מאמר שיטה

פרוטוקול הזרקת עצב תועה ישיר לחולדות

DOI:

10.3791/67820

⸱

14 במרץ 2025

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, UT Southwestern Medical Center, 2Center for Alzheimer's and Neurodegenerative Diseases, UT Southwestern Medical Center, 3Department of Neurology, UT Southwestern Medical Center, 4Department of Molecular Biology, UT Southwestern Medical Center, 5McDermott Center for Human Growth and Development, UT Southwestern Medical Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול להזרקה ישירה של עצב הנרתיק בחולדות, המאפשר העברת תרופות ישירות לעצב ללא סיבוכים לאחר ההזרקה. שיטה זו חלה על מחקרים נוירולוגיים פרה-קליניים הכוללים מניפולציה של מערכת העצבים האוטונומית. זה יכול לשמש להזרקת עצבים ישירה לעצבים אחרים בחולדות ובמינים אחרים, עם השינויים הנדרשים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש שפע יחסי של אסטרטגיות ומתודולוגיות כדי להקל על העברת תרופות למערכת העצבים המרכזית. עם זאת, העברת תרופות ישירות למערכת העצבים ההיקפית פחות נפוצה, עם פחות פרסומים מפורטים של שיטות זמינות כדי לסייע לחוקרים. כאן, אנו מתארים שיטת הזרקה עצבית ישירה למתן תרופות למערכת העצבים ההיקפית, תוך שימוש בעצב התועה כעצב מודל. ניתן להשתמש בשיטה זו לטיפול בהפרעות במערכת העצבים האוטונומית באמצעות מיקוד של עצב הנרתיק השמאלי, אם כי ניתן להוציא שיטת הזרקה כללית זו להזרקת עצבים אחרים עם שינוי קל. שיטה זו מסבירה את כל השלבים הקריטיים הכרוכים בהליך הכרוך במיקרו-כירורגיה בחולדות בוגרות מורדמות תחת מיקרוסקופ מנתח. השימוש בצבע מעקב מתואר כדי להקל על ניטור נאמנות ההזרקה בזמן אמת. ניתנות דוגמאות של זריקות מוצלחות וכושלות. אם מבוצעים כראוי, ניתן לבצע זריקות ישירות של עצב הנרתיק בצורה בטוחה הנסבלת היטב על ידי החולדה ללא סיבוכים לאחר הלידה. לדוגמה, לאחר שהמנתחים הוכשרו בשיטה זו, שש מתוך שש חולדות הוזרקו בהצלחה ללא סיבוכים. שיטה זו של הזרקת עצבים ישירה למחקרים פרה-קליניים בחולדות מסוגלת להעביר חומרים (כולל אך לא רק ריפוי גנטי) לעצבים היקפיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יישום השיטה הנכונה למתן תרופות הוא אחד הגורמים הקריטיים להשגת תוצאות טיפוליות מוצלחות. למרות שפע השיטות להעברת חומרים טיפוליים למערכת העצבים המרכזית (CNS), רק שיטות בודדות מדווחות להעברת מערכת העצבים ההיקפית (PNS) בהזרקה עצבית ישירה. הזרקה עצבית ישירה, כגון הזרקה לגרעיני השורש הגבי (DRG) בחולדות, נוסתה במחקרים פרה-קליניים להבנה טובה יותר של מנגנוני כאב, רעילות תרופות, העברת גנים 1,2,3 ופיתוח שיטה כללית 1,4. דיווחים נוספים על הזרקת עצב ישירה כוללים הזרקת עצב עמוד השדרה4, הזרקת עצב סיאטי1 והזרקת עצב תועה בחולדות5 ועכברים6. לאחרונה הוצעה שיטה להזרקה סופרכונדריאלית להפצה טובה יותר של טיפולים לראש עצב הראייה בארנבים7.

DRG נחשב למיקום האידיאלי להזרקה ישירה של וקטורים טעוני טרנסגנים כגון וירוס הקשור לאדנו (AAV) בגלל התפקוד החושי של גופי התאים ב-DRG2. תוארו שיטות כירורגיות ולא כירורגיות של זריקות DRG 1,8. עם זאת, נמצאו מסקנות שנויות במחלוקת לגבי עקביות התוצאות עם השיטה הלא כירורגית של הזרקת DRG1. שיטה כירורגית הכוללת כריתת למינקטומיה חלקית הוצעה כמוצלחת ב-100% עבור הזרקת DRG בחולדות ללא כל שינוי בתוצאות ההתנהגות3, כמו גם שיטה הכוללת אוסטאוטומיה חלקית בעכברים9. מספר מחקרים מדווחים על שיטות הזרקת DRG למתן תרופות, ששימשו במחקר פרה-קליני של ריפוי גנטי בחולדות ועכברים 1,2,10. מחקרי ריפוי גנטי מבוססי וקטור הכוללים זריקות מקומיות עשויים לכלול את היתרונות הבאים: ירידה בביטוי מחוץ למטרה, הפחתת רעילות מערכתית ועומסים נגיפיים ונפחי הזרקה קטנים יותר, ירידה בסיכון לסיבוכים אימונוגניים11,12.

