Method Article

שיטה בעלת תפוקה גבוהה להתבוננות בפנוטיפים של תנועתיות ב-Pseudomonas aeruginosa

DOI:

10.3791/67761

⸱

June 20th, 2025

 , 
1Département de biologie, Faculté des sciences, Université de Sherbrooke

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג שיטה מהירה ויעילה לזיהוי גורמים גנטיים המעורבים בסוגים שונים של תנועתיות ב-Pseudomonas aeruginosa.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התנהגויות תנועתיות ממלאות לעתים קרובות תפקיד משמעותי ביכולתו של חיידק לנצל את המשאבים הזמינים בסביבתו. זה נכון במיוחד עבור הפתוגן הרב-תכליתי Pseudomonas aeruginosa, שיכול להפגין סוגים שונים של תנועתיות, כולל נחילים ועוויתות, שהן תכונות פתוגניות חשובות התורמות להתיישבות פני השטח, היווצרות ביופילם והתחמקות מהגנות המארח. כתב יד זה מציג פרוטוקול תנועתיות בעל תפוקה גבוהה לחקר התנהגויות התנועתיות של P. aeruginosa. הפרוטוקול מאפשר בדיקה בו-זמנית של זנים מרובים של P. aeruginosa מספריית מוטציות כלל-גנומית, למשל, כדי לזהות ולנתח את הגורמים הגנטיים המעורבים בתנועתיות שלו. הגישה מציעה אפשרות לחקור את התנועתיות בצורה מקיפה ותובנות לגבי המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התנועתיות של P. aeruginosa . ניתן גם לשנות את הפרוטוקול המתואר כאן כך שיתאים לסוגים שונים של מבחני תנועתיות כמו גם למיני חיידקים אחרים, ובכך לספק פלטפורמה רבת עוצמה לקידום ההבנה של התנהגות חיידקים בהקשרים שונים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pseudomonas aeruginosa הוא פתוגן אופורטוניסטי שיכול ליישב סביבות מגוונות בגלל הרבגוניות המטבולית המדהימה שלו 1,2. רבגוניות זו חיונית למעבר ממצב גידול פלנקטוני לביופילמים, מה שתורם ליכולתו לשגשג במגוון רחב של נישות החל ממים ועד לגוף האדם 3,4,5. המעבר בין אופני הגדילה הללו נעזר ביכולת נרחבת לנוע בסביבות אלה באמצעות סוגים שונים של תנועתיות, כולל שחייה, נחילים ועוויתות 1,6. כל סוג של תנועתיות מתווך על ידי מנגנונים ומבנים תאיים נפרדים ומאפשר ל-P. aeruginosa להגיב לרמזים סביבתיים 7,8. תנועתיות השחייה מונעת על ידי דגל קוטבי יחיד ומשמשת לתנועה דרך מדיה נוזלית לעבר חומרים מזינים, למשל9. תנועתיות נחיל היא תנועה מתואמת המתאפשרת על ידי ייצור דגלים וחומרים פעילי שטח ומאפשרת למושבות להתפשט על פני משטחים מוצקיםלמחצה 10,11. לבסוף, תנועתיות העוויתות אינה תלויה בדגלים. במקום זאת, העוויתות מתווכות על ידי פילי מסוג IV (T4P) ומשמשות לתנועה על גבי משטחים12,13. תנועתיות עוויתות תורמת גם לשלבים המוקדמים של היווצרות ביופילם של P. aeruginosa על ידי מתן הצמדה ראשונית לפני השטח. לאחר ההתקשרות הראשונית, העוויתות מאפשרות לחיידקים לנוע על פני משטחים וליצור מיקרו-מושבות, שיכולות להתפתח לאחר מכן לביופילמים בוגרים 1,4,13.

באופן מסורתי, בדיקות תנועתיות חיידקים מתבצעות בנפרד, זן אחד בכל פעם, על צלחת אגר רכה או בשיטות מיקרוסקופיה 6,14,15. מדיה מוצקה למחצה שימשה במשך שנים רבות בחקר תנועתיות חיידקים. כיום, טכניקות אלה עדיין משמשות לזיהוי פנוטיפים של תנועתיות בחיידקים. לדוגמה, באופן מסורתי, תנועתיות נחיל נצפית על ידי חיסון 2.5 מיקרוליטר של תרבית P. aeruginosa במרכז צלחת פטרי המכילה מדיה M9 בריכוז אגר של 0.5%-0.8%16. תנועתיות העוויתות נמדדת בדרך כלל על ידי התבוננות בהתפשטות החיידקים במשטח הממשק בין אגר (ב-1%) לבסיס צלחת פטרי לאחר דקירה מחסנת את P. aeruginosa דרך אמצעי התרבית. הילה גדולה של התרחבות מושבה אינטרסטיציאלית מתקבלת לאחר 48 שעות של דגירה, בעוד שזנים שאינם מתעוותים אינם מייצרים אזור כזה של התרחבות מושבה 1,17,18.

