דו"ח זה מתאר שיטה למדידת זמן Drosophila melanogaster בוגר להפלה באמצעות מוניטור פעילות דרוזופילה (DAM2) בתגובה ללחץ חום בהולכת אוויר בתוך תא אינקובטור. DAM2 מודד פעילות על ידי רישום תנועות זבוב בודדות כאשר הן חוצות קרן אינפרא אדום. ניתוח הנתונים מקל על ידי קובץ הפעלה חדשני שנוצר על ידי המחברים.
מאמר שיטה
בדיקות עמידות לחום באמצעות מערכת ניטור פעילות דרוזופילה : מדריך ליישום הפעלה לניתוח נתונים
במאמר זה
סיכום
תקציר
המחקר של עמידות לחום ב- Drosophila melanogaster היה מעניין במיוחד לחוקרים במשך עשרות שנים, עם גישה נפוצה להערכת סובלנות לחום היא לפקח על הזמן להפיל (TKD) לאחר חשיפה לטמפרטורה גבוהה. באופן קלאסי, זבובים שוכנים בבקבוקונים בודדים וממוקמים בתוך אמבט מים מחומם. לאחר מכן TKD מנוטר באופן ידני על ידי חוקרים. בעוד מבוסס היטב, נותרו בעיות של סובייקטיביות ויישום עקבי של הגדרה מוחשית של הפסקת כל תנועה, כולל התכווצויות שרירים, בעת יישום בדיקות ידניות אלה. פיתחנו שיטה בעלת תפוקה גבוהה לאוטומציה של בדיקות עמידות לחום באמצעות TriKinetics Drosophila Activity Monitors (DAM2). כדי ללוות את מערכת DAM2, כתבנו תוכנית ויצרנו קובץ הפעלה קל לשימוש כדי לקרוא באופן אוטומטי את הזמן האחרון של התנועה מנתוני הפעילות שנוצרו. סקריפט זה כותב לקובץ .csv את הזמן לשיתוק חום (TKD) עבור כל זבוב. הנתונים שלנו מראים ששיטת DAM2 אוטומטית זו עקבית ואמינה. בינתיים, פרופילי פעילות שנוצרו מנתוני ספירת הפעילות מעניינים. פרופילי פעילות אלה ניתנים להידור ויש להם פוטנציאל להרחיב את מבחני סבילות החום כך שיכללו את המרכיבים ההתנהגותיים שלא נחקרו יחסית של עמידות לחום. פרוטוקול זה יתאר בפירוט כיצד להשתמש במערכת DAM2 וב- HoTDAM! תוכנה להערכת עמידות לחום ב- D. melanogaster.
מבוא
אקטותרמים מגיבים בדרך כלל ללחץ חום עם פעילות מוטורית מוגברת. תופעה זו הייתה ברורה לחוקרים במשך עשרות שנים, עם התגובה ההתנהגותית האופיינית שתוארה על ידי קאולס ובוגרט בשנת 19441. הם תיארו כיצד אורגניזם תחת לחץ חום יראה תחילה תנועה מוטורית מוגברת. ככל שעומס החום מצטבר, התפרצויות קצרות של פעילות משולבות בתקופות של חוסר פעילות. הטמפרטורה שבה האורגניזם אינו יכול עוד להראות תנועה מתואמת היא המקסימום התרמי הקריטי (CTmax). ספאם שרירי עוקב, ובסופו של דבר האורגניזם קורס 1,2. קשה להגדיר קריסה זו והיא מייצגת משהו הדומה ל"קפדנות חום, תרדמת או מוות"2. כאן נשתמש במונח קריסה פיזיולוגית כדי להתייחס באופן תיאורטי לנקודת קצה מטושטשת זו של עקת חום.
דרוזופילה מלנוגסטר וחרקים קטנים אחרים היו מודלים חשובים לחקר עקת חום. כדי להעריך לפחות חלק מהאוסף המורכב של תכונות המהוות עמידות לחום, חוקרים רבים צפו ידנית בזמן ובטמפרטורה שבהם מתרחשת קריסה פיזיולוגית, המייצגת את הזמן להפלה (TKD) ו- CTmax, בהתאמה. למרות שהן מבוססות היטב, שיטות בדיקה ידניות אלה סובלות מכמה חסרונות. הגדרה אופרטיבית של קריסה פיזיולוגית יכולה להיות קשה להגדרה ויישום הולם לכל המקרים, במיוחד כאשר הצופים מנוסים פחות. לדוגמה, באיזו נקודה האורגניזם עובר מהתכווצויות שרירים להתמוטטות? דפוס התכווצויות השרירים ופעילות ההתקפים לפני ההתמוטטות יכול להיות בלתי צפוי ויכול לסבך תצפית מדויקת 2,3, מאיימת על דיוק ודיוק. בינתיים, הקושי בתצפית גם מגביל את מספר האורגניזמים שניתן לבחון בו זמנית, מה שמגביל את יכולת ההרחבה.
מכיוון שעלייה בפעילות היא תגובה עקבית לחום ו-TKD ו-CTmax הם בסופו של דבר הנקודה שבה הפעילות נפסקת, ביקשנו להשתמש ב-Drosophila Activity Monitors (DAM2) מבית TriKinetics כדי להפוך את בדיקות הסבילות לחום לאוטומטיות. לאחרונה פרסמנו שיטה לבדיקה אוטומטית, יחד עם תוכנה קלה לשימוש, באמצעות מערכת DAM24. הבדיקה אומתה על ידי השוואת מדדים של עמידות לחום במונחים של TKD לבדיקת TKD ידנית קלאסית המבוססת על תצפית על פני מספר גורמים. חקרנו גם את מרכיב הפעילות המוטורית של מבחני TKD כדי לאפיין עוד יותר את פנוטיפ התרמו-סבילות המושרה. קראנו לבדיקה ולתוכנה הנלווית HoTDAM! (בדיקות עמידות לחום באמצעות מערכת ניטור פעילות דרוזופילה). כאן אנו מספקים תיאור מפורט של שיטת בדיקת סובלנות החום האוטומטית באמצעות מערכת DAM2 ו- HoTDAM! תוכנה. הבדיקה קלה לשימוש וניתן להרחבה בקלות כדי לאפשר מדידה של אורגניזמים רבים בו זמנית.
