מאמר שיטה

מודל זעזוע מוח בילדים בעכברים: פגיעת ראש סגורה עם הפרעות ארוכות טווח (CHILD)

1.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67667

⸱

7 בפברואר 2025

 ,  ,  , 
1Centre d'Études Biologiques de Chizé-Centre National de la Recherche Scientifique (CEBC-CNRS), UMR 7372 CNRS/Université de La Rochelle, 2Univ. Bordeaux, CNRS, CRMSB, UMR 5536, 3Division of Biomedical Sciences, School of Medicine, University of California Riverside, 4Department of Basic Sciences, Loma Linda University School of Medicine

מחברים מתאימים: Christophe J. Dubois <cdubois@rmsb.u-bordeaux.fr>

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

זעזוע מוח בילדים עלול לגרום להפרעות פיזיולוגיות ופסיכולוגיות ארוכות טווח. מודל זה של עכבר זעזוע מוח בילדים גורם לדלקת עצבית ארוכת טווח, שינויים בחומר הלבן ושינויים עצביים עם תפקוד התנהגותי לקוי. ניתן להתאים את המודל למיקומי פגיעה דיפרנציאליים או לזעזועי מוח חוזרים ונשנים כדי להעריך שינויים במהלך החיים.

תקציר

זעזוע מוח ופגיעות מוח טראומטיות קלות (mTBI) במהלך הילדות מהווים סכנה בריאותית משמעותית, כאשר מטופלים רבים בשלב מאוחר יותר בחיים מציגים תוצאות פיזיולוגיות, נוירולוגיות ופסיכו-סוציאליות מתישות. המנגנונים הפתופיזיולוגיים התאיים והמולקולריים אינם ידועים יחסית, ופער משמעותי זה מונע למעשה חקירות של אסטרטגיות טיפוליות ספציפיות למיתון תופעות לוואי כרוניות. אין מודל יחיד לזעזוע מוח של בעלי חיים המשחזר את כל התכונות שדווחו בבני אדם, והמודלים הנוכחיים מתוכננים לענות על שאלות מחקר ספציפיות. יצאנו לפתח זעזוע מוח לנוער המשחזר סימפטומולוגיה קלינית מוקדמת וארוכת טווח שנתקלנו בה, המכונה פגיעת ראש סגורה עם הפרעה ארוכת טווח (CHILD). במודל זה, כוח זעזוע מוח באמצעות מפגע אלקטרומגנטי מועבר לראשו של עכבר מורדם קלות ללא רסן ביום 17 (P17), המאפשר סיבוב חופשי של הראש. עכברים מונחים על רדיד פח מתוח היטב על פני מכשיר סטריאוטקטי, והמשפיע מיושר בזהירות עם אזור קליפת המוח הממוקדת. המשפיע האלקטרומגנטי מאפשר את בחירת עומק הפגיעה, השהייה ומשך הזמן כדי לקבוע את חומרת הפציעה. חוזקו של מודל זה הוא בכך שהוא מאפשר סיבוב ראש, תכונה קלינית חשובה. לאחר הפגיעה, העכברים מנוטרים באופן מיידי כדי להקדיש זמן וזמן לחקור את סביבתם, ולאחר מכן הם חוזרים לסכר שלהם. הגדלת חומרת זעזוע המוח גורמת לדימום תוך גולגולתי בתת-קבוצה של עכברים. עכברים יכולים להיות מנוטרים באופן שגרתי עבור התנהגות ודימות מוחי לאורך חייהם, לפי הצורך. חומרות פציעה שונות מחקות את האופי ההטרוגני של זעזועי מוח בקרב צעירים. מודל CHILD הסטנדרטי הנוכחי אינו מציג שבר בגולגולת, אין שינוי נצפה בדימות מוחי קונבנציונלי (בדומה לקליני), אך מוביל למוות עצבי מתקדם ומתמשך, MRI דיפוזיה שונה, פעילות עצבית שונה ופלסטיות, גליוזה מוגברת והפרעות התנהגותיות מתקדמות עם הגיל. לסיכום, מודל CHILD זה מחקה את המאפיינים המוקדמים וארוכי הטווח שנצפו בחולי זעזוע מוח קליניים רבים.

מבוא

פגיעה מוחית טראומטית בילדים (TBI) היא דאגה בריאותית עיקרית, שכן היא מייצגת את הגורם המוביל לביקורים רפואיים דחופים בילדים, והיא קשורה לתוצאות בריאותיות מתישות בשלב מאוחר יותר בחיים. אפילו פגיעה מוחית טראומטית קלה (mTBI), המהווה 75% מכלל מקרי TBI1, מובילה להפרעות ארוכות טווח, כולל הפרעות פיזיולוגיות, פסיכולוגיות, נוירולוגיות וקוגניטיביות2. למרות השכיחות הגבוהה של mTBI בילדים והסיכונים הבריאותיים המשמעותיים הקשורים אליה, המנגנונים הפתולוגיים, התאיים והמולקולריים שקודמים לליקויים הכרוניים עדיין לא נחקרו. פער הידע הזה מעכב את הפיתוח של טיפולים יעילים ושיטות אבחון ל-mTBI בילדים.