לאחרונה, גישות מוטגנזה של טרנספוזונים גילו גנים חדשים המעורבים בתנועתיות או ביצירת ביופילם ב-P. aeruginosa 19,20,21. לדוגמה, גנים חדשים המעורבים בתנועתיות עוויתות נמצאו באמצעות ספריית מוטציות טרנספוזון בצפיפות גבוהה ב-P. aeruginosa19. כלי שימושי נוסף בגנומיקה פונקציונלית הוא השימוש באוספים מוטנטיים מסודרים22,23. אוסף Keio24, המכיל מחיקות של גן בודד עבור כל הגנים הלא חיוניים ב-Escherichia coli, הוא כנראה האוסף הידוע ביותר של מוטציות ושימש להגדרת גנים המשפיעים על פנוטיפים שונים מגידול במדיה שונה25 ועד מורפולוגיה של תאים26 ועוד. אוספים כאלה זמינים גם עבור Salmonella enterica serovar Typhimurium27, Bacillus subtilis28, P. aeruginosa29 וכן מינים רבים אחרים. אוספים אלה מתאימים גם לחקר תנועתיות בצורה כלל-גנומית, מה שמוביל לפיתוח שיטה בעלת תפוקה גבוהה לחקר התנועתיות של P. aeruginosa. כאן, השיטה נבדקה על ידי הערכת התרומה של מוטציות של P. aeruginosa הן לעוויתות והן לנחילים על לוחות בצפיפות גבוהה. ניתן להשתמש בשיטה זו בעלת תפוקה גבוהה עבור פנוטיפים שונים של תנועתיות והיא מתאימה גם לחקר התנועתיות של חיידקים אחרים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: זרימת העבודה הכללית של הליך זה מתוארת באיור 1.

figure-protocol-1
איור 1: זרימת עבודה ניסויית. (1) הכינו את הכמות הדרושה של מדיית תנועתיות בהתבסס על סוג התנועתיות המעניינת בניסויים. (2) באמצעות מערכת משכפל ידנית או אוטומטית, הכינו את לוחות מלאי המקור לספריית המוטנטים של P. aeruginosa transposon של אוסף המוטאנטים בצפיפות המתאימה, עם דגש על דיוק וחיסון אחיד בכל בארות הלוחות. (3) העבר דגימות מלוחות המקור של אוסף המוטאנטים ללוחות התנועתיות. (4) לאחר הדגירה, התבוננו ונתחו פנוטיפים של תנועתיות וזהו את הגנים המעורבים בתנועתיות המעניינת באמצעות תמונות באיכות גבוהה. (5) בצע מבחני תנועתיות מסורתיים כדי לאמת את הפגיעות שזוהו באמצעות ניסויי תנועתיות בתפוקה גבוהה. נוצר באמצעות BioRender. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

צלחות נחילים - מדיה M9לוחות מתעוותים - מדיה LBלוחות מקור - מדיה LB
200 מ"ל של תמיסת מלחים 5x M910 גרם NaCl10 גרם NaCl
10 מ"ל של 20% גלוקוז10 גרם טריפטון10 גרם טריפטון
25 מ"ל חומצות קסאמינו5 גרם תמצית שמרים5 גרם תמצית שמרים
1 מ"ל של 1M MgSO410 גרם אגר15 גרם אגר
500 מ"ל של אגר 1%הוסף dH2O ל-1 ליטרהוסף dH2O ל-1 ליטר
הוסף dH2O ל-1 ליטרגנטמיצין (ריכוז סופי 15 מיקרוגרם/מ"ל)

טבלה 1: הרכב המדיה עבור הלוחות השונים המשמשים בבדיקה.

1. הכנת צלחות בינוניות לתרבות

הערה: ראה טבלת חומרים להכנת פתרונות מלאי ותנאי אחסון. יש למלא צלחות על משטח מפולס. בעת הייבוש, הצלחות צריכות להיות שטוחות על פני השטח (כלומר, לא מוערמות). זה מבטיח שמדיום התרבות בצלחת יתייבש באופן שווה. כל צלחות יוניוול עם טביעת רגל טיפוסית יכולות לעבוד, אך צלחות עם מידות פנימיות גדולות יותר (ללא קירות פנימיים), כגון צלחות Singer Instruments Plus או צלחות תרבית רקמות בודדות של VWR שאינן מטופלות, מקלות על עבודה עם צפיפות גבוהה יותר של מושבות לכל צלחת.

