Method Article

אופטימיזציה של אספקת שלפוחית חוץ-תאית באמצעות פיגום מודפס בתלת-ממד במעטפת ליבה לטיפול בפצעים כרוניים

DOI:

10.3791/67764

⸱

February 28th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Stem Cell and Regenerative Medicine, Natural and Medical Sciences Research Center, University of Nizwa, 2Doctoral Programme in Biomedicine, Faculty of Medicine, University of Helsinki

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מציג פרוטוקול לייצור פיגומים מודפסים בתלת מימד בתלת מימד לריפוי פצעים כרוניים. שלפוחיות חוץ-תאיות מבודדות מתאי גזע מזנכימליים, ונטענות לתוך הליבה (אלגינט) עם המעטפת העשויה מתאית קרבוקסימתיל ואלגינט ליאז. עיצוב זה מאפשר פירוק פיגומים מבוקר ושחרור יעיל של רכבים חשמליים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מתאר פרוטוקול מפורט לייצור פיגומים מודפסים בתלת מימד במעטפת הליבה שנועדו לשפר את ריפוי הפצעים הכרוניים. הפרוטוקול כולל בידוד שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) מתאי גזע מזנכימליים (MSCs), הידועים בתכונות ההתחדשות והאימונומודולטוריות שלהם. רכבים חשמליים אלה משולבים לאחר מכן במבנה פיגומים ייחודי. הפיגום כולל ליבה המורכבת מאלגינט עמוס ברכבים חשמליים, מוקף במעטפת העשויה מקרבוקסימתיל צלולוז ואלגינט ליאז. עיצוב חדשני זה מבטיח פירוק פיגומים מבוקר תוך קידום שחרור יעיל ומבוקר של רכבים חשמליים באתר הפצע. הפרוטוקול מכסה שלבים מרכזיים, כולל הכנה ואפיון של הרכבים החשמליים, ניסוח דיו ביולוגי להדפסה ביולוגית תלת מימדית ואופטימיזציה של פרמטרי הדפסה להשגת ארכיטקטורת מעטפת הליבה הרצויה. על ידי שילוב של שלמות מבנית ופעילות ביולוגית, הפיגום שואף לטפל במגבלות של חבישות פצעים קונבנציונליות, ומציע גישה ממוקדת להאצת התחדשות רקמות ולהפחתת דלקת בפצעים כרוניים. שיטה זו מספקת אסטרטגיה ניתנת לשחזור וניתנת להרחבה לפיתוח ביו-חומרים מתקדמים עם יישומים קליניים פוטנציאליים בטיפול בפצעים כרוניים. הפרוטוקול גם מדגיש שיקולים קריטיים להשגת תוצאות עקביות, ומבטיח יכולת הסתגלות ליישומים טיפוליים עתידיים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פצעים כרוניים, הקשורים לעתים קרובות לדלקת יתר, דורשים טיפול בזמן כדי למנוע סיבוכים חמורים כמו זיהומים ונמק רקמות, שעלולים להוביל לקטיעות. למרות ההתקדמות, הטיפולים הנוכחיים נותרו יקרים, לא נוחים, בעלי תופעות לוואי ויעילות מוגבלת, מה שמדגיש את הצורך בחבישות מרפאות יותר 1,2,3. פיתוח דור חדש של חבישות פצעים שתוכננו במיוחד לפצעים כרוניים חיוני כדי להתמודד עם אתגרים אלה. יתרה מכך, האופי המורכב של ריפוי פצעים דורש חומרי חבישה בעלי מגוון תכונות, כולל לחות, גמישות, הידבקות, פעילות ביולוגית והתכלות4. מחקר זה נועד לפתח חבישת פצעים מהונדסת ביולוגית המשלבת שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) עם פיגום מודפס בתלת מימד כדי לספק סביבה טיפולית מבוקרת ולהאיץ ריפוי פצעים כרוניים.

EVs שמקורם בתאי גזע מסייעים לריפוי פצעים כרוניים על ידי קידום תגובות אנטי דלקתיות, צמיחת תאים, נדידה ויצירת כלי דם5. בנוסף, EVs יכולים לספק מולקולות ביו-אקטיביות, כולל תרופות מולקולות קטנות, מבנים של גנים וחלבונים לניהול פצעים כרוניים6. יתר על כן, יכולתם להגן על מטען מפני פירוק אנזימטי משפרת את היציבות והזמינות הביולוגית של חומרים טיפוליים, ומציעה יתרונות מובהקים על פני גורמי גדילה קונבנציונליים ותרופות מולקולות קטנות, שלעתים קרובות מתפרקות במהירות in vivo7. למרות היתרונות הללו, אספקה יעילה ומתמשכת של רכבים חשמליים לרקמות מטרה נותרה אתגר משמעותי.

