מאמר שיטה

מודל עכבר פצע דקירה לחקר דימום ודלקת בפגיעה מוחית טראומטית

1.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67797

⸱

21 בפברואר 2025

 ,  ,  , 
1Institute for Human Life Science, Ochanomizu University, 2Kitasato University School of Frontier Engineering

במאמר זה

סיכום

מודלים פשוטים של פגיעה מוחית טראומטית (TBI) הקלו על פיתוח גישות טיפוליות. פרוטוקול זה מתאר את היצירה של קליפת עכבר פצוע דקירה באמצעות מחטים, המאפשרת ניתוח של דימום ודלקת. מודל עכבר TBI פצוע דקירה מציע את היתרון של ביצוע ללא צורך בציוד מיוחד.

תקציר

פגיעה מוחית טראומטית (TBI) נובעת מנזק פיזי, שלעתים קרובות נגרם על ידי תאונות או אירועים שקשורים לספורט. הגורמים ל-TBI הם מגוונים, כולל זעזועי מוח, חבלות מוחיות, המטומות ושברים בגולגולת. כדי לשכפל את הגורמים השונים האלה, מודלים שונים של עכברי TBI פותחו באמצעות פרוטוקולים שונים. פגיעה מוחית פיזית מובילה לפגיעות מוח ראשוניות ומשניות כאחד, אשר מחמירות את אובדן העצבים. פגיעה ראשונית מתרחשת מיד לאחר הנזק, לרוב עקב דימום, ולאחר מכן מעוררת פציעות משניות, כולל דלקת סביב הנגע. לכן פיתוח מודל TBI המתאים להערכת התפשטות דימום וחומרת דלקת הוא קריטי. פרוטוקול זה מציג שיטה לחיקוי פגיעה מוחית חודרת, המכונה מודל עכבר TBI פצע דקירה, כדי לחקור מנגנונים של דימום, דלקת ואובדן עצבי שקשורים לפתולוגיה של TBI. מודל זה נוצר על ידי ניקוב הגולגולת והמוח במחטים והוא פשוט לביצוע ללא צורך בציוד ניסיוני מיוחד. בנוסף, הפגיעה הקלה בקליפת המוח של העכבר באמצעות מחט אינה משפיעה על התנהגות החיה לאחר הניתוח. תכונה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את ההשפעות המקומיות של פגיעה מוחית ללא חששות לגבי השלכות התנהגותיות רחבות יותר. נתוני דגימה מקליפת המוח של עכברים פצועי דקירה מדגימים את יעילות המודל בהערכת דליפת דם לפרנכימה, הפעלת גליה וייצור ציטוקינים דלקתיים. יתר על כן, פרוטוקול זה מקל על הערכה של קרישי דם ותרכובות אנטי דלקתיות, ומסייע בפיתוח חומרים טיפוליים ל-TBI.

מבוא

פגיעה מוחית טראומטית (TBI) נגרמת על ידי נזק פיזי, שלעתים קרובות נובע מתאונות, כולל תאונות דרכים ותאונות נפילה. TBI מסווגת לשני סוגים: פגיעה מוחית חודרת, שמתרחשת כאשר חפץ חד מחורר את הגולגולת כמו גם את המוח, ופגיעה מוחית סגורה, שנגרמת על-ידי טלטול אלים של המוח בפנים ללא שבר בגולגולת1.

הגורמים ל-TBI מגוונים מאוד, כולל זעזועי מוח, חבלות מוחיות, המטומות ושברים בגולגולת; לכן, מודלים של עכברי TBI פותחו באמצעות פרוטוקולים שונים כדי לשכפל את הגורמים השונים האלה. לדוגמה, מודל TBI חוזר על עצמו כולל רעידות מוח, כאשר עכברים נתקעים כמה פעמים באמצעות פגיעת גומי2 מבוקרת אלקטרומגנטית. נוסף על כך, במודל TBI של ירידת משקל, כוח חיצוני חזק מופעל על הראש על ידי התקן סטנדרטי לירידת משקל, מה שגורם לפגיעה קהה מוקדית עם גולגולת שלמה3. יתר על כן, מודל TBI של פצע דקירה מוכן על ידי ניקוב הגולגולת והמוח באמצעות מחט4 (איור 1A). מאחר שפותחו כמה מודלים של TBI, חשוב לבחור מודל שמבוסס על הפתולוגיה הספציפית שצריך להתבונן.

פגיעה מוחית הנגרמת על ידי נזק פיזי מובילה לפגיעות מוחיות ראשוניות ומשניות, אשר מחמירות עוד יותר את אובדן העצבים. פגיעה ראשונית מתרחשת מיד לאחר הנזק, כתוצאה מהתמוטטות מחסום הדם-מוח (BBB), דימום והמטומה. לכן, מזעור דימום והתרחבות המטומה הוא קריטי, מאחר שגורמים אלה יכולים להחמיר את חומרת תסמיני TBI. פגיעה משנית מופעלת על ידי רכיבי דם תוך-פרנכימליים, אשר מובילים לאחר מכן לדלקת סביב הנגע5. הפרוגנוזה לאחר פגיעה מוחית תלויה בדינמיקה הדלקתית; לכן, חיוני להפחית במהירות פגיעות ראשוניות ומשניות לפרוגנוזה חיובית 6,7,8.

