הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

איתור רגישות לתרופות ואינטראקציות תרופתיות ב-Mycobacterium tuberculosis באמצעות Resazurin Microtiter ובדיקת לוח שחמט

923 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67672

⸱

24 באוקטובר 2025

 ,  , 
1Department of Immunology, National Institute for Research in Tuberculosis, 2University of Madras, 3Faculty of Medical Research, Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להמחשה וסטנדרטיזציה של בדיקת מיקרוטיטר רזזורין (REMA) ווריאציית לוח השחמט שלה להערכת הרגישות לתרופות ופרופילי האינטראקציה של Mycobacterium tuberculosis. שיטה זו מספקת תובנות, במבחנה, לאופטימיזציה של שילובי תרופות לשימוש במשטרי טיפול ומלחמה בשחפת עמידה לתרופות מרובות.

תקציר

הופעתה של שחפת עמידה לתרופות מרובות (MDR-TB) מחייבת שיטות מהירות ומדויקות לבדיקת רגישות לתרופות (DST) כדי להנחות טיפול יעיל. מחקר זה מציג מתודולוגיה המשלבת את בדיקת המיקרוטיטר של רסזורין (REMA) ובדיקת לוח שחמט כדי לקבוע ריכוז מעכב מינימלי (MIC) ולהעריך אינטראקציות בין תרופות של תרופות נגד שחפת נגד Mycobacterium tuberculosis. ה-REMA, המותאם לפורמט של 96 בארות, ממנף את הפחתת צבע הרזזורין על ידי M. tuberculosis פעיל מטבולית כאינדיקטור חזותי לרגישות לתרופות. ריכוזים משתנים של תרופות נגד שחפת נבדקים כנגד מבודדים של M. tuberculosis , ונצפים שינויי צבע כדי לקבוע את ה-MIC. לאחר מכן, נעשה שימוש בבדיקת לוח שחמט כדי להעריך השפעות סינרגטיות, תוספות או אנטגוניסטיות פוטנציאליות בין שילובי תרופות. שיטה פשוטה וזולה זו מניבה תוצאות תוך שבעה ימים, ומציעה יתרון משמעותי על פני שיטות שעון קיץ מסורתיות. שיטה זו מספקת תובנות חשובות לגבי שעון הקיץ של מבודדי M. tuberculosis ומאפשרת זיהוי של שילובי תרופות מבטיחים לשיפור תוצאות הטיפול נגד MDR-TB.

מבוא

שחפת, הנגרמת על ידי Mycobacterium tuberculosis, נותרה אתגר בריאותי עולמי אדיר, המחמיר עם הופעתם של זנים עמידים לתרופות. על פי ארגון הבריאות העולמי (WHO), בשנת 2023 היו כ-10.6 מיליון מקרי שחפת חדשים ו-1.3 מיליון מקרי מוות, מה שמדגיש את הצורך הדחוף באסטרטגיות אבחון וטיפול יעילות יותר1. שחפת עמידה לתרופות מרובות (MDR-TB) ושחפת עמידה לתרופות (XDR-TB) מהוות אתגרים גדולים לבקרת מחלות בשל המורכבות, הרעילות ומשך הזמן הממושך של משטרי הטיפול הנוכחיים 2,3.

ההשקה האחרונה של חומרים חדשים נגד שחפת, כגון בדקווילין ודלמניד, המכוונים למסלולים ביוכימיים ייחודיים בשחפת, מייצגת פריצת דרך בניהול שחפת 4,5. תרופות אלה אושרו בעיקר לשימוש במקרי שחפת עמידים לפלואורוקווינולון וריפמפיצין כחלק ממשטרי MDR-TB ארוכים וקצרים יותר שאושרו על ידי ארגון הבריאות העולמי 6,7. עם זאת, קביעת שילובי תרופות ומשטרי מינון אופטימליים, במיוחד כאשר משתמשים בתרופות אלה בשילוב עם טיפולים מבוססים, נותרה תחום מחקר קריטי 8,9. השיטות הנוכחיות לבדיקת רגישות לתרופות (DST), למרות שהן אמינות, הן לרוב עתירות זמן, עתירות משאבים ואינן מעשיות להערכת שילובי תרופות מורכבים בסביבה קלינית או מחקרית10. זה מדגיש את הצורך במבחנים פנוטיפיים פשוטים וניתנים להרחבה שיכולים להעריך הן את יעילות התרופה והן את פרופילי האינטראקציה בשחפת.