פיגומים להדפסה ביולוגית בתלת מימד יכולים לשמש כפלטפורמת אספקה לרכבים חשמליים כדי להגביר את ההשפעות הטיפוליות שלהם8. פיגומים אלה מחקים סביבות תאיות טבעיות ומאפשרים שחרור מבוקר של EVs 9,10. הם גם מגנים על EVs מפני פירוק, ומשפרים את יציבות המיקרו-RNA והחלבונים שלהם11. האן ועמיתיו הראו כי ניתן לשחרר EVs ביעילות מפיגומי GelMA מודפסים ביולוגית בתלת מימד. שחרור זה הוביל לשיפור בחיבור התאים ולביטוי גנים משופר הקשור למסלולי טרנסדוקציה מכנית בתאי גזע מזנכימליים של כרית שומן בוקאלי אנושי (hBFP-MSCs) שנזרעו על הפיגומים12. בורן ועמיתיו, על ידי אופטימיזציה של ריכוז ה-crosslinker, השיגו שחרור מבוקר של ה-EVs. גישה זו הוכיחה יעילות בקידום אנגיוגנזה ומציעה שיטה מבטיחה לאספקה מוסדרת של EVs13.

הדפסה ביולוגית תלת מימדית במעטפת הליבה מאפשרת יצירת מבנים מורכבים ומרובי חומרים על ידי הדפסת חומר ליבה עטוף בנדן. הליבה יכולה לכלול תאים, גורמי גדילה או תרופות, בעוד שהמעטפת מציעה תמיכה מכנית והגנה או פועלת כמחסום. לשיטה זו יש יישומים בהנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית, כגון פיתוח רשתות כלי דם, חיקוי מבני רקמה טבעיים ויצירת מערכות אספקת תרופות. זה מאפשר שליטה מדויקת על חלוקת החומרים והרכבם, ומשפר את הפונקציונליות והרלוונטיות הביולוגית של המבנים. בהשוואה לטכניקות חלופיות, הדפסה ביולוגית תלת מימדית של מעטפת הליבה מספקת שליטה מדויקת על חלוקת החומרים והרכבם, ומשפרת את הפונקציונליות והרלוונטיות הביולוגית של המבנים14,15.

פירוק מהונדס בחבישות פצעים מציע יתרונות כגון הפחתת אי נוחות במהלך שינויים, סביבה לחה לריפוי ובקרת זיהומים, אספקה טיפולית בזמן והתחדשות רקמות אופטימלית 16,17,18. הידרוג'לים של אלגינט (Alg) וקרבוקסימתיל צלולוז (CMCh) תואמים ביולוגית ויעילים להעברת שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) לפצעים, משפרים את הריפוי באמצעות תקשורת תאית והפחתת דלקות18. במחקר זה, רכבים חשמליים שולבו בליבה של Alg, בעוד שנדן של CMCh ו-AlgLyase (AlgLyase) שימש כדי לאפשר פירוק מהיר של חבישה ואספקת EVs. עיצוב מעטפת ליבה זה מקל על שחרור מהיר של EVs בתגובה לפירוק פיגומים, משפר את יעילותם הטיפולית ומתייחס למגבלות הטיפולים הקיימים בפצעים כרוניים. המטרה העיקרית של מחקר זה היא לפתח חבישה מהונדסת ביולוגית המשפרת את ריפוי הפצעים על ידי שילוב שחרור EVs מבוקר עם פיגום מתכלה מגיב, ובסופו של דבר לשפר את תוצאות הטיפול בפצעים כרוניים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר בבעלי חיים נערך בהתאמה מלאה לסטנדרטים האתיים שנקבעו על ידי הוועדה הלאומית לביואתיקה וועדת האתיקה של בעלי חיים של אוניברסיטת ניזווא. אישור אתי למחקר זה ניתן תחת אישור ID: VCGSR, AREC/01/2023. כל בעלי החיים שוכנו בתנאי מעבדה סטנדרטיים, מה שמבטיח בקרות סביבתיות אופטימליות, תזונה נכונה וטיפול מקיף כדי לשמור על רווחתם לאורך כל המחקר. כל הנהלים הנוגעים לבעלי חיים עמדו בקפדנות במדיניות המוסדית, בתקנים הבינלאומיים לטיפול בבעלי חיים ובהנחיות ARRIVE.

