הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

עריכת גנום ביתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti באמצעות CRISPR-Cas9

2.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67732

⸱

21 במרץ 2025

 ,  ,  ,  , 
1School of Biological Sciences, Section of Cell and Developmental Biology, University of California, San Diego, 2School of Biological Sciences, Department of Ecology, Behavior, and Evolution, University of California, San Diego

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לעריכת גנום באמצעות מיקרו-הזרקה עוברית ביתוש A. aegypti באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9.

תקציר

הופעתה של טכנולוגיית החזרות הפלינדרומיות הקצרות (CRISPR)-Cas9 חוללה מהפכה בתחום ההנדסה הגנטית ופתחה את הדלתות לעריכת גנום מדויקת במספר מינים, כולל אורגניזמים שאינם מודלים. ביתוש Aedes aegypti, מוטציות של אובדן תפקוד והחדרת DNA הושגו בטכנולוגיה זו. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לעריכת גנום באמצעות מיקרו-הזרקה עוברית ביתוש A. aegypti באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9, תוך התמקדות הן ביצירת נוקאאוט של גנים והן בקווי נוקין. בפרוטוקול זה, מחטי קוורץ ממולאות בתערובת של RNA מנחה, Cas9 רקומביננטי ופלסמיד המכיל קלטת DNA המקודדת גן לסמן פלואורסצנטי, אם יש צורך בנוקין גן. עוברים בשלב הפרה-בלסטודרם מסודרים על רצועה של סרט דביק דו צדדי המונח על כיסוי, אשר מותקן לאחר מכן על מגלשת זכוכית. בעזרת מיקרו-מזרק, המחטים מוחדרות בעדינות לקצה האחורי של העוברים ונפח קטן של תערובת הקריספר מוחלק. כאשר העוברים בוקעים, הזחלים נבדקים תחת הטווח הפלואורסצנטי, והגלמים ממוינים לפי מין ומופרדים בכלובים שונים. ברגע שהבוגרים מגיחים הם מוצלבים הדדית עם פרטים מסוג בר, ניזונים מדם ומונחים להטלת ביצים. לאחר בקיעת הביצים הללו, הזחלים הפלואורסצנטיים שנאספו מייצגים פרטים עם החדרה יציבה של קלטת ה-DNA לגנום שלהם. לאחר מכן מגדלים זחלים אלה לשלב הבוגר, מוכלאים לפרטים מסוג בר, ולאחר מכן מוערכים עוד יותר באמצעות טכניקות מולקולריות כדי לאשר שהרצף המדויק של קלטת ה-DNA קיים באתר הרצוי של גנום היתוש. ניתן להשיג קווים הומוזיגוטיים גם על ידי מעקב אחר הצינור המסופק של סכימת הצלבה וסינון מולקולרי של המוטציות.

מבוא

עריכת גנום מדויקת הפכה ללא ספק לקלה יותר, אך אפשרית, עם הקמת טכנולוגיות CRISPR-Cas של מספריים מולקולריים1. טכנולוגיות אלו מנצלות מנגנון שמערכת החיסון הפרוקריוטית משתמשת בו כדי להילחם בזיהומי פאג'ים2. בין המערכות הללו, חזרות פלינדרומיות קצרות מקובצות, מפוזרות באופן קבוע (CRISPR) יחד עם נוקלאז Cas9 מסתמכות בדרך כלל על 20 RNA זוגות בסיסים, ה-RNA המנחה (gRNAs), עם רצפים הומולוגיים ל-DNA הממוקד, ואחריהם רצף3 של מוטיב פרוטו-ספייסר NGG (PAM). ה-gRNAs שנטענו על ה-Cas9 מנחים את הנוקלאזות הללו בדיוק לאתרי מטרה ספציפיים בגנום, וגורמים לשבירות DNA דו-גדיליות3.

שבירת גדיל כפול DNA גורמת למנגנוני התיקון לתקן את הסליל הכפול4. בעוד שכל תיקון DNA צפוי להיות מדויק, קיימים מנגנוני תיקון DNA פחות מדויקים שיכולים להשאיר אחריהם צלקות רצף, ובתורם, מוטציות של אובדן תפקוד4. בין מנגנוני תיקון ה-DNA המועדים לשגיאות, הצטרפות הקצה הלא הומולוגית (NHEJ) עלולה לגרום למוטציות בשינוי מסגרת, כולל מחיקות קטנות, הוספות ושינויי נוקלאוטידים (SNPs), שעלולות לגרום למוטציה של אובדן תפקוד. מנגנון התיקון המכוון ההומולוגיה (HDR), לעומת זאת, מסתמך על הכרומוזום ההומולוגי כתבנית כדי להעתיק את הרצף המדויק של האלל הלא פגום ולבצע תיקון מושלם של רצף ה-DNA הממוקד4.

בהתבסס על ידע זה, טכנולוגיית CRISPR-Cas9 פותחה לעריכה מדויקת של גנומים, ככל הנראה בכל רצף המכיל אתר PAM3. ביתושים, נעשה שימוש בטכנולוגיית CRISPR-Cas9 כדי לדפוק מגוון גנים, באמצעות מיקרו-הזרקה עוברית של תערובת של Cas9 ו-gRNAs, תוך ניצול מנגנון התיקון של NHEJ 5,6. מוטגנזה דומה של קו הנבט מתקבלת עם הזרקת תערובת gRNA + Cas9 לתוך המולימפה של יתושים נקבות בוגרות7. טכנולוגיה זו נטבעה בשם ReMOT control ומסתמכת על גרסה שונה של Cas9 המתויגת עם פפטיד שנקלט על ידי השחלות באמצעות אנדוציטוזיס בתהליך התפתחות הביציות (ויטלוגנזה)7. דפיקת קלטות גנים ספציפיות לגנום אפשרית רק באמצעות מיקרו-הזרקה עוברית של תערובת של gRNA ו-Cas9 (או פלסמיד המבטא את המולקולות הללו) יחד עם פלסמיד המקודד קלטת DNA רצויה8. תוך ניצול מנגנון ה-HDR, הפלסמיד המכיל את קלטת ה-DNA המעניינת המוקפת ברצפים הומולוגיים (500-1,000bp)9,10 במעלה הזרם ובמורד הזרם של אתר היעד משמש כתבנית לשכתוב שבירת הגדיל הכפול, ומעתיק גם את קלטת ה-DNA לרצף המטרה9.

