מאמר שיטה

שיטה חדשנית ויעילה לצביעה פלואורסצנטית של לב דרוזופילה עם הקפאה

DOI:

10.3791/67827

⸱

28 במרץ 2025

 ,  , 
1Department of Pathology, Division of Molecular and Cellular Pathology, Heersink School of Medicine, The University of Alabama at Birmingham, 2UAB Nathan Shock Center, The University of Alabama at Birmingham

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול חתך הלב וההדמיה הקרינה של דרוזופילה מפשט את חקר מבנה הלב והפתולוגיות. גישה זו כוללת חתך, צביעה והדמיה פשוטים, תוך עקיפת המומחיות הטכנית הדרושה לנתיחה מסורתית. זה משפר את הנגישות, מה שהופך את הדרוזופילה למודל שמיש יותר למחקר הקשור ללב בקרב הקהילה המדעית הרחבה יותר.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודלים של לב דרוזופילה נמצאים בשימוש נרחב בחקר הזדקנות הלב ומודלים של מחלות לב אנושיות. עם זאת, דיסקציה של לבבות דרוזופילה לפני הדמיה היא תהליך קפדני עתיר זמן הדורש הכשרה מתקדמת ומיומנויות מוטוריות. כדי להתמודד עם אתגרים אלה, אנו מציגים פרוטוקול חדשני המשתמש בהקפאה להדמיה פלואורסצנטית של רקמת הלב של דרוזופילה. הפרוטוקול הודגם בהדמיה של לב דרוזופילה בוגר אך ניתן להתאים אותו לשלבי התפתחות. השיטה משפרת הן את היעילות והן את הנגישות של צביעה פלואורסצנטית תוך שמירה על שלמות הרקמה. פרוטוקול זה מפשט את התהליך מבלי לפגוע באיכות ההדמיה, ובכך מפחית את התלות בטכנאים בעלי הכשרה ומיומנויות מוטוריות מפותחות. באופן ספציפי, אנו מחליפים טכניקות מורכבות, כגון שאיבת ואקום נימית, בשיטות פשוטות יותר כמו הטמעת רקמות. גישה זו מאפשרת הדמיה של מבני לב בקלות רבה יותר וביכולת שחזור. אנו מדגימים את התועלת של פרוטוקול זה על ידי זיהוי יעיל של סמני לב מרכזיים והשגת הדמיה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה וצביעת חיסון החושפת פרטים מורכבים של מורפולוגיה של הלב וארגון התאים. שיטה זו מספקת כלי חזק ונגיש לחוקרים החוקרים את הביולוגיה הלבבית של דרוזופילה, ומאפשרת ניתוחים מפורטים של התפתחות הלב, תפקוד ומודלים של מחלות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלות לב וכלי דם (CVD) הן סיבת המוות המובילה בעולם, ואחראית לכ-17.9 מיליון מקרי מוות מדי שנה, המהווים כמעטשליש מכלל מקרי המוות בעולם. Drosophila melanogaster (הידוע בכינויו זבוב הפירות) נמצא בשימוש נרחב כאורגניזם מודל לחקר הבסיס הגנטי, התאי והמולקולרי של התפתחות הלב, פיזיולוגיה, חילוף חומרים, הזדקנות וקרדיומיופתיה 1,2,3,4,5,6,7,8,9. מודלים של דרוזופילה שימשו גם לחקר תפקידו של שריר הלב בוויסות מערכתי של השמנת יתר10, גורם סיכון עיקרי לתחלואה ותמותה קרדיווסקולרית. מחקרי ריצוף גנום של דרוזופילה 11 חשפו שימור משמעותי של גנים בבני אדם, כולל אלה הקשורים להתפתחות איברים שונים, כולל הלב. בין הגנים השמורים הללו, חלקם מעורבים בתפקוד לקוי של הלב, כגון קרדיומיופתיה או תעלות3. הפיתוח האחרון של טכניקות יעילות לחקר ביצועי הלב הרחיב את יישומי המודל כדי לחקור שינויים ארוכי טווח בפיזיולוגיה של הלב במבוגרים עקב גורמים כמו פעילות גופנית, תזונה והזדקנות8. עם זאת, אתגרים טכניים ולוגיסטיים מעכבים לעתים קרובות את השימוש במערכת מודל זו. אחד האתגרים בשימוש בדרוזופילה במחקרי לב הוא דיסקציה מדויקת של הלב באופן המשמר את הארכיטקטורה הציטו-ארכיטקטונית ואלמנטים של שריר הלב.