1. תרבית תאים

  1. אחזר בקבוקון של MSCs (מעבר #2) מאחסון חנקן נוזלי וטפל בו בטכניקות אספטיות למניעת זיהום. הפשירו במהירות את התאים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס, והקפידו להסיר אותם ברגע שנשאר שבר קרח קטן.
  2. יש להכין מדיום שלם הכולל MSC SFM Basal Medium, בתוספת תוסף MSC SFM XenoFree של 1% (v/v), 1% (v/v) GlutaMAX ו-0.01% (v/v) גנטמיצין. מוסיפים לבקבוקון 1 מ"ל בינוני מלא שחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) בקצב של 3 עד 5 טיפות כל 5 שניות, ואז מערבבים אותו בעדינות. העבירו את כל תכולת בקבוקון ה-MSCs לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל 4 מ"ל מדיום שלם מחומם מראש, בתנאים אספטיים בארון בטיחות ביולוגית Class II.
  3. צנטריפוגה של התאים ב -200 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. ודא שהצנטריפוגה מאוזנת כראוי.
  4. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-1 מ"ל של מדיה שלמה שחוממה מראש. לאחר מכן, העבירו את התאים לבקבוק T25 המכיל 4 מ"ל של מדיום שלם.
  5. הטה בעדינות את הבקבוק כדי להבטיח שהתאים מפוזרים באופן שווה. דגרו את הבקבוק בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2.
  6. החלף את המדיום כל יומיים, והחלף אותו במדיום טרי, מחומם מראש, שלם. השתמש בפיפטינג עדין כדי למנוע הפרעה לתאים. עם הגעה למפגש של 70%-80%, שאפו את המדיום המושקע מבקבוק T25.
  7. שוטפים את התאים עם 3 מ"ל PBS טרי כדי להסיר שאריות. הקפידו על כיסוי מלא של הבקבוק במהלך הכביסה.
  8. הוסף 1 מ"ל של תמיסת טריפסין 0.25% לבקבוק T25, דגר אותו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 3-7 דקות, ופקח בקפידה על הניתוק מתחת למיקרוסקופ בהגדלה פי 4.
  9. הקש בעדינות על הבקבוק במידת הצורך כדי להבטיח ניתוק תאים מלא. הוסף מדיום שלם שחומם מראש לבקבוק ופיפטה למעלה ולמטה על פני השטח כדי לסייע בניתוק התאים. לאחר מכן, העבירו את מתלה התא לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
  10. צנטריפוגה את הצינור בטמפרטורה של 200 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השעו את גלולת התא בתווך טרי ושלם וספרו את התאים באמצעות המוציטומטר נויבאואר. העבירו את התאים לבקבוק T75. הקפידו על צפיפות זריעה של 5,000 תאים/סמ "ר לצמיחה אופטימלית.
  11. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. לאחר 72 שעות של דגירה בתאים, אסוף את המדיה המותנית מהתאים לבידוד EVs. יש להשתמש מיד לאחר האיסוף.

2. בידוד רכבים חשמליים

  1. צנטריפוגה של 13 מ"ל של המדיה המותנית שנאספה ב-800 x גרם למשך 15 דקות להסרת פסולת סלולרית. סנן את הסופרנטנט בעדינות באמצעות מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר כדי להסיר חלקיקים גדולים.
  2. הוסף 5 מ"ל של מאגר משקעים למדיה הממוזגת המסוננת והמערבולת היטב כדי לערבב. ודא שהפתרון הומוגני.
  3. דגרו את התערובת למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס כדי לאפשר ל-EVs לשקע. צנטריפוגה את התערובת ב-3,220 x גרם למשך 30 דקות ב-20 מעלות צלזיוס. בדוק את איזון הצינורות.
  4. השליכו בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור. צנטריפוגה את הגלולה שוב ב-3,220 x גרם למשך 5 שניות כדי להסיר שאריות נוזל.
  5. פיפטה בעדינות את גלולת ה-EV ב-200 מיקרוליטר של PBS כדי למנוע נזק לרכבים החשמליים. מדוד את ריכוז החלבון EVs בהתאם להוראות היצרן (ערכת בדיקת חלבון BCA).
  6. בצע Western Blotting כדי לזהות סמנים ספציפיים ל-EV (CD63, CD81 ו-CD9), כדי לאמת פנוטיפ EV18. הניתוח אישר את נוכחותם של סמנים אלה, ואימת את זהות ה-EVs19.
  7. כדי למזער את הסיכון לזיהום RNase, מומלץ להשתמש בו ישירות ללא אחסון נוסף. במקרה הצורך, אחסן את הרכבים החשמליים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לשימוש נוסף. בחר את מתלי הרכבים החשמליים לנפחים של 40 מיקרוליטר כדי למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים.