טכנולוגיית CRISPR-Cas9 שימשה כדי להפיל גנים מרובים המעורבים בעיקר במערכות החישה של היתוש Aedes aegypti11, אך גם גנים הקשורים לפוריות הגבר וכדאיות הנקבה (PgSIT) לבקרת אוכלוסייה12. חיסול גני מטרה הושג גם על ידי דפיקת גנים המקודדים סמנים פלואורסצנטיים לרצפי הקידוד של גנים ספציפיים13,14. לאסטרטגיה זו יש יתרון בכך שהיא לא רק גורמת למוטציות בשינוי מסגרת אלא גם מאפשרת שימוש באור פלואורסצנטי כדי למיין את הפרטים של קו הנוקאאוט החדש13,14. הגנום של A. aegypti נערך גם עם רצפים של מערכות ביטוי בינאריות, כגון מערכת Q (QF-QUAS)11. דפיקה בגן המקודד את הטרנס-אקטיבטור QF במורד הזרם למקדם של גן ספציפי מבטיחה ביטוי מרחבי-זמני מוגדר של הטרנס-אקטיבטור15,16. ברגע שחוצים קו יתוש המבטא QF לקו יתוש אחר המכיל את אתרי הקישור (QUAS) ל-QF, האחרון נקשר אליו ומפעיל את ביטוי הגנים במורד הזרם לרצף QUAS15,16. מערכת זו, בסך הכל, מאפשרת ביטוי ספציפי לרקמות ולזמן של גנים אפקטורים כאלה, שיכולים להיות סמנים פלואורסצנטיים המשמשים ללוקליזציה של תאים או לזיהוי פעילות עצבית, ואפילו נוקלאזות Cas9 לשיבוש גנים ברקמות ספציפיות (כלומר, נוקאאוט סומטי)11.

בהתחשב בכל המידע הזמין לטרנספורמציה גנטית של A. aegypti , אנו מספקים כאן פרוטוקול מפורט עם הנחיות שלב אחר שלב לביצוע עריכת גנום עם מערכת CRISPR-Cas9 באמצעות מיקרו-הזרקה עוברית. נדונות אסטרטגיות ליצירת נוק-אאוט, באמצעות מוטציות ומחיקות של שינוי מסגרת בתיווך NHEJ, וקווי נוקין, על ידי החדרת קלטות גנים בתיווך HDR.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרטים הקשורים לציוד ולריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה מפורטים בטבלת החומרים. כל בעלי החיים טופלו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, כפי שהומלץ על ידי המכונים הלאומיים לבריאות. הנהלים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של UCSD (IACUC, פרוטוקול שימוש בבעלי חיים #S17187) ואישור שימוש ביולוגי של UCSD (BUA #R2401).

1. gRNAs ועיצוב פלסמיד תורם

  1. עבור יצירת מוטציות נוק-אאוט, תכנן שני gRNAs במרווח של ~20-100 bp (איור 1A).
    1. תכנן 20 bp gRNAs עבור CRISPR-Cas9, לא כולל רצף PAM (NGG) באמצעות כלי מקוון (איור 1A), כגון CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/)17או Benchling (benchling.com) או CRISPOR (http://crispor.gi.ucsc.edu/)18. בחר את ה-gRNAs הספציפיים ביותר ונטולי המטרה לניסויים, כפי שהוצע על ידי הכלי המקוון.
    2. ודא שאתר חיתוך אנזים הגבלה יעיל כלול ברצף בין אתרי חיתוך ה-gRNA (איור 1A). כלול אתר אנזים הגבלה בין אתרי חיתוך gRNA כדי לאפשר אישור ויזואלי מהיר של עריכות מוצלחות.
      הערה: כאשר המחיקה מתרחשת, אתר ההגבלה מוסר, כך שהאנזים לא יחתוך את הרצף, וייצר רצועה אחת לא חתוכה על ג'ל כדי לאשר את המחיקה.
  2. עבור החדרת קלטות גנים בתיווך HDR, תכנן מספר gRNAs באמצעות הכלים שהוזכרו ליצירת מוטציות נוקאאוט ובחר את היעיל ביותר לאחר הערכה מאוחרת יותר.
  3. תכנון פלסמידים תורמים לתיקון מכוון הומולוגיה (HDR) המכילים זרועות הומולוגיה של אתר המטרה, רצף ה-DNA של המטען, סמן פלואורסצנטי, מקור השכפול וגן עמידות לאנטיביוטיקה (איור 1B).
    1. בחר את זרועות ההומולוגיה מהאזורים במעלה הזרם ובמורד הזרם של אתר היעד, כל אחת משתרעת על פני 500-1,000 bp10 (איור 1B).
    2. בחר את רצף המטען, שעשוי לכלול סמן פלואורסצנטי, גן מעניין או אלמנט רגולטורי (למשל, QF2).
    3. בחר סמן פלואורסצנט. סמנים פלואורסצנטיים נפוצים המשמשים ל-A. aegypti כלולים בקלטת DNA המכילה מקדם, גן מקודד סמן פלואורסצנטי ורצף UTR 3'. ראה את הדיון לפרטים נוספים.

