הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שיטת QuEChERS-HPLC שונה לזיהוי פחמימנים ארומטיים פוליציקליים בעוברי דג זברה שנחשפו לחלקיקים עדינים

1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67757

⸱

13 ביוני 2025

 ,  ,  ,  , 
1Suzhou Industrial Park Center for Disease Control and Prevention, 2Suzhou Medical College of Soochow University, 3MOE Education Key Laboratory of Geriatric Diseases and Immunology

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פיתחנו שיטת QuEChERS-HPLC שונה כדי להעריך את הרמות הפנימיות של 16 PAHs בעוברי דג הזברה.

תקציר

חשיפה אימהית לחלקיקים עדינים (PM2.5), בקוטר אווירודינמי של 2.5 מיקרומטר או פחות, נקשרה להפלה ספונטנית ולמחלות מולדות שונות בבני אדם. עם זאת, המנגנונים הבסיסיים נותרו לא ברורים. עוברי דג הזברה נמצאים בשימוש נרחב לחקר הרעילות ההתפתחותית של PM2.5 , אך מדידת הרמות הפנימיות של פחמימנים ארומטיים פוליציקליים (PAHs), המרכיבים הרעילים העיקריים של PM2.5, מהווה אתגר. במחקר זה, פיתחנו שיטת כרומטוגרפיה נוזלית מהירה, קלה, זולה, יעילה, קשוחה ובטוחה בעלת ביצועים גבוהים (QuEChERS-HPLC) להערכת הרמות הפנימיות של 16 ה-PAHs המפורטים ברשימת המזהמים המועדפים של הסוכנות להגנת הסביבה האמריקאית (EPA). עוברי דג הזברה טופלו בחומר אורגני הניתן למיצוי (EOM) מ-PM2.5 למשך 2-72 שעות לאחר ההפריה (hpf). שיטת QuEChERS שימשה להכנת דגימות, ו-HPLC-FLD/DAD (HPLC עם גלאי פלואורסצנטי וגלאי מערך דיודות) שימשה לניתוחים איכותיים וכמותיים של PAHs. זיהינו בהצלחה שישה PAHs (פננתרן, אנתרסן, פלואורן, אצנפתן, פלואורנתן ופירן) בעוברי דג זברה שנחשפו ל-PM2.5. שיטה זו חיונית לחקירת המנגנונים של רעילות התפתחותית הנגרמת על ידי PM2.5.

מבוא

חלקיקים עדינים (PM2.5), בקוטר אווירודינמי של 2.5 מיקרומטר או פחות. הוא גורם סיכון סביבתי מוביל. בשל גודלו הקטן, PM2.5 מסוגל להיכנס למערכת הדם ולחלחל למחסום האם-עובר. מחקרים אפידמיולוגיים קשרו בין חשיפה אימהית ל-PM2.5 עם הפלה ספונטנית ומחלות מולדות שונות 1,2,3,4. עם זאת, המנגנונים הבסיסיים של הרעילות העוברית של PM2.5 אינם מובנים היטב. PAHs, המרכיב הרעיל העיקרי של PM2.5, רעילים מאוד לבני אדם בשל תכונותיהם המוטגניות והמסרטנות 5,6. מבין מאות ה-PAHs, 16 הוקצו כמזהמים בעדיפות גבוהה על ידי הסוכנות להגנת הסביבה האמריקאית (EPA).

דג הזברה, Danio rerio, הוא אורגניזם מודל בעל חוליות רב עוצמה בשל הדמיון הגנטי שלו לבני אדם, התפתחות מהירה, קצב רבייה גבוה וקלות תחזוקה. השקיפות של עוברי דג הזברה מאפשרת תצפית ישירה על כל הגוף תחת מיקרוסקופ, ומאפשרת מחקרים מפורטים. PAHs מומסים יכולים להיכנס לעוברי דג הזברה על ידי דיפוזיה7. מחקרים רבים השתמשו בעוברי דג זברה כדי לחקור את ההשפעות והמנגנונים הרעילים של חומר אורגני הניתן לחילוץ (EOM) מ-PM2.5 8,9,10,11. עם זאת, רוב המחקרים הללו אפיינו רק את 16 ה-PAHs בעדיפות ב-EOM, מבלי לזהות את הרמות הפנימיות של PAHs בעוברי דג הזברה12. אתגר זה עשוי לנבוע מגודלם הקטן של עוברי דג הזברה והמורכבות של המטריצה העוברית.