ה-BBB מורכב מפריציטים, צמתים הדוקים בין תאי אנדותל, וכפות הקצה של אסטרוציטים, הפועלים יחד כדי להגביל דליפה של חומרים מכלי הדם במוחות בריאים9. במערכת פצע הדקירה המוצגת, ה-BBB משובש פיזית. שיטות נפוצות להערכת שלמות ה-BBB כוללות צביעה לאימונוגלובולין G (IgG) והערכת דליפה של עוקבי פלואורסצנטיים, כגון כחול אוונס ודקסרן10,11. צביעת IgG מסמנת רכיבי דם שדולפים ממקום הנגע ושוקעים במוח. ככל שה-BBB מתאושש, דליפת רכיבי הדם למוח פוחתת, והמשקעים האלה מתפרקים בהדרגה. לכן, צביעת IgG משמשת להערכת מידת התאוששות ה-BBB לאחר פגיעה מוחית. בנוסף, רמת הדליפה של עוקב הניתן תוך ורידי לפרנכימה המוחית משקפת את ההתאוששות של BBB. שיטה זו מספקת הערכה ברורה יותר של דינמיקת ה-BBB, שכן דליפת עוקב מצביעה ישירות על מעבר של רכיבי דם מזרם הדם לפרנכימה של המוח. יתר על כן, מזעור הדימום מוביל לפגיעה ראשונית קלה יותר, הנתמכת על ידי קרישת דם מהירה ופיברינוליזה בזמן. לכן, כימות הביטוי של מווסתי קרישת הדם והפיברינוליזה הוא דרך יעילה לנתח תהליך זה. לגבי המנגנון המולקולרי העומד בבסיס הקרישה, דימום לאחר פגיעה מוחית נעצר על ידי היווצרות פיברין. לאחר מכן, הפקקת העשירה בפיברין מתפרקת על ידי מפעיל פלסמינוגן רקמות (tPA) ומפעיל פלסמינוגן אורוקינאז (uPA). במודל של עכבר TBI פצוע דקירה, היווצרות הפיברין מגיעה לשיאה ביום אחד אחרי הפציעה, ופוחתת לאחר מכןב-10. לפיכך, ניתן לחזות את רמת ההתאוששות של ה-BBB על ידי כימות מרכיבי הדם ואקסטרוואזציה של עוקבים לפרנכימה המוחית, כמו גם ביטוי גורמי קרישת הדם.

שיטות כימות לדלקת בתהליך הפגיעה המשנית כוללות הפעלת גליה וביטוי ציטוקינים דלקתיים. דלקת ממושכת נגרמת בעיקר על ידי הצטברות יתר של מיקרוגליה ואסטרוציטים סביב אתר הנגע. לדוגמה, במודל TBI של פצע דקירה, פצעי דקירה מעוררים הפעלה מחדש של תאי גליה סביב הנגע כדי להסיר את פסולת התא ואת מרכיבי הדם. הפעלה מחדש של גליה זו מגיעה לשיאה בדרך כלל 3 ימים לאחר פצע הדקירה12,13. בנוסף לתפקוד הפגוציטוזיס שלהם, תאי גליה שהופעלו מחדש מפרישים ציטוקינים דלקתיים מוגזמים, וכתוצאה מכך אובדן עצבי סביב הנגע14. דווח כי הנחתה של דלקת גליה תורמת לפרוגנוזה חיובית לאחר פגיעה מוחית12,14. קביעת רמת הדלקת שימושית להערכת החומרה והפרוגנוזה. לכן, חיוני לפתח מודל TBI שמתאים להערכת התפשטות הדימום וחומרת הדלקת. המחקר הזה מציג מודל של עכבר פצע דקירה שמחקה פגיעה מוחית חודרת, במטרה לחקור את המנגנונים של דימום, דלקת ואובדן עצבי בפתולוגיה של TBI.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל פרוטוקולי הטיפול בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת אוצ'נומיזו, יפן, ובוצעו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי משרד החינוך, המדע והתרבות ביפן. נעשה שימוש בעכברים נקבות C57BL/6J בוגרות בנות שישה שבועות (20-25 גרם). לכל העכברים ניתנה גישה חופשית למזון ומים בסביבה נקייה. פרטים על הריאגנטים והציוד המשמשים מפורטים בטבלת החומרים.