2. הכנת תערובת הזרקה

  1. יש לדלל את חלבון Cas9 עם מאגר הדילול Cas9 ל-1 מיקרוגרם/מיקרוליטר.
    הערה: אין להפשיר ולהקפיא את Cas9 יותר מפי 2. רצוי להכין כמויות של חלבון Cas9.
  2. רכשו את ה-gRNAs או ייצרו אותם בבית.
    הערה: לייצור פנימי, השתמש בשיטות טיהור RNA סטנדרטיות ובחומרים נטולי RNAse.
    1. תכנן 4-6 gRNAs ובחר את שני ה-gRNAs הטובים ביותר להזרקה (ראה בדיקת מחשוף במבחנה להלן).
    2. תכנן פריימר קדימה הכולל את רצף המקדם T7 במעלה הזרם של רצף ה-gRNA. השתמש בפריימר ההפוך gRNA האוניברסלי עבור תגובות PCR שאינן תבנית, כמתואר להלן. בסיס הרצף החופף מתחבר לרצף המתאים בפריימר ההפוך האוניברסלי (מודגש ומסומן בקו תחתון), ויוצר תבנית לפולימראז ה-DNA כדי להגביר את הרצפים שלהם.
      הערה: עבור תגובות PCR אלה, הפריימר הקדמי צריך להכיל את מקדם T7 (מודגש), ואחריו שני גואנינים (חשובים להתחלת שעתוק באמצעות T7 RNA פולימראז), רצף 20 הנוקלאוטידים של ה-gRNA (N20; ללא רצף ה-PAM), ורצף הפריימר החופף (מסומן בקו תחתון).
      פריימר פורוורד: 5'- GAAATTAATACGACTCACTATAGGN20 GTTTTAGAGCTAGAAATAGC- 3'
      פריימר הפוך: 5''-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTT CAAGTTGATAACGGACTAGTAGC
      CTTATT TTAACTT GCTATTTCTAGCTCTAAAAC - 3'
    3. סנתז את תבנית ה-DNA על ידי PCR שאינו תבנית. הגדר תגובות מרובות (כל אחת מכילה 12.5 מיקרוליטר של תערובת המאסטר 2x, 1.25 מיקרוליטר של תמיסת 10 מיקרומטר של פריימר קדימה, 1.25 מיקרוליטר של תמיסת 10 מיקרומטר של פריימר הפוך, ו-10 מיקרוליטר של מים טהורים במיוחד) כך שמספיק תוצר PCR (300 ננוגרם) יהיה זמין לתגובת השעתוק במבחנה . השתמש בתנאי ה-PCR הבאים: דנטורציה ראשונית למשך 30 שניות ב-98 מעלות צלזיוס; 35 מחזורי הגברה למשך 10 שניות ב-98 מעלות צלזיוס, 10 שניות ב-62 מעלות צלזיוס ו-10 שניות ב-72 מעלות צלזיוס; הארכה סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; ואחסון ב-4 מעלות צלזיוס.
    4. אשר הגברה של מקטע DNA בודד (122 זוגות בסיסים) על ג'ל אגרוז (2%).
    5. נקה את תבנית ה-PCR באמצעות ערכת טיהור PCR, בהתאם להמלצות היצרן.
    6. בצע תגובת שעתוק במבחנה עם ערכת תמלול T7. מערבבים 2 מיקרוליטר של מאגר תגובה פי 10, 2 מיקרוליטר כל אחד מנוקלאוטידים (ATP, CTP, UTP ו-GTP), 2 מיקרוליטר של T7 RNA פולימראז, 3 מיקרוליטר של ה-DNA של התבנית (100 ננוגרם/מיקרוליטר), ו-5 מיקרוליטר של מים טהורים במיוחד. דגרו את התערובת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות (לא יותר מ-16 שעות) עד לילה (12 שעות).
      הערה: בתגובה זו, ה-T7 RNA פולימראז נקשר למקדם T7 הכלול ברצף הפריימר קדימה, מה שמוביל לשעתוק של ה-gRNA.
    7. טפל בתגובת השעתוק עם DNase על ידי הוספת 1 מיקרוליטר של DNase (ערבב היטב) ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    8. טהר את ה-sgRNAs המסונתזים עם ערכת ניקוי שעתוק על ידי ביצוע המלצות היצרן.
    9. בצע בדיקת מחשוף במבחנה כדי להעריך את יעילות החיתוך של ה-gRNAs שנבחרו (איור 1C).
      1. תכנן פריימרים להגברת שבר DNA (500-1,000 bp) המאגף את אתר חיתוך ה-gRNA.
      2. הגדר את תגובות ה-PCR באופן הבא: 12.5 מיקרוליטר של תערובת המאסטר 2x, 1.25 מיקרוליטר של תמיסת 10 מיקרומטר של פריימר קדמי, 1.25 מיקרוליטר של תמיסת 10 מיקרומטר של פריימר הפוך, 9 מיקרוליטר של מים אולטרה-טהורים ו-1 מיקרוליטר של DNA תבנית 5 ננוגרם/מיקרוליטר.
      3. השתמש בתנאי ה-PCR הבאים: תנאים: דנטורציה ראשונית למשך 30 שניות ב-98 מעלות צלזיוס; 35 מחזורי הגברה למשך 10 שניות ב-98 מעלות צלזיוס, 15-30 שניות ב-X מעלות צלזיוס (טמפרטורת חישול אידיאלית לפריימרים), ו-35 שניות ב-72 מעלות צלזיוס; הארכה סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; ואחסון סופי לטווח ארוך ב-4 מעלות צלזיוס.
      4. עיין בהנחיות היצרן לקבלת טמפרטורות ההגברה וטווח הזמן הטובים ביותר. אסוף לפחות חמש תגובות או הגדל את נפחי הריאגנטים כך שיתקבל מספיק מוצר PCR (1.5-2 מיקרוגרם) לאחר ניקוי PCR (פס יחיד) או טיהור פס PCR ג'ל אגרוז.
      5. הגדר תגובות מחשוף Cas9 עם Cas9 רקומביננטי על ידי דגירה של התערובת הבאה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה: 1 מיקרוליטר של מאגר תגובה 10x Cas9, 0.35 מיקרוליטר של Cas9 רקומביננטי (1 מיקרוגרם/מיקרוליטר), 1 מיקרוליטר של gRNA (100 ננוגרם/מיקרוליטר), 6.65 מיקרוליטר של מים טהורים במיוחד ו-1 מיקרוליטר של 300 ננוגרם/מיקרוליטר של DNA תבנית.
      6. הגדר תגובת בקרה שלילית ללא כל gRNA.
      7. בדוק את יעילות המחשוף על ידי הפעלת תגובות על ג'ל אגרוז (1.5-2.0%; איור 1C).