3. תיוג רכבים חשמליים עם PKH-26

  1. הכנת מאגר
    1. ממיסים 0.238 גרם HEPES בכ-90 מ"ל מים סטריליים טהורים במיוחד במיכל סטרילי. השתמש בתמיסת HEPES טרייה. הוסף 0.85 גרם NaCl לתמיסת HEPES.
    2. התאם את ה-pH ל-7.4 באמצעות 1 M NaOH או HCl, לפי הצורך, באמצעות מד pH מכויל. הוסף מים נטולי יונים כדי להביא את הנפח הכולל ל -100 מ"ל. מסננים את התמיסה דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר כדי לעקר אותה.
  2. מדללים 4 מיקרוליטר של צבע PKH-26 ב-1 מ"ל של מאגר מוכן. מערבבים היטב על ידי פיפטה כדי להבטיח הומוגניות.
  3. השעו מחדש רכבים חשמליים מטוהרים ב-1 מ"ל של PBS בריכוז של 700 מיקרוגרם/מ"ל. הוסף 1 מ"ל של מתלי ה-EVs ל-1 מ"ל של תמיסת ה-PKH-26 המוכנה. עבור קבוצת הבקרה של צבע בלבד, הוסף 1 מ"ל של מדיום שלם ללא EVs ל-1 מ"ל של תמיסת PKH-26. כל השלבים הבאים מבוצעים גם עבור קבוצת הביקורת כדי לקחת בחשבון צבירה לא ספציפית פוטנציאלית או היווצרות מיצלה.
  4. מערבבים היטב את הרכבים החשמליים על ידי היפוך עדין של הצינור 10x-15x. דגרו את התערובת למשך 3-5 דקות בטמפרטורת החדר, מה שמבטיח חשיפה אחידה של EVs לצבע.
  5. הכינו תמיסת BSA טרייה של 2 מ"ל 1% באמצעות מים אולטרה-טהורים סטריליים והוסיפו אותה ל-2 מ"ל של התערובת המתקבלת כדי להרוות את תגובת התיוג. מערבבים בעדינות כדי למנוע צבירה.
  6. רכז את ה-EVs המסומנים ב-PKH-26 בהתאם לפרוטוקול הנ"ל (שלבים 2.2-2.7). השעו מחדש את הרכבים החשמליים המסומנים ב-300 מיקרוליטר של PBS. פיפטה ה-PKH-26 המסומן ב-EVs דגימה לתוך צינור מסנן של 30 kDa.
  7. צנטריפוגה את הדגימה ב-3,220 x גרם למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. במהלך שלב זה, צבע ה-PKH-26 החופשי והמולקולות הקטנות יעברו דרך הממברנה לתוך המסנן, בעוד שה-EVs המסומנים ב-PKH-26 יישמרו ב-retentate.
  8. לאחר הצנטריפוגה הראשונית, השליכו את המסנן והוסיפו 300 מיקרוליטר PBS לשימור. השעו בעדינות את הרכבים החשמליים ב-PBS על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
  9. צנטריפוגה את הדגימה שוב ב-3,220 x גרם למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לשטוף את כל הצבע החופשי שנותר או מולקולות קטנות.
  10. אשר את היעדר PKH-26 בתמיסת הסינון על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אם מתגלה צבע כלשהו, חזור על שלבי הכביסה.
  11. אסוף את התמיסה העליונה על ידי מיקרופיפטה והסר את המסנן מצינור האיסוף. הפוך בזהירות את המסנן (הפוך אותו הפוך).
  12. צנטריפוגה את המסנן ההפוך ב-800 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. זה יעזור לאסוף את ה-PKH-26-EVs שנשמרו מממברנת המסנן לתוך צינור האיסוף החדש. השתמש ישירות ב-PKH-26-EVs לשלב הבא.