לב הדרוזופילה או כלי הגב מורכב ממבנה דמוי צינור המורכב משכבה אחת של קרדיומיוציטים, תאי קרום הלב הממוקמים לאורך דופן הלב, נתמכים על ידי שרירי אלרי, ובמבוגרים, מלווים בשכבה של תא שריר אורך גחוני12. נתיחה מדויקת כדי לגשת למבנים העדינים הללו היא תהליך עתיר זמן ועבודה. התקן הנוכחי כולל דיסקציה מאתגרת מבחינה טכנית ויניקת ואקום נימית, הדורשת הכשרה מתקדמת ומיומנויות מוטוריות 13,14,15,16. בדרך כלל, הדיסקציה מתחילה בחתך דופן הגוף הגחוני, והאתגרים מציגים את עצמם במהירות עם האנטומיה הזעירה של הלב, המבנה השברירי שלו והמיקום הגבי הקשה לגישה. זה בשילוב עם טכניקות דיסקציה מסורתיות, מאפשר ניתוח מדויק של מבנה הלב ותפקודו, ומספק כלי משופר לחקר מחלות לב וכלי דם בדרוזופילה13. לדוגמה, באמצעות זה, Alayari et al. סיפקו פרוטוקול לתיוג פלואורסצנטי של מבני לב דרוזופילה, מה שהקל על הדמיה של מורפולוגיה ומבנה לב. למרות מאמצים אלה, דיסקציה וצביעה מסורתית של הלב מתמודדת עם מספר אתגרים, כולל הקושי לשמור על שלמות הרקמות וההכשרה המיוחדת הנדרשת לצביעה יעילה של הלב.

השיטה מציעה פתרון חדשני לבעיה זו על ידי החלפת ההליך כולו בפרוטוקול פשוט יותר המשתמש בהקפאה של בית החזה והבטן של דרוזופילה ולאחר מכן צביעה חיסונית והדמיה פלואורסצנטית. גישה קלה ללמידה זו מבטיחה הדמיה מהירה ופשוטה יותר של מבני לב עם יכולת שחזור רבה יותר. בנוסף, אנו מתארים שיטה פשוטה הכוללת קרח יבש המבטיחה יישור אחיד של ציפורן הבטן של דרוזופילה באותו מישור z המייעל את שלב ההקפאה במורד הזרם. אנו מדגימים את היעילות של פרוטוקול זה בזיהוי סמנים לבביים חשובים, מורפולוגיה של הלב וארגון תאים באמצעות מיקרוסקופיה אימונו-פלואורסצנטית כמו גם קונפוקלית. הקלות והיעילות הגבוהה של גישה זו מועילות במיוחד למחקרי לב מבוססי דרוזופילה בתפוקה גבוהה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת ציוד

  1. ודא שהקריוסטט מופעל ומוגדר ל-20 מעלות צלזיוס. אפשר לחלוף זמן מספיק עד שהטמפרטורה תגיע לנקודה זו. אם המכונה נמצאת בטמפרטורת הסביבה, הקירור לטמפרטורת חיתוך אופטימלית יכול להימשך כ-5 שעות.
  2. הפעל את מחמם השקופיות או החממה, וודא שהוא מוגדר ל-37 מעלות צלזיוס. ודא שלמגלשות יש מספיק זמן להגיע לטמפרטורה הרצויה.
    הערה: בשלב זה, ניתן להניח שקופיות מסומנות על המחמם או החממה ולהשאיר ללא הגבלת זמן עד לחתך.
  3. ודא שקרח יבש מוכן לשימוש. ניתן להסיר קרח מהאחסון בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לאחר הגעה לשלב 5.

