הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הקמת מודול קוקולטורה תלת מימדי של תאי אפיתל באמצעות ממברנות ננו-סיביות

1.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67780

⸱

27 בדצמבר 2024

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, School of Medicine, Ajou University, 2Department of Medical Sciences, The Graduate School, Ajou University, 33D Immune System Imaging Core Center, Ajou University

במאמר זה

סיכום

במאמר זה אנו מדגימים כיצד תאי אפיתל שגודלו בתרבית עם פיברובלסטים במערכת הדו-שכבתית המבוססת על קרום ננו-סיבי יכולים להיצמד ביציבות לקרום ולגדול עליו.

תקציר

מכשולים טכניים בתרבית של תאי אפיתל כוללים התמיינות ואובדן תפקוד. שיטות תרבית תאים תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) ביומימטיות יכולות לשפר את יעילות תרבית התא. מחקר זה מציג מערכת תרבית דו-שכבתית מתקדמת שנועדה לטפח תאי אפיתל כשכבות דמויות רקמה עם תרבית פיברובלסטים בסביבה תלת-ממדית. פוליוויניל אלכוהול (PVA) ופולי(ε-קפרולקטון) (PCL) ממברנות ננו-סיביות (NMs) יוצרו באמצעות אלקטרוספינינג ושימשו כמטריצה חוץ-תאית רלוונטית מבחינה פיזיולוגית לתרבית תאי אפיתל ופיברובלסטים, בהתאמה. בבארות ההחדרה העליונות טופחו תאי אפיתל ריאתיים על ה-PVA NM, ובתאים התחתונים תורבתו פיברובלסטים על ה-PCL NM. תצורה זו מבטלת מגע ישיר בין התא לתא ומקלה על בחינת איתות פרקריני המתווך על ידי גורמים מסיסים. נעשה שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי כדי לנתח את ההתפלגות, דפוס הגדילה והביטוי של חלבונים תוך-תאיים, כולל zona occludens בתאי אפיתל. טכניקות הערמת Z אפשרו שחזורים תלת-ממדיים מפורטים, וסיפקו תובנות מדויקות לגבי שלמות הצמתים הצפופים והארגון המרחבי בתוך שכבת האפיתל. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) העריך את המאפיינים המורפולוגיים של סוגי תאים על הממברנות הננו-סיביות. הדמיית SEM חשפה מבנים מורכבים על פני השטח של התא ואינטראקציות עם הננו-סיבים, ומציעה נקודת מבט מקיפה על ארכיטקטורה תאית ואינטראקציה תאית עם מבנה ננו-סיבי. בדיקת Cell Counting Kit-8 (CCK-8) היא שיטה פשוטה למדידת קצב גדילת תאי אפיתל ופיברובלסטים לאורך זמן. הוא מספק את התנהגויות ההתרבות ואת ההשפעות הסינרגיסטיות האפשריות של coculturing תאים אלה. ממצאים אלה מדגישים את יעילותה של מערכת פשוטה של תרבית משותפת לתרבית בו זמנית של פיברובלסטים ותאי אפיתל, שהיא חיונית בהקשרים פיזיולוגיים ופרמקולוגיים שונים, כולל התחדשות רקמת אפיתל, מיקרו-סביבה של הגידול עם תאי אנדותל, מערכת החיסון ותאי סטרומה אחרים, בדיקת רעילות ובדיקת פעילות תרופתית.

מבוא

במשך עשרות שנים, התרבות הדו-ממדית החד-שכבתית הקלאסית (2D) הייתה חיונית להבנת זיהומים, פרמקולוגיה וטוקסיקולוגיה 1,2. עם זאת, חשוב לקחת בחשבון את המורכבות, אינטראקציות דינמיות בין קומפוזיציות מרובות, וארכיטקטורה תלת מימדית (3D) של microenvironment רקמות. לפיכך, לתרבית התאים הדו-ממדית יש מגבלות בחיקוי מבנים דמויי רקמה 3,4. לדוגמה, קיים מחסור באיתות ECM (מטריצת תא לתא ותא למטריצה חוץ-תאית), שהוא חיוני בהתמיינות תאים, בהתרבות ובתפקודים תאיים במיקרו-סביבה vivo. מסיבות אלה פותחו מערכות של תרביות תאים תלת-ממדיות5. התאים בתרבית תלת-ממדית גדלים ומתקשרים עם המטריצה החוץ תאית הסובבת אותם בשלושה ממדים. יתר על כן, פותחה גישת קו-קולטורה תלת-ממדית, המורכבת מיותר מסוג תא אחד, כדי לגשר על הפער בין מודלים פשטניים של תא בודד במבחנה לבין האינטראקציות הסלולריות הדינמיות המתרחשות ב-vivo6. מערכות קוקולטורה תלת-ממדיות צברו פופולריות בחקר תקשורת תא-תא ואינטראקציות מטריצה חוץ-תאית (ECM) 7,8,9,10. למערכות התרבות התלת-ממדית הנוכחיות יש מספר צורות וניתן להפריד אותן לתרבות משותפת ישירה ועקיפה 8,9. בתרבית ישירה, תפקודי תאים שונים בתאים בתרבית יכולים להיות מושפעים בעיקר ממגע ישיר ולא מהשפעות פרקריניות. לשם השוואה, לחקלאות משותפת עקיפה יש יתרון גדול יותר בחקירת אינטראקציה פרקרינית על ידי שימוש במחסומים או שכבות כדי להפריד בין סוגי תאים שונים.