4. 3D הדפסה ביולוגית

  1. הכנת דיו ביולוגי
    1. הכינו תמיסת נתרן Alg טרייה של 4.5% (w/v) באמצעות מים סטריליים טהורים במיוחד. ערבבו למשך הלילה בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לתמיסה להתמוסס לחלוטין.
    2. ממיסים CMCh במים סטריליים טהורים במיוחד כדי להשיג תמיסה של 3.8% (w/v). הכן טרי. ערבבו למשך הלילה בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס להמסה מלאה.
    3. צנטריפוגה את הדיו הביולוגי המוכן ב-3,220 x גרם למשך 10 דקות ב-25 מעלות צלזיוס כדי להסיר בועות שעלולות להפריע לתהליך ההדפסה.
    4. מערבבים את תמיסת ה-3 מ"ל המוכנה של Alg עם ה-EVs המסומנים או בקרת הצבע בלבד באמצעות מערבל מזרק כדי להשיג את הריכוז של 0.01% (w/v) של EVs. הבטח פיזור אחיד על ידי ערבוב עדין.
    5. בעזרת מערבל מזרק, שלבו 1 מ"ל של CMCh עם תמיסת AlgLyase שהוכנה טרייה במים סטריליים טהורים במיוחד כדי להשיג ריכוז סופי של 0.5 mU/mL.
  2. כפי שמתואר באיור 1A, טען בו-זמנית את הדיו הביולוגי Alg/Exo לחלק הליבה ואת הדיו הביולוגי CMCh/AlgLyase לחלק הנדן של מערך מזרק הליבה/נדן.
  3. הניחו לדיו הביולוגי לנוח במשך 15 דקות לפני ההדפסה.
  4. הגדרת מדפסת ביולוגית תלת-ממדית
    1. באמצעות תוכנת המדפסת הביולוגית התלת-ממדית, צור את מבנה הפיגום על ידי בחירת צורה גלילית עם דפוס מילוי אלכסוני. לשם כך, הגדר את קוטר הצילינדר וגובהו ל -20 מ"מ ו -1.1 מ"מ בהתאמה. הגדר את גודל הנקבוביות ל -1 מ"מ.
    2. הגדר את מהירויות השאיבה של זרבובית הליבה והנדן ל-1 מ"מ לשנייה בעובי של 0.25 מ"מ לשכבה והגדר את מהירות התנועה ל-6 מ"מ לשנייה. הדפס ארבע שכבות בעובי של 0.25 מ"מ לשכבה בטמפרטורת החדר.
  5. התחל להדפיס על סרט פוליאסטר.
  6. השתמש במכשיר האדים עם תרסיס סידן כלורי (2.2%) כדי לקשר את הפיגום במהלך תהליך האקסטרוזיה. מקם את פיית מכשיר האדים במרחק של כ-20 ס"מ מראש האקסטרוזיה כדי להבטיח קישור צולב יעיל מבלי לפגוע במבנה הפיגום. לקישור צולב נוסף, טבלו את הפיגום בתמיסת סידן כלורי (2.2%) למשך 10 דקות.
  7. שטפו את הפיגום 3x במים סטריליים טהורים במיוחד כדי להסיר עודפי סידן כלורי ודיו ביולוגי שאינו קשור.
  8. ודא שהפיגום מאוחסן בסביבה סטרילית בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לשמור על שלמות ופונקציונליות הפיגום עד שלושה חודשים.

