המאמר מתאר פרוטוקול לבנייה מחדש של מיקרוביוטת חלב תורם מפוסטר באמצעות מיקרוביוטת חלב האם עצמה בסביבות מעשיות בעולם האמיתי. הוא מדגים גדילה יעילה של חיידקים ומודולציית מיקרוביום, ותומך ביישום אפשרי של הליך זה במסגרת הטיפול השגרתי בבית חולים ליולדות ובבנק חלב האם הקשור אליו.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בנייה מחדש אישית של מיקרוביוטה של חלב אם: גישה ישימה בסביבות בעולם האמיתי
במאמר זה
סיכום
תקציר
חלב אם (MOM) הוא המשאב התזונתי השלם ביותר לתינוקות. במקרים בהם אימהות אינן מסוגלות לייצר מספיק חלב או אינן יכולות להניק, החלופה המועדפת היא חלב אם תורם מפוסטר (PDM), המסופק באופן שגרתי על ידי בנקי חלב אם. PDM מציע מגוון מעולה של רכיבים תזונתיים ואימונולוגיים בהשוואה לכל נוסחה מסחרית זמינה. עם זאת, כדי להבטיח בטיחות ביולוגית, PDM עובר פסטור, תהליך שמשבית את המיקרוביוטה הקומנסלית ומפחית תרכובות ביו-אקטיביות מסוימות. מחקר זה מציג פרוטוקול שנועד לשחזר את המיקרוביוטה של PDM באמצעות MOM כמקור מיקרוביאלי, תוך התאמת הגישה לסביבה קלינית בעולם האמיתי.
הפרוטוקול יושם בניסוי קליני שנערך בבית חולים ליולדות ובבנק חלב האם הקשור אליו, במטרה לספק חלב תורם מותאם אישית לפגים שאמהותיהם אינן יכולות לייצר מספיק חלב. המתודולוגיה כוללת חיסון PDM עם 10% של MOM, ואחריו דגירה ב 37 ° C במשך 4 שעות. ניתוח מיקרוביולוגי הראה גידול חיידקים מוצלח בחלב המחוסן (IM) לאחר הדגירה, כאשר פרופיל המיקרוביוטה של החלב המשוחזר (RM) דומה מאוד לזה של MOM, מה שמצביע על שיקום מיקרוביוטה יעיל. תוצאות אלה מצביעות על כך שפרוטוקול ההרכבה מחדש אפשרי ליישום בטיפול בילוד, עם פוטנציאל לשפר את האיכות התזונתית והחיסונית של PDM, ובכך לתמוך בבריאות ובהתפתחות של יילודים שאינם יונקים.
מבוא
חלב אם מוכר באופן נרחב כמקור התזונה הטוב ביותר לתינוקות, ומספק לא רק מאקרו ומיקרונוטריאנטים חיוניים, אלא גם מערך מורכב של אלמנטים, כולל מטבוליטים ורכיבים שונים של מערכת החיסון, כגון נוגדנים, ציטוקינים ותאים1. בנוסף, התכונות המועילות בחלב אם נובעות גם מקהילה של מיקרואורגניזמים קומנסליים. כל האלמנטים האלה של חלב אם לשחק תפקיד מכריע בהתפתחות של התינוק1. קהילת המיקרואורגניזמים, המכונה מיקרוביוטה, מושפעת משילוב של גורמים כגון תזונה, אורח חיים אימהי, סוג הלידה וגיל ההריון, וכתוצאה מכך לכל חלב יש מיקרוביוטה עם מאפיינים מסוימים2. המנגנונים שבאמצעותם מיקרוביוטת חלב האם מוע....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
פרוטוקול זה בוצע כחלק מההליכים של ניסוי קליני שנערך על ידי קבוצת המחקר שלנו (הרישום הברזילאי לניסויים קליניים, ReBEC RBR-729kr8x), וקיבל את אישור ועדת האתיקה (תהליך CAAE nº 41063520.4.0 000.0121) והסכמה מדעת התקבלה מכל המשתתפים לפני אקראיות ואיסוף דגימות.
הליך השחזור של מיקרוביוטת החלב נעשה בשלושה שלבים:
1. קבלת חלב אם גולמי
הערה: הליך קבלת חלב ניתן למצוא במקום אחר10,11.
