Method Article

יצירת ספרואידים/אורגנואידים תלת מימדיים מתרביות תאים דו-ממדיות באמצעות מכשיר חותמת חדשני

DOI:

10.3791/67787

⸱

March 28th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Cell and Molecular Therapy NUCEL Group, School of Medicine, University of São Paulo, 2Biochemistry Department, Chemistry Institute, University of São Paulo, 3Department of Polymers, Faculty of Technology of the State of São Paulo – Zona Leste (FATEC ZL), 4Technical Division for Teaching, Research and Innovation Support - DTAPEPI Biotechnology and Innovation Facility, School of Medicine, University of São Paulo

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מציג מתודולוגיה חסכונית ויעילה ליצירת מבני תאים תלת מימדיים באמצעות מערכת מבוססת חותמת ליצירת מיקרו-בארות בתבניות אגרוז. המערכת מקדמת היווצרות של ספרואידים/אורגנואידים אחידים, ובכך משפרת את האינטראקציות בין התאים. גישה זו מפחיתה את השונות הניסויית ותומכת ביישומים בבדיקות תרופות והנדסת רקמות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרביות תאים תלת מימדיות (3D) מספקות ייצוג מדויק יותר של המיקרו-סביבה in vivo מאשר תרבויות דו-ממדיות (2D) קונבנציונליות, מכיוון שהן מקדמות אינטראקציות משופרות בין התאים והמטריצה החוץ-תאית. מחקר זה נועד לפתח מתודולוגיה יעילה, חסכונית וניתנת לשחזור ליצירת מבני תאים תלת מימדיים (ספרואידים/אורגנואידים) באמצעות מערכת חדשנית מבוססת חותמת ליצירת מיקרו-בארות בתבניות אגרוז. חותמת חדשה שימשה לייצור 663 מיקרו-בארות לבאר של צלחת של 6 בארות, מה שמספק סביבה אידיאלית לצבירת תאים. תאי אי לבלב חזיריים ראשוניים נזרעו לתוך המיקרובארות הללו, שם הם הצטברו ליצירת ספרואידים/אורגנואידים. התרביות הודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% CO2, והמדיום הוחלף כל 3 ימים. היווצרות הספרואידים נוטרה מעת לעת, ונאספו דגימות לאפיון. השיטה ייצרה בהצלחה ספרואידים אחידים ואיכותיים, הפחיתה את השונות הניסיונית, מזערה את המניפולציה ושיפרה את האינטראקציות בין התאים. השימוש בתבניות מיקרו-דפוס מבוססות אגרוז סיפק סביבה פשוטה ומבוקרת לתרבויות תלת מימד, והציע פתרון סטנדרטי וחסכוני. מתודולוגיה זו תומכת ביישומים לבדיקת תרופות והנדסת רקמות, ומציעה פלטפורמה מעשית וניתנת להרחבה למודלים של תרביות תאים תלת מימדיות הניתנות ליישום בקלות במסגרות מעבדה שונות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך 50 השנים האחרונות, מחקרים רבים בביולוגיה של התא הראו כי תרביות דו-ממדיות (2D) אינן מצליחות לשכפל במדויק את תנאי ה-in vivo שנצפו במודלים של בעלי חיים1. מבחינה מבנית, תרביות תאים דו-ממדיות אינן מאפשרות לתאים להתארגן באופן תלת מימדי ולשכפל את המצב שנצפה במערכות in vivo . יתר על כן, מסלולי איתות תאיים משתנים בתרביות דו-ממדיות בהשוואה לתרביות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות), מה שעשוי להסביר מדוע סוגים מסוימים של בדיקת תרופות באמצעות תרביות דו-ממדיות הם כה שונים2. התקדמות משמעותית בטכניקות תרבית תאים התגלתה עם כניסתן של מערכות תרבית תלת מימדיות. מערכות תלת מימד משתנות במידה ניכרת במורכבותן בהתאם להרכב התא ולארכיטקטורה הציטולוגית. בדרך כלל נוצרים שני סוגים של מבנים, כלומר: ספרואידים ואורגנואידים. ספרואידים מתוארים כאשכולות פשוטים של תאים המתקבלים מרקמות רגילות או גידוליות, גופים עובריים וקווי תאים. היווצרותם של מבנים תלת מימדיים מושפעת מגורמים שונים, כולל אינטראקציות תא-תא ומסלולי איתות המתווכים על ידי רכיבים של המטריצה החוץ-תאית (ECM), המספקים תמיכה מבנית ורמזים ביוכימיים. אלמנטים אלה מווסתים אינטראקציות התורמות לארגון ותפקוד הרקמות3. מערכת התרבית הספרואידית תוארה לראשונה בתחילת שנות ה-70, תוך שימוש בקווי תאי ריאה של אוגר סיני V79 כמודל לקרצינומות נודולריות, הגדלות בתנאים לא נצמדים ויוצרות כדורים מושלמים4. אורגנואידים מתוארים כאשכולות של סוגי תאים ספציפיים לאיברים שמקורם בתאי גזע או אב, המתארגנים בעצמם באמצעות תהליכים, כגון מיון תאים ומפרט שושלת, באופן מוגבל מרחבית, המשקף את ההתפתחות in vivo 5.

