הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הפרדה ופיצול של חלבוני תסנין תרבית (CFPs) מ-Mycobacterium tuberculosis

880 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67679

⸱

11 ביולי 2025

 ,  ,  , 
1Department of Immunology, National Institute for Research in Tuberculosis, 2Faculty of Medical Research, Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את הגידול, הקציר והריכוז של חלבונים מופרשים של Mycobacterium tuberculosis. חלבוני תסנין תרבית (CFPs) מכומתים, מופרדים ל-20 שברים על ידי מיקוד איזואלקטרי, ונפתרים עוד יותר ל-30 שברים באמצעות SDS-PAGE מכין ומערכת אלקטרו-אלוציה.

תקציר

חלבונים המופרשים של Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) ממלאים תפקיד מכריע בפתוגנזה של שחפת, אפנון חיסוני והתקדמות המחלה. הבנת הרכבם ותפקודם חיונית לזיהוי סמנים ביולוגיים חדשים שיכולים לסייע באבחון שחפת, פיתוח חיסונים והתערבויות טיפוליות. מחקר זה מתמקד בבידוד, פיצול ואפיון שיטתי של חלבוני סינון תרבית (CFPs) כדי לאפשר ניתוחים אימונולוגיים ופרוטאומיים מקיפים. CFPs התקבלו מתרביות M. tuberculosis H37Rv שגודלו בתנאים מוגדרים כימית כדי להבטיח ביטוי חלבון מבוקר. הסופרנטנט התרבית טוהר באמצעות סינון ורוכז באמצעות מערכת סיבים חלולה כדי לשמור על חלבונים מעל 10 kDa. הפיצול הושג באמצעות מיקוד איזואלקטרי בשלב נוזלי, הפרדת חלבונים על סמך הנקודות האיזואלקטריות שלהם ל-20 שברים נפרדים. פתרון נוסף בוצע באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE), ואחריו אלקטרו-אלוציה, והניב 30 שברי חלבון. החלבונים המפוצלים המתקבלים באמצעות גישה זו מספקים משאב רב ערך לפרופיל אימונולוגי וניתוחים פרוטאומיים מבוססי ספקטרומטריית מסה. על ידי בידוד ואפיון שיטתי של חלבונים מופרשים, מחקר זה תורם לזיהוי סמנים ביולוגיים של חלבונים ספציפיים לשחפת, שיכולים לשפר את דיוק האבחון ולקדם את הבנתנו את הפתוגנזה של M. tuberculosis .

מבוא

מחקר מקיף הדגיש את התפקיד המשמעותי של חלבונים מופרשים בגדילה ובאינטראקציות החיסוניות של Mycobacterium tuberculosis1. תסנין התרבית של M. tuberculosis מכיל מערך מורכב של רכיבים חלבונים ולא חלבונים, מה שהופך אותו למשאב רב ערך להבנת הביולוגיה והתכונות החיסוניות שלו. מחקרים פרוטאומיים מוקדמים זיהו כמעט 450 חלבונים בתרביתפילטר 2, שרבים מהם ממלאים תפקיד קריטי ביצירת תגובות חיסוניות נגד שחפת. זיהוי האנטיגנים הרלוונטיים מבחינה אימונולוגית חיוני לפיתוח אבחון וחיסונים חדשניים לשחפת. עם זאת, ההתקדמות בתחום זה מאותגרת על ידי מורכבות התגובה החיסונית לזיהום M. tuberculosis והמגבלות הטכניות של שיטות טיהור ביוכימיות המשמשות לבידוד חלבונים מיקובקטריאליים.

טכניקות הפרדה שונות הופעלו כדי לפתור חלבוני M. tuberculosis, מה שמקל על איתור חלבונים מינוריים אך משמעותיים מבחינה תפקודית ומרחיב את היקף המחקרים הפרוטאומיים. שיטת הפרדה אידיאלית פותרת ביעילות תערובות חלבון מורכבות למספר מוגבל של שברים נפרדים. שתי גישות בשימוש נרחב להפרדת חלבונים מיקובקטריאליים הן שיטות מבוססות כרומטוגרפיה ומבוססות אלקטרופורזה 1,2.