בכתב היד הזה ביצענו מבחני TKD על זבובים מוטנטיים תרמו-חושיים (פוטנציאל קולטן חולף אנקירין 1; TRPA1) והבקרות הגנטיות שלהם (לבן1118; w1118). אורגניזמים אלה נבחרו כדי להדגיש את חשיבות הפעילות המוגברת האופיינית שנצפתה במהלך עקת חום עבור הבדיקה. כלומר, אורגניזמים TRPA1 אינם מראים התנהגות בריחה זו, מה שממחיש את הקשר הפנימי בין תגובות התנהגותיות שמורות לבין הערכות של סובלנות לחום, כגון TKD. ביצענו את הבדיקה הן עבור נקבות והן עבור זכרים, יחד עם יישום טיפול מקדים להקשחת חום. התוצאות המייצגות המוצגות כאן הן נתונים מבדיקות חדשות לחלוטין מאלה ששימשו במבחני האימות המקוריים שפורסמו בעבר.
פרוטוקול
1. גידול זבובים
- בחר את מלאי / קו הזבוב המתאים לחקירה.
הערה: כדי להמחיש את הבדיקה, השתמשנו במלאי הנוקאאוט של פוטנציאל הקולטן הארעי TRPA1 ובבקרה הגנטית שלו, מלאי w1118 . - לשמור על מניות הזבוב בתנאים עקביים לפי הצורך. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, מלאי הבית ב 25 ° C תחת מחזור יומי 12: 12 על מזון סטנדרטי (קמח תירס, מולסה, שמרי טורולה).
- יש להפריד בין זכרים ונקבות בהרדמה קלה.
הערה: בהתאם לניסוי, ניתן להשתמש בזבובים בתוליים או מזדווגים.- אפשרו לזכרים ונקבות בוגרים (בנפרד עבור שני המלאי) להזדווג ולבצע אוביפוזיט במשך 5 ימים. נקו את המבוגרים מהבקבוקים.
- כאשר המבוגרים מתחילים להיסגר מספר ימים לאחר מכן, נקו שוב את הבקבוקים. לאחר יומיים, להפריד את הזכרים והנקבות באמצעות הרדמה אתר אור ולאפשר להם להתבגר בנפרד בצפיפות של 25 זבובים לכל בקבוקון.
2. טיפול מקדים
- ליישם את הטיפול המקדים או את המשתנה הבלתי תלוי שיגדיר את קבוצות הניסוי (גנטי, סביבתי, תרופתי או אחר).
- כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, להפריד את המבוגרים לפי מין, ולאחר 5 ימים, לטפל מחצית המבוגרים על ידי טבילת בקבוקון אטום המכיל את האורגניזמים באמבט מים ב 37 ° C במשך 1 שעה. שמור את הפקדים באינקובטור ב 25 °C (75 °F). יש לאפשר לזבובים להתאושש במשך 24 שעות לאחר טיפול מקדים, לפני בדיקת סבילות לחום.
3. הגדרת מערכת DAM2
- טען את הזבובים לתוך צינורות צג DAM2 וכסה את הצינורות בשני קצותיהם בכותנה. אם יש להעריך את עמידות הזבובים לחום באופן מיידי, אין להשתמש בהרדמה כלשהי בעת העמסת האורגניזמים לתוך צינורות הצג כדי למנוע השפעות מבלבלות פוטנציאליות הקשורות לחשיפה להרדמה. במקום זאת, שאפו זבובים בודדים מבקבוקוני האחיזה לתוך צינורות הצג.
- הכנס את צינורות הבדיקה לצגי הפעילות, ושים לב לאילו מספרי חריצים נטענות הקבוצות השונות.
הערה: אלה עשויים להיות אקראיים בהתאם לניסוי אם מיקום בתוך הצג עשוי להיחשב משתנה מבלבל. - תוכנה לרכישת נתונים DAM2
הערה: מערכת DAM2 והתוכנה מתוארות ביסודיות בגיליון נתוני התוכנה של DAMSystem3 הזמין באתר האינטרנט של החברה (ראה טבלת חומרים). עיין בהוראות DAM2 לקבלת פתרון בעיות ספציפי ופונקציונליות כללית. כאן אנו מספקים הדרכה לשימוש במערכת בהקשר של בדיקת עמידות החום שלנו.- מערכת DAM2 מנטרת את מספר הפעמים שזבוב בודד בתוך כל צינור שובר קרן אינפרא אדום. לאחר מכן, התוכנה לרכישת נתונים יוצרת אינדקס ומאפסת ספירה זו בכל מרווח זמן מוגדר. תחת העדפות, בחר את מרווח הזמן לקריאה שישמש בבדיקה. מצאנו מרווח קריאה של 15 שניות כדי להשיג איזון טוב בין רזולוציה לשגיאות קריאה.
הערה: מומלץ שמרווח הקריאה לא יהיה קצר בשניות ממספר הצגים הנמצאים בשימוש. מרווח קריאה קצר יותר ייתן רזולוציה זמנית טובה יותר לבדיקה, אך גם עשוי להגדיל את המקרים של שגיאות קריאה. התוכנה יכולה להישאר מאחור בזמן שהיא מנסה לאנדקס את הקריאות. בנוסף, מחשב חדש ומהיר יותר עושה דרך ארוכה במניעת שגיאות קריאה. - בעת שקילת שגיאות קריאה, ודא שהמחשב המשמש להפעלת תוכנת רכישת הנתונים DAM2 מוגדר למצב שינה או שינה לעולם לא כדי לא להפריע לבדיקה. יתר על כן, ודא שעדכונים אוטומטיים (כולל עדכוני רשת בשליטת מוסד) מוגדרים למצב כבוי בעת איסוף נתונים.
- ודא שכל הצגים מחוברים ומתקשרים עם התוכנה. ודא שהמצב של כל צג ירוק תחת כרטיסיית הנתונים הנוכחית .
הערה: עיין בגליון נתוני התוכנה של DAMSystem3 לקבלת פרטים על הבעיות שאליהן מתייחסים קודי צבע שונים. - תוכנת איסוף הנתונים תכתוב באופן אוטומטי את ספירות הפעילות לקבצי טקסט בתיקיית הנתונים בתוך קבצי המערכת. כדי להקל על ניתוח הנתונים, מחק את כל קבצי הטקסט בתוך תיקיית נתונים זו לפני הפעלת תוכנת איסוף הנתונים עבור כל בדיקה.
