מאמר שיטה

קביעת ארבעה רכיבים במערכת אספקת RNA של ננו-חלקיקי שומנים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב גלאי פיזור אור אידוי

DOI:

10.3791/67711

⸱

30 במאי 2025

 ,  ,  ,  , 
1Shimadzu (China) Co., Ltd., 2Medical College of Fudan University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו קובעים שיטת ניתוח כמותית עבור ארבעה רכיבים במערכת אספקת RNA של ננו-חלקיקי שומנים (LNP) באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בשילוב עם גלאי פיזור אור אידוי (ELSD). לשיטה הפרדה טובה, רגישות גבוהה ויעילות גבוהה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מציג שיטה לניתוח רכיבי ננו-חלקיקי שומן (LNP). LNP, המשמש כווקטור מרכזי לתרופות מבוססות RNA, מורכב בעיקר מכולסטרול, PEG עם שינויים, שומנים מייננים ושומנים עוזרים. רכיבים אלה מציגים קוטביות חלשה, מה שמוביל לשימור חזק וקושי בהפרדה באמצעות כרומטוגרפיה הפוכה, כמו גם היעדר מאפייני ספיגה אולטרה סגולים מובהקים. על מנת להתמודד עם אתגר זה, מערכת כרומטוגרפיה נוזלית חוברה לגלאי פיזור אור אידוי (ELSD). על ידי התאמה שיטתית של סוג העמודה הכרומטוגרפית ואופטימיזציה של תוכנית פליטת השיפוע של השלב הנייד, הושגה הפרדה מהירה ומלאה של ארבעת המרכיבים הקריטיים. שימוש בטכנולוגיית ELSD העדכנית ביותר שיפר את רגישות הזיהוי באופן משמעותי והרחיב את הטווח הליניארי של השיטה. תוצאות הניסוי הראו כי בטווח ריכוז של 5 מיקרוגרם/מ"ל עד 250 מיקרוגרם/מ"ל, ארבעת המרכיבים של LNP הראו ליניאריות מצוינת עם מקדמי מתאם הגדולים כולם מ-0.999, והדיוק נע בין 94.2% ל-108.0%. בניסויים מדויקים, סטיות התקן היחסיות הן של זמן השמירה והן של שטח השיא עבור תמיסה סטנדרטית של 10 מיקרוגרם/מ"ל היו מתחת ל-0.1% ו-2%, בהתאמה. כאשר משתמשים בשיטה זו לניתוח דגימות LNP שונות, כל הרכיבים מופרדים בהצלחה, והתוכן שלהם מכומת במדויק, מה שמדגיש את יכולת ההסתגלות החזקה של גישה אנליטית זו.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ננו-חלקיקי שומן (LNP) היא אחת ממערכות העברת הגנים הלא-ויראליים המתקדמות ביותר, המשמשת בעיקר להעברת תרופות חומצות גרעין, כגון אוליגונוקלאוטידים אנטיסנס, נוקלאוטידים מפריעים קטנים, mRNA וכו' 1,2,3. LNP מורכב בדרך כלל מארבעה מרכיבים: שומנים מייננים, פוליאתילן גליקול (PEG), פוספוליפידים וכולסטרול. מרכיב המפתח הוא שומנים מייננים, שהם הגורם המכריע ביעילות אספקת תרופות חומצות גרעין. שלושת המרכיבים האחרים יכולים להגביר את היציבות של LNP ולהפחית את הזיהוי של מערכת החיסון 4,5,6.

היחסים המשתנים של ארבעת הרכיבים ב-LNP יכולים להשפיע באופן משמעותי על תהליך ההרכבה העצמית של הננו-חלקיקים, ולהשפיע על תכונות כגון יעילות האנקפסולציה של החומר התרופתי הפעיל (API), יעילות האספקה שלו וקצב השחרור in vivo 7,8,9. לכן, חיוני לבסס שיטת ניתוח כמותית לרכיבי LNP, ובכך להקל על הסינתזה של מערכת אספקת LNP אופטימלית10,11.

כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) היא טכניקה אנליטית עכשווית הנמצאת בשימוש נרחב בניתוח פרמצבטי וזוכה להערכה בזכות היעילות, הרגישות ויכולות האוטומציה הגבוהות שלה. HPLC מקיף גלאים שונים, כולל גלאי אולטרה סגול קונבנציונליים (UV), כמו גם גלאים לשימוש כללי כגון גלאי מקדם שבירה (RID), גלאי פיזור אור אידוי (ELSD), גלאי אירוסול טעון (CAD), וגלאי תדרי רדיו סלקטיביים (RF), ביןהיתר.

