Method Article

זיהוי וסיווג של גרסאות missense של תת-יחידה לקולטן GABAA ספציפיות לתפקידן בנוירונים פירמידליים בהיפוקמפוס

DOI:

10.3791/67833

⸱

June 6th, 2025

 , 
1Department of Molecular Biology and Genetics, Faculty of Engineering and Natural Sciences, Üsküdar University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מציג מסגרת רב-ממדית, המשתרעת מ-DNA לתפקוד חלבון והתנהגות עצבית. הוא מציג גישה חדשה לחקירת מוטציות פתוגניות חזויות בתת-היחידה של קולטן GABAA , ומשער כי מוטציות אפילפטוגניות ומוטציות פרוקסימליות, הצפויות כפתולוגיות, עשויות לייצר השפעות דומות על מודל הנוירונים הפירמידליים CA1.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבנת ההשפעות של וריאנטים לא ידועים מבחינה תפקודית בגנים הקשורים לאפילפסיה היא חיונית להבהרת פתופיזיולוגיה של מחלה ולפיתוח טיפולים מותאמים אישית. עם מסגרת רב-ממדית, המשתרעת מרצף DNA לתפקוד חלבון והתנהגות עצבית, אנו מתארים גישה חדשה לחיזוי וחקירת מוטציות פתוגניות, תוך השערה כי מוטציות אפילפטוגניות בתת-יחידת הקולטן GABAA ומוטציות חזויות סמוכות עשויות לייצר השפעות דומות על מודל הנוירונים הפירמידלי CA1. על ידי בחינת הקשרים האופייניים בין מוטציות פתוגניות חזויות למוטציות אפילפטוגניות פרוקסימליות, המחקר נועד להעריך את ההשפעות של מוטציות חזויות על סמך ההשפעות של מוטציות אפילפטוגניות על סימולציות נוירונים פירמידליים בהיפוקמפוס.

המתודולוגיה מתחילה באיסוף נתונים גנטיים של תת-יחידה γ2 של קולטן GABAA , ולאחר מכן ניקוי ועיצוב נתונים המבוצעים ב-R באמצעות סקריפט מותאם אישית. לאחר מכן, יוחלו מנבאים אנסמבל כדי לזהות ולתעדף את גרסאות הטעות הפתוגניות של תת-היחידה γ2 . יומחש מיפוי וריאנט פתוגני ספציפי (חזוי) לתחומים המבניים של תת-היחידה המשותפים למוטציות אפילפטוגניות, מלווה במודלים מולקולאריים של השפעותיהם והתחשבות בשימור אבולוציוני. לאחר מכן, יבוצעו מטא-אנליזה ספציפית לוריאנט ונורמליזציה של פרמטרים, ואחריה ניתוח מתאם כדי לזהות קשרים משמעותיים בין מוטציות חזויות למוטציות אפילפטוגניות פרוקסימליות. באמצעות סימולטור עצבי מבוסס Python, יתואר מודל נוירונים מבוסס מוליכות רב-תאיתית, המשקף את ההשפעה של מוטציות מסוג פרא ואפילפטוגני. סימולציה של תגובות עצביות שנוצרו על ידי תת-סוג קולטן GABAA אפילפטוגני תישקל לצורך הערכה גסה של ההשפעה החזויה של הווריאנטים הפתוגניים על התגובה העצבית. למיטב ידיעתנו, זהו הפרוטוקול הראשון החוקר מסגרת רב-ממדית להערכת ההשפעות של וריאנטים של קולטני GABAA על התנהגות עצבית, חיונית לחקר אפילפסיה. פרוטוקול זה יכול לשמש בסיס לשיפור התחזיות של פנוטיפים תאיים הנגרמים על ידי גרסאות פתוגניות פוטנציאליות של קולטני GABAA הקשורים לאפילפסיה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כמעט בכל המחלות האנושיות, השונות הגנטית ממלאת תפקיד משמעותי ברגישות האינדיבידואלית. לכן, הבנת האופן שבו וריאציות רצף קשורות לסיכון למחלה מציעה דרך רבת ערך לחשוף תהליכים מרכזיים המעורבים בהתפתחות מחלות ולזהות גישות חדשות למניעה וטיפול1. זה חל גם על הפרעות נוירו-התפתחותיות, המדורגות בין המצבים הרפואיים הכרוניים השכיחים ביותר בטיפול ראשוני בילדים2. מצבים כגון הפרעת הספקטרום האוטיסטי, מוגבלות שכלית ואפילפסיה ממחישים כיצד שונות גנטית משפיעה באופן משמעותי על רגישות הפרט במהלך ההתפתחות3.

