירים את הביטחון בתוצאות עקביות. חשוב לציין שיכולת הריבוב גדלה כך שניתן לחקור עשרות גנים באותו מוח במשך תקופה של חודשים. זה מודגם על ידי דפוסי הביטוי של מספר גנים עצביים במוח הבוגר של דרוזופילה במגוון רמות ביטוי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה בוצע על נקבות בוגרות (בנות 5-6 ימים) של דרוזופילה מלנוגסטר, אך כל מין או מין של דרוזופילה ישים. למתכוני עוגן ג'ל, ראה טבלה משלימה 1; למתכון הג'ל, טבלה משלימה 2; ועבור ריאגנטים אחרים של EASI-FISH, טבלה משלימה 3. למדריך חומרים וריאגנטים יומיומיים, ראה טבלה משלימה 4. למחזיק ג'ל מיקרוסקופ גיליון קל, ראה קובץ משלים 1. איור 1A-C מציג תיאור סכמטי של הטמעת מוחות בג'לים לפני הרחבה והכלאה של בדיקה (שלבים 2.1 עד 3.8). איור 1D הוא צילום של המוחות המוטמעים, איור 1E מציג מחזיק ג'ל למיקרוסקופיה של גיליון אור, ו-איור 1F מתאר את ציר הזמן של ניסוי טיפוסי. הפרטים המסחריים של הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. דיסקציה וקיבוע של מוח זבוב

  1. לנתח מוחות זבובים או מערכת העצבים המרכזית במדיום S2 קר (לפרטי ניתוח נוספים, ראה התייחסות21)
  2. כדי לתקן את המוח, הוסיפו עד 20 מוחות או 10 מערכת העצבים המרכזית ל-2 מ"ל של 4% PFA/PBS קרים ודגרו למשך הלילה על נואטור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס><. אזהרה: PFA מזיק בבליעה או בשאיפה, מגרה את העור והעיניים ועלול להיות מסרטן.
  3. שטפו את הדגימה (1x) עם 2 מ"ל PBT קר (0.5%, ראה טבלה משלימה 4), ולאחר מכן שטפו את הדגימה עם 2 מ"ל PBT קר (4x) למשך 15 דקות על אגוז בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  4. שטפו את הדגימה (1x) עם 2 מ"ל של 70% EtOH קר. אחסן את המוח ב-2 מ"ל 70% EtOH בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.

2. העלאת מוחות והוספת מקשרים של RNA וחלבונים (יום 1)

הערה: ללבוש כפפות בכל עת ולנגב באופן עקבי את הציוד וסביבת העבודה עם RNase Away. כפפות נדרשות (1) כדי להרחיק RNases מדגימות ו-(2) כהגנה מפני מספר ריאגנטים המהווים סכנה בריאותית.

  1. הכן תאי ג'ל על ידי ניגוב שקופית לא טעונה עם מגיב טיהור RNase. הסר את הסרט האטום המגן על הדבק מאטם הסיליקון, הדבק את האטם (עם עד 4 תאים) לשקופית, וציפה כל משטח תא ב-1 מיקרוליטר פולי-ליזין באמצעות קצה פיפטה P20. יבש באוויר וחזור על התהליך.
    הערה: ניתן לבצע את שלב 2.1 יום קודם.
  2. העבירו את המוח לצינור PCR של 0.2 מ"ל (עד 4 מוחות לכל צינור) והחזירו לחות למשך (2x) 5 דקות ב-150 מיקרוליטר PBT (0.1%) ו-(2x) למשך 5 דקות ב-PBS.
  3. כדי להרכיב את המוחות, הוסיפו 40 מיקרוליטר של PBS לכל תא, ואז הדביקו בעדינות את המוחות בשורה במרכז החדר בעזרת פינצטה עדינה, והשאירו מרווח מסוים בין המוחות (ראו איור 1D). הרכבה של עד 6 מוחות או 2 CNS לכל תא אפשרית.
  4. הסר PBS והוסף מיד 50 מיקרוליטר של מאגר MOPS של 20 מ"מ. דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  5. בזמן שהמוחות מאזנים במאגר MOPS, הפשירו את תמיסות המלאי Melphalan-X ו-Ac-X והכינו 75 מיקרוליטר של תמיסת Melphalan-X/Ac-X לכל תא (דללו את מלאי Melphalan-X 1:1 עם מאגר MOPS והוסיפו Ac-X ב-1:100). מערבולת וסובב קצרות כדי לאסוף את התמיסה; תזמן את ההכנה כך שהתמיסה תהיה מוכנה בתום זמן הדגירה של 30 דקות, לא מוקדם יותר.
    אזהרה: Melphalan-X מזיק בבליעה או בשאיפה, מגרה את העור והעיניים ועלול להיות מסרטן.
  6. הסר את כל מאגר ה-MOPS והוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת Melphalan-X/AC-X.
  7. כסו את החדר על ידי הנחת כיסוי מעל, אך אל תשתמשו בדבק האטם כדי לאטום. הנח את החדר בקופסה לחה ודגר מוגן מאור למשך הלילה ב-RT.

