Method Article

כימות התנהגות הטיפוח של Drosophila melanogaster להערכת פנוטיפים של טיפוח יתר

DOI:

10.3791/67708

⸱

March 21st, 2025

 , 
1Simmons University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה המוצגת כאן כוללת הערות ידניות של צילומים שנרכשו של Drosophila melanogaster להתנהגויות טיפוח ספציפיות. זה מאפשר לכמת הן את מספר התקפי הטיפוח והן את הזמן הכולל המושקע בטיפוח כדי להעריך פנוטיפים לא טיפוסיים של טיפוח עצמי.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שינויים הניתנים לצפייה בטיפוח סטריאוטיפי מיושמים באופן תרגומי באורגניזמים מודלים. שינויים אלה מייצגים פתולוגיות המעוררות סטיות דומות בהתנהגות האנושית; לדוגמה, טיפוח מוגזם פועל כפרוקסי להתנהגויות אובססיביות וכפייתיות הקיימות במצבים כמו תסמונת טורט או הפרעה טורדנית-כפייתית. מבחן הטיפוח שהוצגה מאפשר הערכה של פנוטיפים חריגים לטיפוח עצמי ב-Drosophila melanogaster. זבובים מוקלטים לתקופה של 10 דקות, וההקלטות הללו נצפות ומוסרות באופן עיוור עבור התנהגויות טיפוח שהוגדרו בעבר. ניתן להשיג מדדים כמותיים הן של תדירות התקפי הטיפוח והן של הזמן המושקע בטיפוח עצמי על ידי הערות ידניות של הצילומים. הבדיקה זולה יחסית, דורשת מעט חומרים שאינם זמינים כבר בסביבות מעבדה, וניתנת להתאמה בקלות כדי להתאים לצרכים הספציפיים של כל מחקר נתון שמטרתו לצפות בטיפוח. בנוסף, רמת המיומנות הנמוכה הדרושה לביצוע הבדיקה, בהשוואה לשיטות אוטומטיות כבדות במדעי המחשב, הופכת את הפרוטוקול למתאים היטב למעבדות קטנות ולסטודנטים. אנו דנים בפירוט בשלבים הנדרשים לביצוע בדיקה זו ובמגבלותיה הנוכחיות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster הוא אורגניזם מודל מבוסס היטב במחקרים התנהגותיים ונוירו-ביולוגיים, המספק תובנה לגבי מנגנונים המניעים התנהגויות אנושיות אנלוגיות. טיפוח עצמי באורגניזם זה הוא התנהגות מווסתת ומוגדרת היטב, העוקבת אחר דפוסים סטריאוטיפיים המובחנים בקלות זה מזה1. בדרך כלל ניתן לסווג את התנהגויות הטיפוח הנפרדות שמפגין הזבוב לפי אזור אנטומי2, והכי קל להגדיר אותו כאחורי או קדמי. טיפוח דרוזופילה יתמקד בתחילה באזור הקדמי ולאחר מכן יעבור לקצה האחורי3. בתנאים טיפוסיים, זבובים מפגינים התנהגויות טיפוח כדי לשמור על ניקיון (למשל, על ידי הסרת אבק) ומתרחשות בתגובה לחשיפה לגירויים חיצוניים שעלולים להזיק כמו חיידקים פתוגניים4.