המוח המתפתח רגיש יותר להתקפים אפילפטיים מאשר המוח הבוגר בשל חוסר התאמה נוירו-התפתחותית מתוכנתת גנטית באיזון הקריטי בין עירור לעיכוב4. מכיוון ש-GABA (חומצה גמא-אמינובוטירית), המוליך העצבי המעכב העיקרי במוח הבוגר, מעורר במהלך ההתפתחות העוברית והמוקדמת לאחר הלידה, זה לא חיובי ליציבות הדרושה למניעת התקפים במוח צעיר. מצב זמני זה, הנגרם על ידי היעדר ביטוי מספיק של K-Cl co-transporters5, יכול לתרום לסיכון מוגבר לפעילות התקפים בנוכחות קולטני GABAA לא מתפקדים. קולטני GABAA מתווכים פעולות מעוררות ומעכבות של GABA, בהתאם לריכוז התוך תאי של Cl-ion 6. לפיכך, ככל שהמוח מתבגר, מוטציות בגנים המקודדים לקולטן GABAA , כמו גם בתעלות יונים אחרות, מעוותות את הריגוש ומוטציות בגנים המעורבים במטבוליזם עצבי, איתות תאים ויצירת סינפסות7, עלולות לגרום למצבים כמו אפילפסיה של היעדר ילדות8.

התערבויות קליניות ממנפות יותר ויותר ניתוח גנטי כדי לשפר את הדיוק בטיפול בהפרעות נוירו-התפתחותיות2. בדיקות גנטיות באפילפסיה של ילדים מציגות יעדים פוטנציאליים לגישות רפואה מדויקת9, ומדגישות את החשיבות של וריאנטים גנטיים בהנחיית החלטות טיפוליות. בנוסף, ~25% מחולי האפילפסיה עם מוטציות דה נובו מקבלים אבחונים גנטיים המזהים מטרות פוטנציאליות לרפואה מדויקת, מה שמדגיש את הערך המשמעותי של וריאנטים גנטיים בהנחיית החלטות טיפוליות10. זה ניזון על ידי התקדמות בטכנולוגיות ריצוף של הדור הבא, כגון לוחות גנים ממוקדים, ריצוף אקסום שלם וריצוף גנום שלם, שהאיצו באופן דרמטי את התגליות הגנטיות11. עם זאת, המספר ההולך וגדל של תגליות גנים חדשים מגיע עם אתגר כאשר התוצאות מניבות וריאנט בעל משמעות לא ידועה (VUS), סיווג המשקף ראיות סותרות או מידע לא מספיק לגבי התפקיד המולקולרי של הווריאנט בפתוגנזה של המחלה. וריאנטים המסווגים כ-VUS תואמים לקטגוריה אחת בתוך מערכת סיווג הווריאנטים בת חמש השכבות המוצעת על ידי הקולג' האמריקאי לגנטיקה רפואית וגנומיקה (ACMG) והאגודה לפתולוגיה מולקולרית (AMP)12.

