מאמר שיטה

הפרדה ופיצול של חלבוני דופן התא וקרום התא מ-Mycobacterium tuberculosis לניתוח חלבונים במורד הזרם

DOI:

10.3791/67680

⸱

26 בספטמבר 2025

 ,  ,  , 
1Department of Immunology, National Institute for Research in Tuberculosis, 2Faculty of Medical Research, Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מפריד בין חלבוני דופן התא והממברנה הבלתי מסיסים לשברים פשוטים (1-5 חלבונים) באמצעות מיקוד איזואלקטרי מכין (IEF) המבוסס על נקודה איזואלקטרית, ואחריו הפרדה לפי משקל מולקולרי. ניתן להשתמש בשברים המתקבלים ישירות לניתוח אימונולוגי ופרוטאומי ללא טיהור נוסף.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלבוני דופן התא והממברנה, הממלאים תפקיד מרכזי בפתוגנזה של שחפת, הופרדו בהצלחה באמצעות מיקוד איזואלקטרי מכין (IEF) ואלקטרופורזה של ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE). ואחריו פליטת ג'ל, התגברות על מגבלות בשיטות קונבנציונליות להפרדת חלבונים הידרופוביים. בהליך זה, מושבות M. tuberculosis הועברו מ-Lowenstein-Jensen slants ל-2 מ"ל של מרק 7H9, פוזרו בחרוזי זכוכית והודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך שבועיים. לאחר מכן, התרבית הוגדלה ל-200 מ"ל וגודלה בשייקר במשך 4 שבועות. הוא שודרג עוד יותר ל-1 ליטר עם 500 מ"ל של מרק 7H9 וגדל במשך 4 שבועות נוספים. מיקובקטריות שגודלו הושלכו על ידי צנטריפוגה ב-1741 × גרם למשך 30 דקות. עבור כל גלולה של 2 גרם, נוסף 1 מ"ל של מאגר שבירה, והדגימה עברה סוניקציה. הליזאט צנטריפוגה ב-3436 × גרם למשך 15 דקות כדי להסיר תאים לא שבורים, והסופרנטנט רוכז. סופרנטנט זה (ליזאט תא שלם) צנטריפוגה ב-13751 × גרם למשך 30 דקות לחלבוני דופן התא. הסופרנטנט הנותר עבר אולטרה-צנטריפוגה ב-100,000 × גרם למשך 4 שעות כדי להפריד בין קרום התא לציטוזול. חלבוני דופן התא והממברנה המבודדים הועמסו על מערכת IEF הכנה נוזלית ב-4 מעלות צלזיוס והופרדו ב-12 וואט עד שהמתח התייצב על 1400 וולט, המפריד בין 20 שברים. שברי IEF אלה הופרדו עוד יותר על ידי SDS-PAGE מכין, וחלבונים נפלטו באמצעות אלוטר ג'ל שלם ב-250 mA, וכתוצאה מכך נוצרו 30 שברים. באמצעות פרוטוקול זה, הצלחנו לזהות דפנות תאים חדשים של M. tuberculosis וסמנים ביולוגיים ספציפיים לממברנה, והוא גם מראה פוטנציאל לאפיון חלבונים דומים בפתוגנים אחרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים אימונולוגיים הראו כי בנוסף לחלבונים מסיסים, שקל לטהר, התגובה החיסונית האנושית לפתוגנים כמו M. tuberculosis מכוונת גם לחלבון הידרופובי הקיים בדופן התא1 וחלבוני קרום התא2 של Mycobacterium tuberculosis. חלבוני דופן התא והממברנה הללו ממלאים תפקיד מכריע בבקרה אימונולוגית נגד פתוגנים רבים, כולל שחפת. חלק מהחלבונים הללו מדווחים כאנטיגנים אימונודומיננטיים המגבירים את תגובת תאי T ו-B. לעומת זאת, חלבונים אחרים מזוהים כחתימות מולקולריות של פתוגנים המוכרים כיוזמים תגובה חיסונית מולדת, כגון דפוסים מולקולריים הקשורים לפתוגן (PAMPs) על ידי תאי חיסון, ובכך יוזמים תגובה חיסונית. לדוגמה, ליפופרוטאינים מיקובקטריאליים כגון LprG, LpqH, LprA ו-PhoS1 מזוהים על ידי קולטן דמוי טול 23.

