הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הקפאה ישירה של ראשי דרוזופילה לצביעה פלואורסצנטית משופרת של המוח וצביעה חיסונית

2.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67791

⸱

7 בפברואר 2025

 ,  , 
1Department of Pathology, Division of Molecular and Cellular Pathology, Heersink School of Medicine, The University of Alabama at Birmingham, 2Department of Neurobiology, Heersink School of Medicine, The University of Alabama at Birmingham, 3UAB Nathan Shock Center

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מציג פרוטוקול פשוט לעיבוד רקמות הכולל עריפת ראש, קיבוע, קריוסקציה, צביעה פלואורסצנטית, צביעה חיסונית והדמיה, שניתן להרחיב להדמיה קונפוקלית ורב-פוטונית. השיטה שומרת על יעילות דומה לדיסקציות מורכבות, ועוקפת את הצורך במיומנויות מוטוריות מתקדמות. ניתוח תמונה כמותי מספק פוטנציאל חקירה נרחב.

תקציר

צביעה חיסונית של מוחות Drosophila melanogaster חיונית לחקר המנגנונים מאחורי התנהגויות מורכבות, מעגלים עצביים ודפוסי ביטוי חלבונים. שיטות מסורתיות כרוכות לעתים קרובות באתגרים כגון ביצוע דיסקציה מורכבת, שמירה על שלמות הרקמות והדמיית דפוסי ביטוי ספציפיים במהלך הדמיה ברזולוציה גבוהה. אנו מציגים פרוטוקול אופטימלי המשלב הקפאה עם צביעה פלואורסצנטית וצביעה חיסונית. שיטה זו משפרת את שימור הרקמות ואת בהירות האותות ומפחיתה את הצורך בדיסקציה מאומצת להדמיית מוח של דרוזופילה. השיטה כוללת חיתוך מהיר, קיבוע אופטימלי, הגנה מפני הקפאה והקפאה, ולאחר מכן צביעה פלואורסצנטית וצביעה חיסונית. הפרוטוקול מפחית משמעותית את הנזק לרקמות, משפר את חדירת הנוגדנים ומניב תמונות חדות ומוגדרות היטב. אנו מדגימים את היעילות של גישה זו על ידי הדמיה של אוכלוסיות עצביות ספציפיות וחלבונים סינפטיים בנאמנות גבוהה. שיטה רב-תכליתית זו מאפשרת ניתוח של סמני חלבון שונים במוח הבוגר על פני מישורי z מרובים וניתן להתאים אותה לרקמות אחרות ולאורגניזמים מודלים. הפרוטוקול מספק כלי אמין ויעיל לחוקרים המבצעים אימונוהיסטוכימיה באיכות גבוהה במחקרי נוירוביולוגיה של דרוזופילה. ההדמיה המפורטת של שיטה זו מאפשרת ניתוח מקיף של נוירואנטומיה, פתולוגיה ולוקליזציה של חלבונים, מה שהופך אותה לבעלת ערך מיוחד למחקר במדעי המוח.

מבוא

התנהגויות מורכבות החל מאינטראקציות חברתיות1, תפיסה ועיבוד חושי2, למידה3 ועד תנועה4 מונעות על ידי המוח. הפרעות נוירולוגיות נפוצות יותר ויותר וצפויות לגדול עם הזמן 5,6. זה קריטי לחקור כיצד המוח פועל גם בבריאות וגם בחולי. הדוגמה המרכזית של הביולוגיה המולקולרית מציעה שאחד התפקידים החשובים ביותר של יחידות ביולוגיות הוא חלבונים7, וכמה והיכן הם באים לידי ביטוי הם קריטיים להבנת אופן פעולתו של המוח.