הערה: קבצי הטקסט יאוכלסו באופן אוטומטי, ולכן מותר להסיר אותם מתיקיה זו כדי לנקות נתונים ישנים מבלי לפגוע בתוכנית.
- מערכת DAM2 מנטרת את מספר הפעמים שזבוב בודד בתוך כל צינור שובר קרן אינפרא אדום. לאחר מכן, התוכנה לרכישת נתונים יוצרת אינדקס ומאפסת ספירה זו בכל מרווח זמן מוגדר. תחת העדפות, בחר את מרווח הזמן לקריאה שישמש בבדיקה. מצאנו מרווח קריאה של 15 שניות כדי להשיג איזון טוב בין רזולוציה לשגיאות קריאה.
4. בדיקת סובלנות חום
- טען את הצגים לחממת הבדיקה.
- הפעל את תוכנת הרכישה ותן לתוכנה ליצור אינדקס למשך זמן מוגדר (לדוגמה, 40 אינדקסים או 10 דקות אם מרווח הקריאה מוגדר ל- 15 שניות) לפני הפעלת לחץ החום.
הערה: הדבר מאפשר הסתגלות מסוימת לצינורות והתאוששות מתנועת הצגים בעת הגדרתם. במיוחד אם הפעילות במהלך הבדיקה מנותחת, זמן הסתגלות זה יבסס פעילות בסיסית לפני השראת עקת חום. בהתאם לאופי הספציפי של הבדיקה המבוצעת, ניתן לדלג על שלב ההתאקלמות הזה, כאשר הצגים ממוקמים ישירות לתוך האינקובטור כבר בטמפרטורת הלחץ. - אם אתה מבצע בדיקה סטטית (TKD), הגדר את האינקובטור לכבוש מהר ככל האפשר לטמפרטורה המזיקה שנקבעה לאחר תקופת ההתאקלמות. משתנה התגובה יופעל כזמן התנועה האחרון שנרשם (כלומר, המדד האחרון שאינו אפס) כדי להעריך TKD.
- אם מבצעים בדיקה דינמית, לקבוע את הקצב שבו הטמפרטורה תעלה לאחר תקופת ההתאקלמות. כאן משתנה התגובה שנמדד הוא שוב פעם מבחינה טכנית. הזמן שבו נרשמת התנועה האחרונה יחפוף לטמפרטורה (CTmax), בהתאם לקצב ההשתוללות.
- עקוב אחר ספירת הפעילות בזמן אמת בתצוגת מערכת DAM בתוכנת הרכישה או בדוק ישירות את קבצי הטקסט בתיקיית הנתונים בקבצי התוכנית DAMSystem3. העתק את קבצי הטקסט ופתח את העותק בניגוד לקובץ המקורי בתיקיית הנתונים כדי למנוע בעיות בהקלטת נתונים חיים.
- לאחר שלא נראית תנועה באף אחד מהזבובים במשך מספר דקות, עצור את תוכנת הרכישה.
הערה: בבדיקות שלנו, מצאנו כי כמה עד כמה דקות של חוסר פעילות מעידות על קריסה פיזיולוגית עקב לחץ חום דומה לזה שנראה במבחני TKD הידניים הקלאסיים. עם זאת, הדבר תלוי בהתנהגות הבריחה הספונטנית. לכן, שקול משתנים מבלבלים אפשריים אם הטיפול הספציפי בחקירה עשוי לשנות תגובה התנהגותית זו. יתר על כן, בהתאם לפרמטרים הספציפיים של הבדיקה (למשל, טמפרטורה, טיפול), אורך הבדיקה ישתנה כמובן.
5. ארגון וניתוח נתונים
הערה: ראה וידאו משלים S1 לקבלת הדרכה כיצד להוריד את יישום ההפעלה מ- GitHub, כמו גם פונקציונליות בסיסית של התוכנה.
- לאחר קבלת הנתונים, סרוק את קובצי הטקסט לאיתור שגיאות באמצעות התוכנה שאליה בוצעה הפניה (עיין בטבלת החומרים) ובחר נקודות התחלה ועצירה ספציפיות לאיחוד נתוני פעילות. אם בוצע מרווח התאקלמות של 10 דקות, התחל את הקישור 10 דקות לתוך הקלטת הפעילות. ראה את הדיון לפרטים נוספים על binning.
- פתח את HoTDAM! תוכנת ניתוח וייבא את קבצי נתוני הצג הסרוקים על-ידי לחיצה על קובץ | טען נתוני צג.
הערה: התוכנה ויישום ההפעלה זמינים מ- GitHub (https://github.com/MatthewR47/HoTDAM) או מאתר האינטרנט של החברה במקטע Analysis Software . שים לב שיישום ההפעלה תואם רק למערכות ההפעלה של Windows בשלב זה. - הוסף הקצאות קבוצות כדי לציין אילו קבוצות טיפול תואמות לאיזה תא בתוך צגי DAM2.
הערה: פריסת ממשק התוכנה תואמת לפריסת הצגים. - לחץ על התחל הגדרת קבוצות מרובות כדי למשוך תיבת דו-שיח להוספת ייעוד קבוצה שיוחל על תאים מרובים. לאחר קבלת ייעוד הקבוצה, לחץ על התאים כדי להחיל את ייעוד הקבוצה ולאחר מכן לחץ על הפסק ייעוד קבוצות מרובות.
הערה: התוכנה מארגנת ומייצאת נתוני DAMSystem3 לקבצים .csv לניתוח בתוכנת סטטיסטיקה. - יצא את ה- TKD (כלומר, האינדקס האחרון שאינו אפס) עבור כל זבוב בתוך הצגים לקובץ .csv על-ידי לחיצה על קובץ | ייצוא נתוני Knockdown | יצא את כל הצגים או יצא צגים נבחרים. TKD עבור כל זבוב יאורגן בפלט לפי ייעוד קבוצה.
- ייצוא נתוני פעילות עבור כל טיסה על ידי לחיצה על קובץ | ייצוא נתוני פעילות | יצא את כל הצגים או יצא צגים נבחרים לקובץ .csv, תוך שמירה רק על חותמת הזמן וספירת הנתונים, מה שמקל על העבודה עם קובץ הנתונים, תוך הקצאת תוויות קבוצתיות ייעודיות לכל זבוב.