האופי ההידרופובי של חלבוני דופן התא והממברנה מציב אתגרים טכניים משמעותיים מבחינת המסיסות וההפרדה שלהם. מחקרים הראו כי חלבוני ממברנה מהווים כ-20% עד 30% מאזורי הקידוד של כל האורגניזמים, כולל מיקובקטריות 4,5. בשל אופיים הפנימי והאתגרים הטכניים שלהם, חלבוני דופן התא והממברנה קשים יותר למסיסים ולבידוד בהשוואה לחלבונים מסיסים. כתוצאה מכך, רק 2% ממבני חלבון הממברנה דווחו6. מספר גורמים תורמים לקושי בבידוד חלבונים אלה. האתגר העיקרי הוא שכיחותם הנמוכה בתוך התא, מה שמסבך את הבידוד של חלבונים בודדים לצורך אפיון נוסף7. בנוסף, חלבונים אלה נוטים להצטבר, מה שמסבך עוד יותר את מסיסותם. ניתן לטפל בבעיה זו על ידי הוספת חומרי ניקוי כדי לסייע בהמסה. עם זאת, חלבונים מסוימים עדיין עשויים ליצור אגרגטים גם בנוכחות חומרי ניקוי, ובמקרה זה ניתן להשתמש בחומרים כאוטרופיים וחומרים מפחיתים לשיפור המסיסות.

השימוש בחומרי ניקוי לצורך מסיסות עלול להפריע לשיטות ההפרדה הבאות. לדוגמה, לא ניתן להשתמש בחומרי ניקוי טעונים עם כרומטוגרפיה של חילופי יונים, וכל חומרי הניקוי יכולים לשבש את כרומטוגרפיית האינטראקציה ההידרופובית8. לכן, בחירת חומר ניקוי התואם לשיטת ההפרדה שנבחרה היא קריטית. שלב חשוב נוסף בבידוד חלבון דופן התא והממברנה הוא הסרת חומרי ניקוי המשמשים להמסה, מכיוון שאלו עלולים להפריע לניתוחים הפונקציונליים הבאים של החלבונים.

פיתחנו מתודולוגיה חזקה המתגברת על רבים מהאתגרים הקשורים לניתוח חלבוני ממברנה, במיוחד החלבונים ההידרופוביים מדופן התא ומממברנת התא. אתגר מרכזי בחקר חלבונים אלה הוא המסתותם, מכיוון שאופיים ההידרופובי מקשה על מיצוי וניתוח שלהם. המתודולוגיה המתוארת כאן משתמשת במאגר מיקוד איזואלקטרי (IEF) שנוסח במיוחד, המסיס ביעילות את חלבוני דופן התא וקרום התא. שלב מסיסות זה הוא קריטי מכיוון שהוא מאפשר ניתוח עוקב של חלבונים הידרופוביים אלה.

יתרון נוסף של שיטה זו הוא יכולתה להפחית את המורכבות של תערובת החלבון. על ידי שימוש בשתי טכניקות הפרדה משלימות - המבוססות על הנקודה האיזואלקטרית (pI) והמשקל המולקולרי של חלבונים - מתודולוגיה זו מפרידה ביעילות בין חלבוני דופן התא וקרום התא לשברים פשוטים. כל שבר מכיל בדרך כלל רק חלבון אחד עד שלושה, מה שמשפר משמעותית את הרזולוציה ומקל על אפיון במורד הזרם.

מתודולוגיה זו, שפותחה תוך שימוש בחלבוני דופן התא Mycobacterium tuberculosis וקרום התא כמערכת מודל, מתמודדת ביעילות עם האתגרים הקשורים לבידוד וניתוח חלבונים הידרופוביים. הוא מספק גישה אמינה לבידוד, הפרדה ואפיון של שברי חלבון מורכבים אלה, ומקדם את היכולת לחקור אותם בפירוט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה עמד בהנחיות הממשלתיות הרלוונטיות ואושר על ידי הוועדה המדעית המייעצת המוסדית והוועדה האתית הסכמה מדעת התקבלה מאוכלוסיית המחקר לפני שנלקחו הדגימות.