מספר שיטות וחומרים זמינים לתרבית תאים בתנאים תלת מימדיים. השיטות העיקריות המשמשות כיום ליצירת תרבויות תלת מימד הן: 1) טיפות תלויות; 2) תרבית תאים מסתובבת ופלסטיק בעל חיבור נמוך; 3) לוחות פירמידה המכילים בארות חרוטיות; 4) פיגומים מקרו-נקבוביים; 5) חרוזים מגנטיים; ו-6) הידרוג'לים ללא פיגומים.

טיפות תלויות היא השיטה המשמשת להשגת תרביות תלת מימד ללא פיגומים. שיטה זו מציגה מגבלות מסוימות, כולל הצורך בטיפול נרחב, יעילות ייצור נמוכה, גיאומטריה כדורית וחשיפה לכוחות גזירה גבוהים. יתרה מכך, הליכים ספציפיים, כגון החלפת מדיום או תוספת מורכבת, יכולים להיות מאתגרים ועלולים לגרום לאובדן חומר. יתר על כן, דיווחי ספרות מצביעים על כך שחלק מקווי התאים אינם מצליחים לייצר ספרואידים ארוזים היטב בעת שימוש בגישה זו6.

תרבית תאים מסתובבת ופלסטיק בעל חיבור נמוך משמשים למניעת היצמדות תאים למצע, מה שגורם להם להצטבר וליצור ספרואידים. תהליך זה דורש צלוחיות ספציפיות ו/או תסיסה/סיבוב. למרות שזו אחת הגישות הפשוטות ביותר לייצור ספרואידים או אורגנואידים בקנה מידה גדול, היא אינה חפה מחסרונות, כגון הצורך בציוד ספציפי, אורך חיים נמוך של תרבית, שונות בגודל בספרואידים, נזק מכני לתאים ויעילות נמוכה6.

לוחות פירמידה המכילים בארות חרוטיות הם לוחות זמינים מסחרית המשפיעים על העלויות, בנוסף לעובדה שמניפולציות מסוימות עלולות לעכב את היווצרותם של ספרואידים/אורגנואידים7.

פיגומים מקרו-נקבוביים משמשים גם לתרבית תלת מימדית; עם זאת, מכשול מרכזי טמון בהשגת זריעה יעילה של תאים ופיזור אחיד. בעיה זו מתעוררת מכיוון שגודל הנקבוביות עשוי להיות קטן מדי לחדירת תאים או גדול מכדי לשמור על התאים בצורה מאובטחת. כדי לטפל בבעיה זו, נבחנו מספר אסטרטגיות8, המשפיעות ישירות על המורכבות והעלות של טכניקה זו.