הערה: העמודות הראשונות בקבצי הנתונים של DAMSystem3 תואמות לנתונים פנימיים של הצגים (לדוגמה, ניטור אור או הודעות שגיאה) במהלך הרכישה. נתוני הספירה נמצאים בעמודות 11-42 (עיין בגיליון הנתונים של DamSystem3 לקבלת פרטים). ייצוא נתוני הפעילות באמצעות תוכנת הניתוח יסיר את כל העמודות מלבד חותמת הזמן ועמודות נתוני הספירה. - אם אתה מבצע ניסוי CTmax, השתמש ב- TKD כדי לקבוע את ה- CTmax באמצעות קצב השתוללות הטמפרטורה.
הערה: תוכנת הניתוח נכתבה באופן מונחה עצמים ב- C# (קוד מקור זמין ב- GitHub; https://github.com/MatthewR47/HoTDAM) כך שניתן לשנות בקלות היבטים של התוכנה כדי לאפשר התאמה אישית כדי לענות על מטרות ספציפיות.
6. סטטיסטיקה
הערה: ניתן להשתמש בבדיקות רבות ושונות כדי לנתח את נתוני TKD, בהתאם לפרטים של מערך הניסוי.
- השתמש בניתוח הישרדות (למשל, רגרסיה של קוקס, קפלן-מאייר) כדי להמשיג את ההפלה כאירוע שכל זבוב בתוך הבדיקה יחווה.
הערה: לסקירה מפורטת, ראה סדרת 4 המאמרים של Bradburn and Clark הדנה בניתוח הישרדות ויישומו 5,6,7,8. - השתמש ב- ANOVA כדי להעריך הבדלים בין קבוצות ולהשוות אופנים, במיוחד בעת אימות הבדיקה האוטומטית עבור תנאים ספציפיים.
- נתח את נתוני TKD באמצעות ניתוח הישרדות קפלן-מאייר. פצל את הקובץ לפי מלאי כך שהניתוח יבוצע בנפרד (לדוגמה, עבור קווי מניות TRPA1 ו - W1118 ). בחר את משתנה הזמן כמו TKD ( בדקות), knockdown כמו האירוע, pretreatment כמו הגורם, ומין כמו השכבות.
- בצע את בדיקות log-rank, Breslow, ו- Tarone-Ware כדי להשוות טיפול מקדים עבור כל שכבה (כלומר, מין), לצורך המחשה המציגה מספר שיטות.
- לבנות חלקות הישרדות.
תוצאות
הניתוחים עבור מניות TRPA1 ו - w1118 בוצעו בנפרד. זמני TKD אחוזון ותיאורים אחרים ניתן למצוא בטבלה 1.
| אחוזוניםא | ||||||||
| מין | טיפול | 25.00% | 50.00% | 75.00% | ||||
| N | הערכה | Std. שגיאה | הערכה | Std. שגיאה | הערכה | Std. שגיאה | ||
| W1118 | ||||||||
| נקבה | לשלוט | 16 | 42.50 | 0.43 | 40.75 | 2.00 | 38.75 | 0.43 |
| מוקשח | 16 | 48.75 | 4.55 | 43.25 | 2.50 | 38.50 | 1.95 | |
| זכר | לשלוט | 16 | 43.25 | 1.88 | 39.75 | 0.25 | 37.00 | 2.38 |
| מוקשח | 16 | 46.50 | 5.63 | 35.50 | 2.00 | 30.75 | 3.03 | |
| TRPA1 | ||||||||
| נקבה | לשלוט | 16 | 34.25 | 2.17 | 29.25 | 7.50 | 21.50 | 0.72 |
| מוקשח | 15 | 37.25 | 4.84 | 28.75 | 1.77 | 25.75 | 0.86 | |
| זכר | לשלוט | 15 | 38.25 | 3.29 | 32.00 | 1.29 | 24.50 | 7.92 |
| מוקשח | 16 | 27.50 | 0.72 | 25.75 | 1.00 | 22.75 | 6.06 | |
טבלה 1: סטטיסטיקה תיאורית של ניתוחי הישרדות קפלן-מאייר של זבובי w1118 ו-TRPA1. ערכי TKD אחוזון ניתנים בדקות. הקשחה מתייחסת לטיפול מקדים של 37 מעלות צלזיוס ואחריו התאוששות של 24 שעות לפני הלם חום ב -39 מעלות צלזיוס. הבקרות נשמרו בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך הטיפול המקדים. הערה: בניתוחי הישרדות, אחוזון 75 הוא הזמן האחרון שבו 75% מהמדגם ממשיך להציג פעילות.
עבור זבובי w1118, בדיקות דירוג לוג מצאו הבדל משמעותי בהסתברות להפלה בין נקבות קשוחות לנקבות ביקורת (p = 0.026), כך שלנקבות קשוחות הייתה הסתברות נמוכה יותר להיות מופלות על ידי עקת החום במהלך הבדיקה. בינתיים, בדיקת דירוג לוגים לא מצאה הבדל משמעותי בהסתברות להפלה בין 1118 זכרים קשוחים לקבוצת ביקורת (p = 0.798). עבור נקבות TRPA1, לא נמצא הבדל משמעותי בהסתברות להפלה בין אורגניזמים קשוחים לאורגניזמים מבקרים (p = 0.547) באמצעות בדיקת דירוג יומן. לבסוף, עבור זכרי TRPA1, בדיקות דירוג לוג מצאו הבדל משמעותי בהסתברות להפלה בין אורגניזמים קשוחים לאורגניזמים בקבוצת הביקורת (p = 0.014), כך שלאורגניזמים בקבוצת הביקורת הייתה הסתברות נמוכה יותר להיות מופלים על ידי גורם עקה של חום. ראו טבלה 2 עבור כל התוצאות של ניתוחי הישרדות (כולל מבחני Wilcoxon ו-Tarone-Ware כלליים) ואיור 1 עבור עקומות הישרדות.