חומרים ושיטות שונות משמשים לייצור פיגומים ביומימטיים המחקים את ה-ECM תוך שימוש בחומרים תואמים ביולוגית ומתכלים10. מבנה הפיגום הננו-סיבי מחקה את התצורה של ECM טבעי ברקמות ביולוגיות, ומספק ארכיטקטורה תלת-ממדית לתרבית תאים11,12. Electrospun nanofibrous membranes (NMs) שימשו בחקלאות משותפת ישירה ועקיפה של סוגים שונים של תאים 13,14,15.

תאי אפיתל מהווים מחסום פיזי של האיברים העיקריים, ואילו פיברובלסטים הם תאי סטרומה דומיננטיים המתווכים עיצוב מחדש של ECM ומווסתים את האפיתל השכן 6,16,17. תאי אפיתל ופיברובלסטים מתקשרים עם למינין בקרום המרתף ופיברונקטין במטריצה הבין-תאית, בהתאמה, באמצעות קולטני אינטגרין על פני התא18. כאשר תאי אפיתל מגודלים בתרבית על פולי(ויניל אלכוהול) (PVA) NMs בקטרים של 150 - 250 ננומטר ומיקרו-נקבוביות, הם יוצרים רב-שכבות במקום אגרגטים של תאים וכדורים, ודפוסי הצמיחה שלהם דומים לאלה של התאים ברקמת אפיתל19. לשם השוואה, הפולי(קפרולקטון) (PCL) NMs בקוטר 400-1,500 ננומטר ומיקרו-נקבוביות של 10-50 מיקרומטר מספקים ממדיות מרחבית דומה למטריצה הבין-תאית לגידול פיברובלסטים בתרבית13,14. בשל התאימות הביולוגית שלהם, ממברנות PVA ו- PCL משמשות פולימרים נפוצים בהנדסת רקמות20,21.

מחקר זה מציג מערכת תרבית דו-שכבתית מתקדמת המשתמשת ב-NMs אלקטרוספונים נקבוביים כדי לטפח תאי אפיתל כשכבות דמויות רקמה ופיברובלסטים בתוך מבנה תלת-ממדי. ניתן לחלק את הפרוטוקול לחמישה שלבים מרכזיים: ייצור ננו-סיבים, סיבים לאחר הצלבה והערכת איכות, הכנת תרבית המחוברת לקרום, זריעת תאים והתרבות משותפת תלת-ממדית, ובדיקות של תאים בתרבית תלת-ממדית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. ייצור ננו-סיבי PVA יציבים במים