חריגות בהתנהגות טיפוח, במיוחד טיפוח אובססיבי ספונטני, שימשו במערכות מודלים שונות כאינדיקטור להתנהגות אובססיבית ו/או כפייתית. ממצאים תרגומיים המתבוננים בהתנהגויות טיפוח אובססיביות באורגניזמים כמו מכרסמים, ציפורים וכלבים נתנו תובנה לגבי מצבים המעוררים התנהגות כפייתית דומה בבני אדם5. אלה כוללים מצבים כמו טריכוטילומניה, הפרעה טורדנית כפייתית ותסמונת טורט6. התנהגות טיפוח מוגזמת שימשה גם כאמת מידה בהערכת פנוטיפים התנהגותיים במודלים של מצבים נוירו-התפתחותיים דומים ב-Drosophila melanogaster. התנהגויות טיפוח אובססיביות נצפו במודלים של זבובים של תסמונת X שביר (FSX) והפרעת הספקטרום האוטיסטי (ASD) הקשורה אליה. טיפוח ספונטני עודף מתרחש תחת מוטציות של dfmr1, האורתולוג לגן הקשור ל-ASD ו-FSX FMR17. בנוסף יש שינוי בולט בהתפלגות הטיפוח בין הקצוות האחוריים והקדמיים במוטציות אלה8. שינויים אלה מתפרשים כמשקפים התנהגויות אובססיביות וכפייתיות ממוקדות גוף המוצגות על ידי חלק מהמטופלים עם מצבים אלה. בשימוש במבחן הטיפוח המתואר כאן, צפינו בהתנהגויות טיפוח בזבובים לאחר הפלה בתיווך RNAi של הגן Drosophila Atg8a המיוצר על ידי דרייברים GAL4 זמינים מסחרית וקווי UAS-RNAi9.

שיטה זו כוללת הערות ידניות של צילומים שצולמו של זבובים עבור התנהגויות טיפוח ספציפיות. מחקרים קודמים שמטרתם להעריך התנהגות טיפוח, כגון אלה המשתמשים בשיטות עקיפות כמו צבעים, למרות שהם יעילים בכימות יעילות הטיפוח, אינם מאפשרים מדידה של משך הטיפוחאו תדירותו. עם זאת, בדיקה זו מאפשרת לכמת את תדירות ומשך הטיפוח של דרוזופילה , הן באופן כללי והן לפי אזור אנטומי. השיטה המפורטת כאן מציגה כמה יתרונות על פני השיטות האוטומטיות הנוכחיות, מכיוון שהיא ניתנת לשינוי בקלות וניתנת לביצוע על ידי אנשים חסרי רקע חישובי. עם הציוד הנדרש, זמין בקלות ברוב המעבדות, אנו מציגים דרך חסכונית להעריך את נוכחותו של פנוטיפ טיפוח עצמי מוגזם (ראה טבלת חומרים). זה הופך את השיטה לנגישה בעיקר למוסדות לתואר ראשון וניתנת להתאמה בקלות לסביבות הכשרה או מעבדות הוראה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: סקירה כללית של הפרוטוקול מוצגת באיור 1.

1. הכנה לצילומים

  1. מניחים ארבע מנות שלוש בארות זו לצד זו על משטח לבן, מכסים כל אחת בשקופית זכוכית.
  2. מקם מצלמה (כאן, מערכת Raspberry Pi, אבל כל מצלמה המסוגלת לווידאו בחדות גבוהה מספיקה) מעל הכלים.
    1. בדוק כדי לוודא שכל הכלים נמצאים במסגרת ובמיקוד.
    2. בדוק כדי לוודא שאין בוהק בשקופיות שיגביל את הנראות של זבובים בצלחת. בטל את הסנוור על ידי התאמת מיקום הצלחת או עמעום האורות בחלל ההקלטה.
    3. השתמש ברזולוציה גבוהה (מינימום 1920 x 1080 פיקסלים) כדי לדמיין במדויק גפיים זבובים.
  3. סמן את מיקום הכלים והמצלמה על הספסל בו מתבצעת ההקלטה.
    הערה: זה יגביל את הזמן המושקע בשלב 2 בשימוש עתידי במכשיר. ביצוע הבדיקות באותו זמן ובאותו מרחב יגביל את השונות בהתנהגות בהתבסס על גורמים מעבר למניפולציות המתוכננות.
  4. הרדמו קלות את הזבובים בני 4-9 ימים בקור על גוש קרח מכוסה בפרפילם ומגבת נייר (להרדמת CO2 תהיה השפעה משמעותית על ההתנהגות).
    1. הקישו על הזבובים על הבלוק, ולאחר ההרדמה, העבירו את הזבובים לתאי תצפית במהירות האפשרית באמצעות מכחול.
      הערה: העברה זו צריכה להתרחש במהירות האפשרית, שכן חשיפה מוגזמת להרדמה מכל סוג שהיא עלולה להשפיע לרעה על זבובים.
  5. הניחו זבוב בודד בכל באר.
  6. אפשר לקבצים להתאקלם לסביבה החדשה שלהם למשך 30 דקות לאחר ההרדמה. אין לגעת או להפריע לבארות המכילות זבובים לאחר נקודה זו, מכיוון שגורמי לחץ נוספים ישפיעו על ההתנהגות.