1. ניתוח פצע דקירה בקליפת המוח

  1. הכנת ריאגנטים
    הערה: פרוטוקול ההרדמה דומה לזה שתואר קודם לכן15. אם מתקן בעלי החיים ממליץ על חומר הרדמה ספציפי, אנא עקוב אחר הוראותיו. אושר בעבר כי נתרן פנטוברביטל יעיל לניתוח פצע דקירה בקליפת המוח 4,13,16,17.
    1. הרדמה משולבת MMB: ממיסים 1.875 מ"ל של 1 מ"ג/מ"ל מדטומידין, 2.0 מ"ל של 5 מ"ג/מ"ל מידזולם ו-2.5 מ"ל של 5 מ"ג/מ"ל בוטאורפנול טרטרט ב-18.625 מ"ל של מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) ליצירת נפח כולל של 25 מ"ל. לתערובת זו יהיה ריכוז של 75 מ"ג/ליטר מדטומידין, 400 מ"ג/ליטר מידזולם ו-500 מ"ג/ליטר תערובת בוטאורפנול טרטרט. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד 8 שבועות לפני השימוש.
    2. אנטגוניסט הרדמה: ממיסים 150 מיקרוליטר של 5 מ"ג/מ"ל אטיפמזול הידרוכלוריד ב-9.85 מ"ל של PBS ליצירת נפח כולל של 10 מ"ל, בריכוז של 75 מ"ג/ליטר אטיפמזול הידרוכלוריד. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, מוגן מאור, עד 8 שבועות לפני השימוש.
  2. הליך כירורגי
    1. הרדמת עכבר: הרדמה זמנית של העכברים באמצעות נייר ספוג בתמיסת אינהלציה איזופלורן עד שהם נרדמים. לאחר מכן, יש להזריק 10 מיקרוליטר/גרם חומר הרדמה משולב MMB תוך פריטונאלי באמצעות מזרק של 1 מ"ל עם מחט בגודל 27 גרם x 3/4 אינץ'. לאחר 3-5 דקות, אשר את יעילות ההרדמה על ידי ביצוע צביטה בבוהן ובדיקת רפלקס הנכון.
      הערה: הקפד לשים לב היטב לא לתת מנת יתר של הרדמה בעת שימוש בתמיסת אינהלציה איזופלורן.
    2. הנח את העכבר על צדו הגחוני לתוך מגבת נייר. לאחר ההעברה, ודא שוב שהעכבר עדיין מורדם עם צביטה בבוהן.
    3. לגלח את הפרווה על עור אזור העורף. עקר את הפרווה בחלק האחורי של ראש העכבר עם 70% אתנול באמצעות צמר גפן. אחוז בעור העורף בעזרת מלקחיים קהים ובצע חתך ברוחב 1.0-1.5 מ"מ כדי לחשוף את עצם העורף מבלי לפגוע בגולגולת או באיבר כלשהו. פתחו בעדינות ובאיטיות את החתך כדי לראות את הגבול בין קליפת המוח למוח הקטן דרך הגולגולת (איור 1B).
      הערה: ודא שלא נגרם נזק לגולגולת או למוח עבור העכבר ללא פצע.
    4. קרניוטומיה של עכבר: צור חור קטן בהמיספרה הימנית של העצם העורפית באמצעות מחט בגודל 19 גרם x 1•1/2 אינץ'. סובב בעדינות את המחט כדי ליצור נקודת החדרה לדיקור פצע דקירה, תוך הקפדה לא לפגוע בפרנכימה המוחית. החור צריך להיות ממוקם בנקודת האמצע של הקו הבין-אוזני של ההמיספרה הימנית בין למבדה לקצה (איור 1B). חור זה משמש כמדריך להחדרת מחט פצע הדקירה בשלב שלאחר מכן.
    5. פצע דקירה: הכניסו מחט בגודל 27 G x 3/4 אינץ' מנקודת ההחדרה ודקרו את קליפת המוח לאורך ציר הרוסטרוקאודלי (איור 1B,C). המחט מוחדרת עד שהיא נוגעת בקדמת הגולגולת, ואז נסוגה בעדינות. העומק המתאים הוא כזה שבו ניתן לראות את המחט דרך פני השטח של קליפת המוח. הצד השמאלי של קליפת המוח משמש כבקרה לא פגומה.
    6. לתפור את חתך העור באמצעות תפר ניילון 3-0 עם מחט עגולה 1/2.
    7. יש לתת 10 מיקרוליטר/גרם של אנטגוניסט ההרדמה תוך צפקית כשילוב הרדמה MMB. העכבר אמור להיות מסוגל ללכת תוך 8-16 שעות לאחר הזרקת אנטגוניסט ההרדמה.