שיטת הזרקה ישירה לעצב הסיאטי, העצב הארוך ביותר בגוף, נוסתה על ידי חשיפת העצב הסיאטי הימני ברמת אמצע הירך של חולדה. השיטה השתמשה בפיפטה מזכוכית משוכה המצוידת במערכת הזרקה מבוקרת מיקרו-מעבד כדי להזריק נפח כולל של 10 מיקרוליטר צבע עם קצב זרימה של 1.2 מיקרוליטר לדקה1. ניסוי זה הראה חוסר בפיזור הצבע לרמה של DRG, וההתפלגות הייתה מוגבלת בעיקר סביב אתר ההזרקה. באופן דומה, שיטות אחרות של הזרקות עצב ישירות, כגון הזרקות עצב עמוד השדרה, נוסו עם צבע כדי להעריך את הכמות המתאימה של נפח ההזרקה ודפוס חלוקת הצבע בחולדות. 2 מיקרוליטר מוצע כאופטימלי להזרקת עצב עמוד השדרה, בעוד ש-3 מיקרוליטר צבע על ידי הזרקת DRG הראו את ההתפלגות בגרעיני השורש הגבי והגחוני בחולדות1. נפח הזרקת DRG בעכברים דווח כאופטימלי מ-1.0 מיקרוליטר ל-1.5 מיקרוליטר בהתבסס על מתח וגודל גוף 2,9.

שיטת הזרקת עצב תועה ישירה שימשה בחולדות5 ובעכברים6 כדי להעריך את תפקיד הפגיעה העצבית או שלמות התא בהעברת α-synuclein אנושי. שני מחקרים אלה, שנערכו על ידי אותה קבוצת חוקרים, מתארים שיטה קצרה של הזרקה ישירה של וקטורי AAV לעצב התועה השמאלי באזור צוואר הרחם. בחולדות, השיטה כללה נימי זכוכית בקוטר קצה של 60 מיקרומטר כדי להזריק וקטור של 2 מיקרוליטר בקצב זרימה של 0.5 מיקרוליטר לדקה עם מזרק המילטון של 5 מיקרוליטר. בעכברים, נפח כולל של תמיסת וקטור של 750 nL הוזרק בקצב זרימה של 160 nL/min באמצעות מחט פלדה קהה 36-G המותקנת על מזרק NanoFil10 μL 6. ניסויים אלה הראו כי הטרנסגן הועבר והתבטא באקסונים בפונס ובמוח האמצעי של החולדות והעכברים. באופן דומה, הגרעין המוטורי הגבי של עצב הנרתיק השמאלי הראה תגובה חיסונית חיובית עם טרנסגן. ראיות אלה ממחישות כי שיטת הזרקת עצב התועה הישירה עשויה להיות שיטה אמינה בריפוי גנטי שבו ההתמרה התאית מורחבת למספר מיקומים במוח, המקרינים אקסונים דרך עצב התועה. עם זאת, שיטות אלו אינן מזכירות את השימוש בצבע כלשהו כדי לעקוב אחר נאמנות ההזרקה.

כאן, מתוארת שיטה להזרקה ישירה לעצב התועה השמאלי באמצעות צבעי מעקב לא רעילים החלים במידה רבה על חוקרים במחקרים פרה-קליניים. נדונות מלכודות פוטנציאליות שעלולות לגרום לקשיים במתן תרופות והדרכים להתגבר עליהן. מצבים אלה מומחשים בתמונות כדי להראות מה גורם למשלוח לא מוצלח והדרך להפוך אותו למוצלח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הבא מתנהל בהתאם להנחיות האתיקה המוסדיות ואישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC).

1. הכנת דיור

הערה: פרוטוקול זה מיועד לחולדות בוגרות בנות חודשיים לפחות. בעלי חיים קטנים יותר (כולל עכברים וחולדות צעירות יותר) אפשריים אך אינם מומלצים ויהיו קשים הרבה יותר.

  1. יש לספק צ'או לח או כל מזון רך אחר (ג'ל התאוששות וטרינרי) במשך 48 שעות לפני ניתוח עצב התועה. מכיוון שבעלי חיים עשויים להיתקל בקשיים באכילה לאחר ההליך, הציגו פריטים אלה לבעלי החיים לפני הניתוח כדי לעזור להם להכיר את הטעם של פריטים אלה ולעורר מוטיבציה לאכילה.
  2. חולדות בית בנפרד בכלוב לפחות שבוע לפני הניתוח, כמו גם שבוע לאחר הניתוח. זה יאפשר להם להתאקלם ללחץ של להיות לבד ולמנוע גירוד של פצעים לאחר ניתוח על ידי חבר לשגרה.

2. הכנת הפריטים והחלל הכירורגיים

  1. ערכו רשימה של כל הפריטים הדרושים מבעוד מועד ובדקו שוב שכל הפריטים זמינים לניתוח.
  2. עקר את כל הפריטים בשיטות עיקור מתאימות לפני הניתוח.
  3. הגדר את חלל הניתוח הסטרילי מתחת למיקרוסקופ הניתוח. הנח כרית חימום מתחת למיקרוסקופ כדי לשמור על חום החולדה במהלך הניתוח.
  4. הניחו את כל חומרי הניתוח על שולחן כירורגי על וילון סטרילי. שמור מספיק מקום לניתוח תחת המיקרוסקופ המנתח. ודא שמיקוד המיקרוסקופ אופטימלי ומקיף את אזור הניתוח כדי לדמיין את העצב.
  5. הנח את משאבת המזרק קרוב לשלב הכירורגי כך שאורך הצינור יספיק כדי להגיע למקום ההזרקה.
  6. הנח את כלי הניתוח לכיוון הצד של היד הדומיננטית של המנתח.