2. הקלטת הזבובים

  1. לאחר 30 דקות ההתאקלמות, הקליטו את הזבובים באמצעות מצלמה.
  2. השתמש במצלמת Raspberry Pi הפועלת דרך PiSpy11 לאיסוף נתונים התנהגותיים.
    הערה: התוכנה חינמית וזמינה ב-GitHub (https://github.com/gpask/PiSpy), וניתן להגדיר בקלות מערכת Pi בפחות מ-$300. מצלמות אחרות, אם כבר זמינות, מספיקות גם הן להקלטת צילומים
  3. התחל הקלטה עם Pi עם זרימת הפקודה הבאה.
    1. פתח את הטרמינל והקלד cd PiSpy. לאחר מכן, הקלד python3 PiSpy.py, הזן את אורך ההקלטה הרצוי והזן את קצב הפריימים הרצוי. בחר את הרזולוציה הרצויה ולחץ על לכידה מהירה.
    2. השתמש בפונקציית Preview Camera כדי להבטיח שהזבובים ממוקדים וגלויים מספיק.
  4. הקלט את הזבובים למשך 10 דקות בקצב פריימים מומלץ של 24 פריימים לשנייה ושמור את הקובץ (PiSpy נשמר אוטומטית בתיקיית הסרטונים).

3. ניתוח וידאו (איור 2)

  1. כדי לנתח את הסרטון, ייבא את הקובץ לתוכנת Elan 6.812.
    הערה: תוכנה זו, למרות שפותחה במקור עבור חלב פסיכו-לשוני להערות מפורטות של סרטונים וניתוח מעמיק של התנהגויות הטיפוח
  2. הקצה כל שורה כפי שמוצג להלן כדי להוסיף ביאורים לצילומים של אנשים באופן ידני.
    1. עשה זאת באמצעות זרימת הפקודה הבאה: רמה > הוסף רמה חדשה > הקלד מיקום במנה בשם רמה > הוסף.
  3. בהתאם לצרכי המחקר, שימו לב וכמתו התנהגויות ספציפיות שונות (טיפוח קדמי ואחורי, הליכה, שינה ועמידה).
    1. הוסף ביאורים לפי השלבים הבאים.
      1. לחץ פעמיים על הרמה שיש להוסיף לה ביאורים. לחץ לחיצה ימנית וגרור את הסמן לאורך השכבה שנבחרה לתקופה שבה מוצג סיבוב טיפוח יחיד. לחץ לחיצה ימנית, בחר ביאור חדש ולחץ פעמיים על פרק הזמן החדש שסומן. הקלד את הקיצור עבור אופן הפעולה המוצג בנקודת זמן זו.
    2. התבונן בסרטונים לאט, שפשף אותם עם עכבר והוסף הערות. התקרב לבאר זבוב בודד במהלך הביאור כדי למנוע זיהוי שגוי של התנהגויות. אלה יכולים לכלול הקשה על קצה הזכוכית על ידי הזבוב או הזזת הרגליים, מה שעשוי להיראות בתחילה כמו טיפוח.
  4. לאחר שהסרטון מוסבר במלואו, קבל פירוט של כל התנהגות. ודא שנעשה שימוש באותו קיצור או ביאור בכל הסרטונים כדי להשתמש בתכונה זו.
    הערה: Elan 6.8 יספק את מספר הפעמים שהתנהגות מתרחשת, משך הזמן הכולל של התנהגויות והזמן הממוצע שהוקדש לכל התנהגות.
    1. הגדירו התקפי טיפוח כ-2 שניות של טיפוח ללא הפרעה. זהה כל התנהגות שנצפתה באופן הבא. הגדר את הפרמטרים לאזורים אנטומיים לפני ביצוע הבדיקה.
      1. טיפוח קדמי: זהה את הטיפוח המבוצע באזור הקדמי של גוף הזבוב כטיפוח קדמי.
        הערה: התנהגות זו כמעט תמיד תכלול תנועת שפשוף על חלק קדמי, כמו הראש או החרטום, עם שתי הרגליים הקדמיות של הזבוב.
      2. טיפוח אחורי: זהה את הטיפוח המבוצע בקצה הקדמי-אחורי של גוף הזבוב כטיפוח אחורי.
        הערה: בנוסף, כנפיים נכללו באזור האחורי לשם הפשטות. התנהגות זו כמעט תמיד תכלול תנועת שפשוף עם מערכת הרגליים המרכזית והאחורית ביותר תוך כדי תנועה. אינדיקטור טוב לכך שמתרחש טיפוח אחורי יהיה שבמבט ראשון הזבוב עשוי להיראות כאילו חסרות לו הרגליים האחוריות ביותר שלו, כפי שמתואר באיור 2D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקה זו מייצרת נתונים כמותיים המודדים את הזמן והתדירות של התנהגויות טיפוח מצילומים מבוארים. תמונה מייצגת של המערך וכיצד מוגדרות התנהגויות מתוארת באיור 2. בהתחשב בסובייקטיביות המוצגת על ידי ניתוח וידאו, יש לעוור את כל ההערות של סרטונים לחוקר המבצע את הניתוח.