  1. שקלו 0.02 גרם של חומצה פולית (חומצה אקרילית) (PAA) וגרם אחד של PVA, ולאחר מכן הוסיפו אותם לבקבוק זכוכית נקי המכיל מוט מגנטי. מוסיפים 7.8 מ"ל מים מזוקקים לבקבוק, מניחים את הבקבוק על מערבל צלחת, ומכוונים את הטמפרטורה ל-84°C, את המהירות ל-500 סל"ד ואת הזמן ל-12 שעות.
  2. יש להתקרר לטמפרטורת החדר לפני הוספת 0.2 מ"ל גלוטראלדהיד (GA). מניחים את הבקבוק על מערבל הצלחת, ומכוונים את המהירות ל-500 סל"ד, את הזמן ל-30 דקות ואת הטמפרטורה לטמפרטורת החדר.
  3. השתמש מזרק 5 מ"ל עבור electrospinning, להפריד את הבוכנות מן החביות, ולנקות פסולת פלסטיק קטנה בתוך החביות ואת קצה הבוכנות.
  4. השתמש במחטים כדי לחסום את זרימת הנוזל, ולאחר מכן שפך תמיסת PVA לכל חבית (נפח: 2.5-3 מ"ל כל אחת). להרכיב את הבוכנות, ולאחר מכן להסיר את המחטים.
    הערה: ייתכן שיש בועה בתמיסה, לכן המתן עד שהבועה תיעלם. זה לוקח 10 - 30 דקות.
  5. הרכיבו מחט מתכת חדשה 27 G, ולאחר מכן הכניסו אותה למכונת האלקטרוספינינג.
  6. עוטפים היטב את האספן בנייר כסף.
  7. תן ללוח המזרק לחזור למיקום המקורי. השתמש בהגדרות הבאות עבור המכונה: (כל משאבה) נפח הזרקה: 2 מ"ל, קצב הזרקה: 6 מיקרוליטר/דקה, מהירות גליל: 100 סל"ד, מרחק קצה לאסוף: 14 ס"מ. בדוק את זרימת הנוזלים עבור כל משאבה.
  8. הפעל את המכונה עם פוטנציאל חשמלי של כ 12 kV.
  9. ודא כי הלחות היא 40 - 50% בתחילת ו 25 - 30% בסוף התהליך. השתמשו במכשיר אדים כאשר הלחות יורדת והניחו כלים המכילים מים מזוקקים בתוך המכונה יום לפני האלקטרוספינינג כדי להגביר את הלחות.
    הערה: זהו גורם קריטי בייצור מוצלח של ננו-סיבי PVA.
  10. בדוק את הזרימה באופן קבוע. אם המחט חסומה, עצור זמנית את המכשיר. השתמשו במגבון מעבדה כדי להסיר את הטיפה והמתינו עד שהטיפה החדשה תופיע. אם לא, שנה את המחט ולאחר מכן המשך להפעיל את המכונה.
  11. התהליך של ייצור ננופייבר PVA לוקח ~ 6 שעות כדי להשלים. לאחר סיום תהליך האלקטרו-ספינינג, נתקו את נייר הכסף המכיל את משטח הסיבים מהקולט ואחסנו את משטח הננו-סיבים בחומר ייבוש תחת ואקום.

2. טיפול בקרום ננו-סיבי PVA עם אדי חומצה הידרוכלורית (HCl) והערכת איכות הסיבים

הערה: יציבות המים של PVA NMs נשמרת היטב לאחר התגובה שלאחר הצלבה על ידי אדי HCl. תהליך זה מותאם לעובי, גודל נקבוביות וחספוס מתאימים של NMs. PVA הוא פולימר הידרופילי מאוד, וננו-סיבי PVA אלקטרוספון אינם יציבים במגע עם מים ובתנאי לחות. PVA NMs צריך להיות מטופל עם אדי HCl מיד לאחר הייצור של פולימר PVA.

  1. חתכו משטח ננופייבר לחתיכות בגודל הרצוי להחדרת הטרנס-באר.
  2. הכינו צלחת קטנה המכילה 1.5 מ"ל HCl טהור. הניחו את הכלים המכילים HCl וחתיכות ננו-סיבים בתוך תא ואקום וסגרו את המכסה.
    הערה: אדי HCl משמשים כחומר postcrosslink כדי להפוך את ננו-סיבים ליציבים במים.
  3. פתח את השסתום המחובר למשאבת הוואקום, המתן 10 שניות עד שאדי HCl יעלה, ולאחר מכן סגור את השסתום. יש לטפל בקרומים עם נדף HCl למשך 2 דקות.
  4. לאחר הטיפול באדי HCl, הוסיפו כמה טיפות של מים מזוקקים (DW) לממברנות, הניחו אותן על מגלשת זכוכית והוציאו את הממברנה מנייר הכסף. לאחר ייבוש באוויר במשך 20 דקות, הקרומים נדבקים באופן טבעי למגלשה.
  5. מצפים את הממברנות על סרט פחמן בשכבה דקה של זהב באמצעות ציפוי autosputter. השג תמונות של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM).
  6. לאחר הצלבת PVA NMs עם HCl, שטפו אותם 3x עם 1x PBS, ובדקו את ה- pH לאחר השרייתם במדיה תרבותית כדי לאשר את היעדר שאריות HCl.

3. ייצור ננו-סיבים PCL והערכת איכות ננו-סיבים

  1. שוקלים 1.5 גרם PCL ומוסיפים אותו לבקבוק זכוכית נקי. מוסיפים 8.5 מ"ל כלורופורם לבקבוק, מניחים את הבקבוק על מערבל צלחת, וממיסים PCL בכלורופורם למשך 12 שעות בטמפרטורת החדר.
  2. חזור על שלבים 1.3 עד 1.9, למעט שלבים 1.7 ו- 1.8, הגדר את קצב ההזרקה ל- 8 מיקרוליטר לדקה ואת המתח ל- 17.5 קילו וולט.
    הערה: ייצור PCL לוקח ~ 3.5 שעות כדי לסיים.
  3. חותכים חתיכה קטנה מהממברנה ומצפים את החתיכות בתהליך התזה אוטומטי למשך 5 דקות. השג תמונות SEM.