| מין | χ2 | ד"פ | ערך p | |
| W1118 | ||||
| נקבה | דירוג לוג (מנטל-קוקס) | 4.96 | 1 | 0.026 |
| ברסלו (וילקוקסון כללי) | 1.72 | 1 | 0.190 | |
| טארון-וור | 3.07 | 1 | 0.080 | |
| זכר | דירוג לוג (מנטל-קוקס) | 0.07 | 1 | 0.798 |
| ברסלו (וילקוקסון כללי) | 0.86 | 1 | 0.353 | |
| טארון-וור | 0.32 | 1 | 0.572 | |
| TRPA1 | ||||
| נקבה | דירוג לוג (מנטל-קוקס) | 0.36 | 1 | 0.547 |
| ברסלו (וילקוקסון כללי) | 0.45 | 1 | 0.503 | |
| טארון-וור | 0.36 | 1 | 0.549 | |
| זכר | דירוג לוג (מנטל-קוקס) | 6.01 | 1 | 0.014 |
| ברסלו (וילקוקסון כללי) | 4.19 | 1 | 0.041 | |
| טארון-וור | 5.20 | 1 | 0.023 |
טבלה 2: מבחני מובהקות המשווים את ההסתברות להישאר פעילים בין זבובים ממין נקבה וזכר TRPA1 וקבוצת ביקורת. הקשחה מתייחסת לטיפול מקדים של 37 מעלות צלזיוס ואחריו התאוששות של 24 שעות לפני הלם חום ב -39 מעלות צלזיוס. אורגניזמים הבקרה נשמרו ב 25 ° C למשך הטיפול המקדים.
איור 1: עקומות הישרדות המתארות את שיעור האורגניזמים עם הפעילות הנותרת במהלך בדיקת TKD עבור זבובי w1118 ו-TRPA1. הקשחה מתייחסת לטיפול מקדים של 37 מעלות צלזיוס ואחריו התאוששות של 24 שעות לפני הלם חום ב -39 מעלות צלזיוס. אורגניזמים הבקרה נשמרו ב 25 ° C למשך הטיפול המקדים. TKD נמצא בתוך דקות מאז כניסתו של לחץ חום 39 מעלות צלזיוס. קיצורים: TKD = זמן להפיל; TRPA1 = פוטנציאל קולטן חולף אנקירין 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
ניתן לראות פעילות ממוצעת נגד הזמן באיור 2 עבור TRPA1 ו-W 1118 קשוחים ונשלטים.
איור 2: פעילות ממוצעת לעומת זמן עבור זבובי w1118 ו-TRPA1 במשך בדיקת TKD. קיצורים: TKD = זמן להפיל; TRPA1 = פוטנציאל קולטן חולף אנקירין 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
סביר להניח שיש דרכים רבות וחדשניות לנתח את נתוני הפעילות, במיוחד כאשר בוחנים השפעות קבוצתיות ושילוב TKD. מאחר שניתוח פעילות במהלך סבילות לחום אינו נחקר באופן יחסי, לא חקרנו גישות סטטיסטיות חדשות פוטנציאליות לניתוח נתוני פעילות. בדיקה סטטיסטית כזו תצדיק סקירת ספרות ודיון נרחבים הרבה יותר מכפי שראוי כאן. במקום זאת, פשוט ציירנו גרף של הפעילות הממוצעת עבור כל קבוצה (טיפול מקדים או ביקורת) לעומת זמן, מכיוון שפרסמנו בעבר שיטה זו כדי להמחיש את הפעילות עם סקירת ספרות מתאימה.
וידאו משלים S1: הדרכה להורדת יישום ההפעלה מ- GitHub ופונקציונליות בסיסית של התוכנה. ניתן למצוא את הגרסה העדכנית ביותר (תואמת רק ל- Windows בשלב זה) ב- GitHub (https://github.com/MatthewR47/HoTDAM) או באמצעות קישור מאונדקס בסעיף תוכנת ניתוח באתר האינטרנט של החברה. לאחר הורדת המהדורה, יהיה צורך לחלץ את הקבצים ואת HoTDAM! ניתן לפתוח את הבקשה. תוכנת אנטי-וירוס עלולה למנוע את הפעלת היישום; ייתכן שיהיה צורך לתת הרשאות ליישום. לאחר הפעלת הממשק, ניתן להעלות את DAM2 הסרוק (תוכנת סריקת קבצים) (קובץ | טען נתוני צג). ממשק ייעוד הקבוצה מייצג את פריסת צג הפעילות ומאפשר למשתמש להקצות קבוצות טיפול לצינורות בנפרד אחד בכל פעם או לכמה בבת אחת באמצעות התכונה Multi-Select Group Definition . כל הצגים הם בלעדיים זה לזה ביחס לפונקציונליות ייעוד הקבוצה ויש להגדירם בנפרד. לאחר מכן ניתן לייצא נתוני TKD ופעילות לקבצי .csv (קובץ | ייצוא נתונים או קובץ | ייצוא נתוני פעילות) עבור צג שנבחר בנפרד או עבור כל הצגים בבת אחת. אם כל הצגים מיוצאים בבת אחת, נתוני TKD או פעילות ייוצאו לקובץ .csv יחיד, אך הנתונים עבור כל צג יופרדו בתוך הקובץ. קבצי TKD המיוצאים יקבצו זבובים לקבוצות המציגות את אינדקס הפעילות האחרונה שאינו אפס עבור כל צינור. קובצי פעילות ישמרו על כל הצינורות נפרדים, אך יקשרו הקצאות קבוצות ויסירו את כל המידע מהקבצים אך חותמת זמן וספירת נתונים עבור כל צינור. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
דיון
שיטת בדיקת עמידות החום שאנו מתארים כאן היא רב-תכליתית וניתנת להרחבה. פרסמנו בעבר מחקר תיקוף שבו השווינו את HoTDAM! שיטה לבדיקת TKD קלאסית, מבוססת תצפית, ומצאתי שהבדיקה האוטומטית נותנת מראה את אותה מגמה כללית על פני מספר גורמים4 (איור 3). במילים אחרות, באותו אופן כמו בדיקת TKD הידנית הקלאסית, הבדיקה האוטומטית של DAM2 הצליחה להבדיל אורגניזמים לפי מין, טמפרטורת הבדיקה, טיפול מקדים בהקשחה וזמן התאוששות לאחר טיפול מקדים בהקשחה לפני הבדיקה. בעוד שההנחה היא שהבדיקה האוטומטית אובייקטיבית יותר בכך ש- TKD אינו מסתמך על תצפית החוקרים, הנתונים שלנו לא יצביעו על כך שזה הופך את בדיקת DAM2 לעדיפה במידה ניכרת על הבדיקה הידנית במונחים של גילוי אפקט. מצאנו שהבדיקות דומות למדי מבחינת הדיוק, ואם כבר, גדלי ההשפעה בתוך הבדיקה האוטומטית מעט קטנים יותר (ראו חומר משלים של Rokusek et al.4 לסטטיסטיקה תיאורית מפורטת ונתוני ANOVA הן עבור DAM2 האוטומטי והן עבור מבחני התצפית הידניים ממחקרי התיקוף שלנו). הסיבה לכך קשורה ככל הנראה להבדל המובנה במה שהבדיקות מודדות במונחים של TKD, אשר נדון בפירוט להלן.