מודלים של TBI של מכרסמים בוגרים כוללים ירידה במשקל, פגיעה מבוקרת בקליפת המוח ופגיעה בכלי הקשה בנוזלים, וניתן לטיטרציה אותם כדי לגרום לפציעות בינוניות עד חמורות (תלוי במדדי התוצאה)3,4. רבים מהמודלים למבוגרים האלה הותאמו לפגיעה מוחית טראומטית 5,6 בילדים. במהלך העשור האחרון פותחו מודלים של mTBI במכרסמים עם פגיעת ראש סגורה וכן במודלים סיבוביים7. עם זאת, היישום של מודלים אלה בפיתוח מכרסמים הוא דליל בהשוואה לספרות TBI למבוגרים8. כדי להתמודד עם הרלוונטיות הקלינית, המקיפה מגוון רחב של חומרות המדגימות הטרוגניות קלינית בילדים, מחקר זה פיתח את מודל פגיעת ראש סגורה עם הפרעה ארוכת טווח (CHILD) TBI. CHILD הוא מודל זעזוע מוח לא ניתוחי ובלתי מרוסן המשתמש בעכברי P17, גיל התפתחותי המתאים לשיא המיאלינציה שנצפהאצל ילדים בני 2-3 9. כוח זעזוע מוח מועבר באמצעות השפעה אלקטרומגנטית על קליפת המוח הסומטוסנסורית של עכבר מורדם קלות איזופלורן. פגיעה בראש בלתי מרוסן גורמת לכוחות סיבוביים על המוח10, כפי שדווח בדיווחים קליניים רבים על זעזוע מוח. בהתאם ל-mTBI קליני, מודל CHILD אינו מוביל לשבר בגולגולת או לחריגה נראית לעין בדימות מוחי קונבנציונלי.

למודל CHILD מספר יתרונות. ראשית, מאפיינים פתולוגיים מוקדמים וארוכי טווח נצפו ב- CHILD, המחקים את המאפיינים הקליניים הפתולוגיים שנצפו בחולי זעזוע מוח לנוער. היא נצפתה בנקודות זמן מאוחרות גליוזיס, MRI טנזור דיפוזיה שונה, והפרעות התנהגותיות מתקדמות עם גיל10,11, פעילות עצבית שונה ופלסטיות11,12. באופן מעניין, תוצאות היקפיות לא חשודות נמצאו גם עם הפרעות לב בטווח הארוך לאחר פגיעה אחת בילדים13. שנית, מודל זה ניתן לשכפול והראה תוצאות דומות בין חוקרים ובין מעבדות13. שלישית, מודל CHILD הוא גמיש וניתן להרחיבו כדי לתמצת את האופי ההטרוגני של TBIs. לדוגמה, מחקרים קודמים הראו כי מהירויות ועומקי פגיעה שונים גורמים לחומרות שונות10,11. לבסוף, חוזק נוסף של מודל זה הוא שניתן לתת CHILD שוב ושוב וניתן ליישם אותו בקלות על מיקומים דיפרנציאליים כדי לבחון תגובות לפגיעות חוזרות ונשנות ולזהות אזורי מוח פגיעים.

באופן כללי, מודל CHILD משכפל mTBI קליני וזעזוע מוח בילדים ומשמש ככלי מחקרי כדי להקל על הבנת המאפיינים הפתופיזיולוגיים של mTBI בילדים. בעוד שאף מודל אינו מתמצת את כל ההיבטים של התכונות המתוארות במקרי TBI בחיים האמיתיים, מודל זה יכול לענות על רבות משאלות המחקר הבולטות שנותרו ללא מענה.

פרוטוקול

הניסויים שוחזרו בשני אתרים, אוניברסיטת בורדו (צרפת) ואוניברסיטת קליפורניה ריברסייד (קליפורניה, ארה"ב).

בבורדו, כל הניסויים בוצעו על עכברים זכרים ונקבות P17 C57Bl6J שגודלו במתקן בעלי חיים באוניברסיטה. המגדלים הראשונים התקבלו ממקור מסחרי וגידלו בתנאים סטנדרטיים עם מחזור כהה/אור של 12/12 שעות, טמפרטורה של 21 ° C ± 1 ° C, ולחות של 55% ± 10%, ומזון ומים שסופקו אד ליביטום. הליכי הניסוי הם בהתאם לתקנות הוועדה לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת בורדו, החוקים הצרפתיים המסדירים שימוש בחיות מעבדה (הרשאה #29324-2021012118549817 v3), הנחיות המועצה האירופית (86/609/EEC) והנחיות ARRIVE. פרוטוקול זה, בהיותו מודל קל של פגיעה מוחית טראומטית, אינו מייצר כאב או מצוקה. ככזה, הוא אינו מחייב טיפול ספציפי בכאב מעבר לטיפול הכאב הרגיל. גמילת הגורים (TBI, Shams) הייתה יעילה ב-P25.

בריברסייד, נקבות E13 בהריון C57Bl6J הושגו באופן מסחרי, וכל הניסויים בוצעו על ההמלטות שהתקבלו הן בגורים זכרים והן בגורים נקבות בגילאי P17. בעלי החיים גודלו עם מחזור אוטומטי של 12/12 שעות חושך / אור וטמפרטורה של 21 מעלות צלזיוס. לסכרים ולגורים הייתה גישה למזון ולמים. כל הליכי הניסוי אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת קליפורניה, ריברסייד, ועמדו בחוק רווחת בעלי החיים ובמדיניות שירותי בריאות הציבור. כל הגורים (TBI, Sham) במתקן זה נגמלו ב-P21.

פרטי בעלי החיים, הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. צעדים מקדימים

  1. כדי למנוע היפותרמיה, יש לחמם מראש את החדר להשראת הרדמה ואת כלובי ההתאוששות בעזרת רפידות חימום.
  2. הגדר את המנגנון הסטריאוטקסי כאשר המשפיע מותקן בזווית של 90°.
  3. ודא שכל החלקים מהודקים ומאובטחים כראוי ושהבוכנה מוברגת היטב למשפיע.
  4. חותכים גיליון אלומיניום שיתאים למנגנון הסטריאוטקסי (במקרה זה, 18 ס"מ x 30 ס"מ). האלומיניום המשמש כאן הוא באיכות אלומיניום סטנדרטית. עטפו את המסגרת הסטריאוטקסית בנייר כסף כדי ליצור כרית שעליה יונח החיה. אבטחו את המיקום והמתח של נייר הכסף בעזרת סרט מעבדה רגיל על מנת לשמור על משקל החיה.
  5. הפעל את בקר המשפיע, ובתפקוד חומרת הפציעה, הגדר את מהירות הפגיעה ל- 2 M.S-1 לדרגה 1 (G1) או 3 M.S-1 לדרגה 2 (G2) לפגיעה חמורה יותר (שינוי פרמטר זה ישפיע על חומרת זעזוע המוח).
  6. משקלו את בעלי החיים. ב-P17, משקל בעלי החיים חייב להיות מעל 5.9 גרם עבור עכברי C57Bl6. בעלי חיים שנופלים תחת משקל זה אינם נכללים.
    הערה: עבור מחקרים מסוימים, עכברי CD1 שימשו, ועבור P17, הסף נקבע להיות מעל 6.5 גרם (נתונים אישיים).