2. הערכת דימום והחלמה מהתמוטטות BBB

  1. צביעה אימונואנזימטית של קטע מוח פצוע דקירה לדליפת IgG של עכבר
    הערה: כאן נעשה שימוש בקטעי מוח קפואים המותקנים על שקופיות. חלקי מוח קפואים צפים חופשיים מתאימים גם הם לפרוטוקול זה.
    1. הרדמת עכבר: השראת הרדמה על ידי הנחת העכבר ליד נייר ספוג בתמיסת אינהלציה איזופלורן עד שהוא נרדם. לאחר מכן, יש לתת מיד 100 מיקרוליטר/ק"ג חומר הרדמה משולב MMB תוך צפק. אשר את השפעת ההרדמה באמצעות צביטת בוהן ורפלקס ימני.
    2. הנח את העכבר על גבו והצמד את שתי הידיים והרגליים ללוח החיתוך.
    3. כריתת בית החזה של העכבר: אחוז בעור הבטן באמצעות מלקחיים קהים ובצע חתך של 1.0-1.5 ס"מ דרך העור והצפק כדי לחשוף את כלוב הצלעות. פתח בזהירות את כלוב הצלעות במספריים תוך הימנעות מנזק ללב כדי לחשוף אותו לזלוף לב.
    4. קיבוע זלוף לב: הכן משאבת זלוף פריסטלטית והצמד צינור עם מחט בגודל 19 G x 1•1/2 אינץ' בקצה אחד. מלאו את הצינור ב-PBS על ידי הפעלת המשאבה לפני השימוש. לאחר מכן, בזמן שהמשאבה פועלת, הכנס את קצה המחט לחדר השמאלי ואבטח אותו בעזרת מלקחיים. בצע חתך של 0.5-1.0 מ"מ בפרוזדור הימני. העבר את העכבר18 בקצב של 4-6 מ"ל לדקה למשך 5 דקות עם לפחות 20 מ"ל של PBS כדי להסיר את הדם.
    5. עצור את המשאבה והעביר את הצינור לתמיסה של 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-PBS. הפעל מחדש את המשאבה בקצב של 4-6 מ"ל/דקה למשך 5 דקות עם לפחות 20 מ"ל של 4% PFA ב-PBS לקיבוע18.
      הערה: אם המשאבה אינה זמינה, ניתן גם להשתמש במזרק של 50 מ"ל עם מחט בגודל 19 גרם x 1•1/2 אינץ' לזילוף.
    6. דיסקציה מוחית: הניחו את העכבר על צד הגחון שלו על לוח החיתוך וחשפו את הגולגולת על ידי ביצוע חתך דרך קו האמצע של העור מאזור העורף לאף. חשוף בזהירות את המוח לחלוטין על ידי הסרת הגולגולת במספריים, תוך הקפדה לא לפגוע במוח. הרם את המוח בעזרת מלקחיים מעוקלים והעביר אותו לצינור של 15 מ"ל מלא ב-10 מ"ל של 4% PFA ב-PBS.
    7. דגרו את המוח המנותח למשך הלילה ב-4% PFA ב-PBS ב-4 מעלות צלזיוס לקיבוע מלא. לאחר מכן, דגרו את המוח למשך הלילה ב-10 מ"ל של 15% סוכרוז ב-PBS והעבירו אותו ל-10 מ"ל של 30% סוכרוז ב-PBS למשך יום נוסף על שייקר נדנדה. החלפת סוכרוז הדרגתית זו עוזרת למנוע נזק לרקמות מקרח כאשר המוח מאוחסן מאוחר יותר במקפיא.
    8. הטמעת מוח: הטמיעו את המוח באופן עטרתי במדיום הטבעה בתוך תבנית הטמעת רקמות ולאחר מכן הקפיאו באמצעות 2-מתילבוטן עם קרח יבש19.
    9. קטעי מוח קפואים: באמצעות קריוסטט, הרכיבו קטעי קורונל טוריים (בעובי 20 מיקרומטר) של המוח המוטבע על זכוכית שקופית טעונה חיובית. חלקי המוח מיובשים לחלוטין באוויר בטמפרטורת החדר למשך הלילה ומאוחסנים במקפיא של -80 מעלות צלזיוס.
    10. הכנת חוצץ חוסם: מערבבים 10% סרום עגל יילוד, 30 מ"ג/מ"ל אלבומין בקר, 10 מ"ג/מ"ל גליצין ו-0.4% טריטון X-100 ב-TBS כדי ליצור את המאגר החוסם. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שבועיים לפני השימוש.
    11. צביעת IgG של עכבר: לאחר ייבוש חלקי קליפת המוח הפצועים מדקירה בטמפרטורת החדר למשך שעה, יש לתקן אותם לאחר מכן עם 500 מיקרוליטר של 4% PFA לכל שקופית למשך 30 דקות. לאחר מכן, שטפו את החלק עם PBS (500 מיקרוליטר / שקופית) למשך 5 דקות, ולאחר מכן שתי שטיפות עם מי מלח עם Tris buffered (TBS, 500 מיקרוליטר / שקופית) למשך 5 דקות כל אחת.
      הערה: בצע את כל ההליכים בקופסת לחות כדי למנוע את התאדות המאגרים.
    12. להרוות את פעילות האנזימים האנדוגניים בקטעים עם 10% מתנול ו-3% מי חמצן ב-TBS למשך 5 דקות, ולאחר מכן שתי שטיפות עם מי מלח עם Tris-buffered (TBS, 500 מיקרוליטר / שקופית) למשך 5 דקות כל אחת.