3. הרכבת הפלסמיד התורם

  1. PCR מגביר את זרועות ההומולוגיה מה-DNA הגנומי של A. aegypti.
    1. לעיצוב פריימר, עיין בהנחיות יצרן ערכת השיבוט. השתמש בכלי מקוון (למשל, Benchling), המספק תמיכה בתכנון והרכבה של פלסמיד באמצעות אסטרטגיות שיבוט שונות (למשל, גיבסון, שער הזהב ושיבוט מבוסס אנזימי הגבלה).
    2. להגביר את רצף המטען מה-DNA הגנומי של A. aegypti או להזמין מקטע גן מסונתז מסחרית.
    3. להגביר סמני פלורסנט מפלסמידים בתוך הבית.
  2. קשר שברי DNA משלבים 3.1.1 עד 3.1.3 לעמוד השדרה של פלסמיד קיים על ידי מכלול גיבסון. דגרו תערובת של 10 מיקרוליטר של תערובת מאסטר 2x, X μL של כל שברי ה-DNA, 10-X μL של מים טהורים במיוחד ב-50 מעלות צלזיוס למשך שעה.
    הערה: עיין בהנחיות היצרן לחישוב היחס האידיאלי בין תוספות לעמוד השדרה של פלסמיד.
    1. חשב את הריכוזים של כל שבר שיבוט בפיקו מול: pmols = (משקל ב-ng) ×-1,000/(זוגות בסיסים ×-650 דלטונים).
    2. השתמש ב-50-100 ננוגרם של עמוד שדרה פלסמיד ועודף טוחנת פי 2-3 מכל תוספת.
    3. אם מרכיבים 2-3 שברים, מוסיפים 0.02-0.5 pmols מכל שבר לתגובת גיבסון. אם מרכיבים 4-6 שברים, מוסיפים 0.2-1.0 פמול מכל אחד מהם.
  3. השתמש ב-3-5 מיקרוליטר של תגובת ההרכבה של גיבסון כדי להפוך תאים מוכשרים של E. coli JM109.
    הערה: JM109 נבחר להרכבת גיבסון בשל ה-recA-genotype שלו, המפחית אירועי רקומבינציה לא רצויים ומונע העברת נוקלאז במהלך קציר התאים, מה שמבטיח את שלמות שברי ה-DNA המורכבים
    עבור פלסמידים גדולים מ-10 kb, אנו ממליצים על טרנספורמציה של תאים מוכשרים DH5α באמצעות הפרוטוקול המורחב, בהתאם להמלצות היצרן.
  4. הרחב את החיידקים שעברו טרנספורמציה וטהר את הפלסמיד באמצעות ערכת מיני-הכנה.
  5. לאישור הרכבת פלסמיד נכונה, הפעל עיכול אנזים הגבלה אבחנתי עם ה-DNA המטוהר של הפלסמיד ודמיין על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז (איור 1D,E).
    הערה: אנו מציעים להשתמש בכלי מקוון לבחירת כמה אנזימי הגבלה שיכולים לחתוך את הפלסמיד באתר יחיד. לתוכנה כמו Benchling יש כלי מובנה שמבצע עיכול וירטואלי של רצפי פלסמיד עם אנזימי ההגבלה שנבחרו, ומציג את דפוס פס ה-DNA הצפוי על ג'ל אלקטרופורזה וירטואלי (איור 1D).
    1. בצע את עיכול אנזים הגבלת הפלסמיד. דגירה של תערובת של 1 מיקרוליטר של מאגר עיכול הגבלה פי 10, 0.5 מיקרוליטר של אנזים הגבלה 1, 0.5 מיקרוליטר של אנזים הגבלה 2, 1 מיקרוליטר של DNA פלסמיד (300 ננוגרם/מ"ל), ו-7 מיקרוליטר של מים טהורים במיוחד ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
    2. הפעל את תגובות עיכול ההגבלה על ג'ל אגרוז (1.5%).
      הערה: תבנית פס הדנ"א (איור 1E) צריכה להידמות לתבנית פס העיכול הווירטואלי (איור 1D). ניתן לשלוח פלסמידים גם לרצף פלסמיד שלם אם יש שירות זמין.
  6. תרבית שיבוט הפלסמיד ל-150 מ"ל של מדיה LB.
  7. בצע מקסיפרפ פלסמיד, בהתאם להנחיות היצרן.
  8. השעו את הפלסמיד במים טהורים במיוחד.

4. ערבוב מבנה ההזרקה

הערה: טווחי הריכוז הסופיים המוצעים עבור כל מבנה מסופקים בטבלה 1. התחל ביחס של 2:1:2 (ng Cas9: ng sgRNA: ng תורם פלסמיד) והתאם לפי הצורך כדי לייעל את יעילות ה-HDR. ניטור התוצאות יעזור לזהות את השילוב היעיל ביותר.

  1. ליצירת מוטציות נוק-אאוט,
    1. לדלל את האליקווט של חלבון Cas9 לריכוז הרצוי באמצעות מאגר הדילול Cas9 ולדלל את האליקווט של gRNA במים טהורים במיוחד.
    2. מערבבים מראש את חלבון Cas9 עם כל gRNA ליצירת קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין (RNP). שלב את הפתרונות המעורבבים מראש.
  2. עבור החדרת קלטות גנים בתיווך HDR,
    1. לדלל ולערבב חלבון Cas9 ו-gRNAs כפי שהוצע ליצירת מוטציות נוק-אאוט.
    2. מדללים את הפלסמיד התורם במים טהורים במיוחד.
    3. שלב את כל המבנים.

5. משיכה וטעינה של מחטי מיקרו-הזרקה

  1. השתמש בחוט קוורץ כדי למשוך את מחטי ההזרקה (איור 2). יש לוודא שאורך החוט הוא 10 ס"מ, בקוטר חיצוני של 1 מ"מ ובקוטר פנימי של 0.7 מ"מ.
  2. משוך את המחטים באמצעות חולץ מיקרופיפטה לייזר עם אחת משתי התוכניות הבאות:
    תוכנית 1: חום 805, נימה 4, מהירות 50, עיכוב 145, משיכה 145
    תוכנית 2: חום 650, נימה 4, מהירות 40, עיכוב 150, משיכה 156
    הערה: תוכנית 1 מביאה לקצה מחט דק יותר אך ארוך יותר, מה שהופך אותה למתאימה להזרקות עם מבנים בריכוז נמוך יותר, כאשר קצה עדין יותר מועיל לדיוק. תוכנית 2 מניבה קצה מחט קצר יותר אך עבה יותר, אידיאלי להזרקות בריכוז גבוה יותר, מכיוון שהמבנה עבה יותר ודורש מחט יציבה יותר.

6. קצירת עוברים

  1. הכן שואב חשמלי או ידני לאיסוף יתושים והשתמש בבקבוקוני פלסטיק לאיסוף וקצירת עוברים.
  2. הרטיבו ניירות סינון עיגולים לבנים והניחו אותם על הקיר הפנימי או על גבי כותנה לחה בקולט.
  3. הכניסו 5-10 יתושים נקבות שהוזנו בדם לפני 5-10 ימים לתוך הקולט. הניחו את הקולט בחושך למשך 45 דקות.
  4. הוצא את ניירות הסינון לקצירת עוברים.