שיטה זו שימשה להערכת התפקיד שיש לגן הדרוזופילה Atg8a בהתפתחות התנהגות טיפוח. Atg8a הוא אורתולוגי לגן האנושי GABARAP, שהראה ירידה בביטוי בחלק מחולי תסמונת טורט (TS)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בסך הכל, בדיקה זו הניתנת לביצוע בקלות וחסכונית מאפשרת אפיון חזק של התנהגות הטיפוח של Drosophila melanogaster . טכניקה זו נותנת תובנה לגבי התדירות, הזמן המושקע וההתפלגות האנטומית של מספר רב של התנהגויות טיפוח שזוהו בעבר. אינדיקטור טוב לכך שהטיפוח יתרחש או נמצא בעיצומו הוא שינויים במיקום הרגליים, במיוחד הרמת כל אחת מ-6 הרגליים. תשומת לב ספציפית להתנהגויות לאחר תנועת רגליים יכולה לסייע בזיהוי התנהגות טיפוח. בדיקה זו מאפשרת הערות התנהגותיות החל מטיפוח כללי ועד להתנהגויות טיפוח סטריא...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תודה לג'ון יאנג על המשוב על העיצוב הניסיוני, לאריק לות' על תיקון כתב היד, ולמדלן הטפילד על הסיוע בעיצוב הדמויות. עבודה זו מומנה על ידי אוניברסיטת סימונס והמחלקה לביולוגיה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
כרטיס Micro SD בנפח 16 GBAdafruit1294לשימוש בהצגת תצוגת מערכת ההפעלה
Adafruit3578כל תצוגה הניתנת לחיבור באמצעות כבל HDMI או כבל גמיש מספיקה
Drosophila Atg8a-RNAi UASBloomington Stock Center34340Line המשמש בנתונים מייצגים
Drosophila Ok6 DriverN/A/Aקו המשמש בנתונים מייצגים
מגלשות זכוכיתפישר סיינטיפיק12-550-A3שומר על זבובים בהכלה
גופי קירורAdafruitמונע התחממות יתר של עדשת המחשב
Adafruit4563בשימוש עם מצלמת HD בלבד
PiCameraAdafruit4561גרסת ה-HD שימשה כאן אך ניתן להשתמש במצלמה סטנדרטית תחת אילוצי תקציב
Raspberry pi 4מחשב Adafruit4292PiSpy מופעל על
כבל RibbionAdafruit1648לשימוש בחיבור רכיבי מצלמה ותצוגה
SB מארזAdafruit4301מגן על
המחשב Spot PlateFisher ScientificS99406גרסאות Pyrex כבר היו זמינות לשימושנו אך צלחות תרבית תאים או צלחות ספוט מפלסטיק מספיקות גם
חצובהBest Buy6355959להשעיה ומיקום של המצלמה, כל מכשיר המסוגל לכך מספיק
ספק כוח USB CAdafruit1995מספק חשמל למחשב
קו N כן