    13. בצע חסימה באמצעות מאגר חוסם (500 מיקרוליטר / שקופית) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי למנוע קשירה לא ספציפית של הנוגדן. לאחר מכן, דגרו את החלקים עם נוגדן IgG מצומד ביוטין לעכבר (דילול של 1:300 עם המאגר החוסם, 300 מיקרוליטר / שקופית) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
    14. בזמן הדגירה עם נוגדן IgG של העכבר, הכינו את התערובת של 1 מיקרוליטר של מגיב A ו-1 מיקרוליטר של מגיב B מערכת פרוקסידאז מבוססת אבידין/ביוטין ב-300 מיקרוליטר של המאגר החוסם. דגרו על תערובת זו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לפני השימוש. לאחר השלמת הדגירה של נוגדני IgG של העכבר, יש לשטוף את החלקים עם TBS למשך 5 דקות, שלוש פעמים. לאחר מכן, דגרו את החלקים עם התערובת המוכנה של מגיב A ו-B (300 מיקרוליטר / שקופית) למשך שעה בטמפרטורת החדר.
    15. שטפו את החלקים עם 0.1 M Tris-HCl pH 8.0 למשך 5 דקות, שלוש פעמים, במהלך שעה. לאחר מכן, פתח צבע באמצעות 0.05% 3,3'-diaminobenzidine (DAB) ב-0.05% מי חמצן בתוספת 0.1 M Tris-HCl pH 8.0 (500 מיקרוליטר / שקופית) למשך 5 דקות עד שעה (איור 2A). התבונן במיקרוסקופ לשינוי צבע לפני הפסקת התגובה.
    16. שטפו את החלקים עם 0.1 M Tris-HCl pH 8.0 למשך 5 דקות שלוש פעמים, וייבשו את החלקים באוויר למשך 15 דקות. לאחר מכן, יש לייבש את החלקים על ידי טבילתם באתנול 95% למשך 2 דקות פעמיים, ולאחר מכן 100% אתנול למשך 2 דקות, פעמיים. נקה את החלקים בקסילן למשך 5 דקות פעמיים. כיסויהחלק את החלקים באמצעות אמצעי הרכבה בלתי מסיס במים ואפשר להם להתייבש.
    17. ניתוח עוצמת צביעת IgG של עכבר: צלם תמונות של החלקים באמצעות מיקרוסקופ עם מטרה של פי 20.
    18. באמצעות תוכנת ImageJ, כמת את עוצמת הצביעה על ידי מדידת ערכי האפור הממוצעים בחמישה שדות שנבחרו באקראי (8 × 8 מיקרומטר2 לכל אחד) מאזורים מוכתמים אימונואנזימטית בכל קטע. לנרמל את עוצמת הצביעה באמצעות הערך האפור הממוצע מכל נגד; אין אזור פצוע כתיקון רקע. חשב את הממוצע של ערכי האפור הממוצע המנורמל מחמשת השדות כדי לקבוע את הערך האפור הממוצע של צביעת IgG של העכבר עבור כל מקטע.
  2. הערכת דליפת אוונס כחול לפרנכימה של המוח
    הערה: הפרוטוקול הכחול של אוונס דומה לשיטה שתוארה קודם לכן11. דקסטרן עם תווית פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) פועל גם להתאוששות מהתמוטטות BBB10.
    1. הזרקה כחולה של אוונס: יש לתת 2% כחול אוונס ב-PBS (3 מ"ל/ק"ג) לעכבר הפצוע דרך וריד הזנב שעה אחת לפני הדיסקציה.
    2. מיצוי מוח טרי: שעה לאחר מתן כחול של אוונס, יש להחדיר לעכבר PBS כמתואר בשלבים 2.1.1-2.1.4. לאחר מכן, נתחו ופרסו את המוח הטרי באופן עטרתי למקטעים בעובי 1 מ"מ באמצעות פורס מוח. בחרו ארבע פרוסות וחתכו פיסות מוח (1 מ"מ2 ריבוע, כל אחת) שכוללות את אזור פצע הדקירה או אזורים שלמים בקליפת המוח ללא פצע, לפי נייר הגרף (איור 1D).
    3. כימות כחול של אוונס: אספו את ארבעת חלקי המוח בשפופרת של 1.5 מ"ל והפכו אותם להומוגניזציה עם 200 מיקרוליטר של חומצה טריכלורואצטית באמצעות מטחנת רקמות. צנטריפוגה את ההומוגנאט ב-10,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר מכן, אספו את הסופרנטנט בעזרת פיפטה ודללו אותו ב-600 מיקרוליטר אתנול. הכן עקומה סטנדרטית של כחול אוונס, הנעה בין 0-1.0 ננוגרם/מ"ל, כדי לכמת את ריכוזו. מדוד את עוצמת הקרינה ב-680 ננומטר עם אורך גל עירור של 620 ננומטר באמצעות קורא צלחות.