השיטה המהירה, הקלה, הזולה, היעילה, הקשוחה והבטוחה (QuEChERS) היא טכניקת הכנת דגימות חדשנית המשמשת לניתוח שאריות חומרי הדברה, תרופות וטרינריות ומזהמים אחרים בדגימות מזון וסביבה13,14. בשילוב עם כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC), שיטה זו שימשה לאיתור חומרי הדברה בדגי זברה15. ל-PAHs, המכילים שתי טבעות בנזן או יותר, יש תכונות פלואורסצנטיות חזקות, מה שהופך אותם למתאימים במיוחד לזיהוי באמצעות גלאי פלואורסצנטיות. במחקר זה, פיתחנו שיטת QuEChERS-HPLC שונה כדי להעריך את הרמות של 16 PAHs בעוברי דג זברה שנחשפו ל-EOM.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. טיפול לדוגמא

  1. קולקציית PM2.5
    1. אסוף PM2.5 על מסנני קרום קוורץ 47 מ"מ.
      הערה: PM2.5 נאסף בעיר סוג'ואו, סין.
  2. מיצוי EOM
    1. חותכים את המסנן לחתיכות ומניחים בבקבוק זכוכית חרוטי עם 150 מ"ל אצטוניטריל.
    2. אולטרסאונד את הבקבוק ב-35 מעלות צלזיוס למשך שעה והעביר את התמצית לארבעה צינורות של 50 מ"ל.
    3. צנטריפוגה בטמפרטורה של 7,000 × גרם למשך 20 דקות, ואז העבירו את הסופרנטנט למאייד סיבובי ורכזו אותו לכ-5 מ"ל.
    4. מתאדים ליובש תחת זרימת חנקן באמבט מים של 35 מעלות צלזיוס וממיסים את השאריות בדימתיל סולפוקסיד (DMSO).
  3. טיפול בעובר דג הזברה
    1. שמור על דג הזברה במערכת מים מחזורית במחזור אור של 14 שעות וחושך של 10 שעות ב-28 מעלות צלזיוס16.
    2. אוספים ביצים מופרות (200 עוברים לקבוצה) ומעבירים אותן לצלחות פטרי מזכוכית (זכוכית סודה-ליים, 80X15 מ"מ) עם 30 מ"ל מים ממערכת המים המחזורית.
    3. הוסף 30 מיקרוליטר של EOM (10 מ"ג/מ"ל) לצלחת פטרי מזכוכית המכילה 200 עוברים לאחר שעתיים לאחר ההפריה (hpf). קבוצות לא מטופלות משמשות כפקדים ריקים.
      הערה: הריכוז הסופי של EOM הוא 10 מ"ג/ליטר, בהתבסס על שיעור המומים הלבביים (איור משלים S1).
    4. הכניסו את הכלים לאינקובטור של 28 מעלות צלזיוס.