3. ג'לציה ועיכול פרוטאינאז K (יום 2)

  1. הסר בזהירות את הכיסוי ואת Melphalan-X/Ac-X, ושטוף את המוחות המותקנים (2x) למשך 2 דקות עם 100 מיקרוליטר PBT (0.1%) ו-(1x) למשך 2 דקות עם 100 מיקרוליטר PBS.
  2. הפשירו את תמיסת TREx-1000, 4HT, TEMED ו-APS והמשיכו על הקרח.
    הערה: TREx-1000 יכול לשקע ב-20 מעלות צלזיוס; מערבולת היטב כדי להתמוסס לחלוטין לאחר ההפשרה.
    זהירות: ריאגנטים אלו מזיקים או רעילים בבליעה או בשאיפה, כמו גם חומרים מגרים בעור ובעיניים.
  3. הכן את תמיסת הג'ל על ידי ערבוב TREx-1000 עם 4HT, TEMED ו-APS ביחס של 94:2:2:2. מערבולת ולשמור על קרח. לכל תא, הכינו 150 מיקרוליטר תמיסת ג'ל.
  4. הסר את PBS מהתא בעזרת קצה פיפטה ונתף בזהירות את כל ה-PBS שנותר עם מגבון נטול מוך. לכל תא, הוסף מיד 40 מיקרוליטר תמיסת ג'ל על גבי המוח. דגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  5. הסר את תמיסת הג'ל והוסף 40 מיקרוליטר של תמיסת ג'ל טרייה, תוך דגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות נוספות.
    הערה: אוספים תמיסת פסולת ג'ל בצינור מיקרו-צנטריפוגה ומפלמרים לפני השלכתה.
  6. הסר את תמיסת הג'ל וקלף את סרט המגן השקוף מדבק פני השטח של האטם. הוסף 45 מיקרוליטר אחרון של תמיסת ג'ל טרייה, הנח בעדינות כיסוי מעל החדר והימנע מלכידת בועות אוויר. לחץ על משטח הכיסוי כדי לאטום את החדר ולדגור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (בסך הכל שיווי משקל של 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס).
  7. פילמרו את הג'ל בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה וחצי.
  8. לאחר שהג'לים התייצבו, הניחו להם להתקרר על הספסל למשך מספר דקות. הסר בזהירות את הכיסוי והסר את אטם הסיליקון בעזרת סכין גילוח חדש. לאחר מכן, חתוך את הג'ל למלבן וחתוך את הפינה הימנית העליונה כדי לעקוב אחר כיוון הדגימה.
  9. הסר את הג'לים מהשקף בעזרת מברשת צבע עדינה שהורטבה בכמות קטנה של ProK Buffer והעביר אותם בנפרד לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 2 מ"ל.
  10. יש לדגור על כל ג'ל עם 500 מיקרוליטר של חוצץ ProK ו-5 מיקרוליטר של אנזים ProK (1:100) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

4. עיכול DNA והכלאת בדיקה (יום 3)