5. מעקב אחר שחרור רכבים חשמליים

  1. יצירת מודל פצע עורי עגול
    1. להרדים עכברים סוכרתיים הטרוזיגוטיים זכרים (8 שבועות) על ידי מתן זריקה תוך-צפקית של קטמין (70 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג). אשר הרדמה נכונה על ידי הערכת היעדר תגובות רפלקס (למשל, צביטה בבוהן) ועקוב אחר קצב הנשימה. כדי למנוע יובש בקרנית במהלך ההרדמה, יש למרוח משחת עיניים וטרינרית סטרילית על העיניים.
    2. הכן את אזור העור הגבי על ידי גילוח תחילה באמצעות קוצץ חשמלי. הימנע מגירוי או פציעה בעור. עקר את האזור המגולח באמצעות תמיסת פובידון-יוד.
    3. בעזרת תופס סטרילי, צור פצע עורי עגול בעובי מלא של 6 מ"מ על פני הגב של כל עכבר.
    4. הנח בעדינות את הפיגום המודפס בתלת מימד המכיל EVs עם תווית PKH ישירות על מיטת הפצע. ודא שהפיגום מכסה במלואו את משטח הפצע בכיסי אוויר מינימליים על ידי לחיצה קלה באמצעות מלקחיים סטריליים. ודא שהחיה נמצאת במעקב צמוד לאחר ההליך ונשארת בהשגחה עד שהיא חוזרת להכרה מלאה ויכולה לשמור על שכיבה על עצם החזה.
  2. הדמיה פלואורסצנטית
    1. ב-2 שעות, 4 שעות, 8 שעות, 24 שעות לאחר ההשתלה, הרדימו את העכברים באמצעות איזופלורן. לצורך השראת הרדמה, הניחו את העכברים בתא של מערכת ההדמיה in vivo (IVIS) וחשפו אותם ל-2%-3% איזופלורן בחמצן. מרחו משחה עיניים על עיני העכברים כדי למנוע יובש. לאחר ההרדמה, העבירו את העכברים למערכת IVIS ותחזקו אותם עם איזופלורן של 1%-2% בחמצן המועבר דרך תעלות האף. ודא שבעלי החיים מורדמים לחלוטין ויציבים לפני שתמשיך בהדמיה.
    2. השתמש במערכת IVIS כדי ללכוד את האותות הפלואורסצנטיים מהרכבים החשמליים המסומנים ב-PKH המשתחררים מהפיגום. באשף ההדמיה, בחר באפשרות הדמיה פלואורסצנטית והפעל את מסנני העירור והפליטה עבור צבע ה-PKH. התאם את הגדרות המצלמה, כולל שדה הראייה וגובה הנושא, כדי לייעל את זיהוי האות. הבטח מיקום עקבי בכל נקודות הזמן של ההדמיה כדי לאפשר השוואות מדויקות. התחל לרכוש תמונות ושמור את הנתונים המתקבלים.
    3. כמת את עוצמות האות הפלואורסצנטי באמצעות תוכנת IVIS. זה יאפשר מעקב אחר שחרור רכבים חשמליים לאורך זמן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שחרור in vivo של רכבים חשמליים הן מפיגומי Alg-EVs/CMCh והן מפיגומי Alg-EVs/CMCh-AlgLyase מתואר באיור 1B,C. כצפוי, פיגום Alg-EVs/CMCh-AlgLyase הציג פרופיל שחרור מהיר יותר בהשוואה ל-Alg-EVs/CMCh, במיוחד בנקודות הזמן של 2 שעות ו-4 שעות. שחרור EVs מהידרוג'לים נשלט על ידי שילוב של מנגנונים פיזיקוכימיים, כולל דיפוזיה, נפיחות, שחיקה ופירוק20. על ידי מינוף ה-Alglyase, הפיגום מקל על פירוק ה-Alg, ומאיץ את שחרור ה-EVs כדי לשלוט ביעילות בדלקת כרונית בשלב...