התמודדות עם האתגר של וריאנטים גנטיים לא ידועים מבחינה תפקודית דורשת מאמצים בשני ממדים מרכזיים: פרקטיקה קלינית ומחקר. מבחינה קלינית, חוסר הוודאות סביב VUS יכול לסבך את ניהול המטופלים וקבלת ההחלטות13. מנקודת מבט של מחקר מדעי, זיהוי וריאנטים פתוגניים בין המספר ההולך וגדל של וריאנטים בעלי משמעות לא ודאית וקביעת תפקידיהם בפתופיזיולוגיה של מחלות והשפעות פנוטיפיות הם קריטיים1. תרחיש אידיאלי אחד יהיה כרוך בחיזוי מדויק של ההשפעות המולקולריות, העצביות וברמת הרשת של כל הווריאנטים הלא מאופיינים מבחינה תפקודית, ובכך למזער את המשאבים, הזמן והמאמץ הנדרשים לחקירות מבוססות מעבדה. היבטים אלה מדגישים את החשיבות של סיווג מדויק של וריאנטים גנטיים כדי לאפשר אבחון מדויק של אפילפסיה גנטית, לתמוך בטיפול מותאם אישית ולהקל על גילוי מטרות פרמקולוגיות פוטנציאליות. כלי החיזוי הנוכחיים 14,15,16,17 מדויקים יחסית אך בדרך כלל מספקים רק סיווגים בינאריים (פתוגניים לעומת שפירים) וחסרים תובנות ספציפיות למחלה לגבי פתופיזיולוגיה מולקולרית, השלכות פנוטיפיות ומנגנונים בסיסיים. תוך התמקדות בגרסאות השגויות הלא ידועות של גנים נבחרים המקודדים לקולטן GABAA, מאמר זה מציג מסגרת שמטרתה לשפר את הנחיית המחקר על ידי שילוב גורמים הקשריים של וריאנטים כגון היבטים מולקולריים, אבולוציוניים ומבניים, כמו גם סימולציות של פתולוגיה עצבית הנגזרת מנתונים ביופיזיים במבחנה של מוטציות הקשורות לאפילפסיה. המתודולוגיה שלנו מתייחסת לזיהוי וריאנטים פתוגניים לא ידועים של תת-היחידה γ2 של קולטן GABAA, תת-יחידה מרכזית המעורבת בפתופיזיולוגיה של אפילפסיה 18,19,20. לאחר מכן נבדק ההתאמה הספציפית למיקום של הגרסאות החזויות הללו עם המוטציות הקשורות לאפילפסיה המאופיינות בנתונים מבניים ואלקטרופיזיולוגיים. נתונים אלה משמשים לאחר מכן להערכת ההשפעה המשתנה על מודל של נוירון פירמידלי בהיפוקמפוס המבטא תת-סוג של קולטן GABAA, המורכב מתת-יחידות γ2, α1 ו-β3 (קולטני γ2-GABAA), האחראים לעיכוב סינפטי מהיר6. חשוב לציין כי קולטני GABAA מורכבים ממאגר תת-יחידות גדול (α1-α6, β1-β3, γ1-γ3, δ, Ε, θ, π ו-ρ1-ρ3) ובהתאם להרכב תת-היחידה, קולטני GABAA נבדלים זה מזה באפנון, במאפיינים הביופיזיים שלהם, כמו גם בדפוסי ביטוי אזוריים, תאיים ותת-תאיים יחד עם פונקציות ספציפיות 6,21,22,23, 24,25. לפיכך, המחקר הנוכחי מתמקד בקולטני γ2-GABAA או בקולטני GABAA המכילים γ2 בלבד.