4. הרכבה של שתי שכבות של ממברנות בבאר טרנס

הערה: בפרוטוקול זה, אנו משתמשים בצלחת 24 בארות ובהכנסה המתאימה שלה היטב. ה-PVA NM מחובר היטב לעלון, ואילו ה-PCL NM מחובר לבאר התחתונה.

  1. חתכו משטח ננופייבר לחתיכות עגולות, בקוטר של 10 מ"מ ו-13 מ"מ עבור PVA ו-PCL NMs, בהתאמה.
  2. השתמש polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 כחומר דבק כדי לחבר את הממברנות להכנס ואת החדר היטב. לפני השימוש, ערבבו את Sylgard 184 Base (חלק A) ואת Curing Agent (חלק B) בכוס פלסטיק ביחס מסה של 10:1. השתמשו במגלשת זכוכית נקייה כדי לערבב את תמיסת PDMS במרץ במשך 2-3 דקות עד שכל התערובת מתמלאת בבועות. תן לבועה להיווצר ולהיעלם במשך 10 דקות לפני השימוש; בינתיים, תן את המגלשה להתחמם ל 100 ° C.
  3. פזרו את ה-PDMS על שקופית זכוכית וטבלו היטב את הקצה התחתון של העלון ב-PDMS. שמור את התוספת הפוכה היטב על המגלשה חם יותר כדי שה- PDMS יתקשה (~ 10-15 דקות). בדוק בזהירות עם קצה של 200 μL כדי לוודא שה- PDMS אינו דביק.
  4. יש לטפל בחלקי PVA NM כמתואר בשלבים 2.2 עד 2.4.
  5. לחץ בעדינות על האינסרט היטב על פיסת PVA NM כך שתחתית האינסרט פונה היטב לצד הננו-סיבי של חתיכת הממברנה. מוסיפים טיפת מים מזוקקים למרכז הבאר ומשתמשים במלקחיים כדי להסיר את נייר הכסף. שים את הכנס היטב צלחת חדשה 24 בארות, ולתת את הממברנה להתייבש.
  6. בעת חיבור חתיכת PCL NM לתחתית היטב, הקפד לטבול את קצה 200 μL בתערובת PDMS ולנקד אותו בדיוק בארבע הפינות ובמרכז.
  7. הניחו את הצלחת על המגלשה חמה יותר ואפשרו ל-PDMS להתקשות במשך 5-7 דקות כדי להבטיח את איכות ההרכבה.
  8. הכניסו את פיסת ה-PCL NM לבאר המכילה PDMS, כאשר הצד הננו-סיבי של הממברנה מחובר ל-PDMS. השתמשו במברשת קטנה ונקייה כדי ללחוץ מעט על צד נייר הכסף של חתיכת הממברנה לחיבור מלא. הוסף 0.2 מ"ל של אתנול 70% לבאר כדי להסיר בקלות את נייר הכסף.
  9. יש לעקר את האינסרט ואת החלק התחתון היטב במערך הטרנס-באר תחת אור UV למשך הלילה.
    הערה: ניתן לאחסן את PDMS המעורב בטמפרטורה של -20°C לשימוש נוסף. אזהרה: ניתן לאחסן את הצלחת הננו-סיביבית PCL המחוברת לקרום יבש, אך יש להרטיב אותה עם 70% אתנול לפני השימוש.
  10. למחרת, שטפו היטב את העלון ואת החלק התחתון על ידי הוספת 200 μL ו-500 μL של 1x מלח חוצץ פוספט (PBS), בהתאמה, למשך 3 x 10 דקות. התוספת והבאר התחתונה מוכנים לשימוש.

5. זריעת תאים והרכבה של שתי שכבות למודל הקוקולטורה

הערה: תאי MLE-12 גודלו בתרבית ב-1x Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 עם 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% אנטיביוטיקה פניצילין/סטרפטומיצין. תאי NIH3T3 גודלו בתרבית ב-1x DMEM גלוקוז גבוה עם 10% FBS ו-1% אנטיביוטיקה פניצילין/סטרפטומיצין.