2. הכנת פתרונות

  1. הכן 50 מ"ל PBS. הכן 10 מ"ל של 10 מ"מ חומצה טטראצטית אתלין גליקול ב- PBS. הכן תמיסה של 4% פרפורמלדהיד ב-PBS כאשר הנפח הסופי שווה ל-100 מיקרוליטר כפול מספר קבוצות הניסוי.
  2. הכינו תמיסת ניקוי של 70% אתנול במים בבקבוק ריסוס. הכן את כל פתרונות הצביעה הפלואורסצנטיים.
    הערה: פרוטוקול זה יפרט כיצד לבצע צביעה פשוטה באמצעות כתמים או צבעים פלואורסצנטיים פשוטים. במקרה זה, נתאר את השימוש ב-1x Phalloidin 594 ביחס של 1:250 ב-PBS. ריכוזי כתמים פלואורסצנטיים ישתנו בהתאם למגיב ולמטרות הניסוי. יש לבצע בדיקות מקדימות כדי למצוא את הריכוז המתאים. צביעת נוגדנים לא תפורט כאן אך צריכה להיות ישומה בשיטות צביעה קונבנציונליות.

3. איסוף רקמות

  1. הרדמו 5-10 זבובים באמצעות מחצלת זבובים CO2 ומקמו את הזבובים בטווח הראייה מתחת למיקרוסקופ בהגדלה של 1x-2x. ווסת CO2 צריך לרשום בין 1 ל-5 kPa למחצלת CO2 .
    הערה: קיימות שיטות אחרות להרדמה (למשל, FlyNap2), ושיטות אלו אינן משפיעות באופן משמעותי על התוצאות.
  2. בעזרת מספריים קפיציים, ערפו את הראש, קצצו את הכנפיים והוציאו את הרגליים מ -5 עד 10 זבובים. מה שנשאר הוא בית החזה והבטן, ביחד ייקראו הגוף.
    הערה: כדי ליישר גופי זבוב כראוי בשלב 5, אסור שכל אורכי הכנפיים או הרגליים שנותרו יפריעו ליישור שטוח לאורך תחתית התבנית. השיגו זאת על ידי קיצוץ הכנפיים והרגליים קרוב ככל האפשר לבית החזה.
  3. בעזרת מברשת, הניחו בעדינות את הגופות בצינורות מסומנים של 1.5 מ"ל על קרח עד שכל קבוצות הניסוי נאספו.

4. קיבוע של רקמה שלמה

  1. אחרי הוצאת הצינורות מהקרח, הוסיפו 100 מיקרוליטר של 10 מ"מ EGTA, pH 8, לכל צינור כדי להרפות את רקמת הלב בתוך הבטן. ודא שכל הגופים שקועים למשך 10 דקות ומונחים על שייקר המסלול. ניתן להשתמש בצנטריפוגה שולחנית כדי להקל על הגופים לטבול.
  2. הסר והשליך את התמיסה בצינור. פיפטה 100 מיקרוליטר של PBS בכל צינור לשטיפת רקמות למשך 10 דקות, הנחת שייקר המסלול. הסר והשליך לאחר שחלף הזמן.
  3. פיפטה 100 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד בתמיסת PBS לכל צינור. ודא שכל הגופים שקועים בתמיסה.
  4. הניחו על שייקר מסלולי למשך 15 דקות, והגדירו את המהירות לכ-100 יחידות. ודא שההגדרה אינה מעוררת את הרקמות מחוץ למגע עם התמיסה.
  5. לאחר שחלף זמן זה, השליכו את ה-PFA והחליפו אותו ב-1x PBS למשך 10 דקות, וודא שוב שכל הגופים יוצרים קשר עם הפתרון. החזר את הצינורות לשייקר המסלול במהירות דומה לשלב 4.4 עבור כל שטיפה שנותרה.
  6. זורקים את התמיסה הקודמת בכל פעם, שוטפים את הטישו עם PBS 2x למשך 10 דקות כל אחד, בסך הכל 3 כביסות.
  7. לאחר השלכת הכביסה הסופית, העבירו את הגופות לסוכרוז של 10% בתמיסת PBS, והבטיחו שהם באים במגע עם התמיסה בתוך הצינור. לקבלת רוויה אופטימלית, השאירו אותם למשך הלילה או מספיק זמן כך שהגופים ישקעו לתחתית.
    הערה: עדיפה הגנה מפני הקפאה למשך הלילה, אך אם יש צורך בהדמיה באותו יום, אפשר זמן רב ככל האפשר לחומר ההקפאה לחדור לרקמה.