מתודולוגיית החרוזים המגנטיים מייצרת מספר קטן של ספרואידים/אורגנואידים, יש לה עלות גבוהה ועלולה להשאיר שאריות ננו-חלקיקים בתוך התאים9.

בין המערכות לגידול ספרואידים, ניתן להשיג הידרוג'ל אגרוז שאינו דביק, המייצג הידרוג'ל ללא פיגומים. גישה זו מציעה יתרונות בולטים, כגון שליטה מדויקת על גודל המבנים התלת מימדיים והיכולת לייצר מספר ניכר של מבנים אלה לכל לוח. בשיטה זו מוחדרים תאים להידרוג'ל עם בארות מוכנות מראש, בהן הם שוקעים ומתאספים בעצמם לספרואידים תלת מימדיים10.

במחקר זה אנו מציגים מכשיר ומתודולוגיה ליצירת מיקרו-בארות אגרוז באמצעות תבנית מיקרו-דפוס בצורה פשוטה, יעילה, ניתנת לשחזור ובעלות נמוכה.

השימוש בחותמת זו כתבנית ליצירת מיקרו-בארות באגרוז, בסיוע כוח הכבידה, נועד לשפר את האינטראקציה התאית בתוך המיקרובאר והארגון התאי, וליצור מבנים תלת מימדיים (ספרואידים/אורגנואידים) במבחנה בצורה פשוטה, יעילה, ניתנת לשחזור ובעלות נמוכה, ובכך לחסוך זמן מחקר ומשאבי מעבדה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה עוקב אחר הנחיות ועדת האתיקה למחקר בבני אדם של המוסד שלנו CEUA-FMUSP: 1699/2021, שאושר ב-8 בספטמבר 2021 - "בידוד ואנקפסולציה של איי לבלב חזיריים" והוא חלק מהפרויקט הנושאי של קבוצת NUCEL לטיפול תאי ומולקולרי (www.usp.br/nucel), מענק FAPESP מס' 2016/05311-2, שכותרתו: "רפואה רגנרטיבית שמטרתה טיפול במחלות כרוניות-ניווניות (סרטן וסוכרת)".

1. ייצור מכשיר החותמת

הערה: חותמת זו מיוצרת בהתאמה אישית על ידי קבוצת NUCEL (https://w3nucel.webhostusp.sti.usp.br/). מכשיר החותמת פותח באמצעות התוכנה המוזכרת, המוכרת באופן נרחב בזכות הדיוק ויכולות המידול התלת מימדיות המתקדמות שלה.

  1. ודא שאבות הטיפוס המתוכננים כוללים 663 מיקרו-פינים המסודרים כדי לאפשר יצירת מספר שווה של תרביות תלת מימדיות, כגון ספרואידים או אורגנואידים. כדי להבטיח את יציבות החותמת על משטחי מגש T6, מקם חמש נקודות תמיכה באופן אסטרטגי לאורך היקף המכשיר.
  2. ודא שלמיקרו-פינים יש עיצוב חרוטי עם מידות מתכווננות, הנעות בין 1 ל-3 מ"מ אורך. קוטר הבסיס של החרוט נע בין 0.7 ל-1.5 מ"מ, בעוד שזווית ההתחדדות נעה בין 5° ל-10°.
  3. ודא שמבנה ה"עצירה" של המכשיר, המגדיר את עומק המיקרו-פינים, הוא בעל אורך מתכוונן של 10 עד 19 מ"מ וקוטר של 20 עד 40 מ"מ, כאשר מיקרו-פינים מפוזרים באופן אחיד על פני השטח שלו.
  4. בנוסף, תכנן את המכשיר כך שתהיה לו ידית ארגונומית, המתאימה להפעלה ביד אחת, כדי לשפר את הפרקטיות והדיוק במהלך השימוש.
    הערה: כדי להקל על ייצור בקנה מידה גדול של המכשיר, מסופק הקובץ הדיגיטלי בפורמט .stl, בהיותו חיוני לתהליך הדפסת התלת מימד.
  5. כל שעליך לעשות הוא לפרוס אותו באמצעות תוכנה מתאימה ולהדפיס אותו במדפסת תלת מימד תואמת. השתמש במידות ההדפסה הבאות: X - 68 מ"מ; Y - 120 מ"מ; Z - 150 מ"מ, מה שמבטיח איזון אידיאלי בין פונקציונליות לאיכות מבנית.
  6. לייצור המכשיר, השתמש במדפסת תלת מימד הניתנת לצילום, התואמת לשרף הפולימרי הניתן לריפוי UV שחייב להיות בעל רזולוציה גבוהה וגימור משטח אחיד, מאפיינים חיוניים לביצועי מכשיר מיטביים.
  7. פרסו את הדגם הדיגיטלי להדפסה באמצעות תוכנה התואמת למדפסת התלת-ממד שנבחרה.