Drosophila melanogaster, הידוע בכינויו זבוב הפירות, הוא מודל בעל ערך רב לחקר תפקוד המוח בתנאים מזדקנים ופתופיזיולוגיים8. הזמינות של כלים גנטיים מתקדמים בדרוזופילה מאפשרת לחוקרים לחקור את התפקוד של כמעט כל חלבון9, עם ספריות גנטיות מקיפות כמעט לכל גן נגישות10. יחד עם תוחלת החיים הקצרה וקצב הרבייה הגבוה, תכונות אלה הופכות את הדרוזופילה למודל יוצא דופן לחקר המוח11. זה הוביל להישגים משמעותיים, כולל פיתוח מפת מוח מלאה של הזבוב12, ואפילו תרם לפרס נובל על הבהרת המנגנונים העצביים של מקצבים צירקדיים ושעונים מולקולריים 13,14,15. כתוצאה מכך, דרוזופילה נותרה מערכת רבת עוצמה ורב-תכליתית, המניעה קדימה את ההבנה שלנו לגבי תפקוד המוח ומספקת תובנות חסרות תקדים לגבי תהליכים נוירולוגיים.

אימונוהיסטוכימיה ואימונופלואורסצנציה הם כלים בסיסיים לחקר ביטוי חלבונים באתרם. בניגוד לטכניקות כמו Western Blot, המאפשרות רק ניתוח כמותי למחצה ומתבצע בדרך כלל ברקמה בתפזורת16, או טכניקות מסובכות ויקרות כמו ספקטרומטריית מסה למדידת רמת חלבון17, אימונוהיסטוכימיה היא פשוטה יחסית ומאפשרת הן כימות של ביטוי חלבון והן מדידת לוקליזציה של חלבון בתוך רקמה או תא. חשוב לציין, אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית יכולה גם להיות מרובה כדי למדוד חלבונים מרובים כדי לזהות סוגי תאים ורקמות ספציפיים או לענות על שאלות מרובות באותה רקמה. בנוסף, קיבוע רקמות יכול לאפשר השוואות בין תנאי ניסוי שונים, גנוטיפים, גילאים ונקודות זמן צירקדיות. עם זאת, אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית יכולה להיות מאתגרת, וגורמים רבים יכולים להשפיע על איכות התמונה. פרוטוקול הקפאה וצביעה חיסונית אופטימלי זה עבור מוחות של דרוזופילה נועד לשפר את ההדמיה ברזולוציה גבוהה על ידי שיפור שימור הרקמות, חדירת נוגדנים והדמיה של אוכלוסיות עצביות וסמני חלבון. פותח כדי להתמודד עם אתגרים בשיטות מסורתיות, כגון דיסקציה מורכבת, נזק לרקמות ורזולוציית הדמיה מוגבלת הקשורה לתושבות מוח שלמות18. פרוטוקול זה משלב הקפאה עם צביעה פלואורסצנטית כדי להבטיח שלמות מבנית והדמיה חדה על פני מישורי z מרובים. בהשוואה לתכשירים שלמים, שיטה זו ממזערת עיוותים, מאפשרת דיפוזיה עמוקה יותר של נוגדנים ומספקת ניתוחי לוקליזציה נוירו-אנטומיים וחלבונים ברורים18. הרבגוניות שלו מאפשרת הסתגלות לרקמות אחרות ולאורגניזמים מודלים, ומציעה כלי אמין ויעיל למחקר במדעי המוח19,20. ניתן להתאים אותו לבחון כמעט כל חלבון וליישם אותו לחקר כל מצב, מחלה או מודל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת ציוד

  1. ודא שהקריוסטט מופעל ומוגדר ל-20 מעלות צלזיוס. הפעל את מחמם המגלשות או חממה קטנה, וודא שהוא מוגדר ל-37 מעלות צלזיוס.
    הערה: בשלב זה, ניתן להניח שקופיות מסומנות על המחמם או החממה ולהשאיר ללא הגבלת זמן עד לחתך.