3. הכנת תערובת של התרופה המועמדת וצבע המעקב

  1. ודא שהתרופה המועמדת מדוללת כדי להשיג את הריכוז הנדרש בדילול המומלץ כך ש-5 מיקרוליטר של התרופה מעורבבת בצבע נותנים את הכמות הנדרשת של התרופה המועמדת למסירה. נפח הזרקה מקסימלי בשיטת עצב הנרתיק הישיר מומלץ להיות 5 מיקרוליטר (כולל צבע מעקב, ראה שלב 3.2).
  2. מערבבים צבע תואם עם התרופה המועמדת כדי לאפשר מעקב אחר נאמנות ההזרקה בזמן אמת. לדוגמה, ריכוז סופי של 1% Luxol Fast Blue או 0.002% פלואורסצאין הם צבעים תואמים לשימוש.
    זהירות: השתמש בצבע בריכוז האופטימלי שלו בתערובת הצבע והתרופה המועמדת כאשר ריכוז הצבע בתערובת נמוך מדי, ייתכן שלא ניתן יהיה לעקוב אחר ההזרקה. כאשר ריכוז הצבע גבוה מדי, זה עלול לגרום לתערובת סמיכה מדי ובעלת צמיגות גבוהה, שתחסום את מחט ההזרקה.

4. טעינת התרופה המועמדת ותערובת הצבע לתוך הצינור

  1. חבר מזרק זכוכית של 100 מיקרוליטר כשהבוכנה הוסרה למחט של 27 גרם.
  2. חבר קצה אחד של כ-45 ס"מ של צינורות פוליאתילן מעוקרים למחט 27 גרם.
  3. קח מזרק פלסטיק של 3 מ"ל והתאם אותו עם מחט של 27 גרם. טען את המזרק בכ-0.5 מ"ל של 0.9% מי מלח רגילים.
  4. מלאו את צינור הפוליאתן במי מלח רגילים של 0.9% מהקצה הפתוח כדי למלא את כל אורך הצינור ואת כל הקנה של מזרק הזכוכית עד שהוא עולה על גדותיו.
    הערה: חשוב להימנע מבועות אוויר להילכד בתוך הצינור.
  5. הסר והשליך את המזרק והמחט בנפח 3 מ"ל.
  6. הכנס את בוכנת המזרק לתוך הקנה של מזרק הזכוכית ודחף אותה מעט קדימה עד לאמצע הקנה.
  7. הנח את מזרק הזכוכית במשאבת המזרק.
  8. משוך את הבוכנה מעט לאחור באמצעות משאבת המזרק כדי ליצור מרווח אוויר של כ-1.5 ס"מ בקצה הפתוח באורך הצינור.
  9. פיפטה לפחות 5 מיקרוליטר של צבע ותרופות מועמדות עם מיקרופיפטה של 10 מיקרוליטר וזרוק אותה על פיסת פרפילם מעוקרת.
  10. משוך את תערובת התרופה המועמדת לתוך הצינור על ידי משיכת הבוכנה לאחור דרך משאבת המזרק. שמור על בועת האוויר בין תמיסת המלח של 0.9% לתמיסת ההזרקה, אך אחרת, הימנע מלכידת בועות אוויר בתוך תמיסת ההזרקה. סמן את רמת תערובת ההזרקה בצינור בעזרת טוש.
    הערה: פער האוויר בין תערובת התרופה-צבע המועמדת לבין מי המלח הסטריליים בתוך הצינור הוא קריטי למניעת ערבוב של שתי התמיסות.
  11. התקן את מחט ה-35 גרם עם הצינור. קבע את המחט על המשטח הנקי של שלב הניתוח בעזרת סרט כך שהמחט לא תהיה רופפת, לא תזוז ותיגע בשום דבר אחר ותישאר מעוקרת.

5. תחול של מחט ההזרקה

  1. הגדר את תוכנית משאבת המזרק להוציא 0.5 מיקרוליטר לדקה.
  2. הפעל את משאבת המזרק למשך כ-10-15 שניות, עד שתמיסת ההזרקה מתחילה לצאת מקצה המחט. כמות זעירה של התערובת בקצה המחט ללא דליפה במפרק הצינור ומחט ההזרקה (או בכל מקום אחר לאורך המזרק, הצינור או המחט) מעידה על כך שההתקנה נכונה.
    הערה: אם לא רואים טיפה זעירה בקצה המחט, זה מעיד על חסימה של המחט. חסימת מחט עלולה להתרחש עקב הצמיגות הגבוהה של תערובת התרופה והצבע המועמדים, עודף אוויר הכלוא בתוך המערכת, ומזרק הזכוכית אינו יושב כראוי בתוך משאבת המזרק. ראה איור 1 לדוגמא של דליפה בצומת בין המחט לצינור. תחול הוא קריטי מכיוון שהוא עוזר לזהות אם המחט אינה חסומה והזריקה בתוך העצב תעבור בצורה חלקה.