  1. הכינו כמות מתאימה של מדיה לניסויים לפי המתכון בטבלה 1. שמור את המדיה בטמפרטורה של ~45 מעלות צלזיוס - 50 מעלות צלזיוס כדי למנוע מהאגר להתמצק.
    1. עבור לוחות מקור, הכינו 59 LB (מרק ליזוגני) צלחות המכילות 1.5% אגר ו-15 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין, הדרוש כדי לשכפל את ספריית PA14 השלמה-59 x 25 מ"ל =~ 1500 מ"ל. הכן עוד 15 צלחות של LB 1.5% אגר ו-15 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין כדי לשדרג את הספרייה בפורמט של 384 צפיפות-15 x 25 מ"ל = ~400 מ"ל.
    2. צלחות עוויתות: אם עובדים בפורמט של 96 צפיפות, הכינו 59 צלחות עווית (LB 1% אגר). הכן 15 צלחות עווית אם עובדים בפורמט של 384 צפיפות.
    3. צלחות נחיל: הכן 15 (פורמט 384 צפיפות) או 59 (פורמט 96 צפיפות) צלחות נחיל (M9-גלוקוז 0.5% אגר)
  2. מורידים את המכסה מהצלחת ויוצקים 25 מ"ל מדיה לצלחת. פזרו את המדיה באופן שווה על פני הצלחת על ידי הרמה עדינה של כל פינה של הצלחת אחת בכל פעם. חזור על תנועת התנועה הזו 2x-3x. החזירו את המכסה לצלחת.
  3. תנו לצלחות להתמצק ולהתייבש בטמפרטורת החדר (RT) למשך הלילה. אם לא משתמשים בצלחות באופן מיידי, הכניסו אותן לשקיות הרמטיות ואחסנו אותן במקום יבש. ניתן לאחסן אותם למשך 3 שבועות.

2. הכנת לוחות המקור של ספריית המוטנטים P. aeruginosa transposon

הערה: לוחות המקור מתייחסים ללוחות LBA-gentamycin המכילים עותק של ספריית PA14 המשמשים מאוחר יותר לחיסון לוחות התנועתיות. ספריית המוטאנטים של P. aeruginosa transposon (ספריית PA14) היא קבוצה של 59 לוחות קפואים של 96 בארות29. השלבים להכנת לוחות מקור לכל פורמט מתוארים להלן. פרוטוקול זה ניתן להתאמה למעבדות שאין להן גישה למשכפל Rotor+. חוקרים יכולים לבצע בהצלחה את אותם הליכים ניסיוניים באמצעות משכפלים ידניים, כגון משכפלי 96 פינים קפיציים המשמשים כאן לשכפול הלוחות הקפואים של ספריית PA14 במהלך היום הראשון (עיין בטבלת החומרים) או כל משכפל אחר של 96 פינים. יש לעקר משכפלים ידניים ולאפשר להם להתקרר בין כל שימוש.

  1. יום 1: שכפול ספריית PA14 מ-59 לוחות 96 בארות קפואים על לוחות מקור
    1. עקר משכפל קפיצי של 96 פינים על ידי הנחתו על פלטה חמה בטמפרטורה מקסימלית למשך 8 דקות. לאחר העיקור, אפשרו למשכפל להתקרר מספיק (~10 דקות) כדי להימנע מהרג חיידקים.
    2. קח לוחית מקור אחת. בעזרת משכפל 96 פינים סטרילי, טבלו בזהירות את פיני המשכפל לתוך צלחת אחת של 96 בארות, ולאחר מכן העבירו את התאים ישירות אל פני לוחית המקור. חזור על הפעולה עד שכל 59 הלוחות הקפואים של 96 הבארות של ספריית PA14 ישוכפלו על לוחות המקור.
    3. דגרו על לוחות המקור בצפיפות 96 ב-37 מעלות צלזיוס למשך 16-18 שעות.
      הערה: אם משתמשים בשיטה בפורמט של 96 צפיפות, ניתן להשתמש בלוחות המקור הללו כדי לחסן את לוחות התנועתיות.
  2. יום 2: שינוי קנה המידה מתבנית של 96 צפיפות לתבנית של 384 צפיפות
    הערה: ניתן לדלג על יום 2 אם עובדים בצפיפות 96.
    1. לאחר הדגירה, השאירו את הצלחות (שטוחות על משטח, לא מוערמות) בטמפרטורת החדר (~1 שעה) להתקרר. אם יש עיבוי על המכסים, הסר את העיבוי באמצעות מגבון משימה עדין כדי למנוע טיפות מים ליפול על הצלחות, מה שעלול לגרום לזיהום צולב בין מושבות.
    2. הגדר את המשכפל עם הפרמטרים הבאים כדי להבטיח העברת מושבה מדויקת. הפעל את המשכפל. בסעיף בחר מצב הפעלה, בחר בחר והפעל תוכניות מאוחסנות.
    3. בסעיף בחר לוחות מקור, בחר PlusPlate 96 Agar. בסעיף בחר לוחות יעד, בחר PlusPlate 384 Agar. במקטע בחירת פדים, בחר סיכה קצרה 96.
    4. בסעיף שכפול אפשרויות תוכנית, בחר כללי ולחץ על מיחזור > ללא.
    5. בקטע מקור, בחר היסט ולחץ על אקראי > רדיוס ברירת מחדל. במקטע יעד, בחר הצמדה והתאם את הלחץ ל- 20%. השאר את כל ההגדרות האחרות כברירת מחדל.
    6. הכנס את ה-Short Pin RePads 96 לתא המתאים.
    7. מקם את לוחות המקור והיעד על הפלטפורמה הייעודית של המשכפל. הנח את לוחות המקור בצפיפות 96 (לוחות 1, 2, 3 ו-4) ואת לוחית המקור הריקה החדשה (לוחות LBA) על הפלטפורמה. באמצעות הפרמטרים שנבחרו, רובוט הצמדת המערך המיקרוביאלי יעביר מושבות מהלוחות בצפיפות 96 לצלחת החדשה בצפיפות 384. לחץ על הפעל.
    8. החלף את כל הלוחות על הפלטפורמה (ארבעת לוחות המקור הבאים בצפיפות 96 ולוחית מקור ריקה חדשה) וחזור על הפעולה עד שכל הלוחות הוגדלו. עבור סט הצלחות האחרון, השתמש בלוחות 57, 58, 59 ו-1. כל לוח בעל 384 צפיפות יהיה מורכב ממושבות מתחלפות מארבע לוחות בצפיפות 96 (ראו איור 2). דגרו את לוחות ה-LBA בצפיפות 384 ב-37 מעלות צלזיוס למשך 16-18 שעות.
      הערה: לאחר מכן ניתן להשתמש בלוחות מקור אלה בצפיפות 384 כדי לחסן את לוחית התנועתיות לביצוע הפרוטוקול בצפיפות 384. בכל שלב לאחר הדגירה ניתן לאחסן צלחות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד 3 שבועות.