בין גישות פנוטיפיות כאלה, בדיקת המיקרוטיטר של רזזורין (REMA) התגלתה כשיטה מקובלת וקונבנציונלית להערכת רגישות לתרופות. הבדיקה מבוססת על הפחתת צבע הרזזורין הכחול לרסורופינה ורודה על ידי חיידקים פעילים מטבולית, המשמשים כאינדיקטור חזותי לכדאיות התא. למרות שהפך לפופולרי על ידי Palomino et al. ב-200211, העיקרון של שימוש ברזזורין להערכת צמיחת חיידקים מתוארך לעבודתם של Pital et al.12. במהלך שני העשורים האחרונים, שיטת REMA אומתה באופן נרחב ושולבה בנוהלי הפעלה סטנדרטיים למחקר מיקובקטריאלי ובדיקות אבחון 13,14,15.

כהשלמה ל-REMA, בדיקת לוח השחמט, כפי שהוצגה על ידי Caleffi-Ferracioli et al., מרחיבה את התועלת של REMA על ידי מתן אפשרות למחקרי אינטראקציה בין שתי תרופות בפורמט מיקרו-דילול תוך שימוש באותה קריאה מבוססת רזזורין16. למרות שהיא מבטיחה באופן עקרוני, שיטה זו נותרה בעיקר כלי מחקר שימושי לסינון שילובי תרופות סינרגטיים או אנטגוניסטיים פוטנציאליים במהלך הערכה פרה-קלינית מוקדמת ולא בדיקת אבחון שגרתית.

כתב יד זה אינו מציג את REMA או את גרסת לוח השחמט שלו כשיטות חדשניות. במקום זאת, מטרת מחקר זה היא לספק ייצוג חזותי של מתודולוגיה שימושית ומאומתת לקביעת MIC ובדיקת אינטראקציה עם תרופות, שתוארה ויושמה בהצלחה במחקרים קודמים. אנו מספקים פרוטוקול שלב אחר שלב עם הנחיות מפורטות לגבי הכנת חיסון, טיטרציה של תרופות, פריסת צלחות, פרשנות MIC וניתוח אינטראקציה עם לוח שחמט. כתב יד זה נועד לתמוך בשימוש רחב ועקבי יותר ב-REMA ובמבחני לוח שחמט בפיתוח תרופות לשחפת ופרמקולוגיה ניסיונית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: כימיקלים וחומרים המשמשים בניסויים לדוגמה זמינים בטבלת החומרים file.

1. הכנת מדיה 7H9-S

  1. עבור 100 מ"ל של מדיה 7H9-S, שוקלים 0.47 גרם אבקת 7H9 ו-0.1 גרם קזיטון, ואז ממיסים ב-90 מ"ל מים מזוקקים; מערבבים עד להמסה מלאה.
  2. מעקרים את המרק בבקבוק של 250 מ"ל בעזרת חיטוי בחום של 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  3. לאחר החיטוי והקירור, יש להוסיף 10 מ"ל של תוסף אלבומין אולאי דקסטרוז קטלאז (OADC) ו-0.5 מ"ל גליצרול.
  4. יש לדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לבדוק אם יש סטריליות.
    הערה: הסטריליות של המדיום המוכן 7H9-S מאומתת על ידי דגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס. המדיום אמור להישאר צלול למחרת, ללא עכירות.
  5. אחסן את המדיום 7H9-S בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, הרחק מאור ישיר.