טכניקות כרומטוגרפיות, כולל זיקה, חילופי יונים וכרומטוגרפיה בשלב הפוך, היו אבן הפינה של פיצול חלבונים במשך למעלה מעשור. שיטות אלה שימשו באופן נרחב להפרדת חלבוני M. tuberculosis 3. עם זאת, הם מוגבלים על ידי גורמים כמו תפוקות חלבון נמוכות והפרעות מרכיבים שאינם חלבונים, מה שעלול לסבך את הניתוחים האימונולוגיים הבאים. חסרונות אלה מגבילים את התועלת של כרומטוגרפיה לזיהוי אנטיגנים רלוונטיים מבחינה אימונולוגית.

כדי להתמודד עם מגבלות אלו, אומצה שיטת הפרדה דו-ממדית מבוססת אלקטרופורזה. בממד הראשון, חלבונים מופרדים על סמך המיקוד האיזואלקטרי שלהם (IEF) באמצעות מערכת IEF מכינה, המפרידה חלבונים לפי הנקודות האיזואלקטריות שלהם. בממד השני, חלבונים נפתרים עוד יותר על ידי משקל מולקולרי באמצעות SDS-PAGE מכין, ואחריו פליטה עם מכשיר אלוטר ג'ל שלם.

גישה דו-ממדית זו מציעה מספר יתרונות. זה מפחית משמעותית את המורכבות של חלבוני סינון תרבית (CFP) על ידי חלוקתם ל-600 שברים נפרדים. בנוסף, השברים מתאימים לניתוח אימונולוגי ישיר מכיוון שתהליך הפליטה אינו מכניס רכיבים המפריעים לבדיקות אימונולוגיות תאיות 4,5,6.

פרוטוקול זה מפרט את ההכנה וההפרדה של חלבוני תסנין תרבית לניתוח אימונולוגי6.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרטי הריאגנטים והציוד המשמש במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. גידול Mycobacterium tuberculosis והכנת חלבוני תסנין תרבית (CFPs)

  1. הכנת המדיום הנוזלי של סאוטון
    1. שלב את הרכיבים הבאים ב-950 מ"ל מים מזוקקים: גליצרול, 30.0 מ"ל; אשלגן דימימן אורתופוספט (KH2PO4), 0.5 גרם; מגנזיום גופרתי, 0.5 גרם; חומצת לימון, 2.0 גרם; קזאין הידרוליזט, 0.5 גרם; אמוניום גופרתי ברזל, 0.05 גרם; נתרן גלוטמט, 4.0 גרם.
    2. התאם את ה-pH ל-7.2 באמצעות 40% אשלגן הידרוקסיד (כ-5 מ"ל/ליטר).
    3. הגדל את עוצמת הקול ל-1 ליטר וחיטוי ב-15 psi למשך 20 דקות.
  2. הכנת תרחיף מיקובקטריאלי
    1. מושבות העברה של Mycobacterium tuberculosis H37Rv (ATCC 27294) הגדלות במדרונות Lowenstein-Jensen (LJ) לתוך 2 מ"ל של המדיום הנוזלי של Sauton.
    2. לפרק גושים מיקובקטריאליים על ידי ניעור נמרץ עם חרוזי זכוכית בתנאים סטריליים.
  3. התחלת גידול מיקובקטריאלי
    1. העבירו את תרחיף החיידקים לבקבוק מקרטני המכיל 10 מ"ל של המדיום הנוזלי של סאוטון.
    2. דגרו את הבקבוק בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שבועיים.
  4. הרחבת התרבות
    1. העבירו את התרבות הגדלה ל -200 מ"ל של המדיום של סאוטון בבקבוק של 1 ליטר.
    2. דגירה על שייקר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שבועות.
    3. העבירו את תרבית שלב היומן לבקבוק של 4 ליטר המכיל 2 ליטר של המדיום של סאוטון.
    4. מגדלים את התרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתנאים נייחים למשך 4 שבועות נוספים עד להיווצרות פליקל על פני השטח.
  5. קצירת חלבוני תסנין התרבית (CFPs)
    1. קצרו את התרבית על ידי צנטריפוגה בחום של 1,000-1,500 x גרם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. סנן את ה-supernatant דרך מערכת סינון ואקום של 0.45 מיקרומטר.
    3. רכז את המסנן המכיל CFP באמצעות מערכת סינון זרימה משיקה עם חתך של 10 kDa.
  6. אחסון ה- CFP שנקטף
    1. העריכו את תכולת החלבון באמצעות ערכת בדיקת BCA הזמינה מסחרית.
    2. יש להצטמצם את החלבונים, להוסיף נתרן אזיד לריכוז סופי של 0.2%, ולאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

2. מיקוד איזואלקטרי שלב נוזלי מכין (IEF)