figure-protocol-2
איור 2: הגדלת קנה מידה מלוחות בצפיפות 96 ללוחות בצפיפות 384. מושבות מארבע לוחות מקור בצפיפות 96 מועברות ומתמזגות ללוח יחיד בצפיפות 384. כל רבע של הלוח בעל צפיפות 384 מתאים לאחד מלוחות 96 הבארות המקוריים (אדום, כחול, צהוב וירוק), ושומר על המיקום של כל מוטאנט. נוצר באמצעות BioRender. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

3. ניסוי תנועתיות בתפוקה גבוהה

הערה: הפרוטוקול בוצע כאן בפורמט של 384 צפיפות, אך ניתן להתאים את אותו פרוטוקול לפורמט של 96 צפיפות על ידי שינוי הפרמטרים על המשכפל להעברה מלוחות מקור ללוחות תנועתיות באמצעות בחירת 96 במקום 384.

  1. לאחר הדגירה, השאירו את הצלחות (שטוחות על משטח, לא מוערמות) בטמפרטורת החדר (~1 שעה) להתקרר. אם מתרחש עיבוי על המכסים, הסר אותו באמצעות מגבון משימה עדין כדי למנוע טיפות מים ליפול על הצלחות, מה שעלול לגרום לזיהום צולב בין מושבות.
  2. תפוס את המספר המתאים של צלחות (59 לפורמט של 96 צפיפות או 15 לפורמט של 384 צפיפות) לבדיקה הרצויה: צלחות M9-גלוקוז 0.5% אגר לנחיל, LB ו-1% אגר צלחות לעוויתות.
  3. הגדר את המשכפל עם הפרמטרים הבאים כדי להבטיח העברת מושבה מדויקת.
    1. הפעל את המשכפל. בסעיף בחר מצב הפעלה, בחר בחר והפעל תוכניות מאוחסנות. בסעיף בחר לוחות מקור, בחר PlusPlate 384 Agar.
    2. בסעיף בחר לוחות יעד, בחר PlusPlate 384 Agar. במקטע בחירת פדים, בחר סיכה קצרה 384. במקטע שכפול אפשרויות תוכנית, בחר כללי > מיחזור > ללא.
    3. בתוכניות Singer, בחר שכפל רבים.
    4. במקטע Source, בחר Offset > Random > Default Radius. במקטע יעד, בחר הצמדה והתאם את הלחץ ל-2%. השאר את כל ההגדרות האחרות כברירת מחדל.
  4. הכנס את ה-Short Pin RePads 384 לתא המתאים.
  5. מקם את לוחות המקור והיעד על הפלטפורמה הייעודית של המשכפל. הנח את לוחות המקור בצפיפות 384 ואת לוחות התנועתיות הריקים על הרציף. לחץ על הפעלה באמצעות הפרמטרים שנבחרו, רובוט הצמדת המערך המיקרוביאלי יעביר מושבות מלוחות המקור בצפיפות 384 ללוחות התנועתיות. כל לוח בצפיפות 384 יהיה מורכב מעותק מלוח מקור אחד בצפיפות 384.
  6. ודא שההעברה אחידה ושכל המושבות מוצמדות כראוי למשטח האגר של לוחות התנועתיות. שים את צלחות התנועתיות המחוסנות בשקיות ניילון. הנח בזהירות את השקיות המכילות את הצלחות לתוך אינקובטור המוגדר ל -37 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות.
    הערה: הצלחות מונחות בשקיות כדי לשמור על לחות ולמנוע ייבוש לא אחיד. מניחים את הצלחות בחממה כשהמכסים פונים כלפי מעלה.
  7. לאחר הדגירה, בדוק את לוחות התנועתיות אם יש צמיחה אחידה של מושבה והיעדר זיהום.
  8. יום 3: הדמיית לוחות תנועתיות
    הערה: ה-Singer Instruments PhenoBooth משמש לצילום תמונות ברזולוציה גבוהה של לוחות התנועתיות. הוא משתמש במצלמה ברמה מדעית ומייצר תמונות של 23 מגה-פיקסל. הוא כולל חמישה ערוצי תאורה כדי ללכוד תמונות ברזולוציה גבוהה של מושבות מצלחות פטרי וצלחות מלבניות. גם מצלמות איכותיות אחרות עובדות.
    1. לאחר תקופת הדגירה, לוחות התנועתיות מוכנים לתהליך ההדמיה. הפעל את Phenobooth ולחץ על הסמל המתאים לתוכנת Phenobooth.
    2. נפתח דף בחירת פרוייקט; לחץ על פרויקט חדש > ספירת מושבות. בחר את הרצוי file נתיב כדי לאחסן את התמונות ב מיקום שדה. בשדה רזולוציה, בחר 5626 x 4220. נקישה אישור, המכשיר מוכן כעת לצילום.
    3. הכנס את הצלחת לקורא כשהצד הבינוני כלפי מעלה לאחר הסרת המכסה. ודא שהצלחת ממוקמת כהלכה לפני סגירת הקורא כדי למנוע חסימת הצלחת.
    4. הגדר את הפרמטר לאור לבן בכרטיסייה תאורה. לחצו על תצוגה מקדימה. התאם את הגדרות החשיפה בכרטיסיית ההגדרות של PhenoBooth כדי לקבל את הפרמטרים האופטימליים להתבוננות בפנוטיפים של תנועתיות.
    5. לחץ על רכישה; התמונות שצולמו יופיעו בצד שמאל של המסך. לאחר שתסיים, סגור את התוכנה (כל התמונות שצולמו יישמרו בקובץ שנבחר קודם לכן בכרטיסייה מיקום).
      הערה: Phenobooth שומר תמונות בפורמט JPEG, אך עבור שלבי הניתוח במורד הזרם, התמונות יכולות להיות בפורמט TIFF, JPEG או PNG.