7. מערך העוברים

  1. השתמש בזן בר (ליברפול) של A. aegypti להזרקת עובר.
  2. בחר עוברים בשלב קדם-בלסטודרם, במיוחד אלה שצבעם אפור בהיר, מנייר הקציר (איור 3).
  3. העבירו כמה עוברים בעזרת מברשת רטובה לסרט הדביק הדו-צדדי המונח על גבי כיסוי. יישר את העוברים במקביל כשסביבתם עדיין רטובה וודא שהם זה לצד זה, כאשר כל הקצוות האחוריים פונים לחזית.
  4. לאחר המיקום הנכון, אפשר לסביבה להתייבש מעט כדי לאבטח את העוברים במקומם.
  5. הוסף שמן Halocarbon 700 על העוברים במהלך היישור כדי למנוע התייבשות.
    הערה: ודא שהעוברים אינם מוקפים במים בעת הוספת השמן, מכיוון שהדבר יגרום לעוברים לצוף בשמן.

8. מיקרו הזרקת עובר

הערה: ההזרקה מתבצעת בטמפרטורת החדר או ב-18 מעלות צלזיוס. הטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס מומלצת מסיבות מעשיות, מכיוון שהיא מעכבת את התפתחות העובר.

  1. הגדר מיקרו-מזרק עם הפרמטרים הבאים: לחץ פיצוי (Pc) 300 hPa, לחץ הזרקה (Pi) 500 hPa. התאם תנאים אלה במידת הצורך.
  2. טען 3 מיקרוליטר מהמבנה המעורב לתוך מחט באמצעות מיקרו-טוען.
  3. הניחו את זכוכית הכיסוי עם עוברים מיושרים על גבי שקופית מיקרוסקופ (איור 3). מקם את זכוכית הכיסוי והחלק מתחת למיקרוסקופ להזרקה. ודא שהקצה האחורי של העובר ממוקם לכיוון המחט.
  4. הנח מחט אחת לתוך מחזיק מחט יחד עם מיקרומניפולטור ומקם את המחט בזווית של 10 מעלות לכיוון הקצה האחורי של העוברים המיושרים, תוך שמירה על יציבות (איור 4A). פתח בעדינות את המחט מתחת למיקרוסקופ וגע בה קלות בקצה הכיסוי.
    הערה: אפשרות נוספת היא ליצור פתח קטן במחט על ידי הקשה עליו עם עובר. עם זאת, מומלץ לפתוח מחט מעט רחב יותר, מכיוון שהדביקות של חלבון Cas9 עלולה לסתום את המחט.
  5. הזז את זכוכית ההחלקה לכיוון המחט להזרקה (איור 5).

9. טיפול לאחר עובר מוזרק

  1. השתמש במגבונים חד פעמיים נטולי מוך כדי להסיר את השמן המקיף את העוברים.
  2. הוסף מים נטולי יונים כדי לשטוף את העוברים, והעביר את העוברים על נייר סינון רטוב. הנח את נייר הסינון הרטוב על טישו רטוב בתוך כוסות קראט 9 אונקיות (איור 4B ואיור 6A,B).
  3. הניחו כותנה רטובה בתחתית הכוס כדי לשמור על לחות (איור 6B).
  4. שמור את העוברים המוזרקים על נייר סינון רטוב.

10. בקיעת עוברים וסינון זחלי G0

  1. לפחות 4 ימים לאחר ההזרקה, העבירו את נייר הסינון עם העוברים לכ-3 ליטר מים נטולי יונים במחבתות סטריליט של 6 ליטר לבקיעה.
    הערה: ביצים בוקעות בדרך כלל ביעילות רבה יותר תוך שבועיים לאחר ההזרקה. ודא שהביצים נשארות לחות בתקופה זו. נייר הסינון לא צריך להיות רטוב מדי, מכיוון שלחות מוגזמת עלולה להוביל לבקיעה מוקדמת של העוברים. בעוד ששימור ארוך יותר עשוי לשפר את שיעורי הבקיעה, אל תעלה על חודש לקבלת תוצאות מיטביות. שימוש במים לא מחומצנים עשוי גם לעזור בבקיעה.
  2. לאחר שזחלי G0 בוקעים, הוסיפו למחבת מזון דגים מעורבב במים כמזון.
  3. סנן את זחלי G0 עבור הסמן הפלואורסצנטי בשלב הזחל השלישי עד הרביעי (איור 7).
  4. שמור על הזחלים בנפרד על סמך מצבם הפלואורסצנטי, כאשר זחלים חיוביים פלואורסצנטיים ושליליים פלואורסצנטיים נשמרים במחבתות נפרדות.

11. גלמי מיון מין והכלאה לסוג בר

  1. הפרד את היתושים המוזרקים לפי מין כשהם גולמים, תוך שימוש בגודל ובמבנים ספציפיים למין באונה איברי המין לזיהוי:
    1. זכרים: גודל קטן יותר, אונת איברי מין בולטת ומחודדת יותר, ומשוטים רחבים יותר (מבנים בקצה הזנב של הגלמים; איור 8A 1,A2).
    2. נקבות: גודל גדול יותר, אונת איברי מין קטנה יותר ופחות בולטת, ומשוטים צרים יותר (איור 8B 1,B2).
  2. בריכה יתושים חיוביים פלואורסצנטיים או שליליים פלואורסצנטיים מכל מין.
  3. חצו את היתושים המאוגדים עם יתושים מהמין השני מזן ליברפול. השתמש ביחס של 3:1 עד 5:1 מסוג הבר ליתוש G0.
  4. חצו את היתושים למשך 4 ימים.
  5. ספק לנקבות ארוחת דם לאחר המעבר.

12. הקרנת G1

  1. שלושה ימים לאחר האכלת הדם, ספקו כוסות ביצים על ידי הנחת מגבת נייר בתוך הדופן של כוסות קראט 9 אונקיות והוספת כ-3 אונקיות מים נטולי יונים.
  2. לאחר 3-4 ימים, קצרו ובקעו את עוברי G1. סנן את זחלי G1 עבור הסמן הפלואורסצנטי בשלבי הכוכב השלישי עד הרביעי (איור 7).
  3. אסוף את הזחלים הפלואורסצנטיים, מה שמציע החדרת HDR. כאשר הפרטים הפלואורסצנטיים G1 מגיעים לשלב הגולם, הפרידו אותם לפי מין והניחו כל מין בכלובים נפרדים.
  4. הכלאה של יתושי G1 פלואורסצנטיים לאנשים מהמין השני של זן ליברפול.