  1. הכנת דגימת חלבון
    1. להמיס את Mycobacterium tuberculosis CFP ב-60 מ"ל של מאגר הפרדה IEF המכיל 8 M של אוריאה, 1 מ"מ של דיתיותרייטול (DTT), 5% גליצרול, 2% דיגיטונין, 2% אמפוליטים (pH 3.0-10.0 ו-pH 4.0-6.0 ביחס של 1:4).
  2. הגדרת מערכת IEF
    1. מלאו את תא האנודה בחומצה זרחתית 0.1 M ואת תא הקתודה בנתרן הידרוקסיד 0.1 M.
    2. הרכיבו את תא ה-IEF המכין בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
  3. ביצוע IEF
    1. טען עד 350 מ"ג חלבון על מערכת IEF.
    2. מקדו חלבונים ב-4 מעלות צלזיוס עם מערכת מים במחזור הדם הקירור.
    3. הפעל הספק קבוע של 12 וואט עד שהמתח מתייצב על כ -1400 וולט, ואז המשך למשך 30 דקות נוספות.
  4. איסוף וניתוח השברים
    1. קצור שברי IEF וקבע את ה-pH שלהם.
    2. נתח כל מנה על ידי SDS-PAGE ודמיין חלבונים באמצעות צביעת כסף.

3. הכנה ל-SDS-PAGE ופליטת ג'ל שלם

  1. הכנת דוגמאות ל-SDS-PAGE
    1. ערבב שברי IEF עם מאגר דגימה של 6x SDS-PAGE הזמין מסחרית.
    2. מחממים את התערובת בחום של 95 מעלות למשך 5 דקות.
  2. הפעלת SDS-PAGE מכין
    1. טען עד 10 מ"ג חלבון בג'ל פוליאקרילאמיד בגודל 16 ס"מ × 20 ס"מ עם ג'ל ערימה של 4% וג'ל ממיס של 12.5%.
    2. הפעל אלקטרופורזה בזרם קבוע של 50 mA עד שחזית הצבע נמצאת 2 ס"מ מלמטה.
  3. הסרת חלבונים מהג'ל
    1. אזנו את הג'ל במאגר פליטה (60 מ"מ של Tris, 40 מ"מ של CAPS, pH 9.4) למשך 10 דקות.
    2. העבירו את הג'ל למכשיר מסיר הג'ל השלם.
    3. לחסל חלבונים על ידי הפעלת זרם קבוע של 250 mA למשך שעה.
  4. איסוף וניתוח השברים
    1. יש להוציא את החלבונים המופרדים ל -30 שברים בודדים, כל אחד בנפח של 2.5 מ"ל.
    2. קבעו את ריכוז החלבון בשיטת הערכת חלבון BCA בהתאם להוראות היצרן.
    3. נתח 10 מיקרוגרם חלבון מכל שבר על ידי SDS-PAGE ודמיין באמצעות צביעת כסף.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1 ממחיש את המורכבות של חלבוני תסנין התרבית (CFP) שהוכנו. בתחילה, 100 מיקרוגרם של CFP עבר ניתוח עמוד 2D-SDS כדי להעריך את מורכבותו. ניתוח זה חשף נוכחות של כמעט 100 נקודות חלבון שונות ב-CFP (איור 1).

20 השברים שנאספו מכל ריצה נותחו על ידי SDS-PAGE. מתוכם, שלושה שברים מייצגים משלוש ריצות שונות מוצגים באיור 2.

איור 3 מתאר את התפלגות ה-pH של השברים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