4. ניתוח פנוטיפים של תנועתיות

הערה: ניתוח התמונה מבוצע כמתואר בפירוט על ידי French et al.30,31. קובץ Script לביצוע ניתוח נתונים זמין מ-31 (ImageJ Macro).

  1. בקצרה, התמונות מעובדות ב-ImageJ32, מה שמייצר ערך עבור כל מושבה על לוחית התנועתיות. ראשית, המירו תמונות לפורמט של 8 סיביות, ופלחו את המושבות ואזורי התנועתיות המשויכים אליהן מהרקע באמצעות פקודת הסף. צייר אזור עניין (ROI) סביב כל מושבה ומדוד את אזור התנועתיות. פעולה זו יוצרת טבלה המכילה ערך צפיפות משולב עבור כל באר, המאורגן לפי שורות. ניתן לשמור טבלה זו כקובץ CSV להמשך ניתוח.
    1. הפעל את המאקרו ב-ImageJ ופתח את התיקיה המכילה את התמונות.
    2. כשתתבקשו, התאימו את סיבוב הלוח באמצעות שינוי זווית הלוח באמצעות האפשרות Preview כך שהלוח יהיה ישר. כשהפונקציה מרוצה, לחצו על הלחצן 'אשר '.
    3. לאחר מכן, הזיזו את המלבן סביב המושבות והשתמשו בו כדי לחתוך את החלק של הצלחת המכיל את המושבות. כשתהיה מוכן, לחץ על כפתור אישור .
    4. ההנחיה הבאה תגדיר את הרשת המשמשת לציור החזר ROI סביב כל מושבה ולמדידת אזור התנועתיות. בחר את צפיפות המושבה המתאימה. התאימו את הפרמטרים השונים במידת הצורך, כך שכל עיגול יהיה סביב מושבה. כשתהיה מוכן, הפעל את ה-Okay? ולחץ על הלחצן אישור . זה ימדוד את שטח התנועתיות עבור כל מושבה וישמור קובץ CSV בתיקייה המכילה את הנתונים.
  2. שלב קובץ CSV זה עם מקרא הלוח, המאורגן גם הוא לפי שורות, כדי לזהות כל אזור תנועתיות עם המוטאנט המתאים. ערכי צפיפות משולבים נמוכים יותר תואמים את המוטציות שהיו לא תנועתיות או הראו ירידה בתנועתיות.

5. מבחני תנועתיות מסורתיים לאימות פגיעות

הערה: לאחר התבוננות במוטציות עם תנועתיות מושפעת בפרוטוקול התנועתיות בתפוקה גבוהה, חשוב לאמת את הלהיטים המתקבלים בנפרד. פרוטוקול התנועתיות האישי שונה מזה המשמש לבדיקות תפוקה גבוהה, אך המדיה המשמשת זהה.