2. הכנת פתרונות

  1. הכן 50 מ"ל של 1x מי מלח חוצץ פוספט (PBS), pH 7.4, ממלאי 10x PBS. הכן תמיסה של 4% פרפורמלדהיד ב- PBS בנפח סופי של 10 מ"ל.
  2. הכינו תמיסת ניקוי של 70% אתנול במים בבקבוק ריסוס. הכן תמיסת חסימה (3% אלבומין בסרום בקר (BSA) בתמיסת מלח Tris-buffered ממלאי 20x). הכן תמיסת נוגדנים ראשונית (הדילול תלוי בניסוי). כאן, נעשה שימוש בדילול של 1:250 של נוגדן עכבר ApoE ב-3% BSA ב-TBS.
  3. הכן תמיסת נוגדנים משנית (הדילול תלוי בניסוי). כאן, נעשה שימוש בדילול של 1:500 של קמח אלקסה 750 A21037 עז נגד עכבר משני ב-3% BSA ב-TBS.
  4. הכן תמיסת כתמים פלואורסצנטיים (דילול תלוי בניסוי). כאן מכינים תמיסה של 5 מיקרוגרם/מ"ל של הנילוס האדום ב-PBS.
    הערה: יש לקרר את כל התמיסות, במיוחד פלורסנט, ולאחסן במיכל קירור כהה. יש להביא אותם גם לטמפרטורת החדר ממש לפני השימוש.

3. איסוף רקמות

  1. לאחר השגת זבובים בבקבוקונים מזדקנים, פתח את השסתום על מחצלת CO2 והשליך את הזבובים על המחצלת במהירות כדי למנוע בריחה. חכו שהזבובים יאבדו את ההכרה ברובם, ויפסיקו את רוב התנועה. המיקום עף מתחת למיקרוסקופ SZ61 על ידי הזזת המחצלת מתחת לעדשת האובייקט. כוונן את ההגדלה והמיקוד כך שהזבובים יהיו גלויים בבירור ונוחים לעריפת ראש.
    הערה: הזבובים המשמשים לדוגמא זו הם ELAV/+ ו-ELAV>ApoE4
  2. הכנס מספריים קפיציים בין בית החזה לראש, לחץ בחוזקה וערף את ראשיהם של 5 עד 10 ראשי זבובים לכל קבוצת ניסוי. החזירו זבובים שאינם בשימוש לבקבוקון המזדקן שלהם.
    הערה: אם קיים חשש לגבי חדירת קיבוע, ניתן לבצע חתך קטן בחלק האחורי של הראש כדי לאפשר חדירה מוגברת של חומר הקיבוע בשלב 4.1.
  3. בעזרת מברשת, הניחו בעדינות ראשים בצינורות מסומנים של 1.5 מ"ל על קרח עד לאיסוף קבוצות ELAV/+ ו-ELAV>ApoE4.

4. קיבוע של רקמה שלמה

  1. הסר את הצינורות מהקרח ופיפטה 100 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד בתמיסת PBS לכל צינור, וודא שכל הראשים שקועים בתמיסה. אם הראשים נצמדים לדפנות הצינור ונמנעים ממגע עם התמיסה, השתמש במברשת כדי לדחוף אותם בעדינות כלפי מטה או הקש קלות על משטח אופקי כדי להבטיח מגע מתאים.
  2. יש להניח על שייקר אורביטלי בהגדרה בינונית למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות, השליכו את תמיסת הפרפורמלדהיד והחליפו אותה ב-1x PBS למשך 10 דקות, וודא שכל הראשים שקועים בתמיסה.
  3. זורקים את התמיסה הקודמת בכל פעם, שוטפים את הטישו עם PBS 2x למשך 10 דקות כל אחד, בסך הכל 3 כביסות.
  4. לאחר הכביסה האחרונה, העבירו את הראשים לסוכרוז של 10% בתמיסת PBS, וודאו שהראשים שקועים בתוך הצינור. השאירו אותם למשך הלילה לרוויה אופטימלית.
    הערה: אם רוצים הדמיה באותו יום, ניתן להפחית את עירוי הסוכרוז; עם זאת, גם השפעות ההקפאה יופחתו באופן יחסי.