חלבוני תסנין תרבית (CFPs) של Mycobacterium tuberculosis מייצגים תערובת מורכבת של רכיבי חלבון מגוונים הקיימים בריכוזים משתנים. מחקרים פרוטאומיים זיהו עד 1,314 חלבונים בתוך CFP 4,5. מחקרים רבים הדגישו את התפקיד המכריע של CFPs בוויסות תגובות חיסוניות. באופן ספציפי, CFPs ממלאים תפקיד הכרחי הן בחסינות תאית, המאופיינת בתגובות תאי T 4,5,6,7, והן בתגובות נוגדנים בתיווך תאי B <...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Ä מערכת סינון זרימה משיקית שטף KTA סיטיבה29038437
אמפוליטים (pH 3.0 עד 10.0)ביו-ראד1632094
אמפוליטים (pH 4.0 עד 6.0)ביו-ראד1631143
בדיקת חלבון BCA מרק71285-מ
כמוסותמרקC2632
קזאין הידרוליזטמרק65072-00-6
חומצת לימוןמרקג0759
דיגיטוניןמרק300410
DTTמרקD9779
ברזל אמוניום גופרתיהיימדיהGRM10944
גליצרולמרקG5516
גליצרול מרק252859
לוונשטיין-ג'נסן נוטה היימדיהSL001
מגנזיום גופרתימרקM7506
מערכת סינון ואקום לשחרור מהיר של Millipore StericupמרקS2HVU11RE
חומצה זרחתית מרק695017
אשלגן דימימן אורתופוספטמרקעמ' 0662
אשלגן הידרוקסיד מרק484016
תא IEF מכין (Rotofor) ביו-ראד170-2986 
נתרן אזיד מרקS2002
נתרן גלוטמטמרק49621
נתרן הידרוקסידהיימדיהMB095
טריסמרק252859
אוריאהמרקU5128
מכשיר ג'ל שלם ביו-ראד1651250

מקורות

  1. Gomez, M., Johnson, S., Gennaro, M. L. Identification of secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis by a bioinformatic approach. Infect Immun. 68 (4), 2323-2327 (2000).
  2. de Souza, G. A., et al. High-accuracy mass spectrometry analysis as a tool to verify and improve gene annotation using Mycobacterium tuberculosis as an example. BMC Genomics. 9, 316(2008).
  3. Lim, J. H., et al. Identification of the new T-cell-stimulating antigens from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate. FEMS Microbiol Lett. 232 (1), 51-59 (2004).
  4. Covert, B. A., Spencer, J. S., Orme, I. M., Belisle, J. T. The application of proteomics in defining the T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 1 (5), 574-586 (2001).
  5. Tucci, P., et al. Integrative proteomic and glycoproteomic profiling of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate. PLoS One. 15 (3), e0221837(2020).
  6. Deenadayalan, A., et al. Immunoproteomic identification of human T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis that differentiate healthy contacts from tuberculosis patients. Mol Cell Proteomics. 9 (3), 538-549 (2010).
  7. Yasuda, I., et al. Evaluation of cytokine profiles related to Mycobacterium tuberculosis latent antigens using a whole-blood assay in the Philippines. Front Immunol. 15, 1330796(2024).
  8. Målen, H., Søfteland, T., Wiker, H. G. Antigen analysis of Mycobacterium tuberculosis H37Rv culture filtrate proteins. Scand J Immunol. 67 (3), 245-252 (2008).
  9. Bekmurzayeva, A., Sypabekova, M., Kanayeva, D. Tuberculosis diagnosis using immunodominant, secreted antigens of Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis (Edinb). 93 (4), 381-388 (2013).
  10. Rodríguez-Hernández, E., et al. Application of antigenic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis. J Zhejiang Univ Sci B. 21 (11), 856-870 (2020).
  11. Mustafa, A. S. Chemical and biological characterization of Mycobacterium tuberculosis-specific ESAT6-like proteins and their potentials in the prevention of tuberculosis and asthma. Med Princ Pract. 32 (4-5), 217-224 (2023).
  12. Rosenkrands, I., et al. Towards the proteome of Mycobacterium tuberculosis. Electrophoresis. 21 (17), 3740-3756 (2000).
  13. Jungblut, P. R., et al. Comparative proteome analysis of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis BCG strains: Towards functional genomics of microbial pathogens. Mol Microbiol. 33 (6), 1103-1117 (1999).
  14. Lim, J. H., et al. Identification of the new T-cell-stimulating antigens from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate. FEMS Microbiol Lett. 232 (1), 51-59 (2004).
  15. Rodríguez-Hernández, E., et al. Application of antigenic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis. J Zhejiang Univ Sci B. 21 (11), 856-870 (2020).
  16. Deenadayalan, A., Sundaramurthi, J. C., Raja, A. Immunological and proteomic analysis of preparative isoelectric-focusing separated culture filtrate antigens of Mycobacterium tuberculosis. Exp Mol Pathol. 88 (1), 156-162 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

שבירה למקטעי חלבוןמיקוד איזואלקטריSDS-PAGEסממנים חלבונייםפרופיל אימונולוגיסינון בזרימה מיתביתאנליזה פרוטאומיקהאנטיגנים של תאי T
הפרדה ופיצול של חלבוני תסנין תרבית (CFPs) מ-Mycobacterium tuberculosis
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.