  1. שומרים על התאים בכלי תרבית בקוטר 150 מ"מ. כאשר הם 70-80% confluent, לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של 1x PBS ו trypsinize אותם עם 2 מ"ל של 0.05% טריפסין / EDTA מחומם מראש פתרון במשך 3 דקות ב 37 ° C.
  2. הקש בעדינות על הצלחת כדי לעקור את התאים מלמטה, ולאחר מכן הוסף 8 מ"ל של מצע תרבית שלם לכל סוג של תא כדי לנטרל את אנזים הטריפסין. מעבירים את מתלה התא לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל, צנטריפוגה ב-400 × גרם למשך 5 דקות, ומשליכים את הסופרנטנט. צבעו את התאים באמצעות Cell-Tracker כדי לצפות בהתפלגות תאי הזרעים על NM (ראו סעיף 6 לפרטים נוספים).
  3. השהה מחדש את גלולת התא ב- 5 מ"ל של מדיה מלאה DMEM/F12. קבע את מספר התא והתאם ל- 6 × 10 6תאי MLE-12 / מ"ל ו- 8 × 105 תאי NIH3T3 / מ"ל.
    הערה: מדיית DMEM/F12 מלאה משמשת לחקלאות משותפת עם תאי MLE-12 ו-NIH3T3.
  4. מלא את הבאר התחתונה ב- 500 μL של מדיה מלאה DMEM/F12 (הבאר ללא PCL). העבירו את האינסרט הננו-סיבי PVA המחובר לקרום הטרנס, והוסיפו 50 μL של תרחיף תאי MLE-12. לדגור על התאים ב 37 ° C ו 5% CO2.
  5. בו-זמנית, מלא היטב את החלק התחתון המחובר לקרום ננו-סיבי PCL ב-500 μL של תרחיף תאי NIH3T3 ודגור על התאים ב-37°C ו-5%CO2.
  6. לאחר שעתיים, הרכיבו היטב את התא MLE-12 המכיל את התא ואת ה-NIH3T3 המכיל את הבאר התחתונה במערך הטרנס-באר. זהו מודל קוטורטורה עם תאי MLE-12 כשכבה העליונה ותאי NIH3T3 כשכבה התחתונה. תרבית משותפת של התאים בממברנות הדו-שכבתיות לזמן הרצוי.

6. בדיקת התפלגות תאים

  1. הכן 5 מיקרומטר של תמיסה אדומה וירוקה של Cell-Tracker בנפח כולל של 2 מ"ל של מדיום DMEM/F12 מלא.
  2. לאחר טריפסיניזציה, ערבב תאי MLE-12 עם תמיסה אדומה שהוכנה בעבר של Cell-Tracker ו- NIH3T3 עם תמיסה ירוקה של Cell-Tracker. יש לדגור על התאים בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 למשך 30 דקות כדי להבטיח תיוג תאים אופטימלי. הוסף 8 מ"ל של מדיום DMEM/F12 מלא לדגימות וצנטריפוגה ב 400 × גרם למשך 5 דקות.
    הערה: מעקב אחר תאים אינו יכול להשפיע על יכולת הקיום וההתרבות של תאים. מכאן שניתן לגדל תאים מוכתמים ב-Cell-Tracker עד למפגש. עוצמת הפלואורסצנטיות בתאים המוכתמים עשויה לרדת 4-5 ימים לאחר התרבית.
  3. חזור על שלבים 5.3 עד 5.6.
  4. תוך כדי התבוננות תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, להעביר את הכנס היטב מן צלחת 24 בארות צלחת 12 בארות.
    הערה: פעולה זו ממזערת את המרחק בין עדשת האובייקט לבין התאים, ומאפשרת תצפית על המורפולוגיה של התא.

7. תצפיות קונפוקליות של תאים בתרבית תלת ממדית

הערה: חיבור תאי אפיתל ל-PVA NM חלש בהשוואה לזה של פיברובלסטים ל-PCL NM. יש להשליך מדיה ישנה באופן ידני על ידי שאיפת פיפטה ולהוסיף מדיה או תמיסה חדשה בעדינות לקיר הבארות. במהלך תהליך הצביעה, נסו לא לתת לממברנות להתייבש.

הערה: ניתן לשפר את חיבור התאים על ידי ציפוי למינין או שילוב פפטידים של מוטיבים קושרי אינטגרין בננו-סיבים PVA19.