איור 3: השוואה של בדיקת DAM2 אוטומטית לבדיקת TKD קלאסית מבוססת תצפית. מגרשים מראים TKD ממוצע בדקות וקווי שגיאה הם השגיאה הסטנדרטית של הממוצע. גורמים בלתי תלויים שהושוו הם (A) מין לפי טמפרטורת בדיקה, (B) התקשות לפי טמפרטורת בדיקה, (C) מין לפי זמן התאוששות, (D) התקשות לפי מין, (E) טמפרטורת בדיקה לפי זמן התאוששות, ו-(F) התקשות לפי זמן התאוששות. TKD מוחלט נוטה להיות ארוך יותר בבדיקה האוטומטית, אך המגמות הכלליות על פני גורמים עקביות בין המבחנים. נתון זה נלקח מ Rokusek et al. 4. קיצור: TKD = זמן להפיל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
נתוני ההמחשה המוצגים כאן מייצגים ניסויים נפרדים לחלוטין מניסויי האימות המקוריים שלנו, שגם בהם נעשה שימוש בקווי טיסה שונים. הבדיקה (TKD ופעילות) הייתה רגישה להשפעות של טיפול מקדים בהקשחה במלאי w1118 (השתמשנו בזן מסוג קנטון S פראי בניסויים המקוריים) וסיפקה תמיכה לכך שהפונקציונליות הבסיסית של הבדיקה יציבה בתנאים משתנים, אם כי רק שורות בודדות נבדקו עד כה. הבדיקה היא תכליתית בכך שהיא אינה מוגבלת למדידת TKD. מכיוון ש- TKD בבדיקה שלנו מוגדר כהפסקת הפעילות המוטורית, ניתן לקבוע את ה- CTmax אם קצב השתוללות הטמפרטורה ידוע. לבסוף, הבדיקה היא אוטומטית לחלוטין וניתן להגדיל אותה בקלות על ידי הוספת צגי פעילות נוספים, המאפשרים גדלי דגימה גדולים בהרבה ממה שהיה אפשרי באמצעות שיטת תצפית ידנית.
כמה נקודות מפתח שיש לקחת בחשבון בעת ביצוע הבדיקה והניתוח הן כדלקמן. השתמש באינקובטור שיכול להגיע במהירות לטמפרטורה מוגדרת, כך שניתן יהיה לטעון את המוניטורים לתוך האינקובטור בטמפרטורת הגידול ולאפשר להם לשבת בשקט כדי להתאקלם לסביבה החדשה לפני הפעלת לחץ החום. אם הטמפרטורה עולה לאט מדי, אז הבדיקה מתחילה להידמות יותר לבדיקת CTmax דינמית לעומת בדיקת TKD סטטית. לדוגמה, אם התוכנה הורשתה ליצור אינדקס פי 40 לפני השראת עקת החום כדי ליצור קו בסיס, התוכנה יכולה להפיק את קובץ הנתונים החל מאינדקס 40 לצורך קביעת TKD וניתוח נתונים. נקודת המוצא היא מבחינת חותמת הזמן שנרשמה על ידי התוכנה, לכן שימו לב למרווח האינדקס (למשל, 40 אינדקסים הם 10 דקות אם מרווח המדד הוא 15 שניות).
ניתן להשתמש בתוכנת סריקת הקבצים גם כדי "לסלל" אינדקסים והיא יכולה לסכם או לחשב ממוצע של הספירות. לדוגמה, כאשר עשינו גרפים של נתוני פעילות (ראו להלן) קישרנו כל ארבעה מדדים יחד ומסכמים ספירות (כלומר, ייצאנו פעילות כל דקה לעומת כל 15 שניות). שים לב שתוכנת סריקת הקבצים לא תאפשר זמני התחלה חלקיים של דקות בעת קשירה, מבחינת חותמת הזמן. לדוגמה, אם המדד הראשון היה בשעה 12:10:15, כאשר מרווח האינדקס מוגדר ל- 15 שניות, הקישור בדקה אחת יתחיל בדקה הקרובה הבאה (לדוגמה, 12:11:00). לכן, אם פעילות במרווחים של דקות תשמש לניתוח אך הרזולוציה של מרווחים של 15 שניות עבור TKD רצויה, הפעל את תוכנת הרכישה תוך 15 שניות מהדקה השלמה הקרובה ביותר (למשל, מתישהו אחרי 12:09:45 ולפני 12:10:00). סיבוך זה נובע מהעובדה שתוכנת רכישת הנתונים משתמשת בשעון מערכת המחשב כחותמת הזמן, שכן DAMSystem3 נבנה ככל הנראה תוך מחשבה על מחקרי שינה.
במונחים של גישות סטטיסטיות להשוואת TKD, אנו טוענים כי ניתוח הישרדות מציע מידע רב יותר מאשר פשוט להשוות זמני הפלה ממוצעים או חציוניים בין קבוצות. עקומות הישרדות יכולות להציע תובנה חזותית לגבי מהלך הזמן של ההפלה עבור האוכלוסיות במהלך הבדיקה. באופן דומה, ניתן להתאים את הבדיקה הסטטיסטית לשאלה הספציפית שנשאלה במסגרת המחקר. לדוגמה, מבחני Wilcoxon כלליים נותנים משקל רב יותר לאירועים מוקדמים, בעוד שמבחני log-rank נותנים משקל שווה לכל נקודות הזמן ורגישים יותר להבדלים בנקודות הזמן המאוחרות יותר. אם יחסי הסיכון אינם פרופורציונליים (כלומר, עקומות ההישרדות מצטלבות), Tarone-Ware קפדני יותר. מכיוון שלא אמורה להיות צנזורה של נתונים מכיוון שכל האורגניזמים חוו את האירוע (הפלה), ניתן לטעון לשימוש במבחני סדר דרגה לא פרמטריים כמו מאן-ויטני יו וקרוסקל-וואליס יחד עם עקומות ההישרדות של קפאן-מאייר9. אם חקירה מעוניינת להפיל לאחר פרק זמן מוגדר ולא TKD לאחר שכל האורגניזמים הופלו, השימוש בניתוח הישרדות ובמבחני לוג-דרג או ווילקוקסון כלליים יהיה עמיד לנתונים מצונזרים (כלומר, תרחיש שבו לא כל האורגניזמים היו מפסיקים לנוע או קורסים עד סוף הבדיקה). סיפקנו את התוצאות מ-log-rank, Wilcoxon generalized ו-Tarone-Ware בטבלה 2 כדי להמחיש.