  1. שטפו את הג'לים (3x) למשך 10 דקות עם 1 מ"ל PBS ב-RT.
    הערה: השתמש בפיפטות העברה עדינות כדי למנוע נזק לג'ל בעת החלפת התמיסות.
  2. דגירה של ג'לים למשך 30 דקות ב-1 מ"ל של מאגר DNase1 ב-37 מעלות צלזיוס.
  3. הוסף 50 מיקרוליטר של אנזים DNase1 ל-450 מיקרוליטר של מאגר DNase. מערבבים בעדינות, אך לא מערבולים. דגרו כל ג'ל ב-500 מיקרוליטר של DNase1 למשך 2 שעות ו-37 מעלות צלזיוס. שטפו (4x) 15 דקות עם 1 מ"ל PBS ב-RT.
    הערה: ניתן לאחסן ג'לים ב-5x SSC ב-4 מעלות צלזיוס לפני או אחרי עיכול/שטיפה של DNase למשך מספר שבועות.
  4. הכלאה של הפשרה (hyb) ומאגר שטיפת בדיקה. דגרו את הג'לים ב-500 מיקרוליטר של מאגר hyb ללא בדיקות למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
    זהירות: מאגר ה-hyb והבדיקה מכילים פורממיד, החשוד כגורם לסרטן.
  5. מדללים את הבדיקות 1:100 במאגר hyb (10 ננומטר), ומכינים 300 מיקרוליטר לג'ל. דגרו את הג'לים עם מאגר hyb ובדיקות למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס.

5. שטיפות בדיקה (יום 4)

  1. שטפו את הג'לים (3x) למשך 30 דקות עם 750 מיקרוליטר של מאגר שטיפת בדיקה ב-37 מעלות צלזיוס.
  2. שטפו את הג'לים (3x) למשך 30 דקות, ולאחר מכן (3x) למשך שעה עם 1 מ"ל PBS ב-37 מעלות צלזיוס.
  3. שטפו את הג'לים ב-2 מ"ל PBS ב-RT למשך הלילה או 4 מעלות צלזיוס במהלך סוף השבוע.

6. תגובת שרשרת הכלאה (HCR) עם סיכות שיער פלואורסצנטיות (יום 5)

הערה: לעקרון ה-HCR, ראה reference22.

  1. דגרו את הג'לים ב-500 מיקרוליטר של מאגר הגברה (amp) למשך 30 דקות ב-RT.
  2. יש לחמם את סיכות השיער הפלואורסצנטיות בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות במכונת PCR ולקרר במהירות ל-25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  3. עבור כל בדיקה, יש לדלל זוגות סיכות ראש תואמים (h1 ו-h2) 1:50 במאגר אמפר, ולהכין 300 מיקרוליטר לכל ג'ל ומערבולת.
  4. דגרו את הג'לים עם תערובת סיכת הראש למשך 3 שעות ב-RT בחושך.
  5. שטפו את הג'לים (2x) למשך 15 דקות עם 750 מיקרוליטר של 5x SSCT ו-(2x) למשך 30 דקות עם 1 מ"ל של 0.5x SSCT ב-RT.
  6. אם המוח מבטא GFP, יש לצבוע ב-500 מיקרוליטר של נוגדן אנטי-GFP-AF488 (1:500) ב-PBT (0.1%) המכיל 5 מ"ג/מ"ל של BSA טהור במיוחד ולדגור במהלך הלילה (או במהלך סוף השבוע) ב-4 מעלות צלזיוס.

7. הרכבת ג'לים והדמיה (יום 6)