5. הכנת עובש

  1. מלאו תבנית מסומנת כ-50% בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT), המאפשרת לה להתפשט לכל 4 פינות התבנית.
  2. בעזרת מברשת, הניחו בזהירות את הראשים על פני ה-OCT בתוך התבנית. בעת הנחת מספר קבוצות ניסוי באותה תבנית, ודא שקבוצות אלו מופרדות בתוך התבנית כדי למנוע בלבול.
    הערה: חשוב למנוע דילול של תרכובת ה-OCT באמצעות זיהום בתמיסת הסוכרוז הקודמת באמצעות המברשת. בנוסף, מיקום עמוק לתוך ה-OCT באמצעות המברשת יכול ליצור בועות רבות סביב הראשים. הימנע מטעויות אלה כדי למנוע בעיות חתך מאוחר יותר.
  3. בעזרת קצה המלקחיים, דחפו לאט כל ראש לתחתית התבנית כשהעיניים פונות לתחתית. כיוון זה נבחר לחיתוך במישור העטרה.
  4. הימנע מניקוב או ריסוק הראשים בתחתית התבנית במהלך תהליך זה. יישר את כל הראשים במידות X, Y ו- Z כך שכל מקטע יכיל את כל הנושאים בו-זמנית. הקפידו על טבילה איטית כדי להפחית את היווצרות בועות האוויר.
  5. לאחר שכל הראשים מיושרים כהלכה, הניחו בזהירות תבניות ישירות לתוך -20 מעלות צלזיוס להקפאה.
    הערה: אם צוין כי יישור הראשים כבוי משמעותית במהלך החיתוך, שקול להשתמש בקרח יבש או בחנקן נוזלי להקפאה ראשונית של התבנית.
  6. לאחר שהתבנית קפאה ברובה, מלאו את השארית ב-OCT והניחו לה להקפיא לפני האחסון לטווח הארוך ב-80 מעלות צלזיוס.

6. הקפאת תבניות

הערה: בדרך כלל רצוי להכין ולחתוך תבנית ריקה לפני חיתוך תבניות קבוצתיות ניסוי. זה מאפשר להבטיח את הפונקציונליות התקינה של הגלגל, הלהב והזכוכית נגד גלגול מיד לפני חיתוך רקמה.

  1. חבר את סיבית הצ'אק לתבנית על ידי מריחת כמות נדיבה של OCT על התבנית והנחת הביט מעל, לחיצה שטוחה. אפשר לזה לקפוא לחלוטין בקריוסטט, בדרך כלל תוך 5 דקות.
  2. שחרר את הביט ואת בלוק ה-OCT מהתבנית והנח אותו לתוך הצ'אק, וודא שהתבנית נשארת מכוונת כראוי מלמעלה למטה. הדק את מפתח הצ'אק עד שהביט מאובטח.
  3. יישר את הבלוק עם הלהב באמצעות כפתורי הכוונון ובקרות עומק הצ'אק.
  4. הגדר את רוחב המקטע ל-20 מיקרומטר. חותכים כל פרוסה בהילוך איטי אך עקבי, ומאפשרים לזכוכית נגד גלגול ללכוד כל פרוסה. צלם קטעים באמצעות השקופיות המחוממות על ידי נגיעה בשקופית לקצה הקרוב יותר של הקטע ומתן אפשרות לקטע לעלות למעלה על המגלשה. ניתן להתאים עד שמונה חלקים על שקופית בגודל סטנדרטי (25 מ"מ x 75 מ"מ x 1 מ"מ) כאשר המרווחים מתאימים.
    הערה: יש עניין של בחירה בעת בחירת החלקים לאסוף. כתוצאה מכוונת ההטמעה, חלקים מוקדמים יותר יהיו מהחלק הקדמי, וחלקים מאוחרים יותר יהיו מהחלקים האחוריים של הראש. ככזה, אם העניין הוא בתחום מסוים יותר מאשר אחר, ניתן להתאים את בחירת הסעיפים בהתאם. לחלופין, ניתן לאסוף את כל החלקים במספר שקופיות עד שלא תישאר רקמה.
  5. הניחו לשקופיות להתייבש בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות אך לא יותר משעה.