13. אישור אתר החדרת G1

  1. לאחר מתן ארוחת הדם, הגדר נקבות G1 להטלת ביצים נקבה בודדת על ידי הנחת פיסת מגבת נייר קטנה בבקבוקוני דרוזופילה בודדים והוספת 3 מ"ל מים נטולי יונים.
  2. עבור מוטציות נוקאאוט:
    1. לאחר הטלת הביצים, המים מתאדים, ומגבת הנייר מתייבשת, בוקעים את הביצים מנקבות שמציגות בבירור מוטציות נוקאאוט ומקבלות את דור ה-G2.
    2. אסוף את גופת אמהות ה- G1 בקעו בהצלחה צאצאי G2 וחילצו DNA.
    3. השתמש ב-DNA כתבנית ל-PCR כדי להגביר את הרצף המכסה את אתר היעד. ודא שהפריימרים מגבירים שבר DNA של ~200 bp. הגדר את התגובות (כל אחת מכילה 12.5 מיקרוליטר של תערובת המאסטר 2x, 1.25 מיקרוליטר של תמיסת 10 מיקרומטר של פריימר קדמי, 1.25 מיקרוליטר של תמיסת 10 מיקרומטר של פריימר הפוך, 9 מיקרוליטר של מים אולטרה-טהורים ו-1 מיקרוליטר של תבנית DNA [5 ננוגרם/מיקרוליטר]). השתמש בתנאי ה-PCR הבאים: דנטורציה ראשונית למשך 30 שניות ב-98 מעלות צלזיוס; 35 מחזורי הגברה למשך 10 שניות ב-98 מעלות צלזיוס, 15-30 שניות ב-X מעלות צלזיוס (טמפרטורת החישול האידיאלית של פריימרים), ו-10 שניות ב-72 מעלות צלזיוס; הארכה סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; ואחסון סופי לטווח ארוך ב-4 מעלות צלזיוס.
    4. טהר שברי PCR ובצע עיכול אנזימי הגבלה של שברי ה-PCR על ידי דגירה של תערובת של 1 מיקרוליטר של מאגר עיכול הגבלה פי 10, 0.5 מיקרוליטר של אנזים הגבלה 1, 0.5 מיקרוליטר של אנזים הגבלה 2, 1 מיקרוליטר של שבר PCR (200 ננוגרם/מ"ל), ו-7 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      הערה: ניתן להשתמש באנזימי הגבלה מסוימים בתערובת ה-PCR ללא טיהור מוקדם.
    5. דמיין את עיכול שבר ה-PCR על ידי אלקטרופורזה של ג'ל כדי לאשר אם התרחש מחשוף.
    6. רצף את מקטע ה-PCR הלא מעוכל כדי לזהות את מוטציות הנוק-אאוט.
    7. עבור החדרות בתיווך HDR, לאחר הטלת ביצים:
      1. אסוף את גופן של אמהות G1 וחלץ DNA.
      2. השתמש ב-DNA כתבנית ל-PCR כדי להגביר את הרצף המכסה את אתר היעד.
      3. בצע ריצוף של שבר ה-DNA המוגבר כדי לאשר את תקינות קלטת ה-DNA שהוחדרה.
      4. בקעו את הביצה והשיגו את דור ה- G2.

14. הרחבת קווי הקריספר החדשים

  1. עבור קווי מוטאנטים נוקאאוט:
    1. הגדר נקבות G2 להטלת ביצים, עם 20 נקבות לכל G1. כל G1 מייצג שורה אחת.
    2. לאחר הטלת הביצים, אשר מוטציות נוקאאוט באותו אופן כמו עבור G1.
    3. המשך עם חמישה קווי G1 המציגים מוטציות מזוהות בבירור הן ב-G1 והן ב-G2. בקעו את הביצים שנאספו מ-G2 של כל קו, מה שיוצר את דור ה-G3.
    4. מתוך חמשת הקווים החוצים, בחר שני קווים עם מוטציות מזוהות בבירור וכושר גבוה או הפנוטיפ הרצוי.
    5. הכלאה של נקבות G3 מכל קו נבחר עם זכרים מזן ליברפול.
    6. הגדר 50 נקבות בודדות להטלת ביצים מכל שורה. אשר מוטציות נוקאאוט כפי שנעשה בעבר עבור G1.
      הערה: הגדל את מספר הנשים במערך כדי לשמור על גיוון.
    7. חזור על ההליכים במשך שני דורות נוספים עם שני הקווים (איור 4J).
  2. עבור שורות הוספה חדשות בתיווך HDR:
    1. ודא את נוכחותם של אנשים פלואורסצנטיים בדור G2.
    2. הכלאה של יתושי G2, מכל פרט G1, עם זן ליברפול. כל פרט G1 מייצג קו אחד.
    3. המשך עם שלושה דורות נוספים של הכלאה. בדוק ברציפות את סמן הפלואורסצנט ושים לב לכושר19 של כל קו (איור 4x).
    4. בחר קו אחד עם הוספות נכונות וכושר גבוה ואת הפנוטיפ הרצוי.