2. הליך פגיעה מוחית טראומטית קלה לנוער

  1. מרדימים את העכבר בחשיפה של 5 דקות לאיזופלורן. הגדר את הרכב הגז לתערובת של 2.5% (במקרה זה, המוביל הוא תערובת אוויר סינתטי עם 21% חמצן) עם קצב זרימה של 1.5 ליטר לדקה.
    הערה: משלב זה, כל הפעולות חייבות להיעשות במהירות, מכיוון שבעלי חיים שלא נפגעו יתעוררו תוך 5 דקות.
  2. מקם את ראש העכבר מתחת למשפיע. יש לפרוס את הגור בכל אורכו. קוטרו של החוד 3 מ"מ והוא מכוסה בגומי כדי למזער את השפעת המתכת על הגולגולת.
  3. הנמיכו את המשפיע על ידי העברת הידית למצב הרחבה .
  4. הנמיכו בערך את המשפיען ומקמו את העכבר כך שהמשפיע יהיה רק בין האוזניים. לאחר מכן, החליקו את העכבר כך שקצה הבוכנה יזוז קדימה לקצה בוכנה אחד המקביל לקצה בוכנה אחד, ולקצה בוכנה אחד משמאל לחיה (ראו איור 1).
    הערה: חיות דמה ממוקמות מעט רחוק מהבוכנה (אין לפגוע בשום חלק של החיה).
  5. הנמיכו את המפגע כך שהוא ייגע עם ראש החיה (איור 1, E2).
  6. הגדר את המשפיע לנסיגה (איור 1E3).
  7. על מנת לקבוע את חומרת הפציעה, הזיזו את הבוכנה 1 מ"מ למטה לדרגה 1 (G1). לדרגת פגיעה חמורה יותר 2 (G2), הזיזו את הבוכנה 3 מ"מ למטה (איור 1E4).
  8. הגדר את זמן השהייה ל -0.1 שניות ללא קשר לחומרת (שינוי פרמטר זה לא ישפיע על חומרת זעזוע המוח).
  9. לחץ על פגיעה בידית ימין (איור 1, E5).
  10. הגדר במהירות את הידית השמאלית למצב כבוי כדי שהמערכת לא תתחמם יתר על המידה. ראו את תרשים הזרימה לקבלת מידע נוסף (איור 2).

figure-protocol-1
איור 1: מיקום קצה המשפיע. (A) קצה המשפיע ממוקם תחילה על קו האמצע בין האוזניים. (B) לאחר מכן מזיזים את הקצה 3 מ"מ קדימה (שווה ערך לקוטר קצה). (C) לבסוף, קצה הבוכנה מועבר 3 מ"מ בצד שמאל של העכבר. (ד,ה) מיקומים אפשריים של קצה המשפיע ביחס לקנה המגנטי. (D) למפגע יש 3 מצבים ביחס לגוף הבוכנה (ניטרלי, נשלף או מורחב/פגיעה) עם טווח של 5 מ"מ ביניהם. (ה) מיקום קצה הפגיעה ביחס למשטח הגולגולת בשלבים השונים של ההליך. (1) מיקום המשפיע בעמדה הניטרלית; (2) הבוכנה מועברת כדי לגעת בעדינות בגולגולת של בעל החיים (שלב 2.5); (3) לאחר מכן מוגדר המשפיע לסגת (שלב 3.6); (4) כל גוף המשפיע מועבר של x מ"מ למטה (שלב 2.7). עבור ציון G1, מהירות פגיעה (y) של 2 m.s-1 עם עומק 1 מ"מ (x) עבור G1 או מהירות פגיעה (y) של 3 m.s-1 עם עומק 3 מ"מ (x) עבור G2. (5) לאחר לחיצה על פגיעת המנוף, קצה המנוף נע x מ"מ מתחת לפני השטח של הגולגולת במהירות y במהלך זמן השהייה עם המעבר חזרה למצב ניטרלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-2
איור 2: תרשים זרימה של צאצא. תרשים זרימה המפרט את השלבים להשראת CHILD בעכברי PND17 המקודדים בצבע כדי לציין שלבים שונים של השראת זעזוע מוח. צילומים של ההתקנה כוללים (A) את כל מערך השראת CHILD (מכשיר ההרדמה אינו גלוי), כולל בקר ההשפעה, המכשיר הסטריאוטקטי עם המפגע והקצה הממוקמים מעל רדיד הפח המתוח, וקופסת השחזור הממוקמת על גבי כרית חימום. (B) קצה פגיעה מגומי (3 מ"מ) עם קשקשים. (C) המכשיר הסטריאוטקטי עם רדיד הבדיל מתוח לרוחב המסגרת הסטריאוטקטית והסולנואיד המשפיע עם קצה הפגיעה ממוקם מעל נייר הכסף. (D) תא התאוששות היושב על כרית החום. (E) בקר ההשפעה עם שני מתגי בקרה, מסומנים כמו בתרשים הזרימה (תיבה אדומה = הארכה/שליפה/כיבוי; תיבה סגולה = מתג השפעה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. מעקב פוסט טראומה

הערה: ניתן להקליט את השלבים הבאים בווידאו לצורך ניתוח לא מקוון, מה שמאפשר לנסיין לבצע CHILD על מספר בעלי חיים ברצף. עם זאת, יש לבצע הערכות קבועות וחוזרות ונשנות של רווחת בעלי החיים.

  1. שימו לב למשך דום נשימה, אם קיים (מיד לאחר הפגיעה), ואם היה סיבוב ראש במהלך הפגיעה.
  2. מקם את העכבר על צדו הימני בכלוב התאוששות.
  3. שים לב לזמן הנכון של העכבר (גידול על 4 רגליים) ואת הזמן של חידוש התנהגות גישוש. בדרך כלל, עכברי דמה מתעוררים תוך 3-4 דקות ומחדשים התנהגות גישושית 3-4 דקות מאוחר יותר (איור 3). עכברים ילדים מתעוררים תוך 7-12 דקות לאחר הפגיעה (איור 3A) וחוזרים לחקור תוך 12-18 דקות לאחר הפגיעה (איור 3B), בהתאם למין ולחומרת ההשפעה (איור 3A,B).
    הערה: אם בעל החיים המושפע אינו מחדש את התנהגות הגישוש שלו תוך 30 דקות, בעל החיים אינו נכלל.
  4. לאחר החלמה מלאה, החזירו את בעלי החיים לכלוב הביתי שלהם. בשלב זה, ההתנהגות של עכברי דמה ועכברי CHILD (חומרת G1 או G2) צריכה להיות דומה לחלוטין, ואין להבחין בין קבוצות בעלי חיים בתוך ההמלטה.
    הערה: ניתן להחזיק את בעלי החיים עד 18 חודשים לאחר הפציעה14 בתנאים שצוינו בתחילת השיטות. ניתן לבצע הערכות תוצאות התנהגותיות באמצעות סוללה של בדיקות בשילוב עם מדידות MRI, הדמיית מיניסקופ, היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה12. אימונוהיסטוכימיה עבור GFAP ו- NeuN יכולה לשמש בנקודות זמן מוקדמות כדי לאמת את המודל ואת נוכחותם של שינויים ברקמות.

4. אימונוהיסטוכימיה

הערה: יום אחד לאחר הפציעה, בעלי חיים מקבוצות G2 ודמה (n = 4 עכברים עבור G2 ו- n = 4 עבור Sham) הורדמו ועברו ניקוב טרנסקרדילי עם 4% paraformaldehyde (PFA) שהוכן במי מלח חוצצים פוספט (PBS) 0.1 M, pH 7.4 ב 4 ° C. המוחות חולצו10 מהגולגולת והוטבלו באותה תמיסת PFA במשך הלילה, ולאחר מכן הועברו ל-PBS עם נתרן אזיד (0.1%) לפני החיתוך. לאחר מכן הוכנו חתכים קורונליים בעובי של 50 מיקרומטר באמצעות ויברטום. לאחסון ארוך, חלקים הונחו באמצעי הגנה קריו-פרוטקטיבית (30% אתילן גליקול ו-20% גליצרול ב-PBS) בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש. כדי לאפיין את ההשפעה של זעזוע המוח על גליוזיס מוחי ואובדן עצבי, בוצעה אימונוהיסטוכימיה המכוונת ל-GFAP ול-NeuN כמתואר להלן.

  1. שטפו את חלקי המוח 4 פעמים במשך 10 דקות ב-PBS.
  2. העבר את המקטעים בתמיסת חסימה (1% BSA, 0.3% Triton X-100 ב-PBS) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  3. יש לדגור על מקטעים למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם הנוגדנים העיקריים הבאים המדוללים בתמיסת חסימה: עוף נגד GFAP (1:3000) וארנב אנטי-NeuN (1:500).
  4. שטפו את הפרוסות 4 פעמים במשך 10 דקות ב-PBS תחת תסיסה.
  5. לאחר מכן, העבר את החלקים בתמיסת חסימה המכילה את הנוגדנים הפלואורסצנטיים המשניים מדוללים 1:1000 למשך שעה אחת ב- RT, Alexa-Fluor-488-nm עז נגד ארנבת, ו- Alexa-Fluor-568-nm עז נגד עוף.
  6. שטפו את הקטעים 4 פעמים במשך 10 דקות ב- PBS תחת תסיסה.
  7. הרכיבו את המקטעים על שקופיות באמצעות אמצעי הרכבה והוסיפו החלקת כיסוי. השאר את השקופיות בטמפרטורה של 4°C עד לקבלת התמונה.
  8. Aquire immunofluorescence באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence ותוכנת micromanager. השתמש בתוסף תפירה עם עדשת 10x כדי לקבל תמונות אריחים של המיספרות ipsilateral ו contralateral.
    הערה: צביעת בקרה שלילית שבה הושמט הנוגדן הראשוני או הנוגדן המשני לא הראתה תיוג ניתן לזיהוי. לניתוח תמונה מפורט יותר, ניתן להשתמש בתוכנת פיג'י15 כדי לכמת את הפרמטרים של immunostaining באזורים שונים של עניין16.