- לפני ההליך, יש לקבל הסכמה מדעת של היולדת על פי ועדת האתיקה ולהקפיד להסביר ליולדת את כל מה שייעשה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ניתוח צמיחת חיידקים על ידי גידול צלחות
הבדיקות המיקרוביולוגיות שנערכו כדי לאמת את שיטת חיסון PDM עם MOM, כפי שהוצע על ידי Cacho et al.9, הראו כי, בהתבסס על ספירת CFU/mL, לא היו הבדלים משמעותיים בין דגימות החלב שחוסנו לפני ואחרי הדגירה של 4 שעות. אולם הבדלים במספר המושבות נצפו בשתי נקודות הזמן האלה, מה שמצביע על צמיחת חיידקים במהלך הדגירה על MSA עבור Staphylococcus spp. (איור 1A) ועל מדיום MRS עבור חיידקי חומצה לקטית (LAB) (
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן אנו מציגים פרוטוקול שייושם בבתי חולים ליולדות הקשורים לבנק חלב אם, במטרה לספק PDM את ההרכבה מחדש של מיקרוביוטת החלב מאם ספציפית אשר, מסיבות שונות, אינה יכולה לספק מספיק חלב ליילוד שלה. הפרוטוקול פשוט ומבוסס בעיקרו על שני שלבים. הראשון כרוך ביישום נהלים המבוצעים באופן שגרתי בבנקי חלב אם לאיסוף נאות ופסטור לאחר מכן של חלב תורם, כמו גם איסוף חלב האם עצמו, שהמיקרוביוטה שלו תורחב 6,7,8. השלב השני.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.
תודות
המחברים מודים בהכרת תודה על תמיכת המימון של Programa de Pesquisas para o SUS, PPSUS/2020, Ministério da Saúde do Brasil; Fundação de Amparo à Pesquisa e Inovação do Estado de Santa Catarina, מספר מענק: 2021TR000506; Programa de Pesquisa Universal, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) do Ministério de Ciência e Tecnologia do Brasil, מספר מענק: 420996/2023-0; Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica 2022 - 2024, מספר מענק: 120815/2023-0. אנו מודים גם למתנדבים על מתן הדגימות.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| משאבת חלב אם חשמלית | Horigen | XN-2219M2 | משאבה רכה כפולה פלוס |
| Pyrex בקבוקי מדיה | קורנינג | CLS1395100 | מיכלי זכוכית עם מכסי פלסטיק |
| 1000 ומיקרו; L pipette Labmate pro | Corning HTL SA | 5666 | פיפטור בנפח משתנה |
| בקבוקון קריוגני | קורנינג | CLS431417 | בקבוקונים של 2 מ"ל ללא DNase/RNase |
| צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל | קורנינג | CLS431470 | צינורות 15 מ"ל ללא DNase/RNase |
| אמבט מים | EcoSonics | Q3.0/40A | |
| Man– רוגוסה– שארפ (MRS) | Difco | 288210 | מצע גידול חיידקי חומצה לקטית |
| מניטול מלח אגר (MSA) | Himedia | MH118 | סטפילוקוקוס מצע גידול |
| צנצנת אנאירובית | פרמוטציה | צור סביבה דלת חמצן לצמיחת חיידקי חומצה לקטית | |
| Extracta ערכה – DNA e | RNA Loccus | MPTA-PV16-B Y | DNA ערכת מיצוי Nanodrop |
| Promega | E6150 | Quantus DNA | |
| GoTaqG2 | Promega | M7841 | PCR מערכת הגברה |
| קוואנטוס פלואורומטר | Promega | E5150 | DNA / RNA ערכת כימות |
| MiSeq System | Illumina Inc. | M-GL-00006 v4.0 | ציוד ריצוף |
| MiSeq Reagent Kit v2 (300 מחזורים) | Illumina Inc. | MS-102-2002 | ערכות ריצוף וריאגנטים |
| <חזקים>שם תוכנה | |||
| קרא כלי חיתוך עבור נתוני Illumina NGS | |||
| QIIME 2 | https://docs.qiime2.org/2024.10/ | חבילת ניתוח מיקרוביום | |
| <חזק>שם פריימר | <חזק>רצף פריימר | ||
| 16S_357F | TCGTCGGCAGCGTCAGA TGTGTATAAGAGACAGC CTACGGGNGGCWGCAG | ||
| 16S_805R | GTCTCGTGGGCTCGGAG ATGTGTATAAGAGACAGG ACTACHVGGGTATCTAATC |
מקורות
- Szyller, H., et al. Bioactive components of human milk and their impact on child's health and development, Literature Review. Nutrients. 16 (10), 1487(2024).
- Fernández, L., Rodríguez, J. M. Human milk microbiota: Origin and potential us....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