1. גידול שחפת

  1. העבירו כ-10 מושבות שחפת מ-Lowenstein-Jensen ל-2 מ"ל של מדיום מרק 7H9 (השעו 2.35 גרם של בסיס מרק Middlebrook 7H9 ב-400 מ"ל מים מזוקקים, 50 מ"ל תוסף Oleic Albumin Dextrose Catalase [OADC], 0.5 גרם Tween 80, ויוצרים עד 500 מ"ל)
    הערה: M. tuberculosis הוא פתוגן מקבוצת סיכון 3; יש לטפל בו בארון בטיחות ביולוגי (BSC) במתקן BSL3. יש להשתמש בציוד מגן אישי מתאים (PPE).
  2. פזרו את התאים באמצעות חרוזי זכוכית בתנאים סטריליים בשייקר בקבוקים ב-15 סל"ד למשך דקה.
  3. מעבירים את תרחיף החיידקים ל-10 מ"ל של מדיום מרק 7H9 בבקבוק מקרטני ומדגרים ב-37 מעלות צלזיוס למשך שבועיים בחממת שייקר ב-30 סל"ד.
  4. הגדילו את תרבית שלב העץ ל-200 מ"ל של מדיום מרק 7H9 וגידלו בתרבית שייקר במשך 4 שבועות ב-30 סל"ד.
  5. יתר על כן, הגדילו את התרבית בבקבוק של 1 ליטר המכיל 500 מ"ל של מדיום מרק 7H9 וגידלו כתרבית שייקר ב-30 סל"ד למשך 4 שבועות ב-37 מעלות צלזיוס.
  6. קצרו את המיקובקטריות על ידי צנטריפוגה בחום של 1741 גרם למשך 30 דקות.

2. הכנת חלבוני ליזאט תאים שלמים

  1. הכניסו את גלולת החיידקים המבודדת לסוניקציה בהתאם לפרוטוקול סטנדרטי.
  2. הכן את מאגר השבירה עם ההרכב הבא: 20 מ"מ Tris עם 8.5% (8.5 גרם ל-100 מ"ל) NaCl.
  3. התאימו את ה-pH הסופי ל-7.4 עם HCl מרוכז.
  4. הוסף מעכבי פרוטאז טריים שהוכנו למאגר השבירה עם הריכוזים הבאים (פרטים על מעכבי פרוטאז שיש להוסיף מפורטים בטבלה משלימה 1)
  5. טפל בבצילי M. tuberculosis (נפח ארוז של 100 מ"ל ונשקל) על כל 2 גרם של כדור תא חיידקים, הוסף 1 מ"ל של מאגר שבירה עם ליזוזים (1 מ"ג/5 מ"ל של תרחיף תאים) ודגירה למשך 15 דקות ב-37 מעלות צלזיוס תוך ערבוב עדין.
  6. השעו את הבצילי בנפח השבירה הכפול שלו.
  7. הוסף 0.04% (wt/vol) נתרן אזיד ו-0.05% Tween 80 למאגר.
  8. לשבש את תאי החיידקים במאגר השבירה באמצעות סוניקטור עם מחזור של 9 שניות דולק ו-9 שניות כבוי למשך 30 דקות במשרעת של 40%, תוך שמירה על התרחיף על הקרח כדי למנוע דנטורציה של חלבון.
  9. צנטריפוגה את הליזט המוכן ב-3438 גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס להסרת תאים לא שבורים.
  10. רכז את הסופרנטנט באמצעות רכזים צנטריפוגליים (חתך 3 kDa - 5 מ"ל).
  11. קבע את ריכוז החלבון בסופרנטנט באמצעות בדיקת כימות חלבון חומצה ביצינצ'ונינית (BCA) באמצעות חלבון BSA כסטנדרט.
    הערה: בניתוח SDS-PAGE, טען 50 מיקרוגרם חלבון לניתוח.

3. בידוד חלבוני דופן התא וקרום התא על ידי אולטרה-צנטריפוגה

  1. לבודד את דופן התא, קרום התא וחלבונים ציטוזוליים מליזאט התא כולו בהתאם לפרוטוקול של Raja et al.9. כמתואר להלן.
  2. צנטריפוגה של כל התא ליזאט ב-13751 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ומפרידה את חלבוני דופן התא כגלולה.
  3. הכניסו את הסופרנטנט לאולטרה-צנטריפוגה ב-100,000 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות באמצעות אולטרה-צנטריפוגה, הפרידו את חלבוני קרום התא כגלולה והשאירו את החלבונים הציטוזוליים בסופרנטנט.
  4. הערך את ריכוזי החלבון בדופן התא ובשברי קרום התא באמצעות בדיקת חלבון BCA.
    הערה: בניתוח SDS-PAGE, טען 50 מיקרוגרם חלבון לניתוח. דופן התא וקרום התא המופרדים מאוחסנים במקפיא של -80 מעלות צלזיוס עד לניתוח נוסף.