תת-יחידות קולטן GABAA מורכבות ממאפיינים מבניים אופייניים - תחום חוץ-תאי ארוך N-terminal (ECD), ארבעה תחומים טרנסממברניים (TM1 עד TM4), מקשר תוך-תאי המחבר את TM1 ו-TM2, מקשר חוץ-תאי המחבר את TM2 ו-TM3, לולאה תוך-תאית גדולה בין TM3 ל-TM4 (לולאת TM3-TM4), ומסוף C חוץ-תאי קצר 6,26, 27. מוצע כי קולטן GABAA פועל באמצעות מנגנון "נעילה ומשיכה" מורכב, שבו קשירת GABA נועלת את תת-היחידות β ו-α, וגורמת להן למשוך את התחומים החוץ-תאיים (ECDs) של יחידות המשנה, ולסובב אותן נגד כיוון השעון27. תנועה זו מכופפת את התחומים הטרנסממברניים (TMDs), ובכך פותחת את תעלת היונים27. לפיכך, נראה כי פעילות הערוץ מתואמת יחד עם קלטות מבניות בתוך קולטני GABAA. מתברר שמוטציות אפילפסיה גורמות לתפקוד לקוי בפעילות הערוץ באמצעות עיוות של קלטות מבניות אלה28. כתוצאה מכך, המחקר שלנו מבוסס על הרעיון כי וריאנטים פתוגניים חזויים בסמיכות למוטציות אפילפטוגניות שזוהו תפקודית בקלטות המבניות הספציפיות של תת-יחידות הקולטן GABAA עשויות להציג דפוסים דומים של עיוות אלקטרופיזיולוגי או ביופיזי בתפקוד הערוץ, כפי שנצפה במקרים של מוטציות אפילפטוגניות אלה. בעוד שנוכחותן של קלטות מבניות אפילפטוגניות ביחידות המשנה של קולטן GABAA 28 תומכת בעקיפין ברעיון זה, המחקר שלנו מדגים את המורכבות והאתגר של מתאם בין פרמטרים ביופיזיים של מוטציות אפילפטוגניות לאלו של מוטציות פתוגניות חזויות. כדי לחשוף את הקשרים המורכבים הללו, המסגרת שלנו משמעותית מכיוון שהיא מדגישה גישה רב-ממדית הנעה בין DNA לתפקוד חלבון והתנהגות עצבית קריטית לחקר אפילפסיה. גישה זו משלבת גנטיקה חישובית עם מודלים מולקולריים וסימולציות עצביות תוך הדגשת החשיבות של שיטות משלימות, כגון למידת מכונה המאומנת על מערכי נתונים גדולים, שיכולות ללכוד את ההשפעות של מוטציות על מבנה הערוץ, הפעילות והריגוש העצבי. בנוסף, סימולציה של פעילות קולטן γ2-GABAA אפילפטוגני במודל הנוירונים הפירמידליים של ההיפוקמפוס מאפשרת שכפול של פנוטיפ תאי במבחנה הקשור לתעלות קולטן GABAA והדגמה של תגובות נוירון בודד משתנות במרכז תפקוד לקוי של הרשת.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. חיזוי בסיליקו של וריאנטים פתוגניים