3. הערכת רמת הדלקת במוח לאחר פצע דקירה

  1. צביעה אימונואנזימטית של חלק מוח פצוע דקירה לתאי גליה
    1. הכנת חלקי המוח: הכינו את חלקי המוח למשקפי שקופיות המותקנים כמתואר בשלבים 2.1.1-2.1.9.
    2. צביעת גליה: לאחר ייבוש אוויר של חלקי קליפת המוח שנפצעו מדקירה למשך שעה, תקן את החלקים שוב עם 4% PFA (500 מיקרוליטר / שקופית) למשך 30 דקות. לאחר מכן, שטפו את החלקים עם PBS (500 מיקרוליטר / שקופית) למשך 5 דקות, ולאחר מכן שתי שטיפות עם TBS (500 מיקרוליטר / שקופית) למשך 5 דקות כל אחת.
    3. להרוות את פעילות האנזימים האנדוגניים בקטעים עם 10% מתנול ו-3% מי חמצן ב-TBS למשך 5 דקות, ולאחר מכן שתי שטיפות עם מי מלח עם Tris-buffered (TBS, 500 מיקרוליטר / שקופית) למשך 5 דקות כל אחת.
    4. בצע חסימה באמצעות מאגר חוסם (500 מיקרוליטר / שקופית) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי למנוע קשירה לא ספציפית של הנוגדן.
    5. דגרו את החלקים למשך הלילה עם הנוגדן הראשוני (300 מיקרוליטר / שקופית). השתמש בדילולים הבאים עבור הנוגדן העיקרי: דילול של 1:3,000 עבור Iba1, ודילול של 1:1,000 עבור GFAP, מדולל במאגר החוסם.
    6. שוטפים את החלק שלוש פעמים עם TBS למשך 5 דקות כל אחת. לאחר מכן, יש לדגור עם הנוגדן המשני המצומד לביוטין (דילול של 1:300 עם המאגר החוסם, 300 מיקרוליטר / שקופית) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
    7. בזמן הדגירה עם הנוגדן המשני, הכינו את התערובת של 1 מיקרוליטר של מגיב A ו-1 מיקרוליטר של מגיב B מערכת פרוקסידאז מבוססת אבידין/ביוטין ב-300 מיקרוליטר של המאגר החוסם. לאחר מכן דגרו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפני השימוש.
    8. לאחר השלמת הדגירה המשנית של הנוגדנים, יש לשטוף את החלקים שלוש פעמים עם TBS למשך 5 דקות כל אחד, ולדגור את החלקים בתערובת המוכנה של מגיב A ו-B (300 מיקרוליטר/שקופית) למשך שעה בטמפרטורת החדר.
    9. שטפו את החלקים עם 0.1 M Tris-HCl pH 8.0 למשך 5 דקות, שלוש פעמים, במהלך שעה. לאחר מכן, פתח צבע באמצעות 0.05% DAB בתוספת 0.05% מי חמצן 0.1 M Tris-HCl pH 8.0 (500 מיקרוליטר / שקופית) למשך 30 דקות עד 3 שעות. התבונן במיקרוסקופ לשינוי צבע לפני הפסקת התגובה.
    10. שטפו את החלקים עם 0.1 M Tris-HCl pH 8.0 למשך 5 דקות שלוש פעמים, וייבשו את החלקים באוויר למשך 15 דקות. לאחר מכן, יש לייבש את החלקים על ידי טבילתם באתנול 95% למשך 2 דקות פעמיים, ואחריו 100% אתנול למשך 2 דקות, פעמיים. נקה את החלקים בקסילן למשך 5 דקות פעמיים. כיסויהחלק את החלקים באמצעות אמצעי הרכבה בלתי מסיס במים ואפשר להם להתייבש. צלם את תמונות הקטע באמצעות המיקרוסקופ עם מטרה של פי 20.
  2. צביעה אימונו-פלואורסצנטית של חלק מוח פצוע דקירה לתאי גליה
    1. הכנת חלקי המוח: הכינו את חלקי המוח למשקפי שקופיות המותקנים כמתואר בשלבים 2.1.1-2.1.9.
    2. צביעת גליה: לאחר ייבוש אוויר של חלקי קליפת המוח שנפצעו מדקירה למשך שעה, תקן את החלקים שוב עם 4% PFA (500 מיקרוליטר / שקופית) למשך 30 דקות. לאחר מכן, שטפו את החלקים עם PBS (500 מיקרוליטר / שקופית) למשך 5 דקות, ולאחר מכן שתי שטיפות עם TBS (500 מיקרוליטר / שקופית) למשך 5 דקות כל אחת. בצע חסימה באמצעות מאגר חוסם (500 מיקרוליטר / שקופית) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי למנוע קשירה לא ספציפית של הנוגדן.
    3. דגרו את החלקים למשך הלילה עם הנוגדן הראשוני (300 מיקרוליטר / שקופית). השתמש בדילולים הבאים עבור הנוגדן הראשוני: דילול של 1:3,000 עבור Iba1, ודילול של 1:1,000 עבור GFAP, מדולל במאגר חוסם.
    4. שוטפים את החלק שלוש פעמים עם TBS למשך 5 דקות כל אחת. לאחר מכן, יש לדגור עם הנוגדן המשני המצומד פלואורסצנטי (דילול של 1:300 עם המאגר החוסם, 300 מיקרוליטר / שקופית) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
    5. שטפו את החלקים שלוש פעמים עם TBS למשך 5 דקות כל אחד ודגרו את החלקים בתמיסת DAPI של 0.4 מיקרוגרם/מ"ל ב-TBS (500 מיקרוליטר/שקופית) למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    6. שטפו את החלקים עם TBS (500 מיקרוליטר / שקופית) למשך 5 דקות, ועם מים מזוקקים (500 מיקרוליטר / שקופית) למשך 5 דקות. לאחר ייבוש האוויר של החלקים למשך 15 דקות, כסו אותם באמצעי הרכבה על בסיס מים והניחו להם להתייבש. צלם את תמונות הקטע באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם מטרה של פי 20.
  3. qPCR בזמן אמת עבור סמני תאי גליה וציטוקינים דלקתיים
    הערה: רצפי הפריימר 16,20,21,22 המשמשים בפרוטוקול המוצג מפורטים בטבלה 1.
    1. הכנת רקמת מוח טרייה: החדרת העכבר עם PBS כמתואר בשלבים 2.1.1-2.1.4. לאחר מכן, חלצו ופרסו את המוח הטרי באופן עטרתי למקטעים בעובי 1 מ"מ באמצעות פורס מוח. בחר ארבע פרוסות וחתוך חתיכות מוח (1 מ"מ2 ריבוע, כל אחת) הכוללות את אזור פצע הדקירה או אזורים שלמים בצד הנגדי של קליפת המוח, על פי נייר הגרף. קבע את האזור שיש לחתוך, הכולל את הנגע במרכז (איור 1D).
    2. מיצוי RNA: אסוף את ארבעת חלקי המוח בצינור של 1.5 מ"ל והומוגניזציה שלהם עם 1 מ"ל של מגיב TRIzol על ידי פיפטינג. דוגרים את התערובת למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מוסיפים 200 מיקרוליטר של כלורופורם, מערבולת היטב ודוגרים למשך 2 דקות נוספות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה את התערובת ב-12,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. העבירו בזהירות את השכבה העליונה והשקופה לצינור חדש של 1.5 מ"ל, הימנעו ממשקעים לבנים, המכילים DNA וחלבונים.