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היבט מרכזי של הפרוטוקול הוא עיצוב פיגום נדן הליבה, החיוני להשגת אספקה יעילה של רכבים חשמליים. העיצוב משלב אלג כחומר הליבה ושילוב של CMCh עם Alglyase כנדן. הגדרה זו מאפשרת שחרור מבוקר ומהיר של רכבים חשמליים. חומר הליבה, Alg, עוטף את הרכבים החשמליים, ומבטיח את ההגנה והאספקה המקומית שלהם. המעטפת, המורכבת מ-CMCh ו-Alglyase, מאפשרת פירוק מואץ של ליבת ה-Alg, שהיא קריטית לשחרור בזמן של הרכבים החשמליים. בפרסום הקודם שלנו18, הערכנו את קינטיקה של שחרור חוץ גופי של ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תודה מיוחדת לסעיד אל-האשמי ועבד אל-רחמן אלמהרבי מ-Happy Production על עבודתם המצוינת בצילומים. אנו גם מודים למשרד ההשכלה הגבוהה, המחקר והחדשנות ולאוניברסיטת ניזווא על תמיכתם הכספית ועל אספקת המשאבים הנדרשים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
זרבובית חרוטית דיוק סגולה 23 גרםCellinkKT0000002000כדי לספק שחול מדויק של דיו ביולוגי עם סתימה מינימלית
אלגינט ליאז (AlgLyase)Sigma AldrichA1603-100MGAlgyase הוא אנזים המפרק אלגינט.
מסנן Amicon Ultra צנטריפוגלי, 30 kDa MWCOMerckUFC9030משמש לשטיפת PKH-26 מסומן
EVs ערכת בדיקת BCA ThermoScientific10678484לקביעת ריכוז החלבון/EVs
מערכת הדפסה ביולוגיתRegematV1לייצור פיגום נדן ליבה,
אלבומין בסרום בקר (BSA)sigma-aldrich05470-5Gכדי לעצור את תגובת PKH 26 
סידן כלוריסיגמא אולדריץ'C3306-100Gכדי להצליב ולייצב דיו ביולוגי בהנדסת רקמות
צנטריפוגהסיגמא2-16Pמשמש לבידוד EVs
צנטריפוגה 5810 REppendorf22625101משמש לתרבית תאים
Class II ארון בטיחות ביולוגי TelstarBio II Advance
Cell Culture CryoCube  סדרת F570 - מקפיא ULTEppendorfF571240035לאחסון רכבים חשמליים
מיקרוסקופ פלואורסצנטיOLYMPUS IX73P1F משמש לבדיקת שאריות ה-PKH-26 בסינון
ג'נטמיצין (50 מ"ג/מ"ל)תרמופישר15750אנטיביוטיקה למדיה של תרבית תאים
GlutaMAX-I CTS, (100X), תרמופישר נוזליA12860תוסף מדיה לתרבית תאים
HClSigma Aldrich7647-01-0הכנת חוצץ 
HEPESCarl RothArt. מס'   6763.3הכנת חוצץ 
תאית קרבוקסימתיל צמיגה גבוהה (CMCh)BDH27929 4TCMCh היא נגזרת תאית מסיסה במים.
חממתניו ברונסוויק  NB-170Rתרבית תאים
Invivo הדמיהPerkinElmerIVIS Lumina XRMS סדרה III כדי לעקוב אחר שחרור רכבים חשמליים, in vivo
מערבל מגנטSalvisLABMC35להכנת דיו ביולוגי
ערכות אקסוזום miRCURY לבידוד אקסוזוםQiagen76743בידוד EVS
NaOhDaejung1310-73-2הכנת מאגר 
מי מלח חוצץ פוספט (PBS)Thermo ScientificJ61196. תרבית תאים
AP PKH 26MCE154214-55-8צבע פלואורסצנטי אדום לתיוג EVs
נתרן אלגינט (Alg)Sigma AldrichA0682-100Gפוליסכריד טבעי שמקורו באצות חומות.
נתרן כלורי (NaCl)Carl RothArt-Nr-P029.1הכנת חיץ 
StemPro BM תאי גזע מזנכימלייםThermofisherA1382901תאי גזע מזנכימליים
StemPro MSC SFM XenoFreeThermofisherA1067501מדיה לתרבית תאים
טריפסין 0.25%Thermofisher25050014דיסוציאציה של תאים
מערבולת-מערבלDaihan ScientificVM-10משמש לערבוב מאגר משקעים עם המדיה המותנית