במקרה של ניתוח ארבעת המרכיבים של LNP, שחסרים קבוצות סופגות UV מובהקות ולכן אינם מניבים תגובה בגלאי UV, נשקל השימוש בגלאים לשימוש כללי. למרות ש-RID היא אפשרות כזו, היא אינה מתאימה לניתוח שיפוע ומציעה רגישות נמוכה יחסית בהשוואה לשני הגלאים האחרים לשימוש כללי; לפיכך, הוא לא נבחר12. יתר על כן, בעוד שגלאי CAD מתהדרים ברגישות גבוהה, העלות הגבוהה שלהם הופכת אותם לפחות מושכים12.

כתוצאה מכך, נבחר גלאי ELSD. גלאי זה כולל אפשרות מצב רווח ייחודית - מצב 'רחב' - המאפשר ניתוח בו זמנית של רכיבי ריכוז גבוה ועקבות, משפר את הרגישות ומרחיב את הטווח הליניארי.

מאמר זה משתמש במערכת HPLC בשילוב עם ELSD, ומשיג הפרדה יעילה וניתוח כמותי של ארבעת מרכיבי ה-LNP באמצעות אופטימיזציה של עמודות כרומטוגרפיות, פליטת שיפוע של פאזות ניידות ותנאים אחרים13.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת מכשיר

  1. הגדרת מכשירים
    1. הגדר מערכת HPLC יחד עם ELSD.
  2. התקנת עמודים
    1. התקן את העמודה הכרומטוגרפית (C4-300; 150 מ"מ × 4.6 מ"מ ID, 5 מיקרומטר), בהתאם לכיוון החץ בעמודה, כאשר קצה אחד מחובר לשקע הדגימה האוטומטית והשני לכניסת ELSD.
  3. הכנת שלב נייד
    1. הכן את השלבים הניידים: פאזה, תמיסה מימית TEAA של 10 מ"מ (pH = 7.0), ושלב B, תמיסת מתנול TEAA של 10 מ"מ (pH = 7.0).
    2. להכנת שלב A, שקלו במדויק 1.01 גרם טריאתילאמין, ממיסים אותו ב 1000 מ"ל מים, מערבבים היטב ומתאימים את ה- pH ל -7.0 עם חומצה אצטית.
    3. להכנת שלב B, ממיסים 1.01 גרם טריאתילאמין ב-1000 מ"ל מתנול, מערבבים ומתאימים את ה-pH ל-7.0 עם חומצה אצטית.
  4. עריכת שיטה
    1. הפעל את מתגי ההפעלה עבור כל מודול של ה-LC-ELSD והפעל את תוכנת LabSolutions . לאחר מכן, פתח את חלון ניתוח בזמן אמת .
    2. לחץ על קובץ ובחר חדש כדי ליצור קובץ שיטה חדש. שנה את זמן העצירה של LC בשיטה ל-15 ולחץ על החל על כל זמן הרכישה.
    3. לאחר מכן, לחץ על משאבה כדי לשנות את פרמטרי המשאבה. בחר את מצב הניתוח כשיפוע לחץ גבוה בינארי (B.GE) והגדר את קצב הזרימה ל-1.0 מ"ל/דקה.
    4. לאחר מכן, הגדר את ריכוז המשאבה B הראשוני (%B) ל-80% ושנה את שיפוע הפאזה הניידת: ב-3 דקות, %B הוא 80%, ב-4 דקות, %B הוא 85% מ-5.5 דקות ל-12 דקות, %B הוא 100%, ב-12.1 דקות, %B חוזר ל-80%.
    5. לאחר מכן, לחץ על תנור עמודות והגדר את טמפרטורת התנור ל-55 מעלות צלזיוס. לבסוף, לחץ על ELSD כדי לשנות את טמפרטורת צינור הסחיפה ל-40 מעלות צלזיוס. שמור את השיטה.
      הערה: סיכום הפרמטרים מוצג בטבלה 1.
  5. הפעל ואזן את הכלי.
    1. לחץ על הורד ואתחול כדי להפעיל ולאזן את המכשיר.