    3. מוסיפים 500 מיקרוליטר איזופרופנול לשכבה העליונה שנאספה, מערבבים היטב ודוגרים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, הסר את הסופרנטנט והוסף 1 מ"ל של 70% אתנול כדי לשטוף את גלולת ה-RNA. צנטריפוגה ב-7,500 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, הסר את הסופרנטנט לחלוטין וייבש את הגלולה באוויר למשך 10 דקות. ממיסים את כדור ה-RNA ב-15 מיקרוליטר של מים נטולי RNase ומנטרלים את ה-RNA למשך 10 דקות ב-55 מעלות צלזיוס.
    4. מדוד את ריכוז ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח. אחסן את ה-RNA בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס מיד.
    5. סינתזת cDNA: לסינתזת cDNA, השתמש בערכת סינתזת DNA זמינה מסחרית. הכן בסך הכל 10 מיקרוליטר של מאגר תגובה בצינור של 1.5 מיקרוליטר עבור כל דגימה, הכוללת 2 מיקרוליטר של 5 x RT Buffer, 0.5 μL של RT Enzyme Mix, 0.5 מיקרוליטר של Primer Mix, 1 מיקרוגרם של RNA ומים ללא נוקלאז. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות עבור תגובת השעתוק ההפוך ובטמפרטורה של 98 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות עבור תגובת השבתת האנזים. לאחר מכן, הוסיפו 90 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז למאגר וערבבו היטב. אחסן את תמיסת ה-cDNA ב-20 מעלות צלזיוס.
    6. כימות ביטוי RNA: לניתוח qPCR בזמן אמת, השתמש בערכת מיקס qPCR מאסטר זמינה מסחרית. הכן את תמיסת ה-Mix עבור כל דגימה על ידי שילוב של 5 מיקרוליטר של KOD SYBR qPCR Mix, 0.4 מיקרוליטר של פריימר קדימה של 5 מיקרומטר, 0.4 מיקרוליטר של פריימר הפוך של 5 מיקרומטר ו-0.2 מיקרוליטר של 50 x ROX ב-2 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז.
    7. יוצרים תערובת של 2 מיקרוליטר של תמיסת cDNA ו-8 מיקרוליטר של תמיסת Mix בצינור בעל 8 רצועות, מערבבים היטב ומסתובבים.
    8. התחל את תגובת ה-PCR בתנאי הרכיבה הבאים: 98 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ואחריהם 40 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות ו-68 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. בצע את שלב ניתוח עקומת ההיתוך/דיסוציאציה באמצעות מכונת qPCR בזמן אמת.
    9. ניתוח ביטוי mRNA: נתח את רמת ביטוי ה-mRNA בשיטת 2-Delta-Delta-Ct, המתבצעת על ידי נורמליזציה עם גן משק בית, Gapdh, ולאחר מכן עם זה של הצד הנגדי23.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי לנתח את ההתאוששות מפירוק BBB, רמת הדימום בקליפת המוח שנפצעה מדקירה הוערכה על ידי מדידת רמת האקסטרוואזציה של IgG בסרום ב-1, 3, 5 ו-7 ימים לאחר פגיעה מוחית. תמונות צביעת ה-IgG של העכבר חשפו דליפת דם ושקיעה בקליפת המוח בעקבות פגיעה מוחית. זה הופחת אחרי יותר מ-7 ימים, כאשר ה-BBB התאושש, וחלבון ה-IgG התפרק (איור 2B). רמות האקסטרוואזציה של IgG כומתו על ידי מדידת עוצמת צביעת ה-IgG סביב אזור פצע הדקירה, מה שהצביע על כך שאקסטרוואזציה של IgG הגיעה לשיא יום אחד אחרי הפגיעה המוחית (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן, הוצג פרוטוקול ליצירת מודל עכבר TBI באמצעות מחטים. פרוטוקול זה מאפשר הערכה כמותית של ההתאוששות מפירוק ה-BBB והדלקת לאחר פגיעה מוחית באמצעות גישות ביולוגיות היסטולוגיות ומולקולריות. פרוטוקולים חלופיים, כמו למשל מודל TBI שחוזר על עצמו ומודל TBI של ירידה במשקל, יכולים גם הם לשמש לניתוח התמוטטות BBB ודלקת. המודלים האלה משכפלים פתולוגיה של TBI בתנאים מבוקרים, כולל פרמטרים ספציפיים עבור עוצמת הפגיעה, הטווח ואזור המוח, באמצעות מכונות מיוחדות. בנוסף, הם יכולים לגרום לפגיעה מוחית סגורה עם גול...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים ל-Ayana Hamano, Minori Yamashita, Misaki Endo, Hirono Kobayashi ו-Nito Nakahira על הסיוע באימונוהיסטוכימיה וב-qPCR בזמן אמת. עבודה זו נתמכה על ידי JSPS KAKENHI 19K16122, קרן המדע של טקדה, קרן אסטלס לחקר הפרעות מטבוליות, קרן מיצובישי, הקרן למדעי המוח וקרן הזיכרון של אואהארה לק.ה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
19 גרם x 1&שור; מחט 1/2 אינץ'TERUMONN-1938R 
מחט 27 גרם x 3/4 אינץ'TERUMONN-2719S
נוגדן נגד GFAPSigma-AldrichG9269
נוגדן נגד Iba1Wako019-19741
Atipamezole HydrochlorideNippon Zenyaku Kogyoשם המוצר: Antisedan
עכבר מצומד ביוטין IgG נוגדןוקטור מעבדותBA-9200
ארנב מצומד ביוטין נוגדן IgGVector LaboratoriesBA-1000
אלבומין בקרNacalai tesque01860-07
פורס מוחVisikolBSLM-2
Butorphanol TartrateMeiji בריאות בעלי חיים שם המוצר: Vetorphale 5 מ"ג
מיקרוסקופ קונפוקליZeissLSM700
קריוסטט LeicaCM1520
DABSigma-AldrichD5637-1G
DAPIRoche10236276001
אוונס כחולWako056-04061
ארנב מצומד פלואורסצנטי נוגדןIgG InvitrogenA-21206
Fluoromount-GInvitrogen4958-02מדיום
תמיסת אינהלציה איזופלורןViatrisv002139
KOD SYBR qPCR MixTOYOBOQKD-201qPCR ערכת תערובת
מאסטר MedetomidineNippon Zenyaku Kogyoשם המוצר: Domitor
מיקרוסקופאולימפוסFSX100
ספקטרופוטומטר מיקרונפחThermoFisher ScientificNanoDrop One
Midazolam 10 מ"ג/2 מ"לSandoz1124401A1060
MOUNT QUICKDaido SangyoDM01בלתי מסיס במים הרכבה בינונית
סרום עגל יילודGibco16010159
O.C.T. תרכובתSakura Finetek יפן45833הטמעת בינוני
Peel-A-Way, קטום 22 מ"מ מרובעעליון טד פלה27118תבנית הטמעת רקמות
משאבת זלוף פריסטלטיתATTOSJ-1211
קורא צלחותפישר סיינטיפיקציטציה 3
מכונת qPCR בזמן אמתThermoFisher ScientificStepOne Plus
ReverTra Ace qPCR RT KitTOYOBOFSQ-101cDNA ערכת סינתזה
Superfrost Plus שקופית זכוכיתפישר מדעי12-550-15תפר זכוכית שקופית טעון חיובי
עם מחט AlfresaHT2003NA75-KF2
TRIzol ReagentInvitrogen15596026
VECTASTAIN ABC ערכה סטנדרטיתמעבדות וקטורPK-4000ערכת מערכת פרוקסידאז מבוססת אבידין/ביוטין
הרכבה על בסיס מים