5. הכנת עובש

  1. בשלב זה, הוציאו את הקרח היבש מהאחסון ובחרו כמה חתיכות להצבה במגש מתכת או פלסטיק קטן. מידות המגש צריכות להיות כאלה שניתן להכניס את התבנית, ולהניח אותה ישירות על גבי חתיכת קרח יבש אחת, גדולה, ורצוי שטוחה.
  2. מלאו תבנית מסומנת כ-50% בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT). נסה להפחית את הכנסת הבועות על ידי מתן אפשרות לתרכובת לזרום לאט.
  3. בעזרת מברשת, הניחו בזהירות את הגופות על פני ה-OCT בתוך התבנית. יש להפריד באופן ברור בין קבוצות ניסוי מרובות בשלב זה.
    הערה: חשוב למנוע דילול של תרכובת ה-OCT באמצעות זיהום בתמיסת הסוכרוז על ידי המברשת. בנוסף, מיקום עמוק לתוך ה-OCT באמצעות המברשת יכול ליצור בועות אוויר רבות. הימנע מטעויות אלה כדי למנוע בעיות חתך מאוחר יותר.
  4. בעזרת מלקחיים דוחפים כל גוף לתחתית התבנית עם דופן הגב של בית החזה והבטן, בדרך כלל לאורך החלק התחתון. לאחר מכן, התאימו את הגוף כך שהבטן תקבל עדיפות כשטוחה לאורך החלק התחתון של התבנית. יישר את כל הגופים בממדים X, Y ו-Z כך שכל קטע יכיל את כל הנושאים בו זמנית.
  5. תיתכן עקמומיות של הבטן, במיוחד אצל הזכרים; שטח את זה כמיטב יכולתו של הטכנאי. זה חיוני לאיסוף קטעים ארוכים יותר במישור העטרה. הימנע מניקוב או ריסוק הגופות בתחתית התבנית במהלך תהליך זה. עבוד באופן שיטתי כדי ליישר כל נושא בצורה נכונה.
  6. לאחר שכל הנושאים נמצאים במקומם, קחו את התבנית והניחו את החלק התחתון ישירות על פיסת קרח יבש. בדוק אם ה-OCT מתחיל לקפוא לאחר מספר רגעים לאחר המגע. אפשר לזה להימשך עד שכל הנושאים נעטפים בחלק הקפוא של התבנית.
  7. לאחר הגעה לשלב זה, העבירו את התבנית ל-20 מעלות צלזיוס להקפאה לאורך כל הדרך. ממלאים את החלק הנותר של התבנית כשהחלק הראשון קפוא לחלוטין. לאחר מכן ניתן לאחסן את התבניות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר על ידי עטיפתן בנייר אלומיניום או לחתוך אותן מיד.
    הערה: הימנע מחשיפה פתוחה לאוויר ב-20 מעלות צלזיוס ו-80 מעלות צלזיוס בין שני ההקפאהtags. זה יכול לגרום להתפתחות לחות בין השכבות.

6. הקפאת תבניות

הערה: בדרך כלל רצוי להכין ולחתוך תבנית ריקה לפני חיתוך תבניות קבוצתיות ניסוי. זה מאפשר לנו להבטיח את הפונקציונליות התקינה של הגלגל, הלהב והזכוכית נגד גלגול מיד לפני חיתוך רקמה. בנוסף, אפשר לכל תבניות המגיעות מאחסון קר יותר להתאקלם בקריוסטט למשך 30 דקות.