  1. מעבירים את האינסרט לצלחת חדשה בת 24 בארות. השליכו את המדיה הישנה והוסיפו 150 μL של תמיסת 4% פרפורמלדהיד (PFA). יש לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. הסר את תמיסת 4% PFA ושטוף את התאים המודבקים עם 150 μL של 1x PBS.
  3. לחסימה וחדירה, יש להוסיף 150 μL של 5% סרום עיזים רגיל ו-0.2% Triton X-100 מדולל ב-1x PBS ולדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. הכינו את Alexa Fluor 594-conjugated anti-zona occludens Ab (1:400) ואת Phalloidin-iFlour 488 (1:1,000) על ידי דילול שלהם בריאגנט מדלל נוגדנים. הסר את הפתרון חוסם, להוסיף 150 μL של פתרון fluorophore לכל באר, לדגור במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.
    הערה: הכינו את תמיסות הנוגדנים בדיוק מרבי, שכן זה ישפיע ישירות על איכות התוצאות. יש להימנע מחשיפה לאור.
  5. השליכו את תמיסת הנוגדנים ושטפו את התאים עם 150 μL של 1x PBS למשך 10 דקות.
  6. מוסיפים 150 μL של Hoechst 33342 מדולל ב-1x PBS (1:1,000) ודגורים במשך 10 דקות; יש להימנע מחשיפה לאור.
  7. הסר את תמיסת Hoechst 33342 ושטוף את התאים המודבקים עם 150 μL של 1x PBS למשך 10 דקות.
  8. הכינו מגלשת זכוכית נקייה והוסיפו כמות מדויקת של ג'ל הרכבה מימי. השתמשו במלקחיים עם קצוות מחודדים כדי לנתק בעדינות את הקרומים מהקצה שמסביב. הניחו את הממברנות על ג'ל ההרכבה, וודאו שהצד המכיל את התאים פונה כלפי מעלה. מוסיפים כמות מדויקת של ג'ל הרכבה ומכסים בשקופית כיסוי. אטמו את המגלשות בלק והקפידו על אטימה מדויקת ומלאה.
  9. התבוננו בתאים תחת מיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות הגדרות ההדמיה הבאות: בקרת עוצמת לייזר: 405 עוצמה 10; בקרת כוח לייזר: 488 עוצמה 10; בקרת כוח לייזר: 561 עוצמה 10; רגישות הגלאי: 420LP (ערך 600); רגישות הגלאי: 525/50 (ערך 700); רגישות הגלאי: 561LP (ערך 750).

8. בדיקה של חיבור תאים לננו-סיבים

  1. השליכו את המדיה הישנה ושטפו את התאים עם 150 μL של 1x PBS.
  2. תקן את התאים עם 150 μL של 3% GA מדולל ב 1x PBS במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.
  3. שטפו את התאים עם 150 μL של 1x PBS תוך 10 דקות.
  4. תקן את התאים באופן משני על ידי הוספת 150 μL של 1% אוסמיום טטרוקסיד (OsO4) מדולל ב 1x PBS במשך 1 שעות.
    זהירות: OsO4 והאדים שלו מזיקים. יש להשתמש בו במכסה אדים.
  5. השליכו את התמיסה ושטפו את התאים עם 300 μL של 1x PBS למשך 2 x 10 דקות.
  6. לייבש את התאים עם אתנול מדורג מ 50%, 70%, 90%, ו 95% עד 100%, במשך 10 דקות בכל שלב. בצע את שלב ההתייבשות האחרון על ידי הוספת אתנול טרי 100% למשך 10 דקות.
  7. האוויר מייבש את התאים והקרומים לחלוטין. השתמשו במלקחיים עם הקצוות המחודדים כדי לנתק את הממברנות, והניחו את הממברנות על מחזיק הדגימה באמצעות ברז דו-צדדי. בצעו התזת יונים במשך 5 דקות לפני התבוננות בתאים תחת SEM בהגדלה של פי 2,000.

9. בדיקת צמיחת תאים

הערה: בפרוטוקול זה, בדיקת CCK-8 משמשת לכימות קצב גדילת התאים בהתאם להוראות היצרן.

  1. הכינו את תערובת CCK-8 על ידי ערבוב 9 חלקים של DMEM/F12 שחומם מראש (לפי נפח) עם חלק אחד של מגיב CCK-8. לאחר הסרת אמצעי התרבית הישנים, הוסיפו 150 μL של תערובת CCK-8 לבאר המכילה תאים.
  2. העבר את התוספת לצלחת החדשה בת 24 הבארות כדי להפריד אותה מהבאר התחתונה המכילה תאים. לדגור על התאים במשך 45 דקות ב 37 ° C ו 5% CO2.
  3. לאסוף את supernatant ולהעביר אותו צינור 1.5 מ"ל. צנטריפוגה בעוצמה של 1,800 × גרם למשך 3 דקות.
  4. הוסף 100 μL של supernatant מצינור microcentrifuge לצלחת 96 באר. קרא צפיפות אופטית (OD) ב- 450 ננומטר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הקריטיים לעיבוד תאי אפיתל ריאה MLE-12 ופיברובלסטים NIH3T3 על-ידי בניית מודל דו-שכבתי מבוסס קרום ננו-סיבי (איור 1). מודל זה מתאים לדימות תאים חיים, אימונוהיסטוכימיה וניתוח כמותי של תאים בתרבית משותפת. סוגי תאים אחרים עשויים להיות מנוצלים גם על ידי אופטימיזציה של צפיפות התאים ותנאי הגידול.