2. הכנת מיקרו-בארות אגרוז

  1. הכן את תמיסת האגרוז.
    1. שקלו את אבקת האגרוז הטהורה והמיסו אותה בתמיסת מלח חוצצת פוספט 1x (PBS) כדי להשיג ריכוז סופי של 1-2% (w/v).
    2. מחממים את התמיסה במיקרוגל או באמבט מים עד להמסה מלאה, ומוודאים שהיא הומוגנית ושקופה.
      הערה: הימנע מהתחממות יתר או חימום יתר, מכיוון שהדבר עלול לפגוע באגרוז. אין להכין כמויות גדולות של תמיסת מלאי.
    3. הניחו לתמיסה להתקרר ל-~40 מעלות צלזיוס, הטמפרטורה האידיאלית לפיפטינג.
  2. הכן את החותמת בהתאמה אישית.
    1. שטפו את החותמת עם ספוג בעל זיפים רכים ומים מזוקקים להסרת שאריות.
    2. חשוף את ה-stamp הנקי לאור UV למשך 5-10 דקות כדי להבטיח סטריליות.
  3. יוצרים את המיקרו-בארות.
    1. יוצקים/פיפטה ~3 מ"ל מתמיסת האגרוז של 40 מעלות צלזיוס לכל באר של צלחת של 6 בארות, ומבטיחים עומק אחיד של 2-3 מ"מ.
    2. מקם את החותמת בהתאמה אישית במרכז הבאר כשהאגרוז עדיין חם.
      הערה: לחותמת יש תומכים רוחביים המבטיחים יישור ויציבות, ומבטלים את הצורך בתמיכה ידנית. כל חותמת יוצרת ~663 מיקרו-בארות (~2 מ"מ גובה) לבאר. ודא שאין בועות על המיקרו-פינים; אם נוצרות בועות, הזז בעדינות את החותמת כדי לחסל אותן.
    3. הניחו לאגרוז להתמצק במשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר מבלי להזיז את הצלחת.
      הערה: אל תפריע לאגרוז במהלך ההתמצקות כדי למנוע שינויים במבנה המיקרובאר.
    4. הסר את ה-stamp בתנועות עדינות קדימה ואחורה כדי לשחרר את הוואקום מבלי לפגוע במיקרו-בארות.
      הערה: תנועה זו מקלה על כניסת אוויר, ומאפשרת הסרת חותמת חלקה מבלי לעוות את הג'ל. המיקרו-בארות חייבות להישאר שלמות.
    5. שטפו את המיקרו-בארות פי 3 עם תמיסת PBS להסרת שאריות.
    6. חשוף את הצלחת לאור UV למשך 10 דקות כדי למנוע זיהום מיקרוביאלי.
    7. מוסיפים 3 מ"ל של מדיום תרבית ודוגרים את הצלחת בחממת CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
      הערה: דגירה זו מאמתת את היעדר הזיהום לפני זריעת התאים.