6. הכנת חולדה לניתוח

  1. השג את משקל הגוף של החולדה כדי לחשב את המינון הדרוש של משככי כאבים. לדוגמה, קרפרופן משמש במינון של 5 מ"ג/ק"ג תת עורי בחולדות.
    הערה: מומלץ לאחסן קרפרופן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפני ההזרקה.
  2. הרדמו את החולדה בעזרת מכשיר אידוי איזופלורן באמצעות קצב זרימה של 3%-4% לאינדוקציה של הרדמה למשך כ-2-3 דקות. הפחת את קצב זרימת האיזופלורן לכ-1.75%-2% לשמירה על ההרדמה.
  3. העבירו את החולדה לשולחן נפרד עם מערך להסרת שיער והכנת האתר. ודא ששולחן זה קרוב לחלל הניתוח.
  4. מרחו משחת דמעה מלאכותית בשתי עיני החולדה כדי למנוע יובש יתר.
  5. יש לתת משככי כאבים לפי הפרוטוקול המוסדי המאושר לבעלי חיים כדי לשלוט בכאב כאשר החולדה חוזרת להכרה.
  6. לגלח את אזור הניתוח בעזרת קוצץ שיער בצד הגחון של הצוואר באזור צוואר הרחם. גלח עד כ-2 ס"מ מרחק מאונך מקו האמצע משני הצדדים מהסנטר ועד עצם החזה.
  7. יש לעקר את האזור עם 70% אלכוהול אתילי ו-10% בטדין, ולנגב את האזור שלוש פעמים לסירוגין עם ספוגית אלכוהול ופובידון יוד. נגב ממרכז האזור כלפי חוץ בתבנית מעגלית.
  8. העבירו את החולדה לשלב הכירורגי מתחת למיקרוסקופ במצב שכיבה. התאם את מיקוד המיקרוסקופ כדי לדמיין את אזור הניתוח באזור צוואר הרחם.

7. ביצוע ניתוח חולדות להזרקת התרופה המועמדת ישירות לעצב התועה השמאלי (איור 2, איור 3 ואיור 4)

הערה: חלק זה של השיטה ידרוש אדם שני שיסייע למנתח.