SEM מראה את ההתפלגות האחידה של ננו-סיבי PVA מפוברקים ללא היווצרות חרוזים (איור 2A). הקוטר של ננו-סיבי PVA נע בין 150 ננומט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

המעבר מתרבות דו-ממדית למודלים של תרבות תלת-ממדית מהווה התקדמות משמעותית בפיתוח מודלים של תרבות משותפת במבחנה . מודל תרבית תלת-ממדי חייב לחקות את המיקרו-סביבה של הרקמה שבה תאים יכולים להתרבות, לצבור ולהתמיין22. השימוש במודלים תלת-ממדיים מבוססי פיגומים משפרים את השכפול של ארכיטקטורת הרקמות. במחקר זה, מערכת טרנס-באר מבוססת NM מספקת קו-קולטורה תלת-ממדית עקיפה של שני סוגי תאים. PCL NM עם נקבוביות גדולות בתא התחתון מאפשר חדירה תאית ומחקה את המטריצה הבין-תאית. פ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מפרויקט המו"פ של טכנולוגיית הבריאות של קוריאה באמצעות המכון לפיתוח תעשיית הבריאות של קוריאה (KHIDI), במימון משרד הבריאות והרווחה, הרפובליקה של קוריאה (HR16C0001); פרויקט שיפור יכולת המחקר המדעי הבסיסי באמצעות מענק המכון למדע בסיסי של קוריאה (מרכז מתקני מחקר וציוד לאומי) במימון משרד החינוך (2019R1A6C1010003); ומענקים של קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) במימון ממשלת קוריאה (MSIT) (2022R1A4A5032702).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.05% טריפסין/EDTAWelgeneLS015-01
100x פניצילין/סטרפטומיציןGibco10378016
20x PBSתמיסת LPSCBP007A
4% ParaformaldehydeBiosesangPC2031-050-00
Alexa Fluor-594 מצומד ZO-1 נוגדןInvitrogen339194
מדלל נוגדנים OP QuantoEpredia10129-576
ערכת בדיקה CCK-8DonginbioCCK-3000
צלחת תרבית תאים (150x20)SPL20151
CellTracker ירוק CMFDAInvitrogenC7025
CellTracker אדום CMTPXInvitrogenC34552
כלורופורםSamchunC0584
צינור חרוטיSPL50050
כיסוי זכוכיתקורנינגCLS2980245
DMEM גלוקוז גבוהWelgeneLM001-05
DMEM/F12WelgeneLM 002-05
בסיסי ייבוש DURAN עם אוגן מישור, חוט בורגDWK מדעי החיים 7.022 260
מכסה מייבש זכוכית DURAN & StopcockDaihan ScienceSM.2444061
DURAN Stopcock, עם ציר PTFEDWK מדעי החיים 
מכונת אלקטרו-ספינינגNanoNCESR200RD
אלכוהול אתיליסיגמא אולדריץ'459844
FBSסיגמא אולדריץ'TMS-013-BKR 
מודול סורק לייזר קונפוקלי פלואורסצנטי K1-fluoNanoscope Systems
Gel/mountBiomeda Corp.תמיסת M01
GlutaraldehydeSigma Aldrich340855
Hoechst 33342InvitrogenH1399
זרבובית מתכת 27GNanoNC
לקטבע רפובליקה
סרום עיזים רגילVector LaboratoriesS-1000
אוסמיום טטרוקסידסיגמא אולדריץ'201030
Phalloidin-iFlour 488abcamab176753
מנעול Syringe_Lure פלסטיק (10 מ"ל)HENKE SASS WOLFAL10
פולי (חומצה אקרילית)סיגמא אולדריץ'323667
פולי (אלכוהול ויניל)סיגמא אולדריץ'341584
פוליקפרולקטוןסיגמא אולדריץ440744
טהור HCLDuksan1129
סריקת אלקטרונים מיקרוסקופיהSECSNE-4500M
זכוכית שקופיותMarienfeld SuperiorK15663717
Sylgard 184 סטכל מדעOMNI.05255
סינרגיה H1 קורא מולטימודBiotek
Triton X-100סיגמא אולדריץ'X100
10322671 , טהור '