  1. בדיקת תנועתיות נחיל
    הערה: תנועתיות הנחיל מבוצעת כמתואר בפירוט על ידי Ha et al.16.
    1. בקצרה, חיטוי תמיסת אגר עם M9 (0.5% אגר), גלוקוז, חומצות קסאמינו ו-MgSO4. יוצקים את האגר המקורר והמעורב לצלחות פטרי (25 מ"ל לצלחת).
    2. יש לחסן ב-2.5 מיקרוליטר של תרבית חיידקים למשך הלילה. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות כשהעפעפיים פונים כלפי מעלה כדי להתבונן בפנוטיפים של תנועתיות.
  2. בדיקת תנועתיות עוויתות
    הערה: תנועתיות העוויתות מבוצעת כמתואר בפירוט על ידי Haley et al.33,34.
    1. בקצרה, אוטוקלאב אגר LB 1% (ראה טבלה 1). יוצקים את אגר LB 1% מקורר ומעורבב לצלחות פטרי (25 מ"ל לצלחת).
    2. דקירה של חיידקים לתחתית צלחות עוויתות (1% אגר). דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות ולאחר מכן ב-RT למשך 48 שעות נוספות. הסר את האגר מהצלחת ודמיין את אזור העוויתות על ידי צביעת צלחת הפטרי בסגול קריסטל 1%.
    3. צלם את צלחות הפטרי באמצעות PhenoBooth עם אותם פרמטרים המתוארים בשלב 3.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לאפיין את ההשפעה של השבתת גנים על התנועתיות של P. aeruginosa בתפוקה גבוהה. כאן, פירטנו את השימוש בו כדי לחקור את תנועתיות הנחילים והעוויתות באוסף מחיקה כלל-גנומי של P. aeruginosa זן PA14 (ספריית PA14). הפרוטוקול מציע צדדיות רבה וקלות שימוש, ומאפשר שינויים בשלבים שונים של הפרוטוקול, כגון שימוש במדיות תרבות שונות או אוספים מוטנטיים.