2. הכנת דגימת QuEChERS

  1. הסר את הכלים עם עוברים ב 72 hpf מהחממה. שטפו את העוברים פי 3 במים טהורים.
  2. מעבירים את העוברים לצינורות של 1.5 מ"ל (לפי קבוצות שונות) ומסירים עודפי מים.
  3. מכניסים את הצינורות למקפיא של -80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לליופיליזציה של האמבירוס17 וליופיליזציה שלהם. לאחר מכן, טוחנים את העוברים באמצעות מוט זכוכית.
  4. הוסף 25 מיקרוליטר של תמיסה סטנדרטית מעורבת של 16 PAH (2.0 מיקרוגרם/מ"ל) לקבוצת הביקורת DMSO כדי לבדוק התאוששות ספייק.
  5. הוסף 1 מ"ל של n-הקסאן ומערבולת למשך 30 שניות, ולאחר מכן אולטרסאונד ב-35 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  6. צנטריפוגה ב-7,000 × גרם למשך 5 דקות והעבירו את הסופרנטנט לתוך צינור טרי.
  7. חזור על שלבים 2.5 ו-2.6.
  8. אידוי הסופרנטנטים שנאספו ליובש תחת זרימת חנקן באמבט מים של 35 מעלות צלזיוס.
  9. הוסף 1 מ"ל אצטוניטריל ומערבולת למשך 30 שניות.
  10. הוסף 10 מ"ג אמין משני ראשוני (PSA), 45 מ"ג מגנזיום גופרתי ו-15 מ"ג אריזת C18, ואז מערבולת למשך 30 שניות.
  11. צנטריפוגה ב-7,000 × גרם למשך 5 דקות והעבירו את הסופרנטנט לצינור טרי.
  12. חזור על שלב 2.9 וצנטריפוגה בחום של 7,000 × גרם למשך 5 דקות. העבירו את הסופרנטנט לצינור טרי.
  13. אידוי הסופרנטנט ל-0.5 מ"ל מתחת לחנקן.
  14. מסננים דרך קרום מיקרופורי של 0.22 מיקרומטר.

3. קביעת PAHs באמצעות HPLC

  1. הכינו סדרה של פתרונות עבודה (הנעים בין 1 ל-500 ננוגרם/מ"ל) לתקן מעורבב 16 PAH עם אצטוניטריל והזריקו אותם לתוך כרומטוגרף נוזלי באמצעות אצטוניטריל/מים כשלב הנייד.
    1. להזריק 20 מיקרוליטר ולהשתמש בהליך הפליטה הבא: 0-18.5 דקות, 40% אצטוניטריל עד 100% אצטוניטריל; 18.5-28 דקות, 100% אצטוניטריל; 28-29.5 דקות, 100% עד 40% אצטוניטריל; זמן עצירה: 32 דקות; טמפרטורת עמודה: 25 מעלות צלזיוס; קצב זרימה: 1.8 מ"ל לדקה. שרטט עקומה סטנדרטית עם ריכוזי מסה של פתרונות העבודה הסטנדרטיים על ציר ה-x ואזורי השיא המתאימים על ציר ה-y, המכסה טווח שבין 5 ננוגרם/מ"ל ל-500 ננוגרם/מ"ל.
      הערה: ניתן למצוא אורכי גל עירור/פליטה של PAHs בטבלה משלימה S1.
  2. הזרקו את הדגימה המטוהרת (משלב 2.14.) לתוך הכרומטוגרף הנוזלי עם גלאי פלואורסצנטי (FLD) וגלאי מערך דיודות (DAD).
  3. זהה את נוכחותם של PAHs על ידי השוואת זמני שמירה ומדוד את אזורי השיא המשויכים.
    הערה: ריכוזי המסה של ה-PAHs נקבעו באמצעות העקומה הסטנדרטית שנוצרה קודם לכן משלב 3.1.1.
  4. חשב את הריכוזים הפנימיים של 16 PAHs על סמך ריכוזי המסה הנמדדים של הדגימות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כל ההליך לחשיפה ל-EOM, הכנת דגימה וזיהוי PAH מתואר באיור 1. עבור HPLC-FLU/DAD, יחס אות לרעש של 3:1, עם טווח זיהוי בין 0.3 ל-5.0 ננוגרם/מ"ל, נחשב מקובל. מגבלות הזיהוי של שיטת הזיהוי נעו בין 3.0 × 10-4 ל-5.0 × 10-3 ננוגרם לאורגניזם. כל עקומות הכיול הראו ליניאריות גבוהה (r2 > 0.999). ערכי הדיוק שנקבעו באמצעות תמציות שהתקבלו מדגימות מטריצה היו מתחת ל-5%. שיעורי ההחלמה הגבוהים נעו בין 82.0% ל-96.3% (טבלה 1).