במהלך לחץ חום ולפני CTmax, שינויים התנהגותיים (למשל, התנהגות בריחה) משמשים כמנגנוני התמודדות. אסטרטגיות התנהגותיות מולדות אלה נשמרות ברחבי ממלכת החי, אך הן חשובות במיוחד עבור אקטותרמים בהתחשב ביכולת הנמוכה יותר שלהם לוויסות תרמי מטבולי 10,11. ברור שהתנהגות היא היבט חשוב בפנוטיפ עקת החום האקטותרמית, אך מחקרים דלילים יחסית בחנו היבטים התנהגותיים אלה של סבילות לחום. בהתחשב בכך שהבדיקה שאנו מתארים מסתמכת על העלייה האופיינית בפעילות הלוקומוטורית בתגובה ללחץ חום, היא מתאימה היטב לחקור את ההיבטים המוטוריים של תגובות עקת חום. יחד עם זאת, הסתמכות זו על פעילות ספונטנית נושאת עמה כמה מגבלות. חשוב לזכור, במיוחד כאשר בוחנים מרכיבים של תגובות לוקומוטוריות ללחץ חום, כי הן TKD והן פעילות קשורים באופן מהותי. כדי להדגים מצב שבו זה יהיה מגביל עבור הבדיקה שלנו, סיפקנו כאן נתונים מאורגניזמים TRPA1 שחסרים בתרמוסנסציה. כאשר האורגניזמים חסרים לקולטן TRPA1, הזבובים אינם מפגינים את התגובה המוטורית האופיינית לחום12. בנתונים המייצגים המוצגים כאן, תגובת הפעילות באורגניזמים TRPA1 קהה. מדידות TKD לא יהיו ניתנות להשוואה בקלות לאורגניזמים מסוג בר מכיוון שהמדד מייצג תגובה מוטורית שונה.
הכללה והשוואה ישירה של תוצאות, במיוחד למבחני סבילות החום הקלאסיים, היא גם מגבלה פוטנציאלית (איור 3). לעתים קרובות, בדיקות מבוססות תצפית יכללו גירוי מכני או אחר כדי לוודא שאורגניזם חסר תנועה אכן חווה קריסה פיזיולוגית ולא רק מראה חוסר פעילות ספונטנית 3,13. מכיוון שהבדיקה שלנו מסתמכת על פעילות ספונטנית, יש הבדל מובנה בהגדרה התפעולית של TKD שעלול לסבך את ההשוואה. במילים אחרות, הגדרנו TKD כהפסקת הפעילות המוטורית, בעוד שבדיקות קלאסיות מגדירות בדרך כלל TKD כקריסה פיזיולוגית. יתר על כן, בדיקות אוטומטיות כמו זו שאנו מתארים מסתמכות על אוויר מחומם, בעוד שבדיקות ידניות כוללות בדרך כלל אמבט מים, ולכן העברת חום יעילה יותר. כל המגבלות הללו להשוואה בין אופני הבדיקה מייצגות חסרונות ליכולת ההכללה של השיטה האוטומטית. במקביל, דווח כי שיטות מבוססות תצפית סובלות מסיבוכים עם השוואות ישירות בין חקירותגם כן 2,14,15. אנו טוענים כי למרות המגבלות, בדיקות אוטומטיות הן אמצעי בר קיימא להעריך סובלנות חום במונחים של TKD או CTmax.
בדיקות עמידות אוטומטיות אחרות לחום עבור TKD ו- CTmax יושמו ותוארו בעבר בספרות 16,17,18,19, כאשר חלקן משתמשות במוניטורים של פעילות DAM2 18,19. יתר על כן, לפחות כמה חקירות השתמשו בשיטות מבוססות וידאו 16,20,21, כמו גם בניטור פעילות DAM220, כדי לבחון פרופילי פעילות של זבובי פירות כפי שהם מתייחסים לסבילות לחום בהקשר של עקת חום חריפה. ככזה, אוטומציה של מבחני עמידות לחום, כולל עם מערכת DAM2, אינה רעיון חדש. מה שחדשני ובעל ערך בבדיקה שלנו הוא קלות ניהול הנתונים כפי שמתאפשרת על ידי HoTDAM! (ניתוח) תוכנה. קשה לעבוד עם נתוני פעילות, וזה יכול לגזול זמן רב ומסורבל למשוך אפילו את האמצעים הפשוטים ביותר (למשל, TKD) ממערכי הנתונים הגדולים ללא שימוש בתוכנה או בסקריפטים שיש להתאים אישית לכל תרחיש. הוטדאם! הוא בחינם וזמין כיישום הפעלה פונקציונלי לחלוטין עם ממשק פשוט וקל לשימוש. אין צורך בניסיון קודם בקידוד. יתר על כן, התוכנה נכתבה באופן מונחה עצמים עם תיעוד כדי להקל על שינוי. ככזה, HoTDAM! ניתן להתאים אישית בקלות כדי להתאים לצרכים ספציפיים. קוד המקור זמין לצד יישום ההפעלה. תקוותנו היא כי HoTDAM! יכול לשרת מעבדות חדשות במבחני עמידות לחום על ידי הצעת אמצעי קל למדידת TKD ו- CTmax, כמו גם לשרת מעבדות המנוסות במבחני עמידות לחום על ידי הצעת תוכנה הניתנת להתאמה אישית כדי להקל על ניהול הנתונים.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.