3. זריעת תאים במיקרו-בארות

  1. הכן את מתלה התאים.
    1. אסוף את התאים באמצעות טריפסיניזציה או שיטת דיסוציאציה אחרת כדי לקבל תרחיף הומוגני.
    2. ספרו את התאים והתאימו את הריכוז לפי המספר הרצוי למיקרווול.
      הערה: כדי לזרוע 5,000 תאים למיקרווול ב-663 מיקרו-בארות, הכינו תרחיף המכיל לפחות 3.315 ×-10 6 תאיםבסך הכל . מטב את ריכוז התאים כדי למנוע נמק מרכזי וכדי להבטיח דיפוזיה מספקת של חומרים מזינים וחמצן.
  2. זרעו את התאים.
    1. פיפטה ~ 3 מ"ל של תרחיף התאים המוכן מעל המיקרו-בארות, מה שמבטיח פיזור אחיד על ידי סיבוב עדין של הצלחת.
    2. אפשר לתאים להתיישב על ידי כוח הכבידה (~10-15 דקות) או בצע צנטריפוגה עדינה ב-100 × גרם למשך 5 דקות.
      הערה: ניתן להשתמש בצנטריפוגה כדי להבטיח שהתאים יתרכזו במיקרו-בארות.
    3. העבירו את הצלחת לחממת CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם אווירה לחה.

4. תחזוקה של תרביות תאים תלת מימדיות

  1. החלף את מדיום התרבות.
    1. החלף את המדיום כל 2-3 ימים, הסר 50% מהמדיום הישן והוסף מדיום טרי.
      הערה: ודא שהמיקרו-בארות נשארות שקועות לאורך כל תקופת התרבות כדי למנוע התייבשות.
  2. עקוב אחר היווצרותן של תרבויות תלת מימד.
    1. המשך בתרבות עד שהמבנים התלת-ממדיים נוצרים במלואם וקומפקטיים (למשל, 2-3 ימים עבור תרביות ראשוניות של איי הלבלב).
      הערה: עבור תרביות הדורשות זמן היווצרות ארוך יותר, בצע החלפת מדיום חלקית כל 2-3 ימים.