  1. איסוף נתונים של וריאנטים
    1. באמצעות מסד הנתונים ClinVar29, חפש וריאנטים בעלי משמעות לא ודאית (VUS) באזור המקודד של הגן המעניין באמצעות האתר: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/. הזן את סמל הגן (למשל, GABRG2) בשורת החיפוש וסנן את התוצאות כך שיכללו רק את סוגי הגרסאות הרצויות, כגון גרסאות חד-נוקלאוטידיות, גרסאות מיסנסנס עם משמעות לא ודאית. הורד ושמור את הנתונים כ- data.xlxs (קובץ משלים 4: טבלה משלימה S1). רשום את תאריך הנתונים שהורדת.
      הערה: בפרוטוקול הנוכחי, תת-יחידת γ2 אנושית של קולטן GABAA , במיוחד תת-יחידה של קולטן חומצה גמא-אמינו-בוטירית מסוג A של הומו ספיינס גמא-אמינובוטירית מסוג GABRG2 (GABRG2), וריאנט תעתיק 1, mRNA (NCBI Ref. seq.: NM_198904.4), הידוע גם בשם γ2L, ינותח. חשוב לתעד את תעתיק הייחוס של הגן המעניין כמו גם מזהים מתאימים אחרים על פני מסדי נתונים שונים (UniProt, ENSEMBL, PDB) מכיוון ששיטות חישוביות שונות עשויות לדרוש מזהים שונים (קובץ משלים 4: טבלה משלימה S2). במקרה שמסד הנתונים או הכלי החישובי אינם מזהים את מספרי הגרסה של מזהי הרצף, נסה גם את המזהה עם מספר הגרסה (NM_198904.4) וגם ללא מספר הגרסה (NM_198904).
    2. מידע בסיסי על חלבון התייחסות
      1. במסד הנתונים של NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, בחר Nucleotide באפשרויות החיפוש והזן את מזהה NCBI Ref. seq. של הגן המעניין (NM_198904.4). לאחר מכן, על ידי גלילה מטה בעמודה הימנית, לחץ על החלבון תחת הקטגוריה מידע קשור כדי למצוא את החלבון (NP_944494.1) המקודד על ידי התעתיק NM_198904.4. באמצעות המידע שניתן עבור החלבון NP_944494.1, רשום את מיקומי הרצף של האזורים הספציפיים בצורה של טבלה (קובץ משלים 4: טבלה משלימה S3).
        הערה: חשוב לקבוע את המידע הידוע הראשוני עבור מיקום הרצף של אזורים, מוטיבים או שאריות קריטיים מבחינה תפקודית ומבנית כגון תחומי חלבון, אתרי זרחון, אתרי קשירת ליגנד וממשקי אינטראקציה מולקולרית. ניתן להשיג זאת על ידי שילוב של מסדי נתונים (NCBI, ENSEMBL, UniProt...) וחיפושי ספרות.
  2. ארגון נתונים משתנה
    1. ארגן את הנתונים כך שיעמדו בדרישות הקלט עבור המנבאים שנבחרו. ודא שפורמט הנתונים שאוחזרו מאורגן כך שיתאים לדרישות של http://database.liulab.science/dbNSFP שרת dbNSFP. לשם כך, הסר עמודות מיותרות מקובץ data.xlsx (קובץ משלים 4: טבלה משלימה S1 משלב 1.1.1), תוך שמירה על העמודות הבאות בלבד בסדר שצוין:
      "GRCh38Chromosome", "GRCh38Location", "Name", "Protein change".
    2. שמור את הקובץ בשם קובץ חדש: "data1.xlsx" (טבלה משלימה S4). פרמט את קובץ data1.xlsx ב-R על-ידי הפעלת הקוד (קובץ משלים 1: Data_GABAA. R), אשר ישמור את הנתונים המעוצבים data1_output.xlsx (קובץ משלים 4: טבלה משלימה S5) בספריית העבודה הרלוונטית לפרויקט R.