  1. חבר את סיבית הצ'אק לתבנית על ידי מריחת כמות נדיבה של OCT על הבלוק והנחת הביט מעל, לחיצה עליו שטוח. אפשר לזה לקפוא לחלוטין בקריוסטט, בדרך כלל תוך 5 דקות.
  2. שחרר את הביט ואת בלוק ה-OCT מהתבנית והנח אותו לתוך הצ'אק, וודא שהבלוק נשאר מכוון כראוי מלמעלה למטה. הדק את מפתח הצ'אק עד שהביט מאובטח.
  3. יישר את הבלוק עם הלהב באמצעות כפתורי הכוונון ובקרות עומק הצ'אק. הגדר את רוחב המקטע ל-20 מיקרומטר ומטה.
    הערה: חלקים דקים יותר רצויים יותר כדי להגדיל את מספר החלקים האפשריים שנאספו. 2-6 החלקים הראשונים של כל נושא צריכים להכיל את החלקים הרצויים ללא הפרעה של הלב שהם פונקציה של הכיוון ורוחב החתך. יש לנסות ולקבל את כיוון הצ'אק נכון לפני שחותכים את 2-6 החלקים החשובים.
  4. חותכים כל פרוסה בהילוך איטי אך עקבי, ומאפשרים לזכוכית נגד גלגול ללכוד כל פרוסה. אסוף קטעים באמצעות שקופיות מחוממות. הניחו לשקופיות להתייבש בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות, אך לא יותר משעה לפני סבב הכביסה הראשון.

7. צביעה פלואורסצנטית

  1. מיד לאחר תקופת הייבוש, הסר עודפי OCT המקיפים את החלקים באמצעות סכין גילוח. היזהר להימנע ממפגש עם הרקמה בשלב זה. אם השקופית מיועדת להיות מוכתמת בנקודת זמן מאוחרת יותר, אחסן אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  2. שרטט את הגבול הזה בכל שקופית באמצעות סמן הידרופובי. גבול זה ישמש לשמירה על תמיסות שטיפה וכתמים על הרקמה.
    הערה: פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע מכתים וכביסה בשיטת פיפטה, ניתן להשתמש גם בדלי החלקה ומתלים. כל שעליך לעשות הוא להחליף את פיפטינג התמיסות על גבי המגלשות בהטבעת שקופיות בכל אחד מהפתרונות הטריים. כפי שעשינו לאחרונה עבור הדמיית מוח17, ניתן ליישם הליך צביעה חיסונית גם על צביעת לב.
  3. שטפו את כל המגלשות 3 פעמים למשך 5 דקות כל אחת עם PBS על ידי פיפטינג בעדינות על גבי המגלשה, הימנעו מפיפטינג ישירות על גבי הטישו במידת האפשר. בצע זאת באמצעות פיפטה של 1000 מיקרוליטר והטיפים הנלווים. נסו לא לסנן את התמיסה במהירות מכיוון שהדבר עלול לגרום לרקמות להשתחרר מפני השטח של המגלשה.
  4. השליכו את הכביסה הסופית ושפכו את תמיסת הכתם הקרינה (1:250, 1x פלואידין) על הרקמות. הניחו לזה לדגור למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך.
  5. לאחר נקודה זו, הנבדקים רגישים לאור. בצע את כל השלבים הבאים בחושך או על ידי כיסוי השקופיות. השליכו את כתם הקרינה, ובעזרת פיפטה של 1000 מיקרוליטר שטפו 3 פעמים למשך 5 דקות עם PBS.

8. הרכבה והכנה להדמיה

  1. השליכו את הכביסה הסופית והשאירו כמות קטנה של PBS על השקופית. פיפטה 3-5 טיפות של מדיית הרכבה על המגלשה באמצעות פיפטה של 1000 מיקרוליטר, הימנעות מפריסה ישירה על רקמה.
  2. הנח את הכיסוי על השקופית כך שייצור בועות האוויר ימוזער. להקלה, השתמש במלקחיים כדי למקם את החלקת הכיסוי בקצה אחד ולהוריד בהדרגה את הצד השני עד שהוא סומק עם המגלשה. טפל במגלשות הטריות שהותקנו בזהירות ואחסן אותן שטוחות לפחות 24 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  3. אטום שקופיות באמצעות לק, או אם אמצעי ההרכבה מתקשה, הימנע מכך. אין להשתמש בלק המכיל ניאון או נצנצים. בהתאם לכתם הפלואורסצנטי, בצע הדמיה באופן מיידי או אחסן שקופיות ניתן לאחסן ללכידה מאוחרת יותר.