  1. הנח את החולדה על כרית חימום במצב שכיבה מתחת למיקרוסקופ הניתוח הקשור לאור רכוב.
  2. חברו את שיני הלסת העליונה הקדמית של החולדה עם חתיכת תפר שאינו נספג וקבעו את הקצה הפתוח של התפר בתוך חרוט האף כך שהנחיר של החולדה יהיה תמיד בתוך חרוט האף במהלך ההרדמה.
  3. מקם את החולדה כך שראשה מונח בצד שמאל של המנתח הימני (או בצד ימין של מנתח שמאלי). במצב זה, הצד הקדמי של המנתח מאונך לגוף החולדה. הניחו כרית של מד מעוקר מתחת לצוואר והתאימו את זווית אזור צוואר הרחם של החולדה כך שאזור צוואר הרחם יהפוך ישר. זה יקל על איתור עצב הנרתיק השמאלי וביצוע ההזרקה.
  4. עטפו את כל גוף החולדה בווילון מעוקר, תוך שמירה על חלל הניתוח פתוח.
  5. תקן ארבעה פיני מפסק בנפרד עם 4 מקבעים מגנטיים עם אלסטומרים והנח את המקבעים בארבע פינות השלב הכירורגי.
  6. יש להזריק חומרי הרדמה מקומיים אפידרמיס בקו האמצע של אזור צוואר הרחם בו מתבצע החתך. לדוגמה, בדרך כלל משתמשים בתערובת של לידוקאין ובופיבקאין.
  7. בצע חתך עור אורכי באורך של כ-2 ס"מ בקו האמצע בין הסנטר לעצם החזה עם להב אזמל בצד הגחון של הצוואר באזור צוואר הרחם (איור 3A).
  8. הפרד את הקצוות החתוכים של העור בעזרת קצות כותנה מעוקרים.
  9. משוך את קצוות העור בכיוונים מנוגדים ממקום החתך בעזרת קצות מפרק.
  10. הפרד את החזית בעזרת קצות כותנה כדי להעמיק. דחוף את בלוטות הרוק לכיוון הצד הרוחבי.
  11. הפרד את שרירי הסטרנומסטואיד בקצות כותנה ומשוך אותם הצידה בעזרת הסיכות. כאשר הפרדת השרירים הסטרנומסטואידים מתקדמת לרווחה, קנה הנשימה מופיע באמצע, מכוסה בשריר סטרנוהיואיד (איור 3B).
    הערה: היזהר לא להפעיל לחץ על קנה הנשימה.
  12. קדם את הפרדת הרקמות בצד שמאל של קנה הנשימה של החולדה עד להופעת מעטפת הצוואר, המכילה את עורק הצוואר המשותף העובר יחד עם עצב הנרתיק השמאלי.
  13. צרו בזהירות חור נקודתי קטן במעטפת הצוואר בעזרת מלקחיים עדינים, שימו לב כדי לא לפגוע בעורק הצוואר מתחת למיקרוסקופ. הפרד את עצב הנרתיק השמאלי מעורק הצוואר המשותף בעזרת מלקחיים עדינים.
    הערה: אזור הניתוח הוא קריטי מבחינה אנטומית. דופן עורק הצוואר עבה, חלקלק ואינו נפצע בקלות, אך הקצה החד של מלקחיים עדינים עלול לפצוע אותו, ועלול להתרחש דימום. יחד עם זאת, שימו לב כדי לא לפגוע בעצב.
  14. לאחר שהעצב מופרד מהעורק על ידי המלקחיים, השתמש במחט מעוקלת של 25 גרם המותקנת למזרק של 1 מ"ל מהחור הזה כדי "לחבר" ולהחזיק את העצב ביד הלא דומיננטית (איור 4A).
    הערה: קצה המחט המעוקלת נעשה קהה כדי לא לפגוע בעצב ובעורק. זווית העקמומיות של קצה המחט נעשית בהתאמה אישית לכ-90 מעלות באמצעות המוסטט (איור 2).
  15. עם היד הדומיננטית, החזק את המחט העמוסה בתערובת התרופה-צבע המועמדת ודקר בעדינות את העצב באותו כיוון שהעצב עובר כך שהשיפוע של המחט פונה כלפי מעלה.
    1. לדקירה קלה, שמור על העצב ישר על ידי משיכה עדינה באמצעות וו 25 G. הכנס את המחט לעצב והתקדם קדימה, יותר מ-0.5 ס"מ, תוך שמירה על המחט מקבילה לעצב הנרתיק. לאחר מכן, משוך מעט לאחור כך שתישאר מחט של 0.4-0.5 ס"מ בתוך העצב.
      הערה: זווית המחט צריכה להיות רדודה מספיק כדי לחדור לתוך העצב מבלי לעבור לצד השני.
  16. ייתכנו מקרים שבהם המחט אינה חסומה מחוץ לעצב בזמן ההתחלה, אך תערובת התרופה-צבע המועמדת אינה עוברת בצורה חלקה בתוך העצב. כדי להימנע ממצב זה, הגבל את מספר דקירות העצבים במחט אחת לא יותר משלוש פעמים. אם המחט מתקהה, הסיכוי לחסימה או הזרקה לקויה אחרת יגדל.
  17. ודא שהמחט נמצאת לגמרי בתוך העצב. שמור על המיקום ללא תנועה והפעל את משאבת המזרק.
    הערה: בדוק היטב במקום ההזרקה כדי לראות שתערובת התרופה-צבע המועמדת אינה זורמת חזרה מהעצב.
  18. בזמן שההזרקה מתקדמת, יש לבחון כל הזמן שהעירוי נשאר בתוך העצב וזורם בצורה חלקה. השתמש בסימן שנעשה על צינור העירוי כדי לעקוב אחר תנועת תערובת התרופה-צבע מנקודת ההתחלה.
    1. אם תערובת התרופה-צבע המועמדת אינה זורמת בצורה חלקה, משוך את המחט החוצה וחזור על שלב ההתחלה (שלב 5.2). לאחר מכן הכנס מחדש את המחט לעצב והמשך את העירוי.
  19. העצב מתחיל לפתח את צבע הצבע (איור 4B). המשך בעירוי ב-0.5 מיקרוליטר לדקה למשך 10 דקות כדי להחדיר את כל 5 המיקרוליטר של תערובת התרופה-צבע המועמדת
    הערה: מומלץ להשקות את הרקמות החשופות בכמות קטנה של מי מלח סטריליים חמים 0.9% לפי הצורך כדי למנוע יובש ונזק מוגזם.
  20. לאחר החדרת 5 מיקרוליטר ומשאבת המזרק נעצרה, שמור את המחט במקומה למשך דקה נוספת כדי לאפשר לכל תערובת התרופה-צבע המועמדת להתפשט מאתר ההזרקה. הסר את המחט.
  21. הסר את המחט המעוקלת 25 גרם. השתמשו בקצוות כותנה סטריליים כדי להחזיר בעדינות את הרקמות למקומן המקורי. הסר את קצות הנסיגה.
  22. סגור את הפצע בתפר שאינו נספג (ניתן להשתמש גם בתפר נספג). מרחו כמות זעירה של דבק רקמות בין התפרים במידת הצורך כדי לסגור את הפצע בצורה מושלמת.