2. הכנת חיסון M.tuberculosis

  1. הכנת חיסון מתרבית M.tuberculosis שגדלה במדיום מוצק Lowenstein Jensen (LJ)
    1. בעזרת לולאת חיסון סטרילית, אספו לולאה מלאה של תרבית M. tuberculosis ממדיום LJ טרי (בן 21-28 יום).
      הערה: הימנע בזהירות מגירוד עמוק מדי לתוך המדיום, מה שעלול להפריע למושבות ישנות יותר.
    2. הכניסו את החיידקים שנאספו לבקבוק ביז'ו סטרילי המכיל חרוזי זכוכית סטריליים ו-2.5 מ"ל מרק 7H9-S. ודא שחרוזי הזכוכית מסייעים בשיבוש מכני של גושים במהלך מערבולת.
      הערה: תרביות טריות בין 21-28 יום חיוניות כדי להבטיח תוצאות בדיקת רגישות אמינות. הימנע משימוש בתרבויות ישנות יותר, מכיוון שהן עלולות להוביל לתוצאות לא עקביות.
    3. אבטח את בקבוק הביג'ו והמערבולת במרץ למשך דקה אחת לפחות. הקפידו על ערבוב רציף כדי לפרק גושי חיידקים, וכתוצאה מכך מתלה עכור יחסית. המטרה היא פיזור הומוגני של חיידקים בתוך המדיום.
    4. העבירו את תרחיף התרבות לבקבוק ביז'ו טרי והניחו לו לעמוד ללא הפרעה למשך 15 דקות. שלב זה מאפשר לגושי החיידקים הגדולים יותר להתיישב בתחתית.
    5. באמצעות תקן McFarland 1.0 כהפניה, בדוק את העכירות של תרחיף התרבית והתאם עם מרק 7H9-S עד להשגת העכירות הרצויה.
      הערה: תקן מקפרלנד, בדרך כלל 1.0, משמש כהתייחסות לעכירות שווה ערך לכ-1.97 × 106 CFU/mL17. התקן מוכן על ידי שילוב של 0.1 מ"ל של 1% בריום כלוריד ו-9.9 1 מ"ל של 1% חומצה גופרתית, וכתוצאה מכך משקעים עדינים של בריום גופרתי, המספק את העכירות. מתלה החיידקים מושווה חזותית לתקן מקפרלנד על ידי החזקת שני הצינורות על רקע לבן עם קווים שחורים. עכירות תרחיף החיידקים מותאמת כך שתתאים לתקן.
  2. הכנת חיסון מתרבית M.tuberculosis שגדלה במדיום נוזלי 7H9
    1. בעזרת פיפטה סטרילית, העבירו 2.5 מ"ל של תרבית שחפת (בת 2-3 שבועות) לבקבוק ביז'ו טרי עם חרוזי זכוכית.
    2. מערבל את התערובת למשך דקה אחת לפחות כדי להבטיח השעיה הומוגנית. פעולת המערבולת עוזרת לשבור גושים.
    3. העבירו את 2.5 מ"ל תרחיף התרבית לבקבוק ביז'ו טרי והשאירו אותו למשך 15 דקות כדי לאפשר לגושים להתיישב בתחתית.
    4. השווה את העכירות מול תקן McFarland 1.0 והתאם באמצעות מרק 7H9-S כדי להשיג את הריכוז הנדרש.
  3. דילול החיסון
    1. הכן דילול של 1:10: כדי לדלל את החיסון, הוסף 1 מ"ל של תרחיף החיידקים ל-9 מ"ל של מרק 7H9-S במיכל סטרילי (זה ייתן כ-1.97 × 105 CFU/mL).

3. הכנת אנטיביוטיקה ואחסון

  1. הכנת מלאי ופתרונות עבודה: הכינו את התרופות ששימשו בניסוי לדוגמה, יחד עם המלאי ושיטות הכנת פתרונות העבודה שלהן, כפי שמסוכם בטבלה 1.
    1. איזוניאזיד (INH או I): להכנת תמיסת מלאי של 1 מ"ג/מ"ל של איזוניאזיד, ממיסים 2 מ"ג של אבקת איזוניאזיד ב-2.0 מ"ל מים מזוקקים. עקר את התמיסה באמצעות מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר.
    2. מוקסיפלוקסצין (MOX או M): להכנת תמיסת מלאי של 1 מ"ג/מ"ל של מוקסיפלוקסצין, ממיסים 2 מ"ג אבקת מוקסיפלוקסצין ב-2.0 מ"ל מים מזוקקים. עקר את התמיסה באמצעות מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר.
    3. בדקווילין (BDQ או J): בדקווילין מסיס בצורה גרועה במים. להכנת תמיסת מלאי של 1 מ"ג/מ"ל, ממיסים 2 מ"ג אבקת בדקווילין ב-2.0 מ"ל של DMSO. עקר את התמיסה באמצעות מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר.
    4. דלמאניד (DEL או D): בדומה לבדקווילין, לדלמאניד יש מסיסות ירודה במים. להכנת תמיסת מלאי של 1 מ"ג/מ"ל, ממיסים 2 מ"ג אבקת דלמאניד ב-2.0 מ"ל DMSO. עקר את התמיסה באמצעות מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר.
  2. אחסון: יש להוציא 100 מיקרוליטר מכל תמיסת מלאי תרופות לתוך קריוביאלים סטריליים ולאחסן אותם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים. לאחר ההפשרה, השלך את כל התמיסה שנותרה. אין להקפיא מחדש.

4. הכנת תמיסת רזזורין ואחסון

  1. ממיסים רזזורין לריכוז סופי של 0.01% או 0.02% במים מזוקקים. מסננים את התמיסה דרך מסנן של 0.2 מיקרומטר לעיקור.
  2. אחסן את תמיסת הרזזורין המעוקרת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 1-2 שבועות, מוגן מפני אור כדי למנוע השפלה.

5. הכנת לוחית REMA

הערה: עיין באיור 1 למדריך חזותי על הגדרת לוחית המיקרוטיטר של REMA 96 בארות. צלחת 96 הבארות מספקת מספיק מקום להריץ בדיקות תרופות בשכפול עבור כל תרופה בשישה דילולים כפולים.

  1. הוסף מרק 7H9-S: בעזרת פיפטה רב ערוצית, הוסף 100 מיקרוליטר של מרק 7H9-S לעמודות 2-11, שורות B-G. ודא שהחלוקה אחידה בכל הבארות.
  2. הוסף תמיסות תרופות: הוסף 100 מיקרוליטר מתמיסת ה-INH העובדת לבארות B2 ו-B6. באופן דומה, הוסף את פתרונות העבודה MOX, DEL ו-BDQ לבארות שלהם (B3 ו-B7, B4 ו-B8, B5 ו-B9).
  3. דילול ריכוזי התרופה: באמצעות פיפטה רב-ערוצית, בצע דילול סדרתי כפול משורות B עד G (עמודות 2-9), והקפד להשליך את 100 המיקרוליטר הסופיים לאחר ערבוב בשורה G.
  4. בארות בקרת גדילה: הוסף 100 מיקרוליטר של מרק 7H9-S לבארות B10 ו-C10 לבקרת הגדילה.
  5. בקרות שליליות וסטריליות: הוסף 200 מיקרוליטר של מרק 7H9-S לבארות B11 ו-C11 כדי לשמש כבקרות שליליות וסטריליות.
  6. מניעת אידוי: הוסף 200 מיקרוליטר של מים מזוקקים סטריליים לכל הבארות החיצוניות כדי למזער את האידוי במהלך הדגירה.
  7. צלחות חיסון: חסנו כל באר ב-100 מיקרוליטר של תרחיף התרבית המדולל 1:10, למעט באר הבקרה השלילית. הקפידו על חיסון אחיד בכל הבארות.
  8. איטום ודגירה: אטמו את הצלחות בשקיות ניילון כדי לשמור על סטריליות ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים.

6. בדיקת טיטרציה של לוח שחמט REMA

הערה: עיין באיור 2A, B למדריך חזותי על תבנית בדיקת הטיטרציה של לוח השחמט של REMA עבור שילובי תרופות (למשל, BDQ ו-DEL).

  1. דילול תרופות אנכית ואופקית: יש לדלל את התרופה הראשונה (BDQ) אנכית (שורות B-H) ואת התרופה השנייה (DEL) אופקית (עמודות 2-8) כדי ליצור שילובים שונים של שתי תרופות.
    הערה: הכן את תמיסת העבודה המדוללת סדרתית בבקבוקון סטרילי (מ-4 מיקרוגרם/מ"ל - 0.06 מיקרוגרם/מ"ל) לתרופה המדוללת אופקית.
  2. הוסף פתרון עבודה BDQ לדילול אנכי: הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת ה-BDQ העובדת לבאר B2 ו-B8.
  3. הוסף מרק 7H9-S: בעזרת פיפטה רב ערוצית, הוסף 50 מיקרוליטר של מרק 7H9-S לעמודות C2-H8. ודא שהחלוקה אחידה בכל הבארות.
  4. לדלל את ריכוזי התרופה: בעזרת פיפטה רב-ערוצית, בצע דילול כפול משורות B-H (עמודות 2-8), והקפיד להשליך את 50 המיקרוליטר הסופיים לאחר ערבוב בשורה H.
  5. הוסף פתרון עבודה של DEL לדילול אופקי: הוסף פתרונות עבודה בדילול סדרתי של התרופות מ-4 מיקרוגרם/מ"ל ל-0.06 מיקרוגרם/מ"ל לבארות המתאימות.
  6. בארות בקרת גדילה: הוסף 100 מיקרוליטר של מרק 7H9-S לבארות B9 ו-C9 לבקרת הגדילה.
  7. בקרות שליליות וסטריליות: הוסף 200 מיקרוליטר של מרק 7H9-S לבארות B10 ו-C10 כדי לשמש כבקרות שליליות וסטריליות.
  8. צלחות חיסון: חסנו כל באר ב-100 מיקרוליטר של תרחיף התרבית המדולל 1:10, למעט באר הבקרה השלילית. הקפידו על חיסון אחיד בכל הבארות.
  9. איטום ודגירה: אטמו את הצלחות בשקיות ניילון כדי לשמור על סטריליות ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים.

7. דגירה ופרשנות של תוצאות

  1. צביעת רזזורין: לאחר 7 ימי דגירה, הוסף 30 מיקרוליטר רזזורין (0.01%-0.02%) לכל באר. יש לאטום ולדגור על הצלחת למשך הלילה להתפתחות הצבע.
  2. פרש שינוי צבע.
    1. בחנו את הבארות באופן ויזואלי תחת אור לבן עקבי או תאורה מאוזנת באור יום.
      הערה: בקרת הגדילה (ללא תרופה) צריכה להפוך לכחול לוורוד, מה שמעיד על חילוף חומרים פעיל של חיידקים. צבע כחול מעיד על עיכוב מוחלט של הצמיחה. ורוד מציין צמיחה פעילה, ואילו סגול (גוון מעורב) מייצג עיכוב חלקי.
    2. השווה את עוצמת הצבע הן לבקרה השלילית (מדיה בלבד) והן לבקרה החיובית (גידול חיידקים ללא תרופה) לפירוש מדויק. כדי למזער את הטיית הצופה, השתמש בקריאות עצמאיות כפולות או בצילום לוחות.
      הערה: שיפוט חזותי יכול להשתנות בהתאם לתנאי תאורת הסביבה, ולכן תאורה עקבית היא חיונית.
  3. ריכוז מעכב מינימלי (MIC)
    1. הגדר MIC כריכוז הנמוך ביותר של תרופה שבו הבאר נשארת כחולה לחלוטין, מה שמצביע על עיכוב של ≥99% של פעילות מטבולית. שקול בארות המציגות צבע סגול או ורוד המעיד על צמיחה חלקית או מלאה.
      הערה: קביעת ה-MIC על ידי REMA מתקרבת לעקרונות שיטת הפרופורציה הקלאסית, שבה ה-MIC נחשב לריכוז הנמוך ביותר המעכב ≥99% מהחיסון ביחס לבקרה ללא תרופות. בעוד ש-REMA אינו משתמש בספירת CFU, נקודת הקצה החזותית מייצגת מתאם פנוטיפי של סף מבוסס פרופורציה זה. פרשנות זו מתיישבת עם פרוטוקולים קולורימטריים שנקבעו בעבר11,14.

8. חישוב מדד ריכוז מעכב חלקי (FIC)

הערה: מדד ריכוז העיכוב החלקי (FIC) מסייע לקבוע את האינטראקציה בין שתי תרופות (סינרגיה, אנטגוניזם או אדישות). הוא מחושב על סמך ערכי ה-MIC המתקבלים מבדיקת לוח השחמט.

  1. זהה את ה-MIC עבור כל תרופה בלבד: מבדיקת REMA קבע את ה-MIC עבור כל תרופה בשימוש בנפרד.
  2. זהה את ה-MIC עבור כל תרופה בשילוב: מבדיקת טיטרציה של לוח השחמט, זהה את ה-MIC של כל תרופה בשימוש בשילוב עם התרופה השנייה.
  3. חשב את ה-FIC עבור כל תרופה.
    הערה: עיין בטבלה 2 לנוסחאות המשמשות לחישוב מדד FIC ו-FIC. טבלה 3 מציגה MIC מאוחד המבוסס על בדיקת REMA. ערכי מדד MIC ו-FIC מייצגים מוצגים בטבלה 4.
    1. פרש את מדד FIC באופן הבא:
      FIC ≤ 0.5: מצביע על סינרגיה - התרופות פועלות יחד כדי לעכב צמיחה בצורה יעילה יותר מכל אחת מהתרופות לבדה.
      FIC > 0.5 עד < 4.0: ציין תוספות - האפקט המשולב שווה לסכום ההשפעות הבודדות.
      FIC ≥ 4.0: הצביע על אנטגוניזם - התרופות מפריעות זו לפעילות של זו.
  4. דוגמה: חישוב מדד FIC עבור BDQ ו-DEL ב-H37Rv
    1. קבע את ה-MIC של BDQ עבור H37Rv (למשל, 0.125 מיקרוגרם/מ"ל). בשילוב עם DEL, רשום את המיקרופון של BDQ כ-0.03 מיקרוגרם/מ"ל.
    2. קבע את המיקרופון של DEL עבור H37Rv (למשל, 0.063 מיקרוגרם/מ"ל). בשילוב עם BDQ, רשום את המיקרופון של DEL כ-0.125 מיקרוגרם/מ"ל.
    3. חשב FIC עבור BDQ:
      FIC(BDQ) = MIC של BDQ בשילוב/MIC של BDQ בלבד = 0.03 / 0.125 = 0.24
    4. חשב FIC עבור DEL:FIC(DEL) = מיקרופון של DEL בשילוב / מיקרופון של DEL בלבד = 0.125 / 0.063 = 1.98
    5. הוסף את שני ה-FICs כדי לקבל את מדד FIC:אינדקס FIC = FIC(BDQ) + FIC(DEL) = 0.24 + 1.98 = 2.26
    6. פרש את התוצאה.
      הערה: מדד FIC של 2.26 נופל בטווח האינטראקציה התוספתית (>0.5 עד <4.0), מה שמצביע על כך שלשילוב של BDQ ו-DEL יש השפעה תוספת על עיכוב הגדילה של M. tuberculosis.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

קביעת MIC של תרופות נגד שחפת על ידי בדיקת REMA
פעילותם של Bedaquiline, Delamanid, Moxifloxacin ו-Isoniazid הוערכה באמצעות REMA כנגד H37RV רגיש לתרופות ומבודד קליני עמיד לתרופות של M. tuberculosis. בדקווילין, דלמאניד ואיזוניאזיד שימשו בטווח הריכוזים של (1 מיקרוגרם/מ"ל עד 0.03 מיקרוגרם/מ"ל) ומוקסיפלוקסצין היה בטווח של (2 מיקרוגרם/מ"ל עד 0.06 מיקרוגרם/מ"ל). תרחיפי החיידקים של מבודדים קליניים עמידים לתרופות של M. tuberculosis ו-H37Rv חוסנו והודגרו במשך 7 ימים בנוכחות ריכוזי תרופות שונים....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

האיום העולמי הנשקף משחפת עמידה לתרופות (DR-TB) הפך לנושא דחוף 1,19. זה יצר צורך דחוף בפיתוח שיטות משופרות ומהירות לבדיקת רגישות לתרופות (DST), במיוחד עבור תרופות קו שני וחדשות יותר נגד שחפת. שיטות כאלה חיוניות לשיפור אסטרטגיות הטיפול, ניהול יעיל של תרופות נגד שחפת והפחתת הסיכונים להתקדמות המחלה ועמידות נוספת20. שיטה המעריכה הן את הרגישות לתרופות והן את פרופילי האינטראקציה תספק יתרונות משמעותיים בהקשר זה, ת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בקבוק מרובע 250 מ"ל עם פקקשוט דוראן218203655הכנת מדיה
מרק 7H9בקטון דיקינסון271310מצעי גידול ל-M. tuberculosis (טמפרטורת החדר)
צלחת 96 באר עם מכסהקורנינג359696 בארות מיקרו-פלטות פוליסטירן שטוחות שטופלו TC, עטופות בנפרד, עם מכסה, סטריליות (טמפרטורת החדר)
טיפים לאמנות (1000 μ L)טרסונס528106מסנני פוליאתילן הידרופוביים עם  קצה מסנן מתלה מפוליפרופילן-סטרילי (טמפרטורת החדר)
טיפים לאמנות (200 μ L)טרסונס528104מסנני פוליאתילן הידרופוביים עם  קצה מסנן מתלה מפוליפרופילן-סטרילי (טמפרטורת החדר)
בריום כלוריד דיהידראטמרק217565הכנה סטנדרטית של מקפרלנד (טמפרטורת החדר)
בדקווילין (BDQ)יאנסן וג'נסןמתנה מג'נסן וג'נסןתרופה נגד שחפת (4 מעלות; C)
קזיטוןבקטון דיקינסון225930תוסף לתרבית חיידקים (טמפרטורת החדר)
Delamanid (DEL)אוטסוקה פרמצבטיקהמתנה מ-Otsuka Pharmaceuticalsתרופה נגד שחפת (4 מעלות; C)
דימתיל סולפוקסידסיגמא-אולדריץ'67-68-5הכנת מלאי תרופות (טמפרטורת החדר)
סנן 0.2 μ mמיליפורSLGVR33RS0.22  μ m PVDF, מסנן מזרק חד פעמי, סטרילי (טמפרטורת החדר)
גליצרולמרק356350נוסף למדיה תרבותית (טמפרטורת החדר)
לולאת חיסוןסיגמא-אולדריץ'I8263להכנת תרחיף תרבות (טמפרטורת החדר)
איזוניאזיד (INH)סיגמא-אולדריץ'I3377-5Gתרופה נגד שחפת (4 מעלות; C)
LJ בינוני נטוימיקובקטוסל BD221414מצעי גידול עבור M. tuberculosis (4 & deg; C)
בקבוק McCartney Bijou Narrow Mouth, 14 מ"לסופרטק12.124.0014להכנת תרחיף תרבות (טמפרטורת החדר)
בקבוק McCartney Bijou Narrow Mouth, 7 מ"לסופרטק12.124.0007להכנת תרחיף תרבות (טמפרטורת החדר)
מיקרופיפטות (1000 μ L)גילסוןF144059Mלטיפול מדויק בנוזלים (טמפרטורת החדר)
מיקרופיפטות (200 μ L)גילסוןFA10005Mלטיפול מדויק בנוזלים (טמפרטורת החדר)
מוקסיפלוקסצין (MOX)סיגמא-אולדריץ'SML1581-50 מ"גתרופה נגד שחפת (4 מעלות; C)
פיפטה רב-ערוצית (20– 200 μ L)VWR849070024לפיפטינג סימולטני על פני בארות
OADCבקטון דיקינסון211886תוסף לתרבית חיידקים (4 מעלות; C)
מילוי פיפטותמרקZ333980לטיפול מדויק בנוזלים (טמפרטורת החדר)
מלח נתרן רזזוריןסיגמא-אולדריץ'62758-13-8מחוון חמצון חיזור עבור מבחני REMA (טמפרטורת החדר)
פיפטות סרולוגיות, 10 מ"לקורנינגCLS4100נעשה שימוש בפיפטות חד פעמיות סטריליות מפוליסטירן (טמפרטורת החדר)
חרוזי זכוכית מוצקה, קוטר 6 מ"מסיגמא-אולדריץ'Z265950להכנת תרחיף תרבות (טמפרטורת החדר)
חומצה גופרתית 95– 97%מרק100731הכנה סטנדרטית של מקפרלנד (טמפרטורת החדר)
מזרקים לפילטרדיספו ואן100032לשימוש עם מסנני מזרק
מערבל מערבולתרמיCM-101 פלוסלהכנת תרחיף תרבות
תיק פולי עם רוכסןסיגמא-אולדריץ'Z162949

מקורות

  1. Global tuberculosis report 2023. , World Health Organization. https://www.who.int/publications/i/item/9789240083851 (2023).
  2. Khawbung, J. L., Nath, D., Chakraborty, S. Drug-resistant tuberculosis: A review. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 74, 101574(2021).
  3. Alame Emane, A. K., Guo, X., Takiff, H. E., Liu, S. Highly transmitted M. tuberculosis strains are more likely to evolve MDR/XDR and cause outbreaks, but what makes them highly transmitted. Tuberculosis. 129, 102092(2021).
  4. Koul, A., et al. Delayed bactericidal response of Mycobacterium tuberculosis to bedaquiline involves remodelling of bacterial metabolism. Nat Commun. 5, 3369(2014).
  5. Matsumoto, M., et al. OPC-67683, a nitro-dihydro-imidazooxazole derivative with promising action against tuberculosis in vitro and in mice. PLoS Med. 3 (11), e466(2006).
  6. WHO consolidated guidelines on tuberculosis: Module 4. treatment drug-resistant tuberculosis treatment. , World Health Organization. At https://www.who.int/publications/i/item/9789240063129 (2020).
  7. Conradie, F., et al. Treatment of highly drug-resistant pulmonary tuberculosis. N Engl J Med. 382 (10), 893-902 (2020).
  8. Lechartier, B., Hartkoorn, R. C., Cole, S. T. In vitro combination studies of benzothiazinone lead compound BTZ043 against Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 56 (11), 5790-5793 (2012).
  9. Mallikaarjun, S., et al. Delamanid coadministered with antiretroviral drugs or anti-tuberculosis drugs shows no clinically relevant drug-drug interactions in healthy subjects. Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 5976-5985 (2016).
  10. Pai, M., Nicol, M. P., Boehme, C. C. Tuberculosis diagnostics: State of the art and future directions. Microbiol Spectr. 4 (5), (2016).
  11. Palomino, J. -C., et al. Resazurin microtiter assay plate: Simple and inexpensive method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 46 (8), 2720-2722 (2002).
  12. Pital, A., Pital, R. C., Leise, J. M. A rapid method for determining the drug susceptibility of Mycobacterium tuberculosis. Am Rev Tuberc. 78 (1), 111-116 (1958).
  13. Präbst, K., Engelhardt, H., Ringgeler, S., Hübner, H. Basic colorimetric proliferation assays: MTT, WST, and Resazurin. Methods Mol Biol. 1601, 1-17 (2017).
  14. Schön, T., et al. Antimicrobial susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis complex isolates - the EUCAST broth microdilution reference method for MIC determination. Clin. Microbiol. Infect. 26 (11), 1488-1492 (2020).
  15. Singh, S., et al. Rapid identification and drug susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis: Standard operating procedure for non-commercial assays: Part 3: Colorimetric Redox Indicator Assay v1.3.12. J Lab Physicians. 4 (2), 120-126 (2012).
  16. Caleffi-Ferracioli, K. R., Maltempe, F. G., Siqueira, V. L. D., Cardoso, R. F. Fast detection of drug interaction in Mycobacterium tuberculosis by a checkerboard resazurin method. Tuberculosis. 93 (6), 660-663 (2013).
  17. Peñuelas-Urquides, K., et al. Measuring of Mycobacterium tuberculosis growth: a correlation of the optical measurements with colony forming units. Braz J Microbiol. 44 (1), 287-290 (2013).
  18. Chandramohan, Y., et al. In vitro interaction profiles of the new antitubercular drugs bedaquiline and delamanid with Moxifloxacin against clinical Mycobacterium tuberculosis isolates. J Glob Antimicrob Resist. 19, 348-353 (2019).
  19. Hameed, H. A., et al. Characterization of genetic variants associated with rifampicin resistance level in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates collected in Guangzhou Chest Hospital, China. Infect Drug Resist. 15, 5655-5666 (2022).
  20. Lienhardt, C., et al. New drugs for the treatment of tuberculosis: Needs, challenges, promise, and prospects for the future. J Infect Dis. 205, S241-S249 (2012).
  21. Anoopkumar-Dukie, S., et al. Resazurin assay of radiation response in cultured cells. Br J Radiol. 78 (934), 945-947 (2005).
  22. Baker, C. N., Thornsberry, C., Hawkinson, R. W. Inoculum standardization in antimicrobial susceptibility testing: evaluation of overnight agar cultures and the rapid inoculum standardization system. J Clin Microbiol. 17 (3), 450-457 (1983).
  23. McFarland, J. The nephelometer: an instrument for estimating the number of bacteria in suspensions used for calculating the opsonic index and for vaccines. J Am Med Assoc. XLIX (14), 1176(1907).
  24. Bellio, P., Fagnani, L., Nazzicone, L., Celenza, G. New and simplified method for drug combination studies by checkerboard assay. MethodsX. 8, 101543(2021).
  25. Martin, A., Camacho, M., Portaels, F., Palomino, J. C. Resazurin microtiter assay plate testing of Mycobacterium tuberculosis susceptibilities to second-line drugs: Rapid, simple, and inexpensive method. Antimicrob Agents Chemother. 47 (11), 3616-3619 (2003).
  26. Zhao, L., et al. Evaluation of BACTEC MGIT 960 system for the second-line drugs susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in China. J Microbiol Methods. 91, 212-214 (2012).
  27. Said, H. M., et al. Comparison between the BACTEC MGIT 960 system and the agar proportion method for susceptibility testing of multidrug resistant tuberculosis strains in a high burden setting of South Africa. BMC Infect Dis. 12, 369(2012).
  28. Caviedes, L., Delgado, J., Gilman, R. H. Tetrazolium microplate assay as a rapid and inexpensive colorimetric method for determination of antibiotic susceptibility of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 40 (5), 1873-1874 (2002).
  29. Mouton, J. W., Vinks, A. A. Pharmacokinetic/pharmacodynamic modelling of antibacterials in vitro and in vivo using bacterial growth and kill kinetics. Clin Pharmacokinet. 44 (2), 201-210 (2005).
  30. Sychev, A. V., Lavrova, A. I., Dogonadze, M. Z., Postnikov, E. B. Establishing compliance between spectral, colourimetric and photometric indicators in resazurin reduction test. Bioengineering. 10 (8), 962(2023).
  31. Postnikov, E. B., Sychev, A. V., Lavrova, A. I. Dose-response curve in REMA test: Determination from smartphone-based pictures. Analytica. 5 (4), 619-631 (2024).
  32. Mehlawat, N., Chakkumpulakkal Puthan Veettil, T., Sharpin, R., Wood, B. R., Alan, T. Ultrafast and ultrasensitive bacterial detection in biofluids: Leveraging resazurin as a visible and fluorescent spectroscopic marker. Anal Chem. 96 (45), 18002-18010 (2024).
  33. Grosset, J., Truffot-Pernot, C., Lacroix, C., Ji, B. Antagonism between isoniazid and the combination pyrazinamide-rifampin against tuberculosis infection in mice. Antimicrob Agents Chemother. 36 (3), 548-551 (1992).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.