7. צביעה ו-IHC

הערה: עבור פרוטוקול זה, השיטה תפרט את IHC באמצעות נוגדן ראשוני לא מצומד. יש להשתמש בנוגדנים מצומדים פלואורוכרום, או כתמים פלואורסצנטיים אחרים שניתן לבצע בשלב אחד, יחד עם הנוגדן המשני אם יש להשתמש בשניהם יחד.

  1. מיד לאחר תקופת הייבוש, הסר OCT בשולי המגלשה באמצעות סכין גילוח, והשאיר מקום לגבול הידרופובי. צייר גבול הידרופובי על כל שקופית באמצעות הסמן. הניחו לייבוש למשך 5 דקות.
  2. שטפו את כל המגלשות 3 פעמים למשך 5 דקות כל אחת עם PBS על ידי פיפטינג בעדינות על גבי המגלשה, הימנעו מפיפטינג ישירות על גבי הטישו במידת האפשר.
    הערה: הפיפטה של 1000 מיקרוליטר שימושית ביותר כאן. שקופית בגודל סטנדרטי עם רקמה צריכה להיות מכוסה לחלוטין ב-750 מיקרוליטר של כל תמיסה. ניתן להשתמש גם במדפי שקופיות ודליים.
  3. לאחר שטיפת המגלשות, פיפטה 3% BSA בתמיסת חסימת TBS על המגלשות. מניחים לדגור למשך 30 דקות.
  4. השליכו את תמיסת החסימה והעבירו את תמיסת הנוגדנים העיקרית על השקופיות. במקרה זה, דילול של 1:250 של SC-13521 ApoE ב-3% BSA ב-TBS. אפשר לנוגדנים לדגור למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס או למשך שעה בטמפרטורת החדר. השתמש במגבוני טישו לחים או במגבות נייר כדי למנוע מהתמיסה להתייבש בן לילה.
  5. השליכו את הנוגדן העיקרי והשתמשו בפיפטה, שטפו 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחת עם PBS.
  6. הוסף את תמיסת הנוגדנים המשנית. במקרה זה, דילול של 1:500 של AF 750 Goat Anti-Mouse בנוסף לריכוז של 5 מיקרוגרם/מ"ל של אדום הנילוס, הכל ב-3% BSA ב-TBS. אפשר לזה לדגור למשך שעה בטמפרטורת החדר.
    הערה: אנו דוגרים בו זמנית כתם פלואורסצנטי ונוגדנים משניים באותו מאגר, 3% BSA ב-TBS. זה מועדף כל עוד אין התנגשויות ידועות בין שני הריאגנטים. אם קיימים קונפליקטים, יש לדגור בנפרד ולבצע 3 שטיפות נוספות בין הדגירות.
  7. שטפו את המגלשות 3 פעמים עם PBS למשך 5 דקות כל אחת. לאחר הכביסה האחרונה, השאירו כמות קטנה של PBS על השקופית.

8. הרכבה והכנה להדמיה

  1. בעזרת פיפטה של 1000 מיקרוליטר, הוסף 3-5 טיפות של אמצעי הרכבה מתקשים המכיל DAPI (0.9 מיקרוגרם/מ"ל), באופן שווה על פני המגלשה והימנע מנפילה ישירה על הרקמה.
  2. הנח את הכיסוי על המגלשה, הימנע מכל היווצרות בועות אוויר.
    הערה: השימוש במלקחיים יכול לסייע בכך בכך שהוא מאפשר לכיסוי להחליק קרוב לפני השטח של המגלשה לפני שחרורו הסופי.
  3. טפל במגלשות טריות שהותקנו בזהירות ואחסן אותן שטוחות עד לייבוש מלא. אטמו שקופיות באמצעות לק אם צפוי אחסון לטווח ארוך.
  4. צלם תמונות בהקדם האפשרי כדי למנוע דעיכה פלואורסצנטית.

9. רכישת תמונות

הערה: לצילום תמונות, יפורט השימוש בתוכנת Olympus Cell Sense Dimensions.