4. מיקוד איזואלקטרי בשלב נוזלי מכין (Rotofor [מכשיר IEF])

  1. להמיס את חלבוני דופן התא וקרום התא המבודדים על ידי אולטרה-צנטריפוגה במאגר IEF המכיל 8 M אוריאה, 1 מ"מ DTT, 5% גליצרול, 2% דיגיטונין.
  2. הוסיפו 2% אמפוליטים (pH 3.0 עד 10.0 ו-pH 4.0 עד 6.0 ביחס של 1:4)
  3. פרקו את החלבונים המסיסים באמצעות מערכת IEF נוזלית שנשמרה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם אמבט מי קירור.
  4. בצע את הפרדת ה- IEF על פי הוראות היצרן, תוך הפעלת הספק קבוע של 12 וואט עד שהמתח מתייצב (בין 1300 וולט ל -1600 וולט).
  5. המשך בהפעלת ה-IEF למשך 30 דקות נוספות לאחר ייצוב כרךtagה, עם זמן ריצה כולל של כ-5-6 שעות.
  6. אסוף את שברי ה-IEF הבודדים באמצעות משאבת ואקום וקבע את ערכי ה-pH שלהם.
  7. הכניסו את השברים המופרדים (50 מיקרוגרם) ל-SDS-PAGE ודמיינו את החלבונים באמצעות Coomassie Brilliant Blue (CBB) או צביעת כסף. אחסן את שברי ה-IEF המופרדים במקפיא של -80 מעלות צלזיוס עד לניתוח נוסף.

5. הכנה ל-SDS-PAGE ופליטת ג'ל שלמה

  1. מערבבים את דופן התא המופרדת ב-IEF ואת חלקי קרום התא עם מאגר דגימה 6x SDS-PAGE ומחממים ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לפני ניתוח SDS-PAGE.
  2. הפרד את שברי החלבון בממד השני באמצעות ג'ל פוליאקרילאמיד בגודל 16 ס"מ 20 ס"מ המורכב מג'ל ממיס 12.5% וג'ל ערימה של 4%.
  3. השתמש בבאר דגימה אחת באורך 13 ס"מ לטעינת הדגימה.
  4. מוליך אלקטרופורזה בזרם קבוע של 50 mA/gel עד שחזית הצבע מגיעה לתחתית הג'ל.
  5. אזנו את הג'ל במאגר פליטה (60 מ"מ Tris, pH 9.4; 40 מ"מ 3-(Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid [CAPS]) למשך 10 דקות לאחר ריצת האלקטרופורזה.
  6. העבירו את הג'ל למנגנון ג'ל שלם כמתואר על ידי יצרן המכשיר.
  7. יש להוציא את החלבונים מהג'ל על ידי הפעלת החלבון בזרם קבוע של 250 mA למשך שעה.
  8. אוספים כ -30 שברי חלבון, כל אחד בנפח 3 מ"ל, מכל ג'ל באמצעות משאבת ואקום.
  9. כמת את ריכוז החלבון בשברים המנופחים באמצעות בדיקת חלבון BCA.
  10. הכניסו 10 מיקרוגרם מהשברים שנפלטו לניתוח SDS-PAGE והדמינו על ידי צביעה כחולה מבריקה (CBB) של Coomassie.
    הערה: שברים שלמים מופרדים עם ג'ל אוחסנו במקפיא של -80 מעלות צלזיוס עד לניתוח נוסף.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בידוד חלבוני דופן התא וקרום התא על ידי אולטרה-צנטריפוגה במהירות גבוהה
חלבוני דופן התא והממברנה בודדו מליזטים של תאים שלמים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה כמתואר בפרוטוקול. ניתוח SDS-PAGE של השברים התת-תאיים המופרדים - דופן התא, קרום התא ופרופילי חלבון הציטוזול של M. tuberculosis מוצג באיור 1.