2. הכנת פתרונות ודוגמאות סטנדרטיים

  1. הכנת פתרונות סטנדרטיים
    1. שוקלים במדויק 10.0 מ"ג מארבעת החומרים הסטנדרטיים של רכיבי LNP בנפרד, ממיסים ב-1 מ"ל מתנול ומערבולת עד להמסה מלאה לקבלת תמיסות מלאי בריכוז של 10 מ"ג/מ"ל לכל רכיב.
    2. בעזרת פיפטה, העבירו במדויק 100 מיקרוליטר מכל אחת מארבעת תמיסות המלאי לבקבוקון דגימה, ולאחר מכן הוסיפו 600 מיקרוליטר מתנול. מערבבים היטב להכנת תמיסת ביניים מעורבת 1 בריכוז של 1000 מיקרוגרם/מ"ל.
    3. העבירו במדויק 20 מיקרוליטר מכל אחת מארבעת תמיסות המלאי לבקבוקון דגימה, ולאחר מכן הוסיפו 920 מיקרוליטר מתנול. מערבבים היטב להכנת תמיסת ביניים מעורבת 2 בריכוז של 200 מיקרוגרם/מ"ל.
    4. לאחר מכן, הכינו סדרה של פתרונות סטנדרטיים בריכוזים של 5 מיקרוגרם/מ"ל, 10 מיקרוגרם/מ"ל, 20 מיקרוגרם/מ"ל, 50 מיקרוגרם/מ"ל, 100 מיקרוגרם/מ"ל, 200 מיקרוגרם/מ"ל ו-250 מיקרוגרם/מ"ל על ידי דילול טורי לפי טבלה 2.
  2. הכנת דוגמאות
    1. בעזרת פיפטה, העבירו במדויק 100 מיקרוליטר מהדגימה לבקבוקון דגימה, ואז הוסיפו 900 מיקרוליטר מתנול וערבבו היטב. בשלב זה, ודא שריכוז ה-LNP בדגימה מדולל פי 10 וה-LNP מנותק מתרופת חומצת הגרעין.

3. רכישת נתונים

  1. הנח את התמיסות הסטנדרטיות ותמיסות הדגימה לתוך הדגימה האוטומטית של הכרומטוגרף הנוזלי.
  2. לחץ על אצווה בזמן אמת בסרגל הכלים של המסייע בחלון ניתוח בזמן אמת . לאחר מכן, לחץ על חדש בתפריט קובץ כדי ליצור טבלת אצווה חדשה.
  3. בטבלת האצווה, הזן את ה-Vial#, שם המגש, קובץ הנתונים ונפח ההזרקה של הפתרונות הסטנדרטיים והדוגמיים, ובחר את קובץ השיטה שנשמר בשלב 1.4. לחץ על Save Batch File בתפריט File כדי לשמור את קובץ האצווה.
  4. המתן עד שלחץ הכרומטוגרף הנוזלי וקו הבסיס של הכרומטוגרמה יהיו יציבים. לאחר מכן, לחץ על התחל אצווה בזמן אמת בסרגל הכלים של העוזר כדי להתחיל ברכישת נתונים.

4. ניתוח נתונים

  1. קבע עקומות כיול
    1. פתח את חלון הדפדפן של תוכנת LabSolutions וגרור את נתוני הפתרון הסטנדרטיים לתצוגת התוצאות הכמותיות כדי ליצור עקומת כיול. לאחר מכן, שנה את פרמטרי עיבוד הנתונים. לחץ על ערוך בתצוגת השיטה.
    2. בחלון פרמטרי אינטגרציה , שנה את ערך השיפוע ל- 10000. לאחר מכן, בפרמטרי הזיהוי, שנה את שיטת הזיהוי ל-Band והגדר את רוחב הפס המוגדר כברירת מחדל ל-0.1 דקות.
    3. לאחר מכן, שנה את הפרמטרים הכמותיים. שנה את השיטה הכמותית לתקן חיצוני, והגדר את # של רמת הכיול ל-7. בחר את סוג עקומת הכיול כאקספוננציאלית. לאחר מכן, שנה את התרכובת.
    4. הזן את השמות וריכוזי התמיסה הסטנדרטיים של ארבעת רכיבי ה-LNP. לחץ פעמיים על קודקוד השיא כדי לעדכן את זמני השמירה. לבסוף, לחץ על תצוגה כדי להשלים את השינוי של פרמטרי עיבוד הנתונים.
    5. שנה את סוג המדגם בתצוגת התוצאות הכמותיות לסטנדרט (נקודת חישוב). על פי הריכוזים, קבעו את רמות התמיסה הסטנדרטית בין 1-7. לאחר קביעת עקומות הכיול, לחץ על קובץ בשורת התפריטים ושמור את קובץ השיטה.
  2. ניתוח כמותי של דגימות
    1. גרור את נתוני הדגימות לתצוגת התוצאות הכמותיות של חלון הדפדפן, שתציג את תוצאות הריכוז של ארבעת רכיבי ה-LNP בדגימות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח הפתרון הסטנדרטי של LNP בשיטה זו השיג דרגת הפרדה גדולה מ-1.5 עבור ארבעת הרכיבים, תוך מימוש הפרדה בסיסית. יתר על כן, לא נצפו שאריות בתמיסות סטנדרטיות בריכוז גבוה, כפי שמתואר באיור 1. עקומת כיול נקבעה בטווח ריכוז של 5 עד 250 מיקרוגרם/מ"ל, המציגה מקדמי מתאם העולים כולם על 0.999, מה שמעיד על טווח ליניארי רחב וליניאריות מצוינת. עקומת הכיול מודגמת באיור 2.