  1. לפני ההדמיה, בדוק את השקופיות ונגב אותן באמצעות 70% אתנול בתמיסת מים. אם שקופיות מצולמות מיד לאחר ההרכבה, היזהר במיוחד בעת הניקוי כדי למנוע הפרעה לכיסוי. הניחו למשטחי המגלשה והכיסוי להתייבש במשך 5 דקות לפני ההדמיה.
  2. בחר כל ערוץ רצוי לצילום, במקרה זה, את הערוצים עבור DAPI, Nile Red ו-AF 750.
    1. בחר את ההגדלה הרצויה כמתואר להלן. בחירת ההגדלה תלויה בניסוי; כאן, השתמש בהגדלה של פי 10.
      הערה: כל ההגדלות ניתנות לשימוש, כולל עדשות על בסיס שמן. אם תרצה, מרח שמן טבילה על משטח השקופית.
    2. עבור כל ערוץ, כייל את זמני החשיפה המתאימים על סמך הנבדקים הבהירים ביותר בניסוי. הימנע מחשיפת יתר תוך יצירת תמונה בהירה ככל האפשר.
      הערה: באופן כללי, שני הגורמים העיקריים ללכידת תהליך גרועה הם חשיפת יתר, וכתוצאה מכך אובדן הגדרה, ויותר מדי אות רקע, שקשה להפריד מהאות האמיתי. בנוסף, יש להגדיר חשיפות באופן עצמאי עבור כל הגדלה ייחודית בשימוש.
    3. בחר את התיקייה לשמירה ותן שם לתמונות הממוזגות בתפריט. לאחר הצילום, כל התמונות ימוקמו בתיקיה זו ויישאו את השם המוגדר כאן.
    4. צלם תמונות על-ידי התמקדות תחילה בנושא בערוץ המאפשר את נקודת המוקד הטובה ביותר ולאחר מכן התחל באיסוף. שמור על נוהל ההתמקדות בכל נושא באותו ערוץ לעקביות לאורך הניסוי.
    5. לכוד את כל קבוצות הניסוי המשמשות להשוואות מאוחרות יותר באותו יום כדי למנוע דעיכה פלואורסצנטית בין קבוצות ההשוואה.

10. כימות

הערה: ניתן לבצע כימות באמצעות מגוון תוכנות. כאן מוזכר השימוש ב- Olympus CellSense Dimensions.

  1. לאחר האוסף, סקור את התמונות. הסר קטעים המכילים פגמים או חפצי חתך מתיקיית הכימות. בחר תמונות המשקפות את מטרת הכימות. דוגמאות לפגמים הן בועות, קטעים קרועים, רקמות חופפות ואבק או פסולת.
    1. כדי לבחור תמונות מתאימות, ודא שכל התמונות הכוללות רקמת מוח משמשות לכימות כדי לשקף את הביטוי הכללי ברחבי המוח. לחלופין, השתמש בתמונות המשקפות רק את המוח הקדמי, האמצעי או האחורי כדי לתת תובנה לגבי הבדלים בביטוי באזורים אלה.
  2. בתוך תפריטי הספירה והמדידה, קבע את הפרמטרים המעניינים ואת גבולותיהם לכימות תמונות.
    1. לכימות ביטוי ApoE על ידי השוואת ערכי עוצמה ממוצעת, בחר ערכי סף כך שכל הפיקסלים עבור אותו ערוץ ייחשבו (0-אינסוף). בנוסף, שרטט אזורי עניין באמצעות כלי ציור זמינים.
  3. הפעל את הספירה ומדוד באצווה עבור כל הקבצים או בנפרד על כל תמונה.
    1. לעיבוד אצווה, רשום את ההגדרות וביצוע הכימות ולאחר מכן בחר את התיקיה לביצוע כמות. עיבוד באצווה נגיש דרך הכרטיסיה מנהל המאקרו ומאיץ מאוד את זרימת העבודה.
  4. ייצא את טבלת הנתונים לגיליון אלקטרוני לצורך התוויה. לשם כך, השתמש בתפריט התוצאות של ספירה ומדידה בעת פתיחה או ייצוא לטבלה באופן אוטומטי בעת ביצוע אצווה. טבלאות נתונים אלה יכילו את כל הפרמטרים שנבחרו בשלב 10.2.
  5. לניתוח סטטיסטי ושרטוט, התווה נתונים באמצעות גיליון אלקטרוני ישירות, או באמצעות תוכנה אחרת. היכרות עם התוכנה הנבחרת היא המפתח ליצירת ייצוג מדויק של תוצאות הניסוי. כאן, ערכי עוצמה מוחלטים של ביטוי ApoE במוח של המוטאנט נורמלו לבקרה ולאחר מכן שורטטו באמצעות GraphPad Prism.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