הפרדת חלבוני דופן התא על ידי מיקוד איזואלקטרי בשלב נוזלי
חלבוני דופן התא של Mycobacterium tuberculosis הומסו באמצעות מאגר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האופי ההידרופובי של חלבוני דופן התא והממברנה מציב אתגרים ניסיוניים משמעותיים במסיסותם והפרדתם. בפרוטוקול הנ"ל, תיארנו שיטת הפרדה דו-ממדית חדשה המבוססת על אלקטרופורזה כדי לבודד ביעילות את החלבונים ההידרופוביים הללו. בפרוטוקול זה, הפרדנו בתחילה את הממברנה וחלבוני דופן התא על סמך הנקודות האיזואלקטריות שלהם באמצעות מערכת IEF נוזלית. כדי לפתור את בעיית המסיסות, השתמשנו בריכוז גבוה של חומר כאוטרופי (אוריאה) וחומרי ניקוי (דיגיטונין), שהקל על המסה של חלבונים אלה ואיפשר העמסת ריכוזי חלבון גבוהים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת במלואה על ידי מענק DST SERB של ד"ר ק. ר. אומה דווי. ד"ר ב. רמלינגאם מומן על ידי מלגת DBT-Ramalingaswamy.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מרק 7H9 הימדיה M198
40% ביו-לייט 3/10 אמפוליט ביו-ראד1631113
בדיקת חלבון BCA מרקחומצות אמינו מסועפות שרשרת1
ביו-לייט 5/7 אמפוליט ביו-ראד1631152
רכזים צנטריפוגליים 3 kDaמרקZ629456
דיגיטונין.מרקD141
דנאזמרק11284932001
DTTמרקD9779
EDTAמרקE9884
א.ג.ט.א.מרקE3889
גליצרולמרקG5516
לופפטיןמרקה18
פפסטאטין אמרקעמ' 5318
PMSFמרק78830
צרפתמרק10109134001
רוטופור ביו-ראד170-2986  מכשיר מיקוד איזואלקטרי (IEF).
סוניקטורתא ויברה, סוניקסVC 750
טי.אל.קיימרקT7254
TPCKמרק4376
אוריאהמרקU5378
מכשיר ג'ל שלם ביו-ראד1651250

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Seshadri, C., Turner, M. T., Lewinsohn, D. M., Moody, D. B., Van Rhijn, I. Lipoproteins are major targets of the polyclonal human T cell response to Mycobacterium tuberculosis. J Immunol. 190 (1), 278-284 (2013).
  2. Kunnath-Velayudhan, S., et al. Dynamic antibody responses to the Mycobacterium tuberculosis proteome. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14703-14708 (2010).
  3. Drage, M. G., et al. TLR2 and its co-receptors determine responses of macrophages and dendritic cells to lipoproteins of Mycobacterium tuberculosis. Cell Immunol. 258 (1), 29-37 (2009).
  4. Wallin, E., von Heijne, G. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Sci. 7, 1029-1038 (1998).
  5. Almeida, J. G., Preto, A. J., Koukos, P. I., Bonvin, A. M. J. J., Moreira, I. S. Membrane proteins structures: A review on computational modeling tools. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1859 (10), 2021-2039 (2017).
  6. Finkelstein, J. Structures of membrane proteins. Nature. 511 ((Suppl 7509)), 21(2014).
  7. Smith, S. M. Strategies for the purification of membrane proteins. Methods Mol Biol. 1485, 389-400 (2017).
  8. Von Jagow, G., Link, T., Schager, H. Purification Strategies for Membrane Proteins. A Practical Guide to Membrane Protein Purification. , Academic Press. San Diego, CA. (1994).
  9. Raja, A., Uma Devi, K. R., Ramalingam, B., Brennan, P. J. Immunoglobulin G, A, and M responses in serum and circulating immune complexes elicited by the 16-kilodalton antigen of Mycobacterium tuberculosis. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 308-312 (2002).
  10. Covert, B. A., Spencer, J. S., Orme, I. M., Belisle, J. T. The application of proteomics in defining the T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 1 (4), 574-586 (2001).
  11. Deenadayalan, A., et al. Immunoproteomic identification of human T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis that differentiate healthy contacts from tuberculosis patients. Mol Cell Proteomics. 9 (3), 538-549 (2010).
  12. Sinha, S., et al. Immunogenic membrane-associated proteins of Mycobacterium tuberculosis revealed by proteomics. Microbiology. 151 (7), 2411-2419 (2005).
  13. Deenadayalan, A., et al. An Integrated approach for proteomic and immunological analysis of cell wall and cell membrane proteins of Mycobacterium tuberculosis. Med Res Arch. 11 (11), (2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

SDS PAGE

מאמרים קשורים