15. צור קווים הומוזיגוטיים

  1. עבור קווי מוטאנטים נוקאאוט:
    1. דור G6:
      1. בקעו את הביצים המיוצרות על ידי G5 וקבלו את דור ה-G6.
      2. בוגרים חוצים G6 בתוך הקווים שלהם (איור 4K ואיור 9A).
      3. הקימו 50 נקבות G6 בודדות להטלת ביצים בכל שורה, ובקעו את הביצים כפי שתואר קודם לכן (איור 9B).
      4. אספו את נקבות ה-G6 שבקעו בהצלחה צאצאי G7, חלצו דנ"א ובצעו PCR ועיכול אנזימי הגבלה כפי שנעשה עבור G1 (איור 9C).
        הערה: ניתן להשתמש במאגר ריסוק פשוט וזול (SB) בשלב זה למיצוי DNA.
        1. בעזרת מטחנה ידנית, השרו יתוש בודד ב-100 מיקרוליטר של 1x SB (10 מ"מ Tris-HCl pH 8, 1 מ"מ EDTA ו-25 מ"מ NaCl). מוסיפים פרוטאינאז K (200 מיקרוגרם/מ"ל) ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ולאחר מכן 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. סובבו ב-10,000 × גרם למשך 5 דקות ואספו את הסופרנטנט20.
      5. אשר את המוטציה על ידי הדמיית התוצאות על גבי ג'ל.
      6. השליכו את הביצים שמיוצרות על ידי נקבות ללא מוטציות (איור 9D).
      7. שמרו על זחלים מנקבות עם מוטציות מאושרות כדי לבסס כמה שושלות G7, והשליכו דגים ללא מוטציות (איור 9D).
    2. דור G7:
      1. נקבות וזכרים משולבים בתוך כל שושלת G7 (איור 9E).
      2. הקימו 10 נקבות G7 בודדות להטלת ביצים בכל שורה, ובקעו את הביצים כפי שתואר קודם לכן (איור 9F).
      3. אספו את נקבות ה-G7 שבקעו בהצלחה צאצאי G7, חילצו דנ"א ובצעו עיכול PCR ואנזימי הגבלה (איור 9G).
      4. זיהוי מוטציות נוקאאוט בשני האללים או באלל בודד על ידי הדמיית התוצאות על גבי ג'ל.
      5. שמרו על זחלים מנקבות G7 שאושרו שיש להם נוקאאוט בשני האללים, מה שיוצר את דור ה-G8 (איור 9H). השליכו דגים ללא מוטציות (איור 9H).
        הערה: שלב זה מבטיח שהנקבות הומוזיגוטיות. ב-G8, בדיקת ההומוזיגוטיות של הצאצאים מאשרת אם גם האבות הם הומוזיגוטים".
    3. דור G8:
      1. חצו G8 בוגרים לכל שושלת נקבה G7 (איור 9I).
      2. בחרו באופן אקראי חמישה זכרי G8, חלצו דנ"א ובצעו עיכול PCR ואנזימי הגבלה (איור 9J).
      3. ספקו ארוחת דם ובקעו את הביצים מנקבות G8 שעברו הכלאה עם זכרי G8 שאושרו כבעלי נוקאאוט בשני האללים.
      4. המשיכו עם שושלות G7 שבהן לכל הזכרים שזוהו יש נוקאאוט בשני האללים, מה שמצביע על כך שהשושלות הללו הן הומוזיגוטיות.
  2. עבור שורות הוספה בתיווך HDR:
    1. בקעו את הביצים המיוצרות על ידי G5 וקבלו את דור ה-G6. זחלי מסך בשלב G6 לסמנים פלואורסצנטיים.
    2. השליכו זחלים ללא סמנים פלואורסצנטיים (איור 4xi).
    3. יתושים צולבים המציגים סמנים פלואורסצנטיים.
    4. המשך בהליך זה עבור כל דור שלאחר מכן עד שלא נצפה זחל שאינו פלואורסצנטי. בשלב זה, קו היתושים יהיה הומוזיגוט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תכנון ואימות של מיקוד גנים בתיווך gRNA עבור רקומבינציה הומולוגיה של HDR
כדי להבטיח שהגן הרצוי ממוקד במדויק, אנו ממליצים לבחור כמה gRNAs ולמקם את זרועות ההומולוגיה 5' ו-3' קרוב לאתר החיתוך עבור רקומבינציה הומולוגית בתיווך HDR (איור 1A). לדוגמה, עיצבנו שני gRNAs כדי להתמקד בשני הצדדים של קודון ההתחלה של הגן המבוקש והשתמשנו בקלטת QF2-Hsp70-OpIE2-ECFP-SV40 כסמן, והחדרנו אותו לגן הממוקד באמצעות זרועות הומולוגיה של 1 kb דרך מנגנון HDR (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

טכנולוגיית CRISPR-Cas שינתה את נוף עריכת הגנום על ידי קידום שינויים ספציפיים למטרה בכרומוזומים1. למרות שאלמנטים הניתנים להעברה היו חיוניים ליצירת היתושים הטרנסגניים הראשונים, אתרי ההחדרה שלהם אקראיים במקצת, וביטוי מבנה המטען (מקדם + גן) עשוי שלא להתאים לפרופיל הביטוי של הגן בפועל עקב אפקט מיקום הגנום (כלומר, אתר החדרה), שבדרך כלל מוביל לביטוי חוץ רחמי21. לפני הופעתם של המספריים המולקולריים CRISPR-Cas9, פותחו טכנולוגיות המקדמות שבירות דו-גדי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

O.S.A. היא המייסדת של Agragene, Inc. ו-Synvect, Inc. עם מניות עצמיות. תנאי הסדר זה נבדקו ואושרו על ידי אוניברסיטת קליפורניה, סן דייגו בהתאם למדיניות ניגוד העניינים שלה. שאר המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

המחברים מודים לג'ודי אישיקווה ואווה סטיבנסון על עזרתם בגידול יתושים. עבודה זו נתמכה על ידי מימון מפרסי ה-NIH (R01AI151004, RO1AI148300, RO1AI175152) שהוענקו ל-O.S.A. ו-K22AI166268 ל-N.H.R. דמויות נוצרו באמצעות BioRender.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10x מאגר תגובה Cas9PNA Bio CB01
BenchlingN/Awww.benchling.com
Cas9 מאגר דילולPNA Bio חלבון CB03
Cas9 PNABio CP01-50
DH5α E. coli תאים מוכשריםניו אינגלנד BiolabsC2987
סרט דביק דו צדדיסקוטש קבוע3136
בקבוקוני דרוזופילהGenesee Scientific 32-109
ניירות סינון GE Healthcare מדעי החיים 1450-042
מזון דגים טטרהB00025Z6YIפתיתי דג זהב 
FlugsGenesee Scientific AS273
מיקרוסקופ פלואורסצנטיLeica Microsystems   M165 FC
שבר גןטכנולוגיות DNA משולבותN/A
gRNASynthegoN/A
שמן הלוקרבון 700 Sigma-AldrichH8898
מיקרוסקופ הזרקהLeica Microsystems DM2000
JM109  אי קולי תאים מוסמכים Zymo ResearchT3005
מיקרו-מזרקEppendorfFemtoJet 4x 
טיפים למיקרו-טוען למילוי פמטוטיפים אפנדורףE5242956003
מיקרומניפולטור אפנדורףטרנספרמן 4r 
מושכי מיקרופיפטה סאטר אינסטרומנט P-2000
זכוכית פישרברנד 12-542-B
שקופית מיקרוסקופ Eisco12-550-A3
דם עכבר (עכברים חיים המשמשים להאכלה)אוניברסיטת קליפורניהIACUC, פרוטוקול שימוש בבעלי חיים #S17187משמש להאכלת דם יתושים; הפרטים תואמים לפרוטוקולי אתיקה של בעלי חיים
NEB Q5 פולימראז DNA בנאמנות גבוהה של ניו אינגלנד BiolabsM0491S
Qiagen28004
ערכת מיני-הכנה לפלסמיד Zymo ResearchD4036
חוט קוורץ Sutter InstrumentsQF100-70-10
ערכת ניקוי תמלולFisher ScientificAM1908
מים טהורים במיוחד לייף טכנולוגיות10977-023
תוכנת ספסל כיסוי מיקרוסקופ ערכת טיהור PCR