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mueller, J. M., Zhang, N., Carlson, J. M., Simpson, J. H. Variation and variability in Drosophila grooming behavior. Front Behav Neurosci. 15, 769372(2022).
  2. Szebenyi, A. L. Cleaning behaviour in Drosophila melanogaster. Anim Behav. 17 (4), 641-651 (1969).
  3. Seeds, A. M., et al. A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila. Elife. 3, e02951(2014).
  4. Ringo, J. M. How do flies keep clean? Head grooming in Drosophila. J Ethol. 38, 167-172 (2020).
  5. Feusner, J. D., Hembacher, E., Phillips, K. A. The mouse who couldn't stop washing: pathologic grooming in animals and humans. CNS Spectr. 14 (9), 503-513 (2009).
  6. Berridge, K. C., et al. Sequential super-stereotypy of an instinctive fixed action pattern in hyper-dopaminergic mutant mice: a model of obsessive compulsive disorder and Tourette's. BMC Biol. 3, 4(2005).
  7. Russo, A., Diantonio, A. Wnd/DLK is a critical target of FMRP responsible for neurodevelopmental and behavior defects in the Drosophila model of Fragile X syndrome. Cell Rep. 28, 2581-2593.e5 (2019).
  8. Andrew, D. R., et al. Spontaneous motor-behavior abnormalities in two Drosophila models of neurodevelopmental disorders. J Neurogenet. 35 (1), 1-22 (2021).
  9. Tian, Y., et al. GABA- and acetylcholine-related gene expression in blood correlate with tic severity and microarray evidence for alternative splicing in Tourette syndrome: a pilot study. Brain Res. 1381, 228-236 (2011).
  10. Barradale, F., Sinha, K., Lebestky, T. Quantification of Drosophila grooming behavior. J Vis Exp. 125, e55231(2017).
  11. Morris, B. I., et al. PiSpy: an affordable, accessible, and flexible imaging platform for the automated observation of organismal biology and behavior. PLoS One. 17 (10), e0276652(2022).
  12. ELAN (Version 6.8) [Computer software]. Nijmegen: Max Planck Institute for Psycholinguistics, The Language Archive. , Nijmegen: Max Planck Institute for Psycholinguistics, The Language Archive. At https://archive.mpi.nl/tla/elan" (2024).
  13. Müller, N. Tourette's syndrome: clinical features, pathophysiology, and therapeutic approaches. Dialogues Clin Neurosci. 9 (2), 161-171 (2007).
  14. Southall, T. D., Elliott, D. A., Brand, A. H. The GAL4 system: a versatile toolkit for gene expression in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
  15. Hatfield, T., Johnson, S. Knockdown of the GABARAP ortholog Atg8a elicits deficits in learning and promotes obsessive behaviors in Drosophila melanogaster. MicroPubl Biol. 2024, (2024).
  16. Bartholomew, N., et al. Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia. Sci Rep. 5, 15298(2015).
  17. Sindhurakar, A., Butensky, S. D., Carmel, J. B. Automated forelimb tasks for rodents: current advantages and limitations, and future promise. Neurorehabil Neural Repair. 33 (7), 503-512 (2019).
  18. Qiao, B., Li, C., Allen, V. W., Shirasu-Hiza, M., Syed, S. Automated analysis of long-term grooming behavior in Drosophila using a k-nearest neighbors classifier. Elife. 7, e34497(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Drosophila GroomingGrooming BehaviorExcessive GroomingManual AnnotationBehavioral QuantificationAtg8a KnockdownNeurodevelopmental DisordersTourette Syndrome ModelELAN SoftwareRNAi Mutants

Related Articles