8. טיפול לאחר ניתוח בחולדה

  1. יש להחדיר כ-3 מ"ל של 0.9% מי מלח חמים תת עורית לאחר סגירת הפצע. זה עוזר לחולדות להתייבש באופן מיידי.
  2. הנח את החולדה במקור חום עד שהיא מתאוששת לחלוטין מההרדמה למצב רגיל. שימו לב לכל דבר שנצפה שהוא חריג במהלך תהליך ההחלמה.
    הערה: משך ההחלמה עשוי להיות ארוך יותר אם הליך הזרקת העצבים לוקח זמן רב.
  3. העבירו את החולדה לכלוב הביתי שלה עם צ'או לח על רצפת הכלוב. ודא שיש מים זמינים כל הזמן. התבונן בחולדה לאחר הניתוח במשך כשעתיים כדי לוודא שהחולדה לא מרגישה קר.
    הערה: הניחו את החולדה במקור חום למשך שעות נוספות אם היא מרגישה קרה.
  4. עקוב אחר החולדה ב-12 שעות, 24 שעות, 36 שעות, 48 שעות ו-72 שעות לאחר הניתוח עם הערות כתובות של תצפיות. משככי כאבים חוזרים בהתאם לפרוטוקול המוסדי המאושר לבעלי חיים כדי לשלוט בכאב. לדוגמה, קרפרופן במינון של 5 מ"ג/ק"ג תת עורי פעמיים במרווח של 24 שעות. התייעץ עם וטרינר אם הכאב נשאר בחולדה במשך יותר מ-48 שעות.
  5. חזור על ההזרקה התת עורית של כ-3 מ"ל 0.9% מי מלח חמים תוך 24 שעות בהתאם לתנאי החולדה.
  6. המשך להעריך את הפצע. ודא שהפצע יבש ונמצא בתהליך ריפוי.
    הערה: אדמומיות, נפיחות ומצב כואב של הפצע עם חוסר פעילות וקהות של החולדה יכולים להוות אינדיקציה לדלקת בפצע ועשויים להצדיק התייעצות וטרינרית נוספת. חולדה עם כאב תראה גב כפוף, פרווה פרועה ועיניים אדומות ומצב לא פעיל. הוא נמצא בדרך כלל בפינת הכלוב.
  7. הסר את התפרים שאינם נספגים תוך שבועיים לאחר ריפוי הפצע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר הנוכחי נעשה שימוש ב-6 חולדות בוגרות (3 זכרים ו-3 נקבות). מתוך שש, חולדה אחת הוזרקה מספר פעמים כדי להדגים מצב של כישלון בהזרקה המראה דיפוזיה של צבע סביב אתר ההזרקה איור 5A. כל החולדות האחרות הראו הזרקה חלקה וצביעה עצבית, כפי שמוצג באיור 4B ובאיור 5B.

איור 1 מדגים מצב שבו דליפת צבע בין המחט לצינור התרחשה כא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה להזרקה ישירה לעצב הנרתיק השמאלי יכולה להיעשות בבטחה וללא סיבוכים לאחר הניתוח בחולדות. ניתן להשתמש בהעברת תרופות לעצב הנרתיק כדי למקד את מערכת העצבים האוטונומית (ANS). זה כרוך בשלבים קריטיים מסוימים הדורשים תרגול ורמה בינונית עד גבוהה של מיומנות כירורגית.