כפי שמוצ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

עוברי דג הזברה הם מודל רב עוצמה של בעלי חוליות למחקרי רעילות התפתחותית, אך גודלם הקטן מסבך את הזיהוי של תרכובות אורגניות נדיפות למחצה (SVOCs) כגון PAHs. במהלך הכנת הדגימה, מניעת זיהום של עוברי דג הזברה היא קריטית. ניקוי נכון של דגימות הוא צעד מפתח כדי למנוע העברת תרכובות ממדיום החשיפה לתמצית הדגימה. שטיפה לא מלאה עלולה להוביל להערכת יתר, בעוד ששטיפה מוגזמת עלולה לגרום לאובדן חומרים מתוך העוברים, וכתוצאה מכך להערכת חסר. במהלך מיצוי PAH, יש צורך להסיר מים וזיהומים שמקורם בעוברי דג הזברה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

עבודה זו נתמכה כספית על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מספר מענק: 81972999) ותוכנית פיתוח המדע והטכנולוגיה של סוג'ואו (מחקר בסיסי על יישומים רפואיים, SKY2023036 ו-SKY2023115).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
16 פתרונות PAHs סטנדרטיים מעורבים o2si Smart Solutions (דרום קרוליינה, ארה"ב)110124-0616 PAHs פתרונות סטנדרטיים מעורבים  כולל נפתלין (Nap), אצנפתילן (Acy), אס-נפתן (Ace), פלואורן (Flo), פננתרן (Phe), אנתרסן (נמלה), פלואורנתן (שפעת), פירן (Pyr), בנזו [a] אנתרסן (BaA), קריזן (Chr), בנזו [b] פלואורנתן (BbF), בנזו [k] פלואורנתן (BkF), בנזו [a] פירן (BaP), אינדנו [1,2,3-cd] פירן (IcdP), דיבנץ [a, h]אנתרסן (DahA), בנזו [g,h,i] פרילן (BghiP).
1260 Infinity II LC SystemAgilent Technologies (סנטה קלרה, ארה"ב)FLD (G1321A); DAD SL (G1315C)
AcetonitrileScharlab (ברצלונה, ספרד)AC03661000ממס
CNWBOND HC-C18 SPE ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc. (שנגחאי, סין)SBEQ-CA0801C18 היא אריזה בשלב הפוך עם איזון טוב בין הידרופילי להידרופובי, שיכול לספוג ולהפריד היטב תרכובות אורגניות קוטביות ולא קוטביות.
אדמה דיאטומיתAgilent Technologies, Inc (סנטה קלרה, ארה"ב)12214013להפרדה, טיהור והסרה של זיהומים אורגניים;
Dispersive SPE 15 מ"ל, ENAgilent Technologies, Inc (סנטה קלרה, ארה"ב)5982-5056טיהור דגימות
ANPEL Laboratory Technologies (שנחאי) Inc. (שנגחאי, סין)SCAA-104מסנן מחט פאזה אורגני (ניילון), 0.22 ומיקרו; m
HexaneScharlab (ברצלונה, ספרד)HE02481000ממס
MilliporeMerck (ניו ג'רזי, ארה"ב)של מים טהורים
במיוחד - N-EVAP Nitrogen EvaporatorsOrganomation (מסצ'וסטס, ארה"ב)אידוי ממיסים
Sorvall ST4 PlusThermo Fisher Scientific (וולת'ם, ארה"ב)צנטריפוגה
  Vortex- Genie 2 (G560E)Scientific Industries (ניו יורק, ארה"ב)Vortex
ZORBAX Eclipse PAHAgilent Technologies, Inc (סנטה קלרה, ארה"ב)959990-918עמודה זו משמשת בדרך כלל במערכות HPLC כדי להשיג ניתוח מדויק ואמין של PAHs.
אריזת מסנן הכן אורגנומציה