מקורות

  1. Kämpfer, A. A. M., et al. Development of an in vitro co-culture model to mimic the human intestine in healthy and diseased state. Toxicol In Vitro. 45 (Pt 1), 31-43 (2017).
  2. Barrila, J., et al. Three-dimensional organotypic co-culture model of intestinal epithelial cells and macrophages to study Salmonella enterica colonization patterns. npj Microgravity. 3, 10(2017).
  3. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discov Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  4. Krause, S., et al. A novel 3D in vitro culture model to study stromal epithelial interactions in the mammary gland. Tissue Eng Part C: Methods. 14, 261-271 (2008).
  5. Urzì, O., et al. Three-dimensional cell cultures: The bridge between in vitro and in vivo models. Int J Mol Sci. 24 (15), 12046(2023).
  6. Duell, B. L., Cripps, A. W., Schembri, M. A., Ulett, G. C. Epithelial cell coculture models for studying infectious diseases: benefits and limitations. J Biomed Biotech. 2011, 852419(2011).
  7. Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. J. R. Soc. Interface. 11 (96), 20140065(2014).
  8. Liu, R., et al. From 2D to 3D co-culture systems: A review of co-culture models to study the neural cells interaction. Int J Mol Sci. 23 (21), 13116(2022).
  9. Vis, M. A. M., Ito, K., Hofmann, S. Impact of culture medium on cellular interactions in in vitro co-culture systems. Front Bioeng Biotechnol. 8, 911(2020).
  10. Kook, Y. M., Jeong, Y., Lee, K., Koh, W. G. Design of biomimetic cellular scaffolds for co-culture system and their application. J Tissue Eng. 8, 2041731417724640(2017).
  11. Stocco, T. D., et al. Nanofibrous scaffolds for biomedical applications. Nanoscale. 10 (26), 12228-12255 (2018).
  12. Gao, X., Han, S., Zhang, R., Liu, G., Wu, J. Progress in electrospun composite nanofibers: composition, performance and applications for tissue engineering. J Mater Chem B. 7 (45), 7075-7089 (2019).
  13. Kim, T. E., et al. Three-dimensional culture and interaction of cancer cells and dendritic cells in an electrospun nano-submicron hybrid fibrous scaffold. Int J Nanomedicine. 11, 823-835 (2016).
  14. Oh, Y. S., Choi, M. H., Shin, J. I., Maza, P. A. M. A., Kwak, J. Y. Coculturing of endothelial and cancer cells in a nanofibrous scaffold-based two-layer system. Int J Mol Sci. 21 (11), 4128(2020).
  15. Lee, S. J., et al. Bacterial infection-mimicking three-dimensional phagocytosis and chemotaxis in electrospun poly(ε-caprolactone) nanofibrous membrane. Membranes. 11 (8), 569(2021).
  16. DeLeon-Pennell, K. Y., Barker, T. H., Lindsey, M. L. Fibroblasts: The arbiters of extracellular matrix remodeling. Matrix Biol. 91-92, 1-7 (2020).
  17. Lühr, I., et al. Mammary fibroblasts regulate morphogenesis of normal and tumorigenic breast epithelial cells by mechanical and paracrine signals. Cancer Lett. 325 (2), 175-188 (2012).
  18. Humphries, J. D., Byron, A., Humphries, M. J. Integrin ligands at a glance. J Cell Sci. 119 (19), 3901-3903 (2006).
  19. Tran, T. X. T., et al. Synthetic Extracellular Matrix of Polyvinyl Alcohol Nanofibers for Three-Dimensional Cell Culture. J Funct Biomater. 15, 262(2024).
  20. Oun, A. A., Shin, G. H., Rhim, J. -W., Kim, J. T. Recent advances in polyvinyl alcohol-based composite films and their applications in food packaging. Food Packaging Shelf Life. 34, 100991(2022).
  21. Zhang, W., et al. Applications of poly(caprolactone)-based nanofibre electrospun scaffolds in tissue engineering and regenerative medicine. Curr Stem Cell Res Ther. 16 (4), 414-442 (2021).
  22. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, 33(2020).
  23. Rosso, F., Giordano, A., Barbarisi, M., Barbarisi, A. From cell-ECM interactions to tissue engineering. J Cell Physiol. 199 (2), 174-180 (2004).
  24. Malakpour-Permlid, A., et al. Identification of extracellular matrix proteins secreted by human dermal fibroblasts cultured in 3D electrospun scaffolds. Sci Rep. 11, 6655(2021).
  25. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: a powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncol Lett. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  26. Torras, N., García-Díaz, M., Fernández-Majada, V., Martínez, E. Mimicking epithelial tissues in three-dimensional cell culture models. Front Bioeng Biotechnol. 6, 197(2018).
  27. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. 8 (2), 352-361 (2015).
  28. Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-Arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144 (6), 938-941 (2017).
  29. Luo, L., Liu, L., Ding, Y., Dong, Y., Ma, M. Advances in biomimetic hydrogels for organoid culture. Chem Commun. (Camb). 59 (64), 9675-9686 (2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

טכניקת אלקטרוספינינגממбраנת פוליויניל אלכוהולממбраנת פוליקפרולקטוןתרביות שיתוף של פיברובלסטיםאיתות פראקרינימיקרוסקופיה קונפוקליתמיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת
הקמת מודול קוקולטורה תלת מימדי של תאי אפיתל באמצעות ממברנות ננו-סיביות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.