5. איסוף ואפיון מבנים תלת מימדיים

  1. אסוף את הספרואידים/אורגנואידים.
    1. הסר את המדיום הישן ואסוף את המבנים התלת מימדיים באמצעות פיפטינג נמרץ באמצעות קצה פיפטה בקוטר רחב או חתוך כדי למנוע דחיסה או פירוק.
      הערה: יש לשלוט בפיפטינג נמרץ כדי לעקור את האגרגטים מבלי לעוות אותם.
  2. התכוננו לניתוח.
    1. השתמש מיד בספרואידים/אורגנואידים שנאספו או תקן אותם לניתוח עתידי.
      הערה: האסוציאציה והיציבות של ספרואידים תלויים בסוג התא, זמן היווצרות ותנאי התרבית. זהירות חיונית כדי למנוע דיסוציאציה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרבית התאים ששימשה במחקר זה נגזרה מאיי לבלב חזיריים. לתכשיר האי ששימש במחקר זה היה טוהר של 80 ± 5% בהתבסס על צביעה דיתזון, ו->80% כדאיות תאי איים בהתבסס על זיהוי פלואורסצאין דיאצטט בתאים חיים או פרופידיום יודיד בתאים מתים (שיטת הפלואורסצנט חי/מת). ודא שהכנת אי הלבלב החזירי היא לפחות 80% טהורה (למשל, על ידי צביעת דיתזון) ו->80% בת קיימא. לאחר הבידוד, שמור על תרביות דבקות במדיום CMRL 1066, בתוספת 1 מ"מ L-גלוטמין, 0.2% ציפרופלוקסצין ו-10% סרום עגל עוברי (FCS), ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2, כפי שתואר קודם לכן<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות שקיימים פרוטוקולים שונים של תרבית תלת מימד בספרות, מחקר שנערך על ידי Wassmer et al.13 בדק מספר מתודולוגיות ליצירת מבנים תלת מימדיים באמצעות איי לבלב. המחברים הבחינו כי איים מקומיים וספרואידים שהצטברו בעצמם הפגינו הטרוגניות ניכרת ביחס לגודל וצורה והיו גדולים יותר מאלה שהושגו בשיטות אחרות. בהתבסס על ממצאיהם, הם הגיעו למסקנה שניתן לייצר ספרואידים באמצעות טכניקות שונות, שלכל אחת מהן יתרונות וחסרונות משלה. עבור צבירת תאי אי, השיטות המומלצות הן טכניקת הטיפה התלויה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו אסירי תודה במיוחד על הסיוע הטכני המצוין שמספק Zizi de Mendonça (בית הספר לרפואה, אוניברסיטת סאו פאולו, ברזיל). עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מסוכנויות המחקר הברזילאיות הבאות: BNDES 09.2.1066.1, CAPES (מספר תהליך PVE 88881.068070/2014-01), CNPq (מספרי מענק 457601/2013-2, 401430/2013-8, ומספר INCT-Regenera 465656/2014-5), FAPESP (מספר פרויקט נושאי 2016/05311-2), FINEP 01.08.06.05 ומשרדי המדע והטכנולוגיה (MCTI) והבריאות (MS-DECIT).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
31L מיקרוגלאלקטרולוקס78965840 6699 9ציוד המשמש לחימום תמיסת האגרוז, מה שמקל על פירוקו ומבטיח הומוגניות רבה יותר. זה מאפשר לתמיסה להגיע למצב הנוזלי האידיאלי להיווצרות הבארות.
מדפסת תלת מימד 3D 3D שרףהניתן לריפוי UV
אטום - Creality Halot מדפסתCrealityN/Aהמשמשת להדפסת מכשיר החותמת
AgaroseUNISCIENCEUNI-R10111ליצירת הג'ל, ממיסים 1 עד 2% במאגר פוספט מלוח (PBS) או במדיום מתאים.
Autodesk Fusion 3603D modeling
BB15 CO2 IncubatorThermo Fisher51023121ציוד המשמש לדגירת תאים מתורבתים בסביבה מתאימה ומבוקרת.
ChituboxChituboxN/Aתוכנה המשמשת לחיתוך החלק להדפסת
ארון בטיחות ביולוגי Class IIGrupo VECON/Aמבטיחה סביבה סטרילית לביצוע תרבית תאים במסגרת פרמטרים ופרוטוקולים שנקבעו.
מדיום תרביתUSBiological/מדעי החייםC5900-03Aמכיל תוספים לגידול תאים נכון.
לוחות תרבית (P6)SARSTEDT1023221משמש לעיצוב האגרוז ולתרבית התאים.
בקבוק ארלנמאייר (25 מ"ל)Laborglas91 216 14מיכל המשמש להמסה 1– 2% אגרוז במי מלח פוספט (PBS) או מדיום מתאים אחר, המחומם בדרך כלל במיקרוגל.
פלקון 15 מ"ל צינור צנטריפוגה פוליסטירןקורנינג352099משמש לשמירה על תאים בתרחיף וביצוע דילולים אפשריים.
סרום בקר עוברי (FBS)Vitrocell Embriolife005/19תוסף למדיום תרבית.
תמיסת PBS (מאגר פוספט מלוח)מעבדה מיוצרתN/Aמדולל פי 1 עם מים טהורים במיוחד של MiliQ. משמש להמסת אגרוז של 1 עד 2% ולשטיפת בארות שכבר יוצרו.
בקבוק ריאגנט עם פקק כחול - SchottLaborglas21801545משמש להכנה ואחסון של מדיום תרבית.
התקן חותמתNUCEL GroupN/ALink- קישור זה מספק גישה לקובץ ה- .stl של התקן החותמת. כל שעליך לעשות הוא לפרוס אותו באמצעות תוכנה מתאימה ולהדפיס אותו במדפסת תלת מימד תואמת. https://drive.google.com/drive/folders/1gTYComnJWzHpN6ZKOyK
EChKS3Qns0rOA?usp=שיתוף
בקבוק תרבית מטופל עם פילטר 25 ס"מ²קורנינג430639משמש לגידול ותחזוקה של תאים דבקים.
טריפסיןמרק07-07-9002לדיסוציאציה של תאים לפני הזריעה.
אור אולטרה סגול (UV)N/AN/Aמשמש לעיקור הבול והצלחות.
פולימרי אפור אפור תלת מימד אחת