  1. לאחר הדגירה של נוגדנים, יש לשטוף את הג'לים פעם אחת ולשטוף (1x) למשך 30 דקות עם 1 מ"ל PBT (0.1%), ולאחר מכן (3x) למשך 30 דקות עם 1 מ"ל PBS.
    הערה: כביסה ב-PBS תגרום להרחבה פי 2; להרחבה פי 3, שטפו עם 0.05x SSC.
  2. בזמן הכביסה, מצפים את משטח חיבור הג'ל של מחזיק הג'ל של מיקרוסקופ היריעה הקלה פעמיים ב-1 מיקרוליטר פולי-ליזין, מה שמאפשר לו להתייבש ב-37 מעלות צלזיוס בין שכבות. באופן דומה, להדמיה קונפוקלית, מצפים את אזור החיבור לג'ל של צלחת תחתית זכוכית במריחות חוזרות ונשנות של פולי-ליזין.
  3. מכתים את הג'לים למשך 30 דקות ב-RT ב-1 מ"ל של 5 מיקרוגרם/מ"ל DAPI/PBS או DAPI/0.05x SSC, או לחילופין, מכתימים למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
  4. כדי להרכיב את הג'ל על מחזיק הג'ל (מיקרוסקופ גיליון בהיר) או על צלחת תחתית זכוכית (מיקרוסקופ קונפוקלי), הניחו את הג'ל על כיסוי וייבשו בזהירות את הקצוות בעזרת מגבון נטול מוך. ודא שהג'ל מכוון כך שהרקמה תהיה הקרובה ביותר למטרה. בעזרת מכחול, הניחו בעדינות את הג'ל על משטח הפולי-ליזין בתנועה אחת. להדמיה, יש לרחוץ ג'ל ב-PBS (או 0.05x SSC אם מתרחבים ל-3x).
    הערה: לאחר ההדמיה ניתן להסיר בעדינות ג'לים ממשטח הפולי-ליזין בעזרת מברשת רטובה ולהעביר לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 2 מ"ל.
  5. לבדיקה חוזרת מיידית, המשך ליום 7. לאחסון לטווח ארוך יותר (שבוע עד 6 חודשים), יש לאחסן ג'לים ב-1 מ"ל של 5x SSC בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. כשהוא מוכן לשימוש, שטפו ג'לים (3x) למשך 10 דקות עם 1 מ"ל PBS לפני שתמשיך.
    הערה: מידת ההתפשטות עקבית בדרך כלל במאגרים המתוארים (~2x ב-PBS ו-~3x ב-0.05x SSC). כדי לבדוק את גורם ההתפשטות, מדדו את גודל המוח לפני ואחרי ההתרחבות בתמונות שצולמו בסטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדי לדמיין את המוח לאחר הרחבה, צבעו אותו בקצרה ב-DAPI. גורם ההתפשטות המשוער הוא הגודל שלאחר ההרחבה חלקי הגודל שלפני ההרחבה.

8. הפשטת בדיקות וסיכות שיער לריבוב (יום 7)

  1. דגרו את הג'לים למשך 30 דקות ב-1 מ"ל של מאגר DNase1 ב-37 מעלות צלזיוס.
  2. הוסף 50 מיקרוליטר של DNase1 ל-450 מיקרוליטר של מאגר DNase. מערבבים בעדינות, אך לא מערבולים. דגרו את הג'לים ב-500 מיקרוליטר של DNase1 למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס.
  3. שטפו (4x) למשך 15 דקות עם 1 מ"ל PBS ב-RT. הג'לים מוכנים כעת לסבב ההכלאה הבא (יום 3, שלב 6).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הביצועים של פרוטוקול EASI-FISH מותאם זה מודגמים על ידי זיהוי הביטוי של מספר גנים שונים הקשורים למוליכים עצביים ונוירופפטידים על פני מוח הדרוזופילה הבוגר לאורך מספר סבבים. בדרך כלל, מוחות ג'ל ומורחבים הוכלאו עם שניים או שלושה בדיקות בכל סיבוב, ואחריהם HCR עם זוגות סיכות ראש מצומדים עם Alexa Fluor (AF) 488 (אלא אם כן GFP בא לידי ביטוי), AF546 ו-AF647 או Janelia Fluor (JF) 669. ההדמיה בוצעה בעיקר במיקרוסקופ של גיליון אור, וקיבלה ערימת z אחת או מספר אריחים שנתפרו יחד כדי להקיף את המוח כולו. ערימות z בודדות נרכשו גם ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול EASI-FISH המתואר עבור מערכת העצבים השלמה של דרוזופילה מאפשר זיהוי של עשרות תעתיקים באותו מוח או במערכת העצבים המרכזית. הוא חזק, פשוט ורגיש, וניתן לשלב אותו עם זיהוי GFP כדי לזהות תת-קבוצות של נוירונים או גליה. מכיוון ששיטה זו קלה ליישום, היא אמורה להקל על מחקר על ידי מעבדות דרוזופילה המעוניינות במיפוי וכימות ביטוי גנים במוח הזבוב השלם.