כדי לבחון את יכולת השחזור של השיטה, הוזרקה שוב ושוב תמיסה סטנדרטית בריכוז של 10 ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ארבעת המרכיבים של LNP מציגים קוטביות חלשה יחסית. כאשר מנותחים באמצעות עמודת C18, תרכובות המטרה מדגימות שימור חזק בתוך העמודה, מה שמוביל להרחבת שיא הפוספוליפידים עבור רכיבים שנשמרו חזק. יתר על כן, לאחר ניתוח פתרונות בריכוז גבוה, שאריות מצטברות בראש עמודת C18, מה שעלול לפגוע בדיוק הכמות. הכרומטוגרמה מוצגת באיור 5.

כדי לייעל את השיטה, נבחרה במקום זאת עמודת C4 עם הידרופוביות חלשה יותר. הבחירה נועדה להפחית את כוחות האינטראקציה בין ת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תודה לחברות ביו-פרמצבטיות על אספקת דגימות ה-LNP לניסוי, ותודה ל-Shimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co., Ltd על אספקת עמודת הכרומטוגרפיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומצה אצטיתANPEL Laboratory Technologies (שנחאי) בע"מCAEQ-4-000319-0050
איזוןShimadzu (שנחאי) מעבדה גלובלית מתכלים ושות', בע"מAP135W
טורShimadzu (שנחאי) מעבדה גלובלית מתכלים ושות', בע"מShimNex WP C4 (380-01235-74)
ELSDShimadzu (סין) ושות', בע"מELSD-LT III (228-65900-46)
LabSolutions תוכנהShimadzu (סין) ושות', בע"מ
LCShimadzu (סין) ושות', בע"מLC40D XR
מתנולANPEL מעבדה טכנולוגיות (שנחאי) בע"מCAEQ-4-003302-4000
פיפטה-100 ומיקרו; LShimadzu (שנחאי) מעבדה גלובלית חומרים מתכלים ושות', בע"מ00-NAR-100
פיפטה-1000 ומיקרו; LShimadzu (שנחאי) מעבדה גלובלית חומרים מתכלים ושות', בע"מ00-NAR-1000
TEAANPEL Laboratory Technologies (שנחאי) בע"מCAEQ-4-012190-0250
מערכת מים טהורה במיוחדMilliporeZIQ7000T0C
מערבל מערבולתANPEL Laboratory Technologies (שנחאי) בע"מVM-B

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zong, Y., Lin, Y., Wei, T., Cheng, Q. Lipid nanoparticle (LNP) enables mRNA delivery for cancer therapy. Adv Mater. 35 (51), e2303261(2023).
  2. Vlatko, I., et al. Non-immunotherapy application of LNP-mRNA: Maximizing efficacy and safety. Biomedicines. 9 (5), 530(2021).
  3. Eygeris, Y., et al. Chemistry of lipid nanoparticles for RNA delivery. Acc Chem Res. 55 (1), 2-12 (2021).
  4. Sun, D., Lu, Z. R. Structure and function of cationic and ionizable lipids for nucleic acid delivery. Pharm Res. 40 (1), 27-46 (2023).
  5. Rebecca, L., et al. Lipid nanoparticle formulations for enhanced co-delivery of siRNA and mRNA. Nano Lett. 18 (6), 3814-3822 (2018).
  6. Maugeri, M., Nawaz, M., Papadimitriou, A. Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells. Nat Commun. 10, 4333(2019).
  7. Renee, C., et al. The effects of PEGylation on LNP based mRNA delivery to the eye. PLoS One. 15 (10), e0241006(2020).
  8. Benedicto, E., et al. Optimization of phospholipid chemistry for improved lipid nanoparticle (LNP) delivery of messenger RNA (mRNA). Biomater Sci. 10 (2), 549-559 (2022).
  9. Kamanzi, A., et al. Quantitative visualization of lipid nanoparticle fusion as a function of formulation and process parameters. ACS Nano. 18 (28), 18191-18201 (2024).
  10. Melissa, P., et al. Optimization of lipid nanoparticles for the delivery of nebulized therapeutic mRNA to the lungs. Nat Biomed Eng. 5 (9), 1059-1068 (2021).
  11. Packer, M., et al. A novel mechanism for the loss of mRNA activity in lipid nanoparticle delivery systems. Nat Commun. 12 (1), 6777(2021).
  12. Snyder, L. R., Kirkland, J. J., Dolan, J. W. Introduction to Modern Liquid Chromatography. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2010).
  13. Zhang, L. Z., et al. Effect of mRNA-LNP components of two globally marketed COVID-19 vaccines on efficacy and stability. NPJ Vaccines. 8 (1), 156(2023).
  14. Zhang, Y., Wang, X. Performance comparison of different ELSD detectors in pharmaceutical analysis. Anal Methods. 7 (12), 4800-4807 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

LNP

מאמרים קשורים