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Falanga, V., et al. Chronic wounds. Nat Rev Disease Primers. 8 (1), 50(2022).
  2. Tran, H. Q., Shahriar, S. S., Yan, Z., Xie, J. Recent advances in functional wound dressings. Adv Wound Care. 12 (7), 399-427 (2023).
  3. Shao, M., et al. Emerging trends in therapeutic algorithm of chronic wound healers: Recent advances in drug delivery systems, concepts-to-clinical application and future prospects. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 34 (5), 385-452 (2017).
  4. Rezvani Ghomi, E., Khalili, S., Nouri Khorasani, S., Esmaeely Neisiany, R., Ramakrishna, S. Wound dressings: Current advances and future directions. J Appl Poly Sci. 136 (27), 47738(2019).
  5. Ding, J. Y., et al. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in skin wound healing: Roles, opportunities and challenges. Military Med Res. 10 (1), 36(2023).
  6. Sharma, D., Kumar, A., Mostafavi, E. Extracellular vesicle-based biovectors in chronic wound healing: Biogenesis and delivery approaches. Mol Ther Nucleic Acids. 32, 822-840 (2023).
  7. Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. Extracellular vesicles for drug delivery. Adv Drug Delivery Rev. 106, 148-156 (2016).
  8. Han, P., Ivanovski, S. 3d bioprinted extracellular vesicles for tissue engineering-a perspective. Biofabrication. 15 (1), 013001(2022).
  9. Annabi, N., et al. 25th anniversary article: Rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine. Adv Mater. 26 (1), 85-124 (2014).
  10. Zheng, Y., Pan, C., Xu, P., Liu, K. Hydrogel-mediated extracellular vesicles for enhanced wound healing: The latest progress, and their prospects for 3d bioprinting. J Nanobiotechnol. 22 (1), 57(2024).
  11. Keener, A. B. How extracellular vesicles can enhance drug delivery. Nature. 582 (7812), S14-S14 (2020).
  12. Han, P., et al. 3d bioprinted small extracellular vesicles from periodontal cells enhance mesenchymal stromal cell function. Biomater Adv. 158, 213770(2024).
  13. Born, L. J., et al. Sustained released of bioactive mesenchymal stromal cell-derived extracellular vesicles from 3d-printed gelatin methacrylate hydrogels. J Biomed Mater Res A. 110 (6), 1190-1198 (2022).
  14. Kjar, A., Mcfarland, B., Mecham, K., Harward, N., Huang, Y. Engineering of tissue constructs using coaxial bioprinting. Bioact Mater. 6 (2), 460-471 (2021).
  15. Gao, Q., He, Y., Fu, J. Z., Liu, A., Ma, L. Coaxial nozzle-assisted 3d bioprinting with built-in microchannels for nutrients delivery. Biomaterials. 61, 203-215 (2015).
  16. Deshayes, S., Kasko, A. M. Polymeric biomaterials with engineered degradation. J Poly Sci A Poly Chem. 51 (17), 3531-3566 (2013).
  17. Xu, Q., et al. Injectable hyperbranched poly (β-amino ester) hydrogels with on-demand degradation profiles to match wound healing processes. Chem Sci. 9 (8), 2179-2187 (2018).
  18. Vakilian, S., et al. Engineered local delivery of extracellular vesicles loaded with si-tnf-α, via a core-sheath 3d-bio-printed scaffold as an effective wound dressing. J Drug Delivery Sci Technol. 101, 106189(2024).
  19. Mirsanei, Z., et al. Synergistic effects of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles and dexamethasone on macrophage polarization under inflammatory conditions. Inflammopharmacology. 32 (2), 1317-1332 (2024).
  20. Ma, Y., Brocchini, S., Williams, G. R. Extracellular vesicle-embedded materials. J Controlled Release. 361, 280-296 (2023).
  21. Jia, Q., Zhao, H., Wang, Y., Cen, Y., Zhang, Z. Mechanisms and applications of adipose-derived stem cell-extracellular vesicles in the inflammation of wound healing. Front Immunol. 14, 1214757(2023).
  22. Lou, P., et al. Extracellular vesicle-based therapeutics for the regeneration of chronic wounds: Current knowledge and future perspectives. Acta Biomater. 119, 42-56 (2021).
  23. Cai, Y., Chen, K., Liu, C., Qu, X. Harnessing strategies for enhancing diabetic wound healing from the perspective of spatial inflammation patterns. Bioactive Mater. 28, 243-254 (2023).
  24. Li, Z., et al. Multifunctional hydrogel-based engineered extracellular vesicles delivery for complicated wound healing. Theranostics. 14 (11), 4198(2024).
  25. Cabral, J., Ryan, A. E., Griffin, M. D., Ritter, T. Extracellular vesicles as modulators of wound healing. Adv Drug Delivery Rev. 129, 394-406 (2018).
  26. Moghadasi Boroujeni, S., Mashayekhan, S., Vakilian, S., Ardeshirylajimi, A., Soleimani, M. The synergistic effect of surface topography and sustained release of tgf-β1 on myogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 104 (7), 1610-1621 (2016).
  27. Jayaraman, P., et al. Controlled release of drugs in electrosprayed nanoparticles for bone tissue engineering. Adv Drug Delivery Rev. 94, 77-95 (2015).
  28. Huang, X., Brazel, C. S. On the importance and mechanisms of burst release in matrix-controlled drug delivery systems. J Controlled Release. 73 (2-3), 121-136 (2001).
  29. Smith, A. M., Senior, J. J. Alginate hydrogels with tuneable properties. Adv Biochem Eng Biotechnol. 178, 37-61 (2021).
  30. Yan, X., Sha, X. Nanoparticle-mediated strategies for enhanced drug penetration and retention in the airway mucosa. Pharmaceutics. 15 (10), 2457(2023).
  31. Pant, B., Park, M., Park, S. -J. Drug delivery applications of core-sheath nanofibers prepared by coaxial electrospinning: A review. Pharmaceutics. 11 (7), 305(2019).
  32. Pinheiro, A., et al. Extracellular vesicles: Intelligent delivery strategies for therapeutic applications. J Controlled Release. 289, 56-69 (2018).
  33. Yoshioka, M., Kayo, T., Ikeda, T., Koizuni, A. A novel locus, mody4, distal to d7mit189 on chromosome 7 determines early-onset niddm in nonobese c57bl/6 (akita) mutant mice. Diabetes. 46 (5), 887-894 (1997).
  34. Fang, R. C., et al. Limitations of the db/db mouse in translational wound healing research: Is the noncnzo10 polygenic mouse model superior. Wound Repair Regen. 18 (6), 605-613 (2010).
  35. Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. J Dermatol Sci. 90 (1), 3-12 (2018).
  36. Sellers, R. S. Translating mouse models: Immune variation and efficacy testing. Toxicol Pathol. 45 (1), 134-145 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular Vesicle Delivery3D Bioprinted ScaffoldChronic Wound ManagementMesenchymal Stem CellsCore Sheath ScaffoldExtracellular Vesicle IsolationBioink FormulationScaffold Cross LinkingWestern BlottingDiabetic Wound Healing

Related Articles