מקורות

  1. Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nat Biotechnol. 38 (7), 824-844 (2020).
  2. Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
  3. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  4. Shen, H., Li, Z. DNA double-strand break repairs and their application in plant DNA integration. Genes (Basel). 13 (2), 322(2022).
  5. Vinauger, C., et al. Modulation of host learning in Aedes aegypti mosquitoes. Curr Biol. 28 (3), 333-344.e8 (2018).
  6. Li, M., Bui, M., Yang, T., Bowman, C. S., White, B. J., Akbari, O. S. Germline Cas9 expression yields highly efficient genome engineering in a major worldwide disease vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (49), E10540-E10549 (2017).
  7. Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nat Commun. 9 (1), 3008(2018).
  8. Rouyar, A., et al. Transgenic line for characterizing GABA-receptor expression to study the neural basis of olfaction in the yellow-fever mosquito. Front Physiol. 15, 1381164(2024).
  9. Ang, J. X. D., et al. Considerations for homology-based DNA repair in mosquitoes: Impact of sequence heterology and donor template source. PLoS Genet. 18 (2), e1010060(2022).
  10. Zhang, J. -P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biol. 18 (1), 35(2017).
  11. Coutinho-Abreu, I. V., Akbari, O. S. Technological advances in mosquito olfaction neurogenetics. Trends Genet. 39 (2), 154-166 (2023).
  12. Li, M., et al. Targeting sex determination to suppress mosquito populations. eLife. 12, RP90199(2024).
  13. Zhan, Y., Alonso San Alberto, D., Rusch, C., Riffell, J. A., Montell, C. Elimination of vision-guided target attraction in Aedes aegypti using CRISPR. Current Biol. 31 (18), 4180-4187.e6 (2021).
  14. Greppi, C., et al. Mosquito heat seeking is driven by an ancestral cooling receptor. Science. 367 (6478), 681-684 (2020).
  15. Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
  16. Riabinina, O., et al. Improved and expanded Q-system reagents for genetic manipulations. Nat Methods. 12 (3), 5 p following 222 219-222 (2015).
  17. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Res. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  18. Concordet, J. -P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Res. 46 (W1), W242-W245 (2018).
  19. Williams, A. E., et al. Quantifying fitness costs in transgenic Aedes aegypti mosquitoes. J Vis Exp. , e65136(2023).
  20. Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. -L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).
  21. Coutinho-Abreu, I. V., Zhu, K. Y., Ramalho-Ortigao, M. Transgenesis and paratransgenesis to control insect-borne diseases: current status and future challenges. Parasitol Int. 59 (1), 1-8 (2010).
  22. Christian, M., et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics. 186 (2), 757-761 (2010).
  23. Kim, Y. G., Cha, J., Chandrasegaran, S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1156-1160 (1996).
  24. DeGennaro, M., et al. orco mutant mosquitoes lose strong preference for humans and are not repelled by volatile DEET. Nature. 498 (7455), 487-491 (2013).
  25. McMeniman, C. J., Corfas, R. A., Matthews, B. J., Ritchie, S. A., Vosshall, L. B. Multimodal integration of carbon dioxide and other sensory cues drives mosquito attraction to humans. Cell. 156 (5), 1060-1071 (2014).
  26. Lobo, N. F., Clayton, J. R., Fraser, M. J., Kafatos, F. C., Collins, F. H. High efficiency germ-line transformation of mosquitoes. Nat Protoc. 1 (3), 1312-1317 (2006).
  27. Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Rep. 11 (1), 51-60 (2015).
  28. Handler, A. M., Harrell, R. A. 2nd Transformation of the Caribbean fruit fly, Anastrephasuspensa, with a piggyBac vector marked with polyubiquitin-regulated GFP. Insect Biochem Mol Biol. 31 (2), 199-205 (2001).
  29. Harrell, R. A. 2nd Mosquito embryo microinjection under halocarbon oil or in aqueous solution. 2024 (7), Cold Spring Harb Protoc. (2024).
  30. Sun, R., Raban, R., Akbari, O. S. Generating mutant strains with transgenic Cas9. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (9), 671-678 (2023).
  31. Giraldo, D., et al. An expanded neurogenetic toolkit to decode olfaction in the African malaria mosquito Anopheles gambiae. Cell Rep Methods. 4 (2), 100714(2024).
  32. Liu, G., Lin, Q., Jin, S., Gao, C. The CRISPR-Cas toolbox and gene editing technologies. Mol Cell. 82 (2), 333-347 (2022).
  33. Chu, V. T., et al. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nat Biotechnol. 33 (5), 543-548 (2015).
  34. Laursen, W. J., et al. Humidity sensors that alert mosquitoes to nearby hosts and egg-laying sites. Neuron. 111 (6), 874-887.e8 (2023).
  35. Weng, S. -C., Antoshechkin, I., Marois, E., Akbari, O. S. Efficient sex separation by exploiting differential alternative splicing of a dominant marker in Aedes aegypti. PLoS Genet. 19 (11), e1011065(2023).
  36. Li, M., et al. Development of a confinable gene drive system in the human disease vector. eLife. 9, e51701(2020).
  37. Dalla Benetta, E., et al. Engineered Antiviral Sensor Targets Infected Mosquitoes. The CRISPR journal. 6 (6), 543-556 (2023).
  38. Li, H. -H., et al. C-Type lectins link immunological and reproductive processes in Aedes aegypti. iScience. 23 (9), 101486(2020).
  39. van Oers, M. M., Vlak, J. M., Voorma, H. O., Thomas, A. A. M. Role of the 3' untranslated region of baculovirus p10 mRNA in high-level expression of foreign genes. J Gen Virol. 80 (Pt 8), 2253-2262 (1999).
  40. Salem, T. Z., et al. The influence of SV40 polyA on gene expression of baculovirus expression vector systems. PloS One. 10 (12), e0145019(2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מיקרו-הזרקה עובריתהשבתה גנטיתהכנסה גנטיתסמן פלואורסצנטיתיקון מכוון הומולוגיהדיכוי אוכלוסיית יתושיםRNA מנחה
עריכת גנום ביתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti באמצעות CRISPR-Cas9
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.