השיטה שתוארה לעיל מאפשרת הדמיה פלואורסצנטית של מוחות זבובים בוגרים באופן אמין וללא דיסקציה מייגעת. באיור 1, השיטה פשוטה וניתנת לביצוע במהירות אם כל הדגימות, הציוד והחומרים זמינים. לחלופין, באמצעות אחסון של -80 מעלות צלזיוס בשלב תבנית ה-OCT, ניתן לשמור דגימות לשימוש שבועות רבים לאחר מכן. אין צורך להכשיר חוקרים זמן רב כדי ללמוד את טכניקות הניתוח וההטמעה הפשוטות, מה שהופך את השיטה הזו לנגישה למדי.

דוגמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדמיה פלואורסצנטית מדויקת של ראשי דרוזופילה בהקפאה. זוהי גישה פשוטה שיש לה כמה יתרונות חשובים. כלומר, השיטות פשוטות מספיק שכל מי שיש לו הכשרה בסיסית בבטיחות במעבדה יכול להשלים, הן ניתנות להתאמה למדידת הביטוי של כל חלבון שקיימים נוגדנים איכותיים עבורו, והן מאפשרות מדידה מדויקת של כמה חלבון מעניין מתבטא והיכן הביטוי הזה מתרחש ברחבי הראש. אם איכות הרקמה והתמונה גבוהה מספיק, זה יכול לאפשר מיפוי תלת מימדי של ביטוי בכל ראש הדרוזופילה .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים לחברי מעבדת מלקני על עזרתם במשוב רב ערך על פיתוח הפרוטוקול. מלאי זבובים, Elav-Gal4 (BL#458) ו-UAS-ApoE4 (BL#76607) הושגו ממרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה (בלומינגטון, אינדיאנה, ארה"ב). עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) AG065992 ו-RF1NS133378 ל-G.C.M. עבודה זו נתמכת גם על ידי קרנות UAB Startup 3123226 ו-3123227 ל-G.C.M.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1000 uL פיפטהEppendorf3123000063
1000 uL קצות פיפטהאולימפוס פלסטיק23-165R
10X פוספט חוצץ מלח (PBS)FisherJ62036.K7ph=7.4
200 הוכחה אתנולDecon Laboratories64-17-5
20X Tris Buffered SalineThermo ScientificJ60877.K2pH=7.4
AF750 עז נגד עכבר נוגדן משניAlexa FluorA21037
זכוכית נגד גלגולIMEBAR-14047742497
ApoE עכבר נוגדן ראשוניסנטה קרוזSC13521
סרום בקר אלבומיןפישר9048-46-8
צינורות צנטריפוגה 1.5 מ"לפישר05-408-129
שקופיות טעונותGlobe Scientific1415-15
תבניות חיתוך הקפאהפישר2363553
CryostatLeicaCM 3050 S
להבי קריוסטטC.L. תרנגול הודוDT554N50
במים
??????
מלקחיים עדיניםFine ScienceTools 11254-20
Fly PadTritech ResearchMINJ-DROS-FP
התקשות מדיית הרכבה עם DapiVectashieldH-1800
KimwipesKimtech34120
מיקרוסקופאולימפוסSZ61
נילוס אדום SigmaN3013
תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימליתפישר4585
שייקר אורביטליOHAUSSHLD0415DG
Paraformaldehyde 20%מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים15713
סכיני גילוחGravey#40475
מספריים אביבייםכלי מדע עדינים15000-10
סוכרוזפישרS5-500
קרח יבש מזוקקים