המוטאנטים קיבלו ניקוד על סמך אזור התנועתיות שלהם. רוב המוטאנטים בצלחת לא ישפיע...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול התנועתיות בעל התפוקה הגבוהה המתואר כאן מאפשר לנו לעבד ולנתח את פנוטיפ התנועתיות של מושבות רבות בדיוק וביכולת שחזור. בהשוואה לשיטות ידניות מסורתיות, גישה חצי אוטומטית זו מגדילה את יכולת ההרחבה והתפוקה של מבחני תנועתיות כדי לאפשר הערכה כלל-גנומית של תנועתיות חיידקים. הפרוטוקול עבר אופטימיזציה לשימוש עם ספריית PA14, אך ניתן להשתמש בבדיקה זו עם כל ספרייה מסודרת של מוטאנטים, כגון אוסף Keio עבור E. coli24 או אוסף SGD עבור Salmonella enterica s...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים לא מצהירים על גילוי נאות.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למעבדת סורט באוניברסיטת מקמאסטר על שסיפקה עותק של ספריית PA14. אנו מודים לד"ר פבריס ז'אן-פייר על הערותיו המועילות על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (RGPIN-2019-06044) ומענק התחלתי לחוקרים חדשים מ-Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS; #295613). J.-P.C. מחזיקה במלגת Chercheur boursier Junior 2 מטעם Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96 לוחות באר   קורנינג   3701 
אגר פישר סיינטיפיק    BP1423-2 ריכוז סופי של 0.5% לתנועתיות הלהקה או 1% לתנועתיות מתנדנדת בהתאמה.
חומצות קזאמינו    פישר סיינטיפיק    223050 הכין מלאי של 20% מים. מסנן מחטא עם 0.22 & mu; m מסנן ומאוחסן ב-4 &מעלות צלזיוס. ריכוז סופי 0.5% ב-M9 מינימום בדיוק.
קריסטל ויולט  ביולוגיה בסיסית    CB0331הכינו תמיסה של 1% במים.
D-Glucose   ביולוגיה בסיסית    GB0219 הכינו מלאי של 20% (1.1 מ') במים ועקרו על ידי אוטוקלב. ריכוז סופי 0.2% במדיום מינימלי M9. 
פילטרופור S 0.2 סארשטד 83.1826.001
גנטמיצין סולפט   ביולוגיה בסיסית    GB0217 הכינו ציר של 30 מ"ג/מ"ל במים. מסנן מחטא עם 0.22 & mu; M מסנן ואחסן ב-4 ° C & ndash; ריכוז סופי בלוחות 15 ומיקרו; ג/מ..    
לולאת חיסון ומחט פישר סיינטיפיק  22363597
M9 Minimal Salts, 5X פישר סיינטיפיק  248510הכינו מלאי של 1 מטר במים ועקרו באמצעות אוטוקלאב. ריכוז סופי 1 מ״מ במדיום המינימלי M9.    
מגנזיום סולפט (MgSO4)   פישר סיינטיפיק  M63-500  הכינו מלאי של 1 מטר MgSO4 במים. מסנן מחטא עם 0.22 & mu; מסנן M ואחסן בטמפרטורת החדר. ריכוז סופי  
ספריית מוטנטים להחדרת טרנספוזונים PA14   ליברטי ואח', 2006 (ראו רפרנס 29)59 לוחות עם 96 בארות לכל האוסף. כל באר מכילה מוטנט יחיד ב-LB עם 25% גליצרול.
צלחת פטרי 92x16mm סארשטד 82.1473.001
PhenoBooth+ Singer Instruments https://www.singerinstruments.com/solution/phenobooth/specification/ המיס 11.3 גרם מהאבקה ב-200 מ"ל מים מטוהרים. אוטוקלאב ב-121 & דרג; C ל-15 דקות 
מזרק פלסטיק 10 מ"ל פישר סיינטיפיק  14955459
Rotor+     Singer Instruments https://www.singerinstruments.com/resource/rotor-had/ 
Short pin RePads 384 צפיפויות  Singer Instruments   REP-004 
פינים קצרים RePads 96 צפיפויות    Singer Instruments   REP-002 
נתרן כלוריד (NaCl)   פישר סיינטיפיק  BP358-212 
משכפל 96 פינים עם קפיץEnzyScreen   CR1000 
להב ניתוח מנירוסטה מס' 25 פישר סיינטיפיק  08-918-5F
Tryptone Oxoid   LP0042B 
לוחות יוניוולSinger Instruments   פלוסטס: PLU-003   מימד הלוח: 54 פעמים; 34 & פעמים; 38 ס"מ - ללא קירות פנימיים, שמספקים מידות פנימיות גדולות יותר. 
לוחות יוניוולVWRלוחות תרבית רקמה לבאר אחת: 75780-348אותם מידות כמו ה-PlusPlates.
תמצית שמרים פישר סיינטיפיק  248510 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Burrows, L. L. Pseudomonas aeruginosa twitching motility: type IV pili in action. Annu Rev Microbiol. 66, 493-520 (2012).
  2. Khan, F., Pham, D. T. N., Oloketuyi, S. F., Kim, Y. M. Regulation and controlling the motility properties of Pseudomonas aeruginosa. Appl Microbiol Biotechnol. 104 (1), 33-49 (2020).
  3. Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa new insights into pathogenesis and host defenses. Pathog Dis. 67 (3), 159-173 (2013).
  4. Ribbe, J., Baker, A. E., Euler, S., O'Toole, G. A., Maier, B. Role of cyclic Di-GMP and exopolysaccharide in type IV pilus dynamics. J Bacteriol. 199, e00859-e00916 (2017).
  5. Arora, S. K., Neely, A. N., Blair, B., Lory, S., Ramphal, R. Role of motility and flagellin glycosylation in the pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa burn wound infections. Infect Immun. 73 (7), 4395-4398 (2005).
  6. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
  7. Limoli, D. H., et al. Interspecies interactions induce exploratory motility in Pseudomonas aeruginosa. eLife. 8, e47365(2019).
  8. Breidenstein, E. B. M., Fuente-Núñez, C., de la Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa: all roads lead to resistance. Trends Microbiol. 19 (8), 419-426 (2011).
  9. Toutain, C. M., Zegans, M. E., O'Toole, G. A. Evidence for two flagellar stators and their role in the motility of Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187 (2), 771-777 (2005).
  10. Köhler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pechère, J. C. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and requires flagella and pili. J Bacteriol. 182 (21), 5990-5996 (2000).
  11. Tremblay, J., Richardson, A. P., Lépine, F., Déziel, E. Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour. Environ Microbiol. 9 (10), 2622-2630 (2007).
  12. Kühn, M. J., et al. Mechanotaxis directs Pseudomonas aeruginosa twitching motility. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (30), e2101759118(2021).
  13. Talà, L., Fineberg, A., Kukura, P., Persat, A. Pseudomonas aeruginosa orchestrates twitching motility by sequential control of type IV pili movements. Nat Microbiol. 4 (5), 774-780 (2019).
  14. Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility. J Bacteriol. 31 (6), 575-580 (1936).
  15. Turnbull, L., Whitchurch, C. B. Motility assay: Twitching motility. Methods Mol Biol. 1149, 73-86 (2014).