תודות
הפרויקט המתואר נתמך על ידי מענקי פרס הפיתוח המוסדי (IDeA) מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים של המכונים הלאומיים לבריאות (5P20GM103427 ו- 1U54GM115458). תוכנית עמיתי המחקר לתואר ראשון של UNK ותוכנית מחקר הקיץ של הסטודנטים לרפואה של UNMC.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מבחנות פוליסטירן 14 מ"ל | Falcon | 352057 | |
| 30 ליטר מיכל דגים | וול-מארט | ||
| 8 אונקיות בקבוקים | Genesee | 32-129F | |
| תא אקלים קבוע | Memmert | HPP750eco | |
| קמח תירס | מעבדה מדעית | FLY801010 | |
| DAM2 Drosophila Activity Monitor | TriKinetics | DAM2 | (DAMSystem3 Data Sheet) https://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Price%20List%202024.7.pdf |
| DAMSystem תוכנה לרכישת נתונים | TriKinetics | להורדה בחינם | |
| Drosophila agar | Lab Scientific | FLY80201 | |
| אתנול | Fisher Scientific | BP82011 | |
| Ether | תוכנת Fisher Scientific | E134-4 | |
| FileScan | TriKinetics | לסריקה לאיתור שגיאות טקסט, binning data ופלט | |
| FlyStuff Flugs לבקבוקים | Genesee | 49-100 | |
| FlyStuff Flugs לבקבוקונים | Genesee | 49-102 | |
| בקבוקוני FlyStuff | Genesee | 32-113RL | |
| תוכנת HoTDAM | Github או Trikinetics | https://github.com/MatthewR47/HoTDAM | |
| מחמם טבילה במחזור | PolyScience | MX-CA11B | |
| מולסה | מעבדה Scientific | FLY80084 | |
| חומצה פרופיונית | פישר סיינטיפיק | A258-500 | |
| פיירקס צינורות זכוכית 5 x 65 מ"מ עבור DAM2 | TriKinetics | PGT 5x65 | https://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Price%20List%202024.7.pdf |
| מברשת צבע קטנה | וול-מארט | ||
| SPSS סטטיסטיקה | IBM | ||
| tegosept | Lab Scientific | FLY55015 | |
| שמרי טורולה | MP ביומדיקל | 290308505 | |
| TRPA1 mutant stock | מרכז מניות בלומינגטון | 26504 | w[1118]; TI{w[+mW.hs]=TI}TrpA1[1] |
| w1118 stock | מרכז מניות בלומינגטון | 3605 |
מקורות
- Cowles, R. B., Bogert, C. M. A preliminary study of the thermal requirements of desert reptiles. Bull Am Mus Nat Hist. 83, 261-296 (1944).
- Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: history and critique. Can J Zool. 75, 1561-1574 (1997).
- Jørgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits. Funct Ecol. 33 (4), 629-642 (2019).
- Rokusek, B., et al. HoTDAM! An easy-to-use automated assay expands the inducible thermotolerance phenotype in Drosophila melanogaster: Heat hardening reduces motility. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 286, 111522(2023).
- Bradburn, M. J., Clark, T. G., Love, S. B., Altman, D. G. Survival analysis part III: Multivariate data analysis - Choosing a model and assessing its adequacy and fit. Br J Cancer. 89 (4), 605-611 (2003).
- Bradburn, M. J., Clark, T. G., Love, S. B., Altman, D. G. Survival analysis part II: Multivariate data analysis- An introduction to concepts and methods. Br J Cancer. 89 (3), 431-436 (2003).
- Clark, T. G., Bradburn, M. J., Love, S. B., Altman, D. G. Survival analysis part IV: Further concepts and methods in survival analysis. Br J Cancer. 89 (5), 781-786 (2003).
- Clark, T. G., Bradburn, M. J., Love, S. B., Altman, D. G. Survival analysis part I: Basic concepts and first analyses. Br J Cancer. 89 (2), 232-238 (2003).
- Hazra, A., Gogtay, N. Biostatistics series module 9: survival analysis. Indian J Dermatol. 62 (3), 251-257 (2017).
- Stevenson, R. D. The relative importance of behavioral and physiological adjustments controlling body temperature in terrestrial ectotherms. Am Nat. 126 (3), 362-386 (1985).
- Grigg, G. C., Beard, L. A., Augee, M. L. The evolution of endothermy and its diversity in mammals and birds. Physiol Biochem Zool. 77 (6), 982-997 (2004).
- Soto-Padilla, A., et al. Thermosensory perception regulates speed of movement in response to temperature changes in Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 221 (10), jeb174151(2018).
- Hoffmann, A. A., Sørensen, J. G., Loeschcke, V. Adaptation of Drosophila to temperature extremes: bringing together quantitative and molecular approaches. J Therm Biol. 28 (3), 175-216 (2003).
- Terblanche, J. S., et al. Ecologically relevant measures of tolerance to potentially lethal temperatures. J Exp Biol. 214 (22), 3713-3725 (2011).
- Rezende, E. L., Castaneda, L. E., Santos, M. Tolerance landscapes in thermal ecology. Funct Ecol. 28 (4), 799-809 (2014).
- MacLean, H. J., Hjort Hansen, J., Sørensen, J. G. Validating the automation of different measures of high temperature tolerance of small terrestrial insects. J Insect Physiol. 137, 104362(2022).
- Gioia, A., Zars, T. Thermotolerance and place memory in adult Drosophila are independent of natural variation at the foraging locus. J Comp Physiol A. 195, 777-782 (2009).
- Kjærsgaard, A., et al. The effect of developmental temperature fluctuation on wing traits and stressed locomotor performance in Drosophila melanogaster, and its dependence on heterozygosity. Evol Ecol Res. 14 (7), 803-819 (2012).
- Bak, N. K., Rohde, P. D., Kristensen, T. N. Strong sex-dependent effects of malnutrition on life- and healthspan in Drosophila melanogaster. Insects. 15 (1), 9(2023).
- Bettencourt, B. R., et al. Natural variation in Drosophila stressed locomotion meets or exceeds variation caused by Hsp70 mutation: analysis of behavior and performance. Behav Genet. 393, 306-320 (2009).
- Kjærsgaard, A., et al. Locomotor activity of Drosophila melanogaster in high temperature environments: plastic and evolutionary responses. Clim Res. 43 (1-2), 127-134 (2010).
הדפסות חוזרות והרשאות