מקורות

  1. Fabbri-Destro, M., Rizzolatti, G. Mirror neurons and mirror systems in monkeys and humans. Physiology. 23, 171-179 (2008).
  2. Faust, T. E., Gunner, G., Schafer, D. P. Mechanisms governing activity-dependent synaptic pruning in the developing mammalian CNS. Nat Rev Neurosci. 22, 657-673 (2021).
  3. Roozendaal, B., McEwen, B. S., Chattarji, S. Stress, memory and the amygdala. Nat Rev Neurosci. 10, 423-433 (2009).
  4. Arber, S., Costa, R. M. Networking brainstem and basal ganglia circuits for movement. Nat Rev Neurosci. 23, 342-360 (2022).
  5. GBD 2019 Dementia Forecasting Collaborators. Estimation of the global prevalence of dementia in 2019 and forecasted prevalence in 2050: an analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. Lancet Public Health. 7, e105-e125 (2022).
  6. Huang, Y., Li, Y., Pan, H., Han, L. Global, regional, and national burden of neurological disorders in 204 countries and territories worldwide. J Glob Health. 13, 04160(2023).
  7. Crick, F. Central dogma of molecular biology. Nature. 227, 561-563 (1970).
  8. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9, 235-244 (2016).
  9. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the Fly: A primer on the Drosophila model system. Genetics. 201, 815-842 (2015).
  10. Larkin, A., et al. FlyBase: updates to the Drosophila melanogaster knowledge base. Nucleic Acids Res. 49, D899-D907 (2021).
  11. Jeibmann, A., Paulus, W. Drosophila melanogaster as a model organism of brain diseases. Int J Mol Sci. 10, 407-440 (2009).
  12. Winding, M., et al. The connectome of an insect brain. Science. 379, eadd9330(2023).
  13. Bargiello, T. A., Jackson, F. R., Young, M. W. Restoration of circadian behavioural rhythms by gene transfer in Drosophila. Nature. 312, 752-754 (1984).
  14. Zehring, W. A., et al. P-element transformation with period locus DNA restores rhythmicity to mutant, arrhythmic Drosophila melanogaster. Cell. 39, 369-376 (1984).
  15. Huang, R. C. The discoveries of molecular mechanisms for the circadian rhythm: The 2017 Nobel Prize in Physiology or Medicine. Biomed J. 41, 5-8 (2018).
  16. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4, 429-434 (2012).
  17. Ong, S. E., Foster, L. J., Mann, M. Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics. Methods. 29, 124-130 (2003).
  18. Behnke, J. A., Ye, C., Moberg, K. H., Zheng, J. Q. A protocol to detect neurodegeneration in Drosophila melanogaster whole-brain mounts using advanced microscopy. STAR Protoc. 2, 100689(2021).
  19. Moraes, R. C. M., et al. Apolipoprotein E induces lipid accumulation through Dgat2 that is prevented with time-restricted feeding in Drosophila. Genes. 15 (11), 1376(2024).
  20. Roth, J. R., et al. Rapamycin reduces neuronal mutant huntingtin aggregation and ameliorates locomotor performance in Drosophila. Front Aging Neurosci. 15, 1223911(2023).
  21. Currier, T. A., Pang, M. M., Clandinin, T. R. Visual processing in the fly, from photoreceptors to behavior. Genetics. 224, (2023).
  22. McKellar, C. E., Siwanowicz, I., Dickson, B. J., Simpson, J. H. Controlling motor neurons of every muscle for fly proboscis reaching. Elife. 9, (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

DrosophilaOCT
הקפאה ישירה של ראשי דרוזופילה לצביעה פלואורסצנטית משופרת של המוח וצביעה חיסונית
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.