מקורות

  1. Wang, H., et al. Association of maternal exposure to ambient particulate pollution with incident spontaneous pregnancy loss. Ecotoxicol Environ Saf. 224, 112653(2021).
  2. Grippo, A., et al. Air pollution exposure during pregnancy and spontaneous abortion and stillbirth. Rev Environ Health. 33 (3), 247-264 (2018).
  3. Tanner, J. P., et al. Associations between exposure to ambient benzene and pm2. 5 during pregnancy and the risk of selected birth defects in offspring. Environ Res. 142, 345-353 (2015).
  4. Feng, Y., et al. Global air pollution exposure and congenital anomalies: An updated systematic review and meta-analysis of epidemiological studies. Int J Environ Health Res. 34 (5), 2333-2352 (2024).
  5. Lin, Y., et al. Sources, transformation, and health implications of pahs and their nitrated, hydroxylated, and oxygenated derivatives in PM2.5 in Beijing. J Geophys Res-Atmos. 120 (14), 7219-7228 (2015).
  6. Chen, Y., et al. Determining priority sources of PM2.5-bound polycyclic aromatic hydrocarbons by their contribution to disability adjusted life years. Atmos Environ. 248, 118202(2021).
  7. Carls, M. G., et al. Fish embryos are damaged by dissolved pahs, not oil particles. Aquat Toxicol. 88 (2), 121-127 (2008).
  8. He, Y., et al. Developmental toxicity of the organic fraction from hydraulic fracturing flowback and produced waters to early life stages of zebrafish (Danio rerio). Environ Sci Technol. 52 (6), 3820-3830 (2018).
  9. Ren, F., et al. AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Sci Total Environ. 719, 135097(2020).
  10. Manjunatha, B., Deekshitha, B., Seo, E., Kim, J., Lee, S. J. Developmental toxicity induced by particulate matter (PM2.5) in zebrafish (Danio rerio) model. Aquat Toxicol. 238, 105928(2021).
  11. Chen, J., Zhang, M., Aniagu, S., Jiang, Y., Chen, T. PM2.5 induces cardiac defects via AHR-SIRT1-PGC-1α mediated mitochondrial damage. Environ Toxicol Pharmacol. 106, 104393(2024).
  12. Zhang, H., et al. Crosstalk between AHR and Wnt/β-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Toxicology. 355, 31-38 (2016).
  13. González-Curbelo, M., et al. Evolution and applications of the QuECHERS method. TrAC Trends Anal Chem. 71, 169-185 (2015).
  14. Wilkowska, A., Biziuk, M. Determination of pesticide residues in food matrices using the qQuECHERS methodology. Food Chem. 125 (3), 803-812 (2011).
  15. Zhao, C., et al. Acute toxicity and bioconcentration of pyrimorph in zebrafish, Brachydanio rerio. Pest Manag Sci. 67 (9), 1178-1183 (2011).
  16. Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2019).
  17. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).
  18. Ji, C., et al. AHR-mediated m6A RNA methylation contributes to PM2.5-induced cardiac malformations in zebrafish larvae. J Hazard Mater. 457, 131749(2023).
  19. Alegbeleye, O. O., Opeolu, B. O., Jackson, V. A. Polycyclic aromatic hydrocarbons: A critical review of environmental occurrence and bioremediation. Environ Manage. 60 (4), 758-783 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

גילוי PAHהכנת דגימהגלאי פלואורסצנציהגלאי מערך דיודותחומר אורגני נשלףרעילות התפתחותית
שיטת QuEChERS-HPLC שונה לזיהוי פחמימנים ארומטיים פוליציקליים בעוברי דג זברה שנחשפו לחלקיקים עדינים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.