  16. Ha, D. -G., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa. Methods Mol Biol. 1149, 67-72 (2014).
  17. Semmler, A. B. T., Whitchurch, C. B., Mattick, J. S. A re-examination of twitching motility in Pseudomonas aeruginosa. Microbiology. 145 (Pt 10), 2863-2873 (1999).
  18. Henrichsen, J. Twitching Motility. Annu Rev Microbiol. 37, 81-93 (1983).
  19. Nolan, L. M., et al. A global genomic approach uncovers novel components for twitching motility-mediated biofilm expansion in Pseudomonas aeruginosa. Microb Genom. 4 (11), e000229(2018).
  20. Overhage, J., Lewenza, S., Marr, A. K., Hancock, R. E. W. Identification of genes involved in swarming motility using a Pseudomonas aeruginosa PAO1 mini-Tn5-lux mutant library. J Bacteriol. 189 (5), 2164-2169 (2007).
  21. De Bleeckere, A., et al. High throughput determination of the biofilm prevention concentration for Pseudomonas aeruginosa biofilms using a synthetic cystic fibrosis sputum medium. Biofilm. 5, 100106(2023).
  22. Brochado, A. R., Typas, A. High-throughput approaches to understanding gene function and mapping network architecture in bacteria. Curr Opin Microbiol. 16 (2), 199-206 (2013).
  23. Hertzberg, R. P., Pope, A. J. High-throughput screening: new technology for the 21st century. Curr Opin Chem Biol. 4 (4), 445-451 (2000).
  24. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol. 2, 2006.0008(2006).
  25. Tong, M., et al. Gene dispensability in Escherichia coli grown in thirty different carbon environments. mBio. 11 (6), e02259-e02320 (2020).
  26. French, S., Côté, J. P., Stokes, J. M., Truant, R., Brown, E. D. Bacteria getting into shape: genetic determinants of E. coli morphology. mBio. 8, e01977-e02016 (2017).
  27. Porwollik, S., et al. Defined single-gene and multi-gene deletion mutant collections in Salmonella enterica sv Typhimurium. PLoS One. 9 (7), e99820(2014).
  28. Koo, B. M., et al. Construction and analysis of two genome-scale deletion libraries for Bacillus subtilis. Cell Syst. 4 (3), 291-305.e7 (2017).
  29. Liberati, N. T., et al. An ordered, nonredundant library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 transposon insertion mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (8), 2833-2838 (2006).
  30. French, S., et al. A robust platform for chemical genomics in bacterial systems. Mol Biol Cell. 27 (6), 1015-1025 (2016).
  31. French, S., Guo, A. B. Y., Brown, E. D. A comprehensive guide to dynamic analysis of microbial gene expression using the 3D-printed PFIbox and a fluorescent reporter library. Nat Protoc. 15 (2), 575-603 (2020).
  32. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  33. Haley, C. L., Kruczek, C., Qaisar, U., Colmer-Hamood, J. A., Hamood, A. N. Mucin inhibits Pseudomonas aeruginosa biofilm formation by significantly enhancing twitching motility. Can J Microbiol. 60 (3), 155-166 (2014).
  34. Déziel, E., Comeau, Y., Villemur, R. Initiation of biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa 57RP correlates with emergence of hyperpiliated and highly adherent phenotypic variants deficient in swimming, swarming, and twitching motilities. J Bacteriol. 183 (4), 1195-1204 (2001).
  35. Gao, P., et al. oprC impairs host defense by increasing the quorum-sensing-mediated virulence of Pseudomonas aeruginosa. Front Immunol. 11, 1696(2020).
  36. Rosenau, F., et al. Lipase LipC affects motility, biofilm formation and rhamnolipid production in Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiol Lett. 309 (1), 25-34 (2010).
  37. Anyan, M. E., et al. Type IV pili interactions promote intercellular association and moderate swarming of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (50), 18013-18018 (2014).
  38. Burdman, S., Bahar, O., Parker, J. K., De La Fuente, L. Involvement of type IV pili in pathogenicity of plant pathogenic bacteria. Genes. 2 (4), 706-735 (2011).
  39. Lewis, K. A., et al. Nonmotile subpopulations of Pseudomonas aeruginosa repress flagellar motility in motile cells through a type IV pilus- and pel-dependent mechanism. J Bacteriol. 204 (5), e00528-e00621 (2022).
  40. Chang, C. Y. Surface sensing for biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa. Front. Microbiol. 8, 2671(2018).
  41. Zegadło, K., et al. Bacterial motility and its role in skin and wound infections. Int J Mol Sci. 24 (2), 1707(2023).
  42. Jurado-Martín, I., Sainz-Mejías, M., McClean, S. Pseudomonas aeruginosa: An audacious pathogen with an adaptable arsenal of virulence factors. Int J Mol Sci. 22 (6), 3128(2021).
  43. Qin, S., et al. Pseudomonas aeruginosa: pathogenesis, virulence factors, antibiotic resistance, interaction with host, technology advances and emerging therapeutics. Sig Transduct Target Ther. 7 (1), 199(2022).
  44. Piskovsky, V., Oliveira, N. M. Bacterial motility can govern the dynamics of antibiotic resistance evolution. Nat Commun. 14 (1), 5584(2023).
  45. Xu, J., Koizumi, N., Nakamura, S. Crawling motility on the host tissue surfaces is associated with the pathogenicity of the zoonotic spirochete Leptospira. Front Microbiol. 11, 1886(2020).
  46. Rasmussen, L., et al. A high-throughput screening assay for inhibitors of bacterial motility identifies a novel inhibitor of the Na+-driven flagellar motor and virulence gene expression in Vibrio cholerae. Antimicrob Agents Chemother. 55 (9), 4134-4143 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Pseudomonas AeruginosaBacterial MotilitySwarming MotilityTwitching MotilityHigh Throughput ProtocolMotility AssayGenome Wide MutantBiofilm FormationColony Pinning RobotImageJ Analysis

Related Articles