      הערה: שיטות חישוביות שונות דורשות סוגי נתונים ופורמטים שונים. איסוף וארגון נתונים על פי דרישות פורמט ספציפיות, אפילו עבור תריסר גרסאות, עלול להיות מועד לשגיאות ולגזול זמן, ולכן שלב זה חשוב אלא אם כן מאגר הגרסאות מורכב מכמה גרסאות בלבד. לאחר מכן, ייתכן שארגון נתונים ידני יהיה אפשרי.
  3. חיזוי פתוגניות
    1. העבר את התוכן של קובץ data1_output.xlsx לגרסה האקדמית של שרת dbNSFP30,31 אליו ניתן לגשת באמצעות http://database.liulab.science/dbNSFP. לשם כך, העתק/הדבק או העלה ישירות את הקובץ בפורמט .txt.
    2. ודא שהאפשרויות הבאות נבחרו מראש ואושרו בשרת: HG38 (בניית גנום), ClinPred32 ו-BayesDEL33 לפני ההגשה. תוך מספר דקות, השרת יפיק את התוצאות.
      הערה: בפרוטוקול הנוכחי, נבחרו שני מנבאי אנסמבל, כלומר BayesDEL33 ו-ClinPred32, עבור דיוק גבוה34 ופרקטיות. עם זאת, ניתן לבחור גם מנבאים אחרים, כגון AlphaMissense, הזמין במסד הנתונים dbNSFP30,31. הבחירה בכלים בסיליקו תלויה במספר גורמים, כולל יצירת מספיק קווים מרובים של ראיות חישוביות לחיזוי רב עוצמה12. מנבאים אנסמבל המשלבים ניתוח של אלגוריתמי חיזוי מרובים יכולים לשרת מטרה זו.
    3. הורד את קובץ הפלט (תבנית .txt) ושמור אותו בשם data2.xlsx (קובץ משלים 4: טבלה משלימה S6).
    4. הגדר את המסננים ב-data2.xlsx (קובץ משלים 4: טבלה משלימה S6) על ידי לחיצה על אפשרות הסינון בתפריט וקביעת גרסאות הקונצנזוס בשתי העמודות על ידי סינון עבור D. זה ייתן את רשימת הגרסאות הפתוגניות ביותר; שמור אותו (ראה לשונית קונצנזוס בטבלה משלימה S6 [קובץ משלים 4]).
  4. בחירת גרסאות
    1. בין התחזיות הפתוגניות הקונצנזוס, קבע את הגרסאות בסמיכות למוטציות אפילפטוגניות שהתקבלו מהספרות. ודא שלאחרונים יש פרמטרים מבניים וביופיזיים המתאימים למידול נוירונים.
      הערה: שלב זה הוא גישוש וקשור גם לסקירת החלבון המעניין מבחינת הפרמטרים המבניים, הפיזיקוכימיים והביופיזיקליים שלו. במחקר הנוכחי, נתונים אלה התקבלו מ-Brünger et al.35 ו-Guo et al.36 בנוסף לסקר של מוטציות הקשורות לאפילפסיה. חוץ מזה, כאופציה, ניגשו לציונים של AlphaMissense37 ממסד הנתונים dbNSFP30,31 החוזר על שלב 1.3 (קובץ משלים 4: טבלה משלימה S7). פרטים נוספים ניתנים בסעיפי הפרוטוקול 2.1.1 ו-2.1.2 ובתוצאות (ראה "אשכולות וריאנטים לפרמטרים מבניים וביופיזיים").
    2. להדמיה בסיסית, השתמש בשרתי Protter38 (https://wlab.ethz.ch/protter/start/) ו-HOPE39 (https://www3.cmbi.umcn.nl/hope/) כדי לבחון את הגרסאות בשלב הקודם בהקשר של מוטציות נבחרות בגן GABRG2 : P302L40 ו-K328M (או K289M41, כאשר לא כוללים את פפטיד האות של 39 שאריות).
      הערה: בשל המורכבות העצומה, יש לבצע הערכה מבנית של השפעות הווריאנטים ברמות ניתוח מרובות. כלים כמו Protter38 יאפשרו הדמיה ברורה של הגרסאות בהקשר של תכונות טופולוגיות של החלבון ושרתים ידידותיים למשתמש כמו HOPE39 יתנו תובנה לגבי השפעת הווריאנט על ידי מודלים מולקולריים. בנוסף, סקירת ספרות מקיפה של החלבון המעניין היא קריטית לזיהוי ושילוב המידע על מוטציות הקשורות לאפילפסיה.
    3. ניתוח שימור אבולוציוני ותובנות מבניות