EASI-FISH מספק מספר יתרונות על פני פרוטוקולי FISH קודמים שאינם כוללים מיקרוסקופ הרחבה. יציבות RNA מצוינת נצפית לאורך סבבים רבים של FI...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לפול טילברג על עצות לגבי הדינמיקה של מיקרוסקופיית התפשטות, לכריסטינה כריסטופורו על העזרה בנתיחות מוח, ולג'פרי מייסנר על המשוב הביקורתי. אנו מודים גם לטניה וולף וג'רי רובין, כמו גם לג'פרי מייסנר וויאט קורף, על שאפשרו לנו לכלול תוצאות שנוצרו כחלק משני מחקרים גדולים יותר. כל העבודה בוצעה בקמפוס המחקר של ג'נליה ונתמכה על ידי המכון הרפואי הווארד יוז באמצעות מימון לצוותי הפרויקט MultiFISH ו-Fly-eFISH, ג'רי רובין ומשאבים טכניים של הפרויקט.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צינורות PCR של 0.2 מ"ל ארה"ב מדעית 1402-4700
צינורות מיקרוצנטריפוגה עם מכסה בורג 0.5 מ"ל, ענברארה"ב מדעי 1405-9707
0.5 מ' EDTA, PH 8, RNaseחינם InvitrogenAM9260G
10 מ' NaOHSigma72068
10x PBS פישרBP 3994
20x SSCThermoFisherAM 9763
40% אקרילאמיד Bio-Rad1610140
4-הידרוקסי-טמפו (4HT)סיגמא 176141
5M נטול NaCl RNase תרמופישרAM97060G
פיפט טרנספר 5 מ"ל- קצה עדיןגלובל סיינטיפיק 134070-S20
צלחת תחתונה מזכוכית 6 בארות CellvisP06-1.5H-N
אצטוניטריל, נטול מים ThermoFisher042311-K7
חומצה אקריליתTCIA0141
אקרילויל-X ThermoFisherA20770
אמוניום פרסולפט (APS)SigmaA3678
מאגר הגברה  מכשירים מולקולרייםhttps://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish
ללא מים DMSOInvitrogenD12345
AstA_B2מכשירים מולקולרייםPRR477
מכשיריםמולקולרייםChAT_B1 PRG115
מכשירים מולקולרייםCrz_B5 PRR480
DAPIסיגמאD9542
FIJIקוד פתוחhttps://imagej.net/software/fiji/
FMRFa_B2מכשירים מולקולרייםPRR487
מכשירים מולקולרייםGAD1_B5RTE581
GFP נוגדן פוליקלונלי, Alexa Fluor 488ThermoFisherA-21311
מכשיריםמולקולריים מאגר הכלאה
Imaris StitcherOxford Instrumentshttps://imaris.oxinst.com/products/imaris-stitcher
Imaris viewerOxford Instrumentshttps://imaris.oxinst.com/imaris-viewer
JF-669, SE Tocris6420
MelphalanCaymen Chemicals16665
MOPs BufferFisherBP308-100
N,N מתילן-ביס-אקרילאמיד Bio-Rad1610142
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)SigmaT22500
מים ללא נוקלאז אמביוןAM9932
אוליגו בדיקות מכשירים מולקולרייםhttps://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish
פרפורמלדהיד (PFA)EMS15710
PBSפישר 
Photoflo-200 EMS74257
פולי-L-ליזין הידרוברומיד (פוליליזין)SigmaP1524
מאגר שטיפת בדיקהמכשירים מולקולרייםhttps://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish
פרוטאינאז K NEBP8107S
QIAערכת הסרת נוקלאוטידים מהירהQiagen28306
RNase Away ThermoFisher7003, מגיב
RNase-Free DNase1Qiagen79254
S2ThermoFisher21720024
אטמי סיליקון InvitrogenP24743
מכשירים מולקולרייםTdc2_B5RTE880
מכשירים מולקולרייםTk_B5PRR484
UltaPure 10% SDSThermofisher15553027
Ultrapure BSAThermoFisherAM2616
מכשירים מולקולרייםלא מצומדים ואלקסה פלואור מצומדים סיכותשיער מכשירים מולקולריים
VAChT_B1מכשירים מולקולרייםRTA904
מכשירים מולקולרייםvGLUT_B2RTB212
Zeis Z7 ג'נליה קבצי CAD זמינים על פי בקשה
Zeiss LSM 980 קונפוקלי מיקרוסקופ הפוךZeisshttps://www.janelia.org/node/46947/#lsm980
Zeiss Z7 מיקרוסקופ גיליון אורZeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html
https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fishBP24384טיהור בינוני https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish מחזיק ג'ל