הליך כירורגי זה דורש הרדמה כללית מאוזנת בחולדות. המנתח שואף לסיים את הניתוח תוך פרק זמן קצר יותר כדי להגביל את החשיפה של חומרי הרדמה להחלמה טובה יותר, במיוחד בחולדות זקנות. שיטה זו מניחה גם מנתח מיומן ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים NR ו-XC אין ניגודי אינטרסים. RMB ו-SJG הם ממציאים של קניין רוחני הקשור להעברת גנים ל-ANS באמצעות הזרקות עצב תועה (פטנט ארצות הברית #11,753,655). SJG ו-RMB קיבלו הכנסות מתמלוגים מ-Taysha Gene Therapies, ו-SJG קיבלה הכנסות מייעוץ מ-Taysha Gene Therapies.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות למתקן מרכז משאבי בעלי החיים הדרום-מערבי של UT על סידור מרחב ניתוחי חולדות. המימון לעבודה זו סופק על ידי המקורות הבאים ל-SJG: NIH/NINDS R01 NS087175, קרן התקווה של חנה ו-Taysha Gene Therapies.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 מ"ל BD  מזרק טוברקולין עם ניתוק 25 גרם x 5/8 אינץ'. מחטבקטון, דיקינסון ושותמק"ט:309626משמש לחיבור עם מחט מעוקלת כדי למשוך את עצב הנרתיק ולהחזיק אותו בזמן ההזרקה.
0.5% הזרקת בופיבקאין הידרוכלורידHospiraNDC 0409-1162-19חומרי הרדמה מקומיים המשמשים להרדמת רקמות מקומיות.
100 מ"ל 0.9% השקיית נתרן כלורי USPStericare Solutionsפריט #6240מי מלח רגילים, המשמשים להחזרת לחות לחולדות ורקמות.
20 בלאנט, קצות מפרק, 7.5 מ"מKent Scientific CorporationSurgi 5018משמש לפירוק והחזקת רקמות בזמן הניתוח.
מזרק BD-Luer-Lok 3 מ"ל, סטרילי, לשימוש חד פעמי בקטון, דיקינסון ושותמק"ט # 309657משמש להזרקת מי מלח לחולדה ומילוי מי המלח לתוך צינורות הפוליאתילן.
AK-Fluor10%AkornNDC 17478-253-10צבע פלואורסצאין הנראה בתוך העצב. משמש למעקב אחר נאמנות ההזרקה.
משקל שקילה של בעלי חייםKent Scientific CorporationSCL 4000משמש למדידת משקל גוף של חולדה.
Ansell ENCORE Perry Style 42 PF כפפות כירורגיותAnsellASTM D3577Sterilie, היא משמשת בזמן הניתוח על ידי מנתח.
משחת דמעות מלאכותיות 3.5 גרםPivetalNDC 46066-753-55משמשת בעיניים למניעת יובש יתר בעיניים.
המוסטט בייבי-מיסטר כלים מדעיים עדינים13013-14משמש לעצירת דימום במקרה חירום. משמש גם לכיפוף המחט בגודל 25 G x 5/8 אינץ'.
BD Intramedic PE TubingBecton, Dickinson and Company14-170-12Aמשמש במערכת הגדרת ההזרקה לחיבור עם מחט המילטון ומחטי NanoFil. הוא גם מחזיק את תערובת ההזרקה.
מחט גלישה BD Precison, 25 גרם x 5/8 אינץ'בקטון, דיקינסון ושותREF#305122משמשת להזרקת מי מלח לחולדות, ולייצור מחט מעוקלת.
מחט גלישה BD Precison, 27 גרם x ½ "Becton, Dickinson and CompanyREF#301629שימש למילוי מי מלח סטריליים לתוך הצינור התוך-עורי של BD.
בנצ'מרק אקוריס " NextPette" סט מתנע מיקרו פיפטה בנפח משתנה כולל 4 פיפטות: 10/20/200/1000 μ L, בתוספת מעמדMilliporeSigmaBMSP7700S1משמש לפיפטה תמיסה סטרילית.
בטאדין, פובידין יוד 10% 67618015017 כנהמשמש לחיטוי אזור הניתוח.
תמיסה להזרקת קרפרופן 50 מ"ג/מ"למסופקת על ידי Covtrus (6451506845)SKU 591149במקרה שלנו, השתמשנו בקרפרופן מדולל במינון של 5 מ"ג/ק"ג המסופק על ידי המרכז למשאבי בעלי חיים של המרכז הרפואי של אוניברסיטת טקסס סאות'ווסטרן.
מחט מעוקלת (בהתאמה אישית)בקטון, דיקינסון ושותREF#305122BD PrecisionGlide 25 G x 5/8 אינץ' במחט מעוקלת ל-90 מעלות בעזרת המוסטט. קצה המחט נעשה קהה. יש לעקר אותו לפני השימוש. הוא משמש כדי לחבר את עצב הנרתיק ולהחזיק אותו בזמן ההפרדה וההזרקה.
מיקרוסקופ ניתוחמוטיק SMZ-171-BLED (משקפת עם אורות)משמש להגדלת האזור האנטומי הקריפי בזמן הפרדת עצב התועה, אינג'סיטון ולבדיקת דליפת הזרקה.
יריעת וילונות DynarexReorder#8122משמש כוילון לאחר עיקור.
אפליקטורים לקצה כותנה של דוקאל,דוקאל9003משמש להקהות הפרדת רקמות, צריך לעקר לפני השימוש.
Dumont #7 - מלקחיים עדיניםכלים מדעיים עדינים11274-20משמש להפרדת עצב הנרתיק השמאלי מעורק הצוואר המשותף. הוא מעוקל כל כך קל לשימוש.
Ethicon PDS II תפר מונופילמנט לא צבוע - תפר, 4/0 18 PDS II CLR MONO PSEthiconVA - Z682Gמשמש לתפירת הפצע.
תפר ניילון אתילון שחור מונופילמנט Ethicon1856Gמשמש לתפירת הפצע אם משתמשים בתפר שאינו סופג. משמש גם לחיבור שן החולדה כדי לקבע את האף בתוך חרוט האף.
מלקחיים עדינים - גימור מראהכלי מדע עדינים11412-11בשימוש בזמן הפרדת עצב התועה מעורק הצוואר המשותף. זה ישר.
מספריים עדינים - SharpFine Science Tools14060-09משמש לחיתוך רקמות.
פתרון ניקוי המילטוןהמילטוןHT18311משמש לניקוי המילטון לאחר השימוש.
מחט המילטון, 27 גרם, מחט RN רכזת קטנה, 2 אינץ', PT3, 6/PKהמילטון7762-01משמש לחיבור BD Intramedic&Trade; צינורות PE.
מזרק המילטון , 710RN המילטון7638-01משמש להחזקת סם בזמן הזרקת עצב התועה.
מזרק אינסוליןEXEL INT, נקודת נוחותREF 26027משמש להזרקת קרפרופן והרדמה מקומית.
לידוקאין 2% הזרקהCovetrusReorder#002468משמש לערבוב עם Bupivacaine ולהזרקה במקום החתך. 
Luxol Fast Blue MBSNAcros Organics212170250צבע הנראה בתוך העצב, המשמש לערבוב עם תרופה כך שתערובת ההזרקה נראית לעין.
מעקר מיקרו חרוזים עם חרוזי זכוכיתכלים מדעיים עדיניםפריט מס' 18090-46משמש לעיקור כלים כירורגיים בין ניתוח החולדות.
מחטי NanoFil-NF35BV-2 מכשיר דיוק עולמיNC9708956משמש להזרקת תערובת תרופות - צבע בתוך עצב הנרתיק.
מחזיקי מחט אולסן-הגר עם חותכי תפריםכלי מדע עדינים12002-12משמשים בתפירת פצעים.
סרט עטיפת מעבדה Parafilm M, 4 אינץ' x 125 רגל, גליל אחד לקופסה, 12 ספירהHonestmedPM#996משמש להחזקת 5 uL הנקובים של תערובת צבע תרופות כך שטעינת תערובת צבע תרופות לתוך הצינור התוך-עורי BDTM תהיה מדויקת.   
רפידות הכנת אלכוהול PDIHonestmedNDC 10819-3914-2משמש לחיטוי אזור הניתוח.
ספוגי גזה סטריליים מסוג VII Premium Care, 8 שכבות, 2 אינץ' x 2 אינץ'Dukalפריט C5119משמש ככושון מתחת לצוואר של חולדה בזמן הניתוח. 
עיתונות' n סרט נצמד לכלבי יםשמחשימש לכיסוי חולדה בזמן הניתוח כמו וילון. 
סט מפסק חולדותקנט Scientific CorporationSurgi 5002משמש לשמירה על החתך פתוח כך שיהיה קל להפריד את עצב הנרתיק מעורק הצוואר.
רייט טמפ ג'וניורקנט סיינטיפיק20.3 ס"מ רוחב x 25.4 ס"מ אורך (8 אינץ' רוחב x 10 אינץ' L), משמש לשמירה על חום חולדות.
S& מלקחיים T - קצות SuperGripמדעיים עדינים00632-11משמש בזמן התפירה להחזקת רקמות ללא נזק.
S& מלקחיים לקשירת תפריםכלים מדעיים עדינים00272-13משמשים להידוק התפר.
להב אזמל #15Fine Science Tools10015-00משמש לביצוע חתך בעור בצד הגחון של הצוואר.
ידית אזמל-#7Fine Science Tools10007-12משמשת להחזקת להב האזמל.
משאבת מזרק  KD Scientific78-81-8052GL  Serial #D107034, דגם # LEGATO-180, היא משאבה ניתנת לתכנות שיכולה לשאוב נפח קטן של תערובת תחת תוכנית.
TipOne Filter TipOne Tip Refill Starter Systems"ב פריט מדעי#1120-3510משמש לפיפט את תערובת התרופה והצבע.
וופורייזר לאיזופלורן, משפך מלאקנט סיינטיפיק קורפוריישןVetflow 1231המשמש להרדמת חולדות.
דבקי רקמות Vetbond3M מדע מיושם על LifeID B00016067משמש לאיטום רקמות במקום הפצע החתוך אם התפירה אינה מושלמת.
Wahl BravMini+ ערכת קוצץ אלחוטית מקצועיתKent Scientific CorporationCL7300-Kitמשמשת לחיתוך שיער של חולדה.
' ' ' ' פריט לא סטרילי תאגיד כלים ארה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fischer, G., et al. Direct injection into the dorsal root ganglion: Technical, behavioral, and histological observations. J Neurosci Methods. 199 (1), 43-55 (2011).
  2. O'donnell, M., Fontaine, A., Caldwell, J., Weir, R. Direct dorsal root ganglia (drg) injection in mice for analysis of adeno-associated viral (AAV) gene transfer to peripheral somatosensory neurons. J Neurosci Methods. 411, 110268(2024).
  3. Puljak, L., Kojundzic, S. L., Hogan, Q. H., Sapunar, D. Targeted delivery of pharmacological agents into rat dorsal root ganglion. J Neurosci Methods. 177 (2), 397-402 (2009).
  4. Rueter, L. E., Kohlhaas, K. L., Curzon, P., Surowy, C. S., Meyer, M. D. Peripheral and central sites of action for a-85380 in the spinal nerve ligation model of neuropathic pain. Pain. 103 (3), 269-276 (2003).
  5. Ulusoy, A., et al. Neuron-to-neuron alpha-synuclein propagation in vivo is independent of neuronal injury. Acta Neuropathol Commun. 3, 13(2015).
  6. Helwig, M., et al. Brain propagation of transduced alpha-synuclein involves non-fibrillar protein species and is enhanced in alpha-synuclein null mice. Brain. 139 (Pt 3), 856-870 (2016).
  7. Chiang, B., et al. Development of a novel suprachoroidal-to-optic-nerve (scone) drug delivery system. Drug Deliv. 31 (1), 2379369(2024).
  8. Ferrari, L. F., Cunha, F. Q., Parada, C. A., Ferreira, S. H. A novel technique to perform direct intraganglionar injections in rats. J Neurosci Methods. 159 (2), 236-243 (2007).
  9. Yuan, X. M., et al. Rapid injection of lumbar dorsal root ganglia under direct vision: Relevant anatomy, protocol, and behaviors. Front. Neurol. 14, 1138933(2023).
  10. Mason, M. R., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
  11. Arjomandnejad, M., Dasgupta, I., Flotte, T. R., Keeler, A. M. Immunogenicity of recombinant adeno-associated virus (AAV) vectors for gene transfer. BioDrugs. 37 (3), 311-329 (2023).
  12. Ertl, H. C. J. Immunogenicity and toxicity of AAV gene therapy. Front Immunol. 13, 975803(2022).
  13. Wayman, C., et al. Performing permanent distal middle cerebral with common carotid artery occlusion in aged rats to study cortical ischemia with sustained disability. J Vis Exp. (108), e53106(2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

AAV9

מאמרים קשורים