      1. פתח את Jalview 42,43,44, תוכנית קוד פתוח לעריכה, הדמיה וניתוח של חלבונים.
      2. ייבוא רצפים ליישור. לחץ על קובץ בתפריט העליון | אחזור רצפים; בחר את מסד הנתונים בתיבת הדו-שיח (כגון UniProt); לחץ על הכרטיסייה אחזור מזהים; וכפי שמתואר בתיבת הדו-שיח, הזן מזהי הצטרפות UniProt של הגן המעניין (GABRG2) מבני אדם ומינים אחרים של בעלי חוליות: P18507, P22723, Q6PW52, A0A2I3TKX0, F1RR72, A0A8I3MDZ2, A0A8M1P4D6. לחץ על OK.
        הערה: מספרי ההצטרפות של UniProt של חלבונים המקודדים על ידי GABRG2 הם כדלקמן: P18507 (P18507-2) עבור הומו ספיינס, P22723 עבור Mus musculus, A0A2I3TKX0 עבור Pan troglodytes, F1RR72 עבור Sus scrofa, A0A8I3MDZ2 עבור Canis familiaris ו-A0A8M1P4D6 עבור Danio rerio.
      3. בהתאם לגן המבוקש, ייתכן שחלק מהרצפים לא יהיו מוערים; לכן, בצע חיפוש BLAST כדי לזהות מידע רלוונטי והומולוגים פוטנציאליים להבנה הקשרית טובה יותר. במקרה זה, העלה את פורמט FASTA של רצפי חלבונים באמצעות הוסף רצפים / מאפשרות תיבת הטקסט מתחת ל שלח תפריט כדי לייצר יישורי רצף מרובים של הרצפים הרצויים.
      4. לאחר טעינת היישור, שים לב לרצפים המוצגים להשוואת רצפים מרובים. כל שורה מייצגת רצף וכל עמודה מייצגת מיקום ביישור. כדי לקבוע את שיטת היישור הטובה ביותר, השתמש בגישות שונות; לדוגמה, לחץ על שירותי האינטרנט בתפריט רצף ובחר באפשרות הפעל T-Coffee עם הגדרה מוגדרת מראש , המאפשרת יישור אופטימלי.
      5. לחץ לחיצה ימנית על הרצף P18507 Homo sapiens (רצף הייחוס במחקר הנוכחי) והגדר אותו כרצף הייחוס. בחר פורמט בתפריט העליון ולחץ על גלישה להדמיה של היישור המלא במסך. באותו תפריט פורמט, לחץ על הסולם למעלה כדי לשפר את ההדמיה של מספרי שאריות ספציפיים. כדי לשפר עוד יותר את ההדמיה, התאם את ערכות הצבעים על ידי מעבר לצבע ובחירת אפשרויות שונות (למשל, צבע קלוסטלי, תכונה כימית); שנה את גודל הגופן במידת הצורך.
      6. לחץ על חשב בשורת התפריטים ובחר חישוב אוטומטי של קונצנזוס כדי להדגיש אזורים שמורים.
      7. התמקדו במיקום של וריאנטים מעניינים שזוהו בשלב החיזוי בסיליקו ובחנו מיקומי וריאנטים ספציפיים. הוסף ביאורים לשאריות ספציפיות על-ידי לחיצה ימנית עליהן ובחירה באפשרות הוסף ביאור. כתוב את התווית (למשל, מזהה גרסה) עם קוד הצבע המתאים ושמור.
        הערה: בניתוח הנוכחי, P302L (סגול) ו-A303T (אדום) נבחרו כדי לדמיין אותם ביישור הרצפים המרובים יחד עם הנתונים המבניים (ראה סעיף הבא).
    4. שחזור תלת מימדי של החלבון המלא המציג את השאריות השמורות שנבחרו
      1. בקובץ שהתקבל מהשלב הקודם, לחץ לחיצה ימנית על רצף ההתייחסות (GABRG2 human) ובחר נתוני מבנה תלת מימדיים.
      2. זהה את הנתונים המבניים המתאימים (7QNE, שרשרת C)26 מהתפריט הנפתח ובחר פתח תצוגת מבנה חדשה עם Jmol.
        הערה: זה יאפשר שילוב של השאריות שנבחרו ביישור הרצפים המרובים בנתונים המבניים על ידי Jmol, צופה מבוסס Java בקוד פתוח למבנים כימיים תלת מימדיים.

2. בחירת פרמטרים ומידול ביופיזיקