הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה מדורגת לניתוח מכניקת הנשימה של מודל עכברי ex vivo באמצעות טכניקת התנודה הכפויה (FOT).
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
מכניקת הנשימה היא תחום מחקר מרכזי בהגדרה וטיפול בפתולוגיות ריאה על ידי הערכת קיבולת ריאות תפקודית. ניתן להעריך את מכניקת הריאות באמצעות תמרוני ריאות שונים הכוללים צורות גל תנודתיות שונות. כאשר הם מיושמים על הריאות, תמרונים אלה מודדים משתנים מרובים, כגון לחץ, נפח וזרימה, בהתבסס על התגובה לצורות הגל. לאחר מכן אותות אלה מחושבים ומנותחים כדי לקבוע פרמטרים כגון היסטריה, התנגדות, תאימות, שיכוך רקמות וגמישות רקמות, ומספקים הערכה מפורטת של תפקוד הריאות הכולל. ניתוח מכניקת הנשימה חשוב במיוחד בהערכת ריאות התורם להשתלת ריאות. הפרוטוקול הנוכחי הוא הראשון מסוגו, המציע שיטה הדרגתית מקיפה וניתנת לשחזור להערכת מכניקת הנשימה באמצעות מודל עכברים ex vivo . הוא כולל פרטים על מודל בעלי החיים הנבחר, התאוששות ריאות, אחסון ושימור וניסויים באמצעות מערכת מבוססת טכניקת תנודה מאולצת. בנוסף, הוא מתאר ניתוח נתונים, משמעות קלינית והיישומים של טכניקת התנודה הכפויה בחקר מודל ex vivo .
מבוא
השתלת ריאות מייצגת את הטיפול העמיד היחיד למחלות ריאה סופניות. כ-4,600 אנשים עוברים השתלות ריאה מדי שנה ברחבי העולם, אך כמעט 600 חולים מתים ברשימת ההמתנה משנית למחסור בריאות תורם מתאימות 1,2. במאמצים להגדיל את מאגר הריאות הזמין, מערכות הקצאת התורמים מותאמות ללא הרף, מה שהוביל למנתחים לנסוע למרחקים ארוכים יותר כדי לאבטח את איברי התורם3. המרחקים המוגדלים תמיד מגדילים את הזמן האיסכמי הקר, ומציגים צורך בשיטות נוספות לשימור איברים.
התקן הנוכחי לשימור איברים מתורם של השתלת ריאות הוא שימור סטטי קר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, המגביל את זמן השימור ל-6-8 שעות - חלון כדאיות קטן להשתלה4. עם זאת, עם מרחקי נסיעה ארוכים יותר וכתוצאה מכך עלייה בזמנים איסכמיים, הערכת תפקוד הריאות לפני ההשתלה חשובה ביותר4. עם התפתחות המדיניות להשתלת ריאות, נערך מחקר חדשני כדי לענות על צורך זה. לאחרונה, מחקרים הציעו כי שימור סטטי קר ב-10 מעלות צלזיוס הוא טמפרטורת אחסון אופטימלית יותר לשימור ריאות עם שיפור כתוצאה מכך בתפקוד הריאות, עמידות בפני פציעות ושיעורים דומים של תפקוד לקוי של השתל ראשוני בעת השתלה 4,5,6,7,8. יתר על כן, מחקר המתמקד בזלוף ריאות ex vivo (EVLP) הראה שיפור משמעותי בניצול הריאות של התורם ובהשתלות מבלי לפגוע בנמענים9. בעוד שהשימוש ב-EVLP להרחבת מאגר התורמים להשתלת ריאות והארכת זמן השימור מתועד היטב, טכנולוגיה זו יקרה, עתירת זמן ודורשת הכשרה מיוחדת לביצוע10. ככזה, יש צורך בשיטות נוספות לחקר תפקוד ריאות ex vivo שהן מקיפות וזולות וניתנות לשחזור.
ניתן לקבוע באופן אמין מדדים מסורתיים של מכניקת ריאות, למשל, תאימות, התנגדות, אלסטנס ועקומות לחץ-נפח, באמצעות פלתיסמוגרפיה של הגוף או עם טכניקות הנשמה באמצעות מודל חד-תא. ניתן להשיג מכניקה מפורטת יותר באמצעות מודל התנודה המאולצת כדי להתאים למודל הפאזה הקבועה, שיכול לחלק את מכניקת דרכי הנשימה לתאים מרכזיים והיקפיים (התנגדות ניוטונית, שיכוך/אלסטנטיות של רקמות, היסטריה)11. בעוד שהיישום של טכניקות אלה ניתן לשחזור ומקיף, מגבלה עד כה הייתה הדרישה לבצע אמצעים כאלה במודל in-vivo, ככל הנראה מכיוון שהריאה האקסנגווינית מאבדת מבנה בטבעת הכניסה המכתשית12. מחקר זה השתמש במכונת הנשמה מכרסמים קטנה המבוססת על טכניקת תנודה מאולצת זמינה מסחרית במטרה לפתח מודל ex vivo כדי לאפיין טוב יותר את מכניקת הריאות ליישומי השתלת ריאות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
מחקר זה אושר על ידי הוועדה לחקר בעלי חיים בהתאם למדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. נעשה שימוש בעכברים מסוג בר C57Bl/6, בגילאי 6-8 שבועות ובמשקל שבין 18-28 גרם. פרטים על הריאגנטים והציוד מסופקים בטבלת החומרים.
1. הכנה
- השתמש במיקרוסקופ ניתוח עם הגדלה של עד פי 20 לכל ההליכים הכירורגיים.
- נקה ועיקר את כל המכשירים הכירורגיים לפני תחילת ההליך. מכשירי חיטוי או השתמש בתמיסת עיקור מתאימה לשמירה על תנאים אספטיים.
2. שאיבת ריאות תורם
- בצע את כל הפעולות בתנאים סטריליים.
הערה: שלב זה מבוצע בחלל כירורגי ייעודי ובתנאים סטריליים. - הכניסו את העכבר לתא אינדוקציה להרדמה וגרמו להרדמה עם 5% איזופלורן בחמצן ושמרו על הרדמה עם 3.5% איזופלורן בחמצן לאורך כל ההליך (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד).
- רשום את משקל העכבר לפני החתך הראשון.
- אבטח את העכבר על שולחן הניתוחים והקפד על עומק הרדמה מתאים על ידי הפעלת לחץ על הבוהן. אם העכבר נסוג מכאב, הגדל את ההרדמה לפי הצורך.
- הסר את הריאות מהתורם בהתאם להליך סטנדרטי13.
הערה: הריאות והלב חולצו בבלוק כדי לחלחל את הריאות ex vivo, וחלק מקנה הנשימה הוסר לאינטובציה מאוחרת יותר.
3. אחסון ושימור ריאות
- לאחר הוצאת הריאות מהתורם, יש להחדיר את קנה הנשימה עם צנתר אנגיו-ורידי 18 G על ידי קידום זהיר של הקטטר, כדי לוודא שהוא לא מנקב את קנה הנשימה.
- אבטח את קנה הנשימה מעל הצינורית באמצעות תפר משי 3-0, והבטיח אטימה הדוקה. קדם את האנגיו-צנתר התוך-ורידי 18 G עד שהוא נמצא בתוך דרכי היציאה של החדר הימני (RVOT), ממש מעבר למסתם הריאתי.
- רשום את הזמן שבו הריאות הוצאו מהגוף.
- אחסן את הריאות בצינור חרוטי של 50 מ"ל המכיל את תמיסת השימור הזמינה מסחרית בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס או 10 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
4. הגדרה וכיול
- התחל בהפעלת המערכת ו/או התוכנה.
- הפעל את התוכנית, לחץ על כפתור צור מחקר חדש ופעל לפי ההנחיות שעל המסך כדי להגדיר את הפרוטוקול ולהקצות נבדקים.
- לחץ על מפגש ניסוי והיכנס באמצעות ראשי התיבות הראשון והאחרון של המשתמש.
- התחל לתייג נושאים לפי מוסכמה עקבית למתן שמות.
- הזן את פרטי המין, תאריך הלידה והמשקל של כל נושא.
- בחר והקצה נבדקים לאתר המדידה ואשר משקולות.
- המשך בהגדרה ובכיול של התוכנה על ידי ביצוע ההנחיות שעל המסך.
הערה: במהלך כיול הצינור, אותו סוג של צינורית ששימשה באינטובציה של ריאות התורם הוצמד לצינור ה-Y של המערכת כדי להבטיח עקביות. - חזור על הכיול אם ערכי הכיול נמצאים מחוץ לטווחים המקובלים.
- בטל את ההנחיות להתחיל באוורור עד שיהיה מוכן. ניתן להתחיל מפגשים ניסיוניים עם אוורור והקלטת נתונים מאוחר יותר.
5. אוורור ריאות ואיסוף נתונים
- הסר את הריאות מהצינור החרוטי של 50 מ"ל. שטוף את דרכי היציאה של החדר הימני (RVOT) באמצעות צנתר אנגיו-ורידי 18 גרם שהונח קודם לכן עם תמיסת שימור נוספת במינון של 60 מ"ל/ק"ג כדי לשטוף את נימי הריאות.
הערה: יש לנקוט בזהירות רבה כדי למנוע התייבשות של ריאות התורם מכיוון שזהו מבלבל ידוע בחקר מכניקת הריאות. - אבטח את ריאות התורם למכונת ההנשמה והתחל בניסוי.
- לחץ על התחל אוורור, וכשמוכן, לחץ על התחל הקלטה כדי להתחיל את ההפעלה הניסיונית.
הערה: מכונת ההנשמה ששימשה למחקר זה נקבעה להיות בעלת קצב נשימה של 150 נשימות לדקה, נפח גאות של 10 מ"ל/ק"ג ו-PEEP של 3. - הפעל כל משימה על ידי לחיצה כפולה על המשימה להערכות מכניקת ריאות מרשימת המשימות בצד ימין של הדף.
- הפעל את משימת האינפלציה העמוקה הממוקמת ברשימת המשימות כדי להבטיח עוד יותר שאזורים אטלקטיים מגויסים ונפחי הריאות מתוקננים. לפרטים, עיין בסעיף תוצאות.
- המשך ברצף המשימות.
הערה: ניתן להעריך את תפקוד הריאות באמצעות משימות מרובות להערכת תכונות מכניות. Deep Inflation מתקנן את נפח הריאות, בעוד Prime-8 מייצב את מכניקת הריאות. PV-P ו-PV-V מודדים תאימות סטטית ודינמית, התנגדות דרכי הנשימה ומוליכות. Snapshot 150 מספק הערכה מהירה של עמידות, תאימות ועמידות, בעוד ש-QuickPrime מעריך את עמידות דרכי הנשימה והרקמות יחד עם צמיגות הריאות. משימות אלה מבטיחות ביחד ניתוח מקיף של תפקוד הריאות. במאמר זה, הנתונים עבור המשימות שבוצעו ב-Deep Inflation, Snapshot 150 ו-QuickPrime (באמצעות ציוד זמין מסחרית) מסופקים כתוצאות מייצגות. נפחי הריאות תוקננו בין הפרעות באמצעות משימת האינפלציה העמוקה על מנת למזער משתנים מבלבלים בעת פירוש הנתונים. - הפעל את רצף המשימות הנבחר בשלוש עותקים.
- לחץ על הפסק הקלטה ולאחר מכן על הפסק אוורור.
- ייצא נתונים בנפרד או המשך לנושא הבא וחזור על שלבים 5.1-5.9.
הערה: עבור נתונים הנגזרים מהפרעות Snapshot 150 ו-QuickPrime, נדרש COD של >0.95 לניתוח אמין.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תיאור גרפי של העיצוב הניסיוני מסופק עבור מודל העכבר (איור 1). הריאות נופחו באמצעות מערכת הנשמה של מכרסמים קטנים המבוססת על טכניקת תנודה מאולצת זמינה מסחרית כדי להעריך את מכניקת הנשימה של רקמת התורם בתנאים שונים (איור 2). כאשר משווים את התוצאות בין קבוצות ריאות התורם המשומר, קבוצות של ריאות תורם שאוחסנו ב-10 מעלות צלזיוס נמצאו כבעלות ביצועים טובים יותר מכל הקבוצות שאוחסנו ב-4 מעלות צלזיוס בכל הפרמטרים. בקבוצות האחסון של 10 מעלות צלזיוס, נמצא כי לריאות התורם יש יר...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
חשיבות ויישומים פוטנציאליים
מכניקת נשימה משמשת באופן שגרתי ביישומים שונים לחקר פתולוגיה של ריאות ופגיעה בריאות. חקר מכניקת הנשימה תואר פעמים רבות להתקדמות מחלות כגון ARDS ובמקרים של הנשמה מסייעת, אך תואר הרבה פחות בספרות בכל הנוגע להשתלת איברים 15,16,17,18,19. בנוסף, ככל שמדיניות הקצאת הריאות משתנה וטכניקות...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי המחקר נערך ללא קשרים מסחריים או פיננסיים שעלולים להתפרש באופן שגוי כניגוד אינטרסים.
תודות
המחברים רוצים להודות לסופי פצ'נסי על השימוש במערכת ההנשמה, ולקולין וולש על הסיוע. איור 1 נוצר באמצעות biorender.com. מחקר זה נתמך על ידי מענק מהמכון הקליני והתרגומי של דרום קרוליינה (NIH/המרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום) תחת פרס מספר UL1-TR001450.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 18 גרם אנגיו-קטטר | ב. בראון | 4251687-02 | רכזת ישרה |
| 24 גרם אנגיו-קטטר | ב. בראון | 4251601-02 | רכזת ישרה |
| 3 מ"ל מזרק | פישר סיינטיפיק | 14-823-41 | |
| 3-0 תפר משי | Medex | ETH-A304H | |
| 50 מ"ל צינורות חרוטיים | תרמו פישר | 339652 | |
| 70% EtOH | פישר סיינטיפיק | BP82031GAL | |
| תא אינדוקציה להרדמה | מכשיר הרווארד | 75-2030 | תא אינדוקציה אטום לחולדות |
| מכונת הרדמה | מכשיר הרווארד | 75-0238 | מערכת הרדמה ניידת עם ניקוי פסיבי |
| מסכת הרדמה | מכשיר הרווארד | 59-8255 | מסכת הרדמה עכברוש |
| מלקחיים מיקרו קהים | בעולם Precision Instruments | 501217 | מלקחיים חבישה, 12.5 ס"מ, ישר, |
| עכברי C57Bl/6 | קוד זן נהר צ'ארלס | 027 | סוג פראי, 6-8 שבועות, 18-28 גרם |
| סולם משקל דיגיטלי | Fisher Scientific | S72422 | |
| מערכת FlexiVent | Scireq | NC2926059 | מאוורר מכרסמים קטנים מבוסס טכניקת תנודה מאולצת |
| מזרק אינסולין, 1 מ"ל | פישר סיינטיפיק | 14-841-33 | |
| איזופלורן, USP | Piramal טיפול קריטי | NDC 66794-017-25 | |
| מיקרוסקופ הפעלה או זכוכית מגדלת כירורגית | AmScope | SM-3BZ-80S | 3.5x - 90x סטריאו מיקרוסקופ |
| Perfadex תמיסת | Xvivo | 19811, 19850 | |
| צלחות פטרי | פישר סיינטיפיק | FB0875714 | |
| צמר גפן סטרילי | Puritan | 25-806 1WC | |
| ספוגי גזה סטריליים | Fisher Scientific | 22-037-902 | |
| מספריים כירורגיים | World Precision Instruments | 1962C | מספריים מצנבאום |
מקורות
- Erdman, J., et al. Lung transplant outcomes in adults in the United States: Retrospective cohort study using real-world evidence from the SRTR. Transplantation. 106 (6), 1233-1242 (2022).
- Valapour, M., Lehr, C. OPTN/SRTR 2022 Annual Data Report: Lung. , Available at: https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2022/Lung.aspx (2022).
- Benvenuto, L., Arcasoy, S. The new allocation era and policy. J Thorac Dis. 13 (11), 6504-6513 (2021).
- Ali, A., et al. Static lung storage at 10 °C maintains mitochondrial health and preserves donor organ function. Sci Transl Med. 13 (611), eabf7601(2021).
- Wang, L., et al. The effect of ischemic time and temperature on lung preservation in a simple ex vivo rabbit model used for functional assessment. J Thorac Cardiovasc Surg. 98 (3), 333-342 (1989).
- Date, H., et al. In a canine model, lung preservation at 10 °C is superior to that at 4 °C: A comparison of two preservation temperatures on lung function and on adenosine triphosphate level measured by phosphorus 31-nuclear magnetic resonance. J Thorac Cardiovasc Surg. 103 (4), 773-780 (1992).
- Hoetzenecker, K., et al. The advent of semi-elective lung transplantation-prolonged static cold storage at 10 °C. Transpl Int. 37 (1), 12310(2024).
- Abdelnour-Berchtold, E., et al. Evaluation of 10 °C as the optimal storage temperature for aspiration-injured donor lungs in a large animal transplant model. J Heart Lung Transplant. 41 (12), 1679-1688 (2022).
- Moreno Garijo, J., Roscoe, A. Ex vivo lung perfusion. Curr Opin Anaesthesiol. 33 (1), 50-54 (2020).
- Rajab, T., Keshavjee, S. Ex vivo lung perfusion. Artif Organs. 44 (1), 12-15 (2020).
- Oostveen, E., et al. The forced oscillation technique in clinical practice: Methodology, recommendations, and future developments. Eur Respir J. 22 (6), 1026-1041 (2003).
- Gibney, B., et al. Structural and functional evidence for the scaffolding effect of alveolar blood vessels. Exp Lung Res. 43 (9-10), 337-346 (2017).
- Rajab, T. Techniques for lung transplantation in the rat. Exp Lung Res. 45 (9-10), 267-274 (2019).
- Evaluation of ventilation at 10 °C as the optimal storage condition for donor lungs in a murine transplant model. Hill, M., et al. The International Society for Heart and Lung Transplantation 44th Annual Meeting and Scientific Sessions, Prague, Czech Republic, , (2024).
- Hess, D. Respiratory mechanics in mechanically ventilated patients. Respir Care. 59 (11), 1773-1794 (2014).
- Henderson, W., et al. Fifty years of research in ARDS: Respiratory mechanics in acute respiratory distress syndrome. Am J Respir Crit Care Med. 196 (7), 822-833 (2017).
- Mauri, T., et al. Respiratory mechanics to understand ARDS and guide mechanical ventilation. Physiol Meas. 38 (12), R280-R303 (2017).
- Bersten, A., et al. Respiratory mechanics and surfactant in the acute respiratory distress syndrome. Clin Exp Pharmacol Physiol. 25 (11), 955-963 (1998).
- Grinnan, D., Truwit, J. Clinical review: Respiratory mechanics in spontaneous and assisted ventilation. Crit Care. 9 (5), 472-484 (2005).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