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lian, J., Yue, Y., Yu, W., Zhang, Y. Immunosenescence: a key player in cancer development. J Hematol Oncol. 13 (1), 151(2020).
  2. Wang, F., et al. Reciprocal interactions between beta1-integrin and epidermal growth factor receptor in three-dimensional basement membrane breast cultures: a different perspective in epithelial biology. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (25), 14821-14826 (1998).
  3. Dzobo, K., Dandara, C. The extracellular matrix: its composition, function, remodeling, and role in tumorigenesis. Biomimetics. 8 (2), 146(2023).
  4. Sutherland, R. M., McCredie, J. A., Inch, W. R. Growth of multicell spheroids in tissue culture as a model of nodular carcinomas. J Natl Cancer Inst. 46 (1), 113-120 (1971).
  5. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  6. Bialkowska, K., Komorowski, P., Bryszewska, M., Milowska, K. Spheroids as a type of three-dimensional cell cultures-examples of methods of preparation and the most important application. Int J Mol Sci. 21 (17), 6225(2020).
  7. Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates. J Vis Exp. (81), e50665(2013).
  8. Andersen, T., Auk-Emblem, P., Dornish, M. 3D Cell culture in alginate hydrogels. Microarrays (Basel). 4 (2), 133-161 (2015).
  9. Hou, S., et al. Advanced development of primary pancreatic organoid tumor models for high-throughput phenotypic drug screening. SLAS Discov. 23 (6), 574-584 (2018).
  10. Napolitano, A. P., et al. Scaffold-free three-dimensional cell culture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels. Biotechniques. 43 (4), 494-500 (2007).
  11. Maria-Engler, S. S., et al. Co-localization of nestin and insulin and expression of islet cell markers in long-term human pancreatic nestin-positive cell cultures. J Endocrinol. 183 (3), 455-467 (2004).
  12. Mantovani, M. C., et al. Immobilization of primary cultures of insulin-releasing human pancreatic cells. Islets. 1 (3), 224-231 (2009).
  13. Wassmer, C. H., et al. Engineering of primary pancreatic islet cell spheroids for three-dimensional culture or transplantation: a methodological comparative study. Cell Transplant. 29, 963689720937292(2020).
  14. Stuart, M. P., et al. Successful low-cost scaffold-free cartilage tissue engineering using human cartilage progenitor cell spheroids formed by micromolded nonadhesive hydrogel. Stem Cells Int. 2017, 7053465(2017).
  15. Charelli, L. E., Dernowsek, J. A., Balbino, T. A. Generation of tissue spheroids via a 3D printed stamp-like device. J Vis Exp. (188), e63814(2022).
  16. Micromold for the production of cellular spheroids and use. , Patent BR 10 2019 027360 7 A2 (2019).
  17. Riffle, S., Pandey, R. N., Albert, M., Hegde, R. S. Linking hypoxia, DNA damage and proliferation in multicellular tumor spheroids. BMC Cancer. 17, 338(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Three Dimensional Cell CultureSpheroid FormationOrganoid GenerationAgarose MicrowellsStamp DevicePorcine Pancreatic IsletsCell AggregationDrug Testing PlatformTissue EngineeringCell Viability

Related Articles