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. Immunological method for mapping genes on phila polytene chromosomes. Proc Natl Acad Sci USA. 79 (14), 4381-4385 (1982).
  2. Gall, J. G. The origin of in situ hybridization - A personal history. Methods. 98, 4-9 (2016).
  3. Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Rep. 46 (2), 65-72 (2013).
  4. Long, X., Colonell, J., Wong, A. M., Singer, R. H., Lionnet, T. Quantitative mRNA imaging throughout the entire Drosophila brain. Nat Methods. 14 (7), 703-706 (2017).
  5. Yang, L., et al. Single-molecule fluorescence in situ hybridization for quantitating post-transcriptional regulation in Drosophila brains. Methods. 126, 166-176 (2017).
  6. Meissner, G. W., et al. Mapping neurotransmitter identity in the whole-mount Drosophila brain using multiplex high-throughput fluorescence in situ hybridization. Genetics. 211 (2), 473-482 (2019).
  7. Duckhorn, C. J., Junker, I. P., Ding, Y., Shirangi, T. R. Combined in situ hybridization chain reaction and immunostaining to visualize gene expression in whole-mount Drosophila central nervous systems. Behavioral Neurogenetics. 181, 1-14 (2022).
  8. Eng, C. L., et al. Transcriptome-scale super-resolved imaging in tissues by RNA seqFISH. Nature. 568 (7751), 235-239 (2019).
  9. Zhang, M., et al. Spatially resolved cell atlas of the mouse primary motor cortex by MERFISH. Nature. 598 (7879), 137-143 (2021).
  10. Janssens, J., et al. Spatial transcriptomics in adult Drosophila reveals new cell types in the brain and identifies subcellular mRNA patterns in muscles. eLife. 13, RP92618(2024).
  11. Gandin, V., et al. Deep-tissue spatial omics: Imaging whole-embryo transcriptomics and subcellular structures at high spatial resolution. bioRxiv. , (2024).
  12. Fang, R., et al. Three-dimensional single-cell transcriptome imaging of thick tissues. eLife. 12, RP90029(2023).
  13. Moses, L., Pachter, L. Museum of spatial transcriptomics. Nat Methods. 19 (5), 534-546 (2022).
  14. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Optical imaging: Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  15. Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nat Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
  16. Schwarzkopf, M., et al. Hybridization chain reaction enables a unified approach to multiplexed, quantitative, high-resolution immunohistochemistry and in situ hybridization. Development. 148 (22), 199847(2021).
  17. Wang, Y., et al. EASI-FISH for thick tissue defines lateral hypothalamus spatio-molecular organization. Cell. 184, 6361-6377 (2021).
  18. Eddison, M., Ihrke, G. Expansion-assisted iterative fluorescence in situ hybridization (EASI-FISH) in Drosophila CNS. protocols.io. , (2022).
  19. Meissner, G., et al. A split-GAL4 driver line resource for Drosophila CNS cell types. bioRxiv. , (2024).
  20. Nern, A., et al. Connectome-driven neural inventory of a complete visual system. bioRxiv. , (2024).
  21. FlyLight Protocol. , HHMI Janelia Research Campus. Available from: https://www.janelia.org/project-team/flylight/protocols (2025).
  22. HCR Amplification Technology. , HCR. Available from: https://www.molecularinstruments.com/technology (2025).
  23. Wolff, T., et al. Cell-type-specific driver lines targeting the Drosophila central complex and their use to investigate neuropeptide expression and sleep regulation. eLife. 14, RP104764(2025).
  24. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Watanabe, K., Chiu, H., Anderson, D. J. Whole-brain in situ mapping of neuronal activation in Drosophila during social behaviors and optogenetic stimulation. eLife. 12, RP92380(2024).
  26. Damstra, H. G. J., et al. Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx). eLife. 11, e73775(2022).
  27. Xu, S., et al. Behavioral state coding by molecularly defined paraventricular hypothalamic cell type ensembles. Science. 370 (6514), abb2494(2020).
  28. Wang, Y., et al. EASI-FISH for thick tissue defines lateral hypothalamus spatio-molecular organization. GitHub. , (2021).
  29. Park, G., et al. Using Amira to generate cell body masks in fluorescent light sheet microscopy images of EASI-FISH samples. protocols.io. , (2023).
  30. Bahry, E., et al. RS-FISH: Precise, interactive, fast, and scalable FISH spot detection. Nat Methods. 19 (12), 1563-1567 (2022).
  31. Managan, C., Ihrke, G. EASI-FISH spot counting in Drosophila brain using RS-FISH. protocols.io. , (2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Gene ExpressionDrosophila BrainExpansion MicroscopyIn Situ HybridizationEASI FISHMultiplex DetectionConfocal MicroscopyLight Sheet MicroscopyNeuropeptide ExpressionSingle RNA Detection

Related Articles