מקורות

  1. Narayan, R. K., et al. Clinical trials in head injury. J Neurotrauma. 19 (5), 503-557 (2002).
  2. Shitaka, Y., et al. Repetitive closed-skull traumatic brain injury in mice causes persistent multifocal axonal injury and microglial reactivity. J Neuropathol Exp Neurol. 70 (7), 551-567 (2011).
  3. Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nat Protoc. 4 (9), 1328-1337 (2009).
  4. Ikeshima-Kataoka, H., Shen, J. S., Eto, Y., Saito, S., Yuasa, S. Alteration of inflammatory cytokine production in the injured central nervous system of tenascin-deficient mice. In Vivo. 22 (4), 409-413 (2008).
  5. Zhou, Y., Wang, Y., Wang, J., Anne Stetler, R., Yang, Q. W. Inflammation in intracerebral hemorrhage: From mechanisms to clinical translation. Prog Neurobiol. 115, 25-44 (2014).
  6. Hijazi, N., et al. Endogenous plasminogen activators mediate progressive intracerebral hemorrhage after traumatic brain injury in mice. Blood. 125 (16), 2558-2567 (2015).
  7. Kataoka, K., et al. Roles of urokinase-type plasminogen activator in a brain stab-wound. Brain Res. 887 (1), 187-190 (2000).
  8. Wang, Y., et al. Early posttraumatic csf1r inhibition via plx3397 leads to time- and sex-dependent effects on inflammation and neuronal maintenance after traumatic brain injury in mice. Brain Behav Immun. 106, 49-66 (2022).
  9. Kaplan, L., Chow, B. W., Gu, C. Neuronal regulation of the blood-brain barrier and neurovascular coupling. Nat Rev Neurosci. 21 (8), 416-432 (2020).
  10. Endo, M., et al. 2-carba cyclic phosphatidic acid regulates blood coagulation and fibrinolysis system for repair after brain injury. Brain Res. 1818, 148511(2023).
  11. Goldim, M. P. S., Della Giustina, A., Petronilho, F. Using Evans blue dye to determine blood-brain barrier integrity in rodents. Curr Protoc Immunol. 126 (1), e83(2019).
  12. Hashimoto, K., et al. 2-carba cyclic phosphatidic acid suppresses inflammation via regulation of microglial polarization in the stab-wounded mouse cerebral cortex. Sci Rep. 8 (1), 9715(2018).
  13. Ikeshima-Kataoka, H., Abe, Y., Yasui, M. Aquaporin 4-dependent expression of glial fibrillary acidic protein and tenascin-c in activated astrocytes in stab-wound mouse brain and in primary culture. J Neurosci Res. 93 (1), 121-129 (2015).
  14. Nakashima, M., et al. The neuroprotective function of 2-carba-cyclic phosphatidic acid: Implications for tenascin-c via astrocytes in traumatic brain injury. J Neuroimmunol. 361, 577749(2021).
  15. Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Exp Anim. 60 (5), 481-487 (2011).
  16. Ikeshima-Kataoka, H., Abe, Y., Abe, T., Yasui, M. Immunological function of aquaporin-4 in stab-wounded mouse brain in concert with a pro-inflammatory cytokine inducer, osteopontin. Mol Cell Neurosci. 56, 65-75 (2013).
  17. Ikeshima-Kataoka, H., Yasui, M. Correlation between astrocyte activity and recovery from blood-brain barrier breakdown caused by brain injury. Neuroreport. 27 (12), 894-900 (2016).
  18. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), e3564(2012).
  19. Botta, S., Chemiakine, A., Gennarino, V. A. Dual antibody strategy for high-resolution imaging of murine Purkinje cells and their dendrites across multiple layers. STAR Protoc. 3 (2), 101427(2022).
  20. Amin, D. N., et al. Identification of stage biomarkers for human African trypanosomiasis. Am J Trop Med Hyg. 82 (6), 983-990 (2010).
  21. Jiang, J., et al. Therapeutic window for cyclooxygenase-2 related anti-inflammatory therapy after status epilepticus. Neurobiol Dis. 76, 126-136 (2015).
  22. Wei, J., et al. Microglia activation: One of the checkpoints in the CNS inflammation caused by angiostrongylus cantonensis infection in rodent model. Parasitol Res. 114 (9), 3247-3254 (2015).
  23. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative pcr and the 2(-delta delta c(t)) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  24. Hazy, A., et al. Divergent age-dependent peripheral immune transcriptomic profile following traumatic brain injury. Sci Rep. 9 (1), 8564(2019).
  25. Xia, Y., et al. Osthole confers neuroprotection against cortical stab-wound injury and attenuates secondary brain injury. J Neuroinflammation. 12, 155(2015).
  26. Cieri, M. B., Villarreal, A., Gomez-Cuautle, D. D., Mailing, I., Ramos, A. J. Progression of reactive gliosis and astroglial phenotypic changes following stab-wound-induced traumatic brain injury in mice. J Neurochem. 167 (2), 183-203 (2023).
  27. Barreda-Manso, M. A., Yanguas-Casas, N., Nieto-Sampedro, M., Romero-Ramirez, L. Neuroprotection and blood-brain barrier restoration by salubrinal after a cortical stab injury. J Cell Physiol. 232 (6), 1501-1510 (2017).
  28. Rapp, P. E., et al. Patient characterization protocols for psychophysiological studies of traumatic brain injury and post-TBI psychiatric disorders. Front Neurol. 4, 91(2013).
  29. Brody, D. L., Benetatos, J., Bennett, R. E., Klemenhagen, K. C., Mac Donald, C. L. The pathophysiology of repetitive concussive traumatic brain injury in experimental models; new developments and open questions. Mol Cell Neurosci. 66 (Pt B), 91-98 (2015).
  30. Meehan, W. P., Zhang, J., Mannix, R., Whalen, M. J. Increasing recovery time between injuries improves cognitive outcome after repetitive mild concussive brain injuries in mice. Neurosurgery. 71 (4), 885-891 (2012).
  31. Chen, C., et al. A novel simple traumatic brain injury mouse model. Chin Neurosurg J. 8 (1), 8(2022).
  32. Machado, C. A., et al. Weight-drop model as a valuable tool to study potential neurobiological processes underlying behavioral and cognitive changes secondary to mild traumatic brain injury. J Neuroimmunol. 385, 578242(2023).
  33. Hashimoto, K., Ikeda, N., Nakashima, M., Ikeshima-Kataoka, H., Miyamoto, Y. Vitronectin regulates the fibrinolytic system during the repair of cerebral cortex in stab-wounded mice. J Neurotrauma. 34 (22), 3183-3191 (2017).
  34. Unterberg, A. W., Stover, J., Kress, B., Kiening, K. L. Edema and brain trauma. Neuroscience. 129 (4), 1021-1029 (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

TBI

מאמרים קשורים