תוצאות

מודל CHILD הוא מודל מהיר יחסית וניתן לשחזור של mTBI בעכברים ילדים, המאפשר גם שינויים בחומרה ובמיקום. עכברי CHILD, כצפוי, הציגו זמני החלמה ארוכים יותר באופן משמעותי מפגיעת ראש סגורה (איור 3). כאשר נצברו קוהורטים (n = 36 נקבת שאם, n = 140 בושה זכרית, n = 30 נקבה G1, n = 55 זכר G1, n = 32 נקבה G2, n = 141 זכר G2), נצפה עיכוב בזמן התיקון (איור 3A, ANOVA 3-way p < 0.001) ובזמן לחידוש התנהגויות גישוש (איור 3B, 3-way ANOVA p < 0.001). תקופת ההחלמה הייתה תלויה גם בחומרת ההשפעה (איור 3, G1 לעומת G2; 3-way ANOVA, p < 0.001 עבור שני הפרמטרים). השפעות המין נצפו בבירור כאשר נקבות תואמות גיל הציגו זמן התאוששות ממושך בהשוואה לזכרים הן בזמן הנכון (3-way ANOVA, p < 0.01) והן בזמן לחקירה (איור 3, 3-way ANOVA, p < 0.001). באופן מעניין, לא היו הבדלים בתוך המינים בין חומרת הפציעה (G1 לעומת G2).

פיתוח מודל פרה-קליני דורש יכולת שחזור כדי לאפשר הפצה רחבה יותר בין קבוצות מחקר. שתי מעבדות (Badaut, צרפת; Obenaus, ארה"ב) ערך השוואות לצורך יכולת השחזור. באמצעות שימוש בתזמון נכון ובזמן להתנהגות גישוש לצורך השוואות, לא נמצא הבדל משמעותי, דבר המצביע על יכולת השחזור של G2 CHILD בין שני אתרים שונים (ראה טבלה 1).

figure-results-1
איור 3: זמני התאוששות במודל CHILD עבור דרגות חומרה G1 ו-G2. הפרמטרים ששימשו היו זמן שהייה של 0.1 שניות, ומהירות פגיעה של 2 m.s-1 עם עומק של 1 מ"מ עבור G1 או מהירות פגיעה של 3 m.s-1 עם עומק 3 מ"מ עבור G2. (A) זמן התיקון הנמדד כזמן העמידה על 4 הכפות לאחר הפגיעה. (B) זמן לחדש התנהגות גישושית מהשפעה. הנתונים ממוצעים ± SD, מספר בעלי החיים בקבוצה מסומנים ב-(A). §§§, מציין הבדל משמעותי בהשוואה למקבילים המזויפים (p < 0.001), * ו- *** מצביעים על הבדל משמעותי בין זכרים ונקבות עבור כל רמת חומרה (p < 0.05 ו- p < 0.001 בהתאמה), #, ##, ### מצביעים על השפעות משמעותיות ואינטראקציה בין חומרה ומין (p < 0.05, p < 0.01 ו- p < 0.001 בהתאמה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

סימן היכר במודלים פרה-קליניים של פגיעות מוח טראומטיות קלות הוא התפתחות אסטרוגליוזיס16,17 שנשארת זמן רב לאחר הפציעה הראשונית18. נוסף על כך, מחקרים בילדים ובמבוגרים דיווחו על עלייה משמעותית לאחר פגיעה מוחית טראומטית קלה עד חמורה בהערכות סמנים ביולוגיים חריפים (ימים) של חלבון גליה פיברילרי אסטרוציטי (GFAP) מסרום 19,20,21. כפי שדווח קודם לכן10, לאחר השראת ילדים, אסטרוגליוזיס ניכר יום אחד לאחר פציעה בקליפת המוח הסומטוסנסורית האיפסילטרלית (איור 4A), בהשוואה לשמס. בנקודת הזמן של יום אחד, לא היה אובדן משמעותי של נוירונים (NeuN immunohistochemistry). לפרטים אנליטיים, עיין ב- Clément et al.16.

figure-results-2
איור 4: השראת שינויים בדפוס התיוג החיסוני של אסטרוגליוזיס GFAP יום אחד לאחר הפגיעה במודל CHILD. (A) תיוג חיסוני של GFAP בוצע כדי להעריך שינויים באסטרוציטים חיוביים ל-GFAP. החלק העליון הוא תמונה בהגדלה נמוכה עם מסגרות מלבניות המתאימות לתמונות הזום של השורה התחתונה. בקבוצת הדמה (משמאל), תיוג חיסוני GFAP היה קיים בגבולות גליה, כפיס המוח ושכבת רדיאטום. בקבוצת CHILD (מימין), זעזוע מוח גרם לעלייה במספר האסטרוציטים החיוביים ל-GFAP בשכבות קליפת המוח השטחיות (תיחום על ידי הקו המקווקו) ובשכבת ההיפוקמפוס רדיאטום בהשוואה לקבוצת הדמה. (B) כדי להעריך את ההשלכות של מודל CHILD על תאי עצב, NeuN immunostaining בוצע כדי להראות את הגרעינים בשכבות קליפת המוח השונות ובהיפוקמפוס. לא נמצא הבדל משמעותי בין קבוצות ה-sham (משמאל) וה-CHILD (מימין) בביטוי הסמנים העצביים. פסי קנה מידה: 1 מ"מ, מוגדל: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

אתרמיןקבוצהnזמן לעמוד (ים)זמן לחקור (ים)
U בורדוהנקבותשאם36195.8 ± 29.1427.6 ± 38.2
ילד G232737.4 ± 101.41123.1 ± 97.3
זכריםשאם140207.7 ± 21.6429.6 ± 22.0
ילד G2141468.1 ± 30.7846.1 ± 30.8
אוניברסיטת קליפורניה ריברסיידהנקבותשאם819.8 ± 10.878.3 ± 36.2
ילד G230724.8 ± 53.2922.7 ± 54.0
זכריםשאם1188.3 ± 55.4114.9 ± 57.8
ילד G237697.7 ± 53.0929.3 ± 58.0

טבלה 1: השוואות בין אתרים לצורך קביעת זמן וזמן לבחינת פרמטרים.

דיון

שלבים קריטיים בפרוטוקול
פרוטוקול CHILD המתואר כאן דורש שימוש במשפיען אלקטרומגנטי (איור 2A) אשר (1) מתקנן את פרמטרי ההשפעה (מהירות, עומק, משך), (2) מבטיח יכולת שחזור בתוך מעבדות ובין מעבדות, ו-(3) זמין מסחרית. מרכיב קריטי נוסף הוא קצה הפגיעה שפוגע בראשו של המכרסם. ניתן להשתמש במגוון אפשרויות, החל מקצות סיליקון ועד קצוות מתכת, אולם פרוטוקול זה משתמש בקצה גומי המתקבל מהבוכנה של מזרק בנפח 2 מ"ל (איור 2B). הרציונל של קצה גומי הוא להעביר את הכוח והסיבוב של הפגיעה לגולגולת אך מבלי לגרום לשברים בגולגולת. בעכברי G2, תת-קבוצה קטנה הראתה שברים בגולגולת, עם או בלי דימום תת-דוראלי נלווה. שימוש במשפיען אלקטרומגנטי מספק גם את ההזדמנות לתפעל מהירות/משך יחד עם עומק הפגיעה כדי לווסת את החומרה, כפי שנעשה בכינויי G1 ו-G2. מיקום הפוגע על הראש צריך להיות מיושר בזהירות לצורך שחזור, עם זאת, להבדלי מיקום קטנים אין השפעה משמעותית על תוצאות הפציעה מכיוון שסיבוב הראש תורם באופן משמעותי לתהליך הפתופיזיולוגי.

מרכיב קריטי נוסף הוא המדיום שעליו מונח העכבר במהלך פגיעת הראש. ישנם מגוון דוחות המשתמשים בחומרים שונים, מקצף ועד נייר, אך כאן, נעשה שימוש ברדיד אלומיניום. הרציונל לשימוש ברדיד אלומיניום הוא שהוא אינו נשבר בעת מסירת הפגיעה. עובי רדיד האלומיניום חשוב כדי לספק התנגדות מסוימת לפגיעה, אך גם מאפשר תנועת ראש וסיבוב מספיקים. בעבר תיעדנו את תנועת הראש וסיבוב הראש בפרסום הראשוני10.

כאשר המוח מופק ממקרה הגולגולת יום אחד לאחר טראומה, אין דימום נראה לעין או שבר בגולגולת יש לראות ברמת החומרה G1. כפי שצוין לעיל ופורסם10, פגיעת G2 יכולה להוביל לדימום זעיר בחלק מהעכברים הממוקמים בין הניאוקורטקס לקורפוס קלוסום. שימו לב שהשפעות G1 או G2 גורמות לזמני תיקון דומים (ראו איור 3A). הספרות הקלינית מסכמת כי דימות מוחי לא אמור להציג שינוי נצפה בסריקות MRI אנטומיות; במחקרים שפורסמו בעבר, שינויים בדימות מוחי לא נצפו ב- G110. תכונה של מודל CHILD היא שניתן לגזור דרגות חמורות/בינוניות יותר של פגיעת ראש סגור (CHI) במידת הצורך. אם נעשה שימוש ב-CHI חמור יותר, לנוכחות של דם חוץ-כלי דם תהיה השפעה ישירה על רקמת המוח עם אובדן פוטנציאלי של נוירונים ביום הראשון ומלווה בצביעת GFAP מוגברת. בהיעדר דימום נראה לעין או שינויים מורפולוגיים גסים ביום הראשון לאחר פרוטוקול G2, צביעת GFAP עלתה בקליפת המוח בהשוואה לעכברי דמה (איור 4A). שינויים ב-GFAP הם ציון דרך קריטי במודל CHILD ביום אחד לאחר הפציעה10,16 ונמשכים לאורך זמן לאחר 30 יום16 ו-12 חודשים לאחר הפציעה18.

שינויים ופתרון בעיות
כפי שצוין, היעדר שבר בגולגולת ודימום תוך גולגולתי גלוי הם ציוני דרך קריטיים לייעוד כמודל זעזוע מוח. אם אחד מהם מזוהה, יש לשנות את הפרמטרים של המשפיע, כולל עומק הפגיעה. ניתן (1) לשנות את מהירות הפוגע (להקטין כדי להגביל את הסיכון לשבר בגולגולת), (2) לשנות את הגומי בקצה כדי להפוך אותו רך יותר ומרטיב יותר כדי למזער את השבר בגולגולת, ו-(3) להעריך את עומק הפגיעה שניתן להקטין כדי להפחית את התזוזה והסיבוב של הראש. התוצאה של השינוי בעומק ההשפעה תהיה ירידה בסיכון לדימום תוך גולגולתי. תנאי הניסוי שתוארו לעיל יכולים להשתנות בקלות בבעלי חיים מבוגרים עם תוצאות דומות. כפי שניתן לראות בתוצאות לעיל, הפרוטוקול עובד היטב על שני המינים עם הבדל בין המינים בהתאוששות מפציעה.

מגבלות
פרוטוקול CHILD זה פותח כדי למזער את החשיפה להרדמה ואת הפולשנות ללא ניתוח כדי להמחיש את ציוני הדרך של ברגמה. בעוד שהירידה בפולשנות של ה-CHI וזמני ההתאוששות הקצרים מאוד לאחר הפגיעה (איור 3) הם חוזקה, מגבלה היא השונות הפוטנציאלית של מיקום קצה הפגיעה בהיעדר ציוני דרך של ברגמה. יתרונו של מודל זה הוא שללא ניתוח ופרוצדורה מהירה, הוא מאפשר חזרה על ההליך על מספר גבוה של בעלי חיים בהשוואה לפרוצדורות פולשניות יותר, ומכאן התחשבות בשונות האפשרית של מודל CHILD. מודל CHILD הנוכחי נבדק ואומת במספר מחקרים באמצעות עכבר צעיר בעל עובי גולגולת מסוים. מחקר זה הבחין כי עכברים עם משקל <5.9 גרם הציגו זמן התאוששות ארוך יותר באופן משמעותי (<30 דקות) וגם הציגו פנוטיפ חמור יותר (תצפיות אישיות). לכן, מוצע לכלול רק עכברים צעירים >6.0 גרם לצורך עקביות מודל CHILD והגבלת שבר גולגולת10. יש לציין כי התאמת מודל CHILD לחולדות תדרוש סט חדש של פרמטרים אד-הוק כדי לקבל מודל זעזוע מוח דומה.

משמעות השיטה ביחס לשיטות קיימות/חלופיות
ישנן שיטות שונות לגרום ל-mTBI באמצעות גישה של ראש סגור. חשוב להדגיש שרוב דגמי mTBI פותחו ושימשו במכרסמים בוגרים8. פיתוח מודל CHI קטן נעשה במכרסמים צעירים, ובעיקר בחולדות (P20 חולדות זקנות, מודל פגיעת ראש סגור של האצה סיבובית מהונדסת (CHIMERA) מודל22). כאן מוצע מודל פשוט המתאים היטב לעכברים צעירים בין P17 ל-18 שניתן להרחיב בקלות ב-P20 ומעורר שינויים ארוכי טווח18. הוכח כי לשתי דרגות חומרה יש השלכות ארוכות טווח על התוצאות של בעלי החיים, כולל שינויים בתכונות הרקמות, כולל היפראקטיביות עצבית12, דלקת ושינויים בכלי הדם ובכלי הדם במוח 10,11,12,13,14,16,18. מודל CHILD ממוקם באופן ייחודי בשל קלות היישום שלו וללא דרישה למיומנויות ניתוח. בנוסף למעבדות בבורדו ובאוניברסיטת קליפורניה על שפת הנהר, מדווח גם על יכולת השחזור של מודל CHILD במעבדות אחרות (למשל, מונפלייה13).

חשיבות ויישומים פוטנציאליים של השיטה בתחומי מחקר ספציפיים
מודל חדש של זעזוע מוח בעכבר צעיר מוצע כאן כדי לחקות מאפיינים קליניים של רפואת ילדים, כולל סיבוב ראש והיעדר מוות תאי עצב משמעותי (איור 4B); לא נבדק דימום ב-MRI10. ניתן לחזור על המודל הנוכחי בנקודות זמן חוזרות (עבור mTBI חוזר), ומיקום הפגיעה יכול להשתנות בהתאם לאזור העניין של החוקרים. כפי שמוצג, פיתחנו רמות חומרה שונות, דרגה 1 (G1) ודרגה 2 (G2), שתיהן הציגו פנוטיפים של mTBI או זעזוע מוח, בהתבסס על התוצאות שנמדדו. היעדר תמותה10 והאפשרות לעקוב אחר העכברים לאורך זמן רב לאחר הפציעה, לפחות עד 18 חודשים בידינו, הם פלוס14.

בהקשר של שחזור מחקרים פרה-קליניים, נקבע כי למחקרים רב-מעבדתיים יש איכות גבוהה יותר, פחות הטיה וקפדנות רבה יותר בתכנון המחקר מאשר עבודת מעבדה בודדת23. בקונסורציום שלנו (שמומן על ידי מענק NINDS מס '1R01NS119605 (Obenaus, Badaut) ו- 1RF1NS138032 (Obenaus, Territo)), הוכח כי מודל CHILD היה ניתן לשחזור בין אתרים עם היעדר הבדל בפרמטרים לשחזור. נתונים אלה מצביעים על כך שניתן להשתמש במודל CHILD באופן נרחב בקבוצות מחקר שונות, כמו גם במחקרים רב-מעבדתיים גדולים יותר. מודל CHILD הוא מודל שימושי למחקרים רב-קבוצתיים לפיתוח תרופות, כמו גם להשגת הבנה טובה יותר של התהליכים הפתופיזיולוגיים הפועלים.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

מאמר שיטה זה מומן על ידי Eranet Neuron Neuvasc (Badaut), Agence Nationale de la Recherche Nanospace (Badaut), CNRS IRP IINOVAtion (Badaut) ו- NIH NINDS Grant No. 1R01NS119605 (Obenaus, Badaut) ו- 1RF1NS138032 (Obenaus, Territo). איור 1 נוצר באמצעות BioRender.com.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
BSASigma Aldrich Chimie S.a.r.l
80 Rue de Luzais
L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701
38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex
צרפת		A7030
C57Bl6J עכברים מעבדת נהר צ'ארלס צרפת CRLF 9 All. מולן ברגר, 69130 ואקוטי; קולי, צרפתבורדו
אימפקטור אלקטרומגנטיLeica Biosystems, ריצ'מונד, אילינוי ארה"באימפקטור סטריאוטקסי
מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטיאולימפוס, BX41, סנטר ואלי, פנסילבניה
אתילן גליקולסיגמא אולדריץ' צ'ימי S.a.r.l
80 Rue de Luzais
L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701
38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex
צרפת		102466
נוגדן ראשוני GFAPMillipore, Billerica, MAAB5541נוגדן משני עוף נגד GFAP
GFAPבדיקות מולקולריות, InvitrogenA11034עיזים נגד ארנב AlexaFluor  488
GlycerolSigma Aldrich Chimie S.a.r.l
80 Rue de Luzais
L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701
38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex
צרפת		G5516
רדיד אלומיניום כבדקירקלנדRK611שהושג בתוכנת Cosco
Micromanager (NIH, ארה"ב
נוגדן ראשוני NeuNAbCam, דיסקברי דרייב, קיימברידג'
קמפוס ביו-רפואי,
קיימברידג', CB2 0AX, בריטניה		AB128886ארנב אנטי-NeuN
נוגדן משניבדיקות מולקולריות, InvitrogenA11041עז אנטי-עוף AlexaFluor 568
PBSSigma Aldrich Chimie S.a.r.l
80 Rue de Luzais
L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701
38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex
France		P5493
PFASigma Aldrich Chimie S.a.r.l
80 Rue de Luzais
L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701
38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex
צרפת		1.04003
סודיום אזידSigma Aldrich Chimie S.a.r.l
80 Rue de Luzais
L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701
38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex
France		26628-22-8
מסגרת סטריאוטקסית - כלי KOPF בסיסיים7324 Elmo St, Tujunga, CA 91042, É tats-Unis900-C
מסגרת סטריאוטקסית - מניפולטור אלקטרודותמכשירי KOPF 7324 Elmo St, Tujunga, CA 91042, É tats-Unis960
מסגרת סטריאוטקסית - מכשיריKOPF מסגרת U 7324 Elmo St, Tujunga, CA 91042, ו-Eacute; tats-Unis900-U
Triton x-100Sigma Aldrich Chimie S.a.r.l
80 Rue de Luzais
L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701
38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex
France		X100
VectashieldVector laboratoriesH-1000-10Mounting
medium VibratomeLeica Biosystems, ריצ'מונד, אילינוי, ארה"בVTS1000
מעבדת ג'קסון מעבדת ג'קסון 600 מיין סטריט בר הרבור, מיין ארה"ב 04609UCR
אחד

מקורות

  1. Dewan, M. C., et al. Estimating the global incidence of traumatic brain injury. J Neurosurg. 130 (4), 1080-1097 (2018).
  2. Rivara, F. P., et al. Persistence of disability 24 to 36 months after pediatric traumatic brain injury: a cohort study. J Neurotrauma. 29 (15), 2499-2504 (2012).
  3. Fesharaki-Zadeh, A., Datta, D. An overview of preclinical models of traumatic brain injury (TBI): Relevance to pathophysiological mechanisms. Front Cell Neurosci. 18, (2024).
  4. Panchenko, P. E., Hippauf, L., Konsman, J. P., Badaut, J. Do astrocytes act as immune cells after pediatric TBI. Neurobiol Dis. 185, 106231(2023).
  5. Kochanek, P. M., Wallisch, J. S., Bayır, H., Clark, R. S. B. Pre-clinical models in pediatric traumatic brain injury-challenges and lessons learned. Childs Nerv Syst. 33 (10), 1693-1701 (2017).
  6. Smith, A. M., Grayson, B. E. A strike to the head: Parallels between the pediatric and adult human and the rodent in traumatic brain injury. J Neurosci Res. 102 (7), e25364(2024).
  7. McNamara, E. H., Grillakis, A. A., Tucker, L. B., McCabe, J. T. The closed-head impact model of engineered rotational acceleration (CHIMERA) as an application for traumatic brain injury pre-clinical research: A status report. Exp Neurol. 333, 113409(2020).
  8. Bodnar, C. N., Roberts, K. N., Higgins, E. K., Bachstetter, A. D. A systematic review of closed-head injury models of mild traumatic brain injury in mice and rats. J Neurotrauma. 36 (11), 1683-1706 (2019).
  9. Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106-107, 1-16 (2013).
  10. Rodriguez-Grande, B., et al. Gliovascular changes precede white matter damage and long-term disorders in juvenile mild closed head injury. Glia. 66 (8), 1663-1677 (2018).
  11. Ichkova, A., et al. Early cerebrovascular and long-term neurological modifications ensue following juvenile mild traumatic brain injury in male mice. Neurobiol Dis. 141, 104952(2020).
  12. Badaut, J., et al. Endocannabinoid-mediated rescue of somatosensory cortex activity, plasticity and related behaviors following an early in life concussion. bioRxiv. , (2024).
  13. Leyba, K., et al. Neurovascular hypoxia after mild traumatic brain injury in juvenile mice correlates with heart-brain dysfunctions in adulthood. Acta Physiol. 238 (2), e13933(2023).
  14. Obenaus, A., et al. Progressive lifespan modifications in the corpus callosum following a single juvenile concussion in male mice monitored by diffusion MRI. bioRxiv. , (2023).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  16. Clément, T., et al. Juvenile mild traumatic brain injury elicits distinct spatiotemporal astrocyte responses. Glia. 68 (3), 528-542 (2020).
  17. Drieu, A., et al. Persistent neuroinflammation and behavioural deficits after single mild traumatic brain injury. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (12), 2216-2229 (2022).
  18. Obenaus, A., et al. A single mild juvenile TBI in male mice leads to regional brain tissue abnormalities at 12 months of age that correlate with cognitive impairment at the middle age. Acta Neuropathol Commun. 11 (1), 32(2023).
  19. Ryan, E., et al. Traumatic brain injury in children: Glial fibrillary acidic protein and clinical outcomes. Pediatr Emerg Care. 38 (3), e1139-e1142 (2022).
  20. Czeiter, E., et al. Blood biomarkers on admission in acute traumatic brain injury: Relations to severity, CT findings and care path in the CENTER-TBI study. EBioMedicine. 56, 102785(2020).
  21. Edwards, K. A., et al. Serum GFAP, NfL, and tau concentrations are associated with worse neurobehavioral functioning following mild, moderate, and severe TBI: A cross-sectional multiple-cohort study. Front Neurol. 14, 1223960(2023).
  22. Smith, A. M., et al. High-fat diet consumption negatively influences closed-head traumatic brain injury in a pediatric rodent model. Exp Neurol. 379, 114888(2024).
  23. Hunniford, V. T., et al. A systematic assessment of preclinical multilaboratory studies and a comparison to single laboratory studies. eLife. 12, e76300(2023).

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

פגיעה מוחית טראומטית קלהמודל CHILDמודל עכבר צעירפוגע אלקטרומגנטיMRI דיפוזיהמוות עצביהערכה התנהגותיתמיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה
מודל זעזוע מוח בילדים בעכברים: פגיעת ראש סגורה עם הפרעות ארוכות טווח (CHILD)
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.