9. הדמיה

הערה: מיקרוסקופ Olympus BX 63 עם עדשות 10x, 40x ו-60x שימש לצילום תמונה. נעשה שימוש גם במסננים המתאימים ל-DAPI, Lipid Spot 488 ו-Phalloidin 594.

  1. לפני ההדמיה, בדוק את השקופיות ונקה אותן באמצעות מגבון טישו ואתנול 70% בתמיסת מים. אם שקופיות מצולמות מיד לאחר ההרכבה, היזהר במיוחד בעת הניקוי כדי למנוע הפרעה לכיסוי.
  2. בחר זמני חשיפה מתאימים עבור כל ערוץ בהתבסס על נושאי הפלואורסצנט הבהירים ביותר בניסוי הכולל. הימנע מרוויית יתר תוך יצירת תמונה בהירה ככל האפשר והקטנת הרקע. סקר במהירות כל קבוצת ניסוי עם תצוגה חיה של כל ערוץ כדי לוודא שהחשיפות מוגדרות כראוי.
  3. התמקד בכל נושא, תוך שימוש באותו ערוץ בכל נושאי הצילום לעקביות. לאחר מכן, צלמו כל נושא. לכוד את כל קבוצות הניסוי המשמשות להשוואה באותו יום כדי למנוע הבדלים בדעיכה פלואורסצנטית בין קבוצות ההשוואה.
  4. לאחר ההדמיה, אחסן שקופיות בחושך ב-4 מעלות צלזיוס לצילום מחדש של תמונה מאוחר יותר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה שתוארה לעיל מקלה על חקר לב הדרוזופילה באמצעות הדמיה פלואורסצנטית ללא דיסקציה מייגעת. זהו היתרון העיקרי של שיטה זו, שכן השיטה הקונבנציונלית לדיסקציה של לב דורשת פיתוח מיומנויות מוטוריות מורכבות. כפי שמודגם באיור 1, השיטה נגישה יותר מדיסקציה של הלב עבור חוקרים חדשים ומאפשרת גמישות בניסוי. לחלופין, באמצעות אחסון של -80 מעלות צלזיוס בשלב תבנית ה-OCT, ניתן לשמור דגימות לשימוש שבועות רבים לאחר מכן. אין צורך להכשיר טכנאים מספיק זמן כדי ללמוד את טכניקות הניתוח וההטמעה הפשוטות, מה שהופ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתחנו פרוטוקול יעיל להכנת צינור לב דרוזופילה להדמיה באמצעות הדמיה פלואורסצנטית או קונפוקלית. קדם לכך דיון בשיטה נפוצה אך עתירת זמן ועבודה לגישה ולניטור השלמות הציטולוגית של לב דרוזופילה. השיטה החדשנית והיעילה שלנו מציעה אלטרנטיבה תמציתית ויעילה לגישות מסורתיות על ידי שימוש בהטמעה ישירה של קריו, השומרת על השלמות המבנית של צינור הלב של דרוזופילה. שמירה על שלמות מבנית היא שלב מכריע תוך שימוש בטכניקות מיקרוסקופיה להמחשת המבנה האנטומי של דרוזופילה ויש להתא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לחברי מעבדת מלקני על עזרתם במשוב רב ערך על פיתוח הפרוטוקול. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) AG065992 ו-RF1NS133378 ל-G.C.M. עבודה זו נתמכת גם על ידי קרנות UAB Startup 3123226 ו-3123227 ל-G.C.M.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1000 ומיקרו; L פיפטהאפנדורף3123000063
1000 ומיקרו; L טיפים לפיפטהאולימפוס פלסטיק23-165R
10X פוספט חוצץ מלח (PBS)פישרJ62036.K7ph=7.4
200 הוכחה אתנולDecon Laboratories64-17-5
20X Tris Buffered SalineThermo ScientificJ60877. K2pH=7.4
זכוכית נגד גלגולIMEBAR-14047742497
סרום בקר אלבומיןפישר9048-46-8
צינורות צנטריפוגה 1.5 מ"לפישר05-408-129
שקופיות טעונותגלובוס סיינטיפיק1415-15
תבניות חיתוך בקרפישר2363553
CryostatLeicaCM 3050 S
להבי קריוסטטC.L. SturkeyDT554N50
קרח
יבש מלקחיים עדיניםכלים מדעיים עדינים11254-20
Fly PadTritech ResearchMINJ-DROS-FP
התקשות מדיה הרכבה עם DapiVectashieldH-1800
KimwipesKimtech34120
מיקרוסקופאולימפוסSZ61
תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימליתפישר4585
פרפורמלדהיד 20%מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים15713
פלואידין 594AbnovaU0292
סכיני גילוחGravey#40475
מספרייםאביבייםכלים מדעיים עדינים15000-10
סוכרוזפישרS5-500

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baker, K. D., Thummel, C. S. Diabetic larvae and obese flies-emerging studies of metabolism in Drosophila. Cell Metab. 6 (4), 257-266 (2007).
  2. Bhide, S., et al. Increasing autophagy and blocking Nrf2 suppress laminopathy-induced age-dependent cardiac dysfunction and shortened lifespan. Aging Cell. 17 (3), e12747(2018).
  3. Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342 (1), 1-11 (2004).
  4. Bodmer, R., Venkatesh, T. V. Heart development in Drosophila and vertebrates: conservation of molecular mechanisms. Dev Genet. 22 (3), 181-186 (1998).
  5. Gill, S., Le, H. D., Melkani, G. C., Panda, S. Time-restricted feeding attenuates age-related cardiac decline in Drosophila. Science. 347 (6227), 1265-1269 (2015).
  6. Melkani, Y., Pant, A., Guo, Y., Melkani, G. C. Automated assessment of cardiac dynamics in aging and dilated cardiomyopathy Drosophila models using machine learning. Commun Biol. 7 (1), 702(2024).
  7. Ocorr, K., et al. KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (10), 3943-3948 (2007).
  8. Piazza, N., Wessells, R. J. Drosophila models of cardiac disease. Prog Mol Biol Transl Sci. 100, 155-210 (2011).
  9. Wolf, M. J., Rockman, H. A. Drosophila, genetic screens, and cardiac function. Circ Res. 109 (7), 794-806 (2011).
  10. Lee, J. H., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Heart-and muscle-derived signaling system dependent on MED13 and Wingless controls obesity in Drosophila. Proc Natl Acad Sci. 111 (26), 9491-9496 (2014).
  11. Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).
  12. Rotstein, B., Paululat, A. On the morphology of the Drosophila heart. J Cardiovasc Dev Dis. 3 (2), 15(2016).
  13. Alayari, N. N., et al. Fluorescent labeling of Drosophila heart structures. J Vis Exp. (32), e1423(2009).
  14. Guo, Y., Abou Daya, F., Le, H. D., Panda, S., Melkani, G. C. Diurnal expression of Dgat2 induced by time‐restricted feeding maintains cardiac health in the Drosophila model of circadian disruption. Aging Cell. 23 (7), e14169(2024).
  15. Melkani, G. C., et al. Huntington's disease-induced cardiac amyloidosis is reversed by modulating protein folding and oxidative stress pathways in the Drosophila heart. PLoS Genet. 9 (12), e1004024(2013).
  16. Hartley, P. S., Coward, R. J. Modeling podocyte biology using Drosophila nephrocytes. Methods Mol Biol. 2067, 11-24 (2020).
  17. Watson, J. R., Roth, J., Melkani, G. C. Direct cryosectioning of Drosophila heads for enhanced Brain Fluorescence Staining and Immunostaining. J. Vis. Exp. , Press e67791(2025).
  18. Kelso, R. J., et al. Flytrap, a database documenting a GFP protein‐trap insertion screen in Drosophila melanogaster. Nuc Acids Res. 32 (suppl_1), D418-D420 (2004).
  19. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
  20. Mery, A., et al. The Drosophila muscle LIM protein, Mlp84B, is essential for cardiac function. J Exp Biol. 211 (1), 15-23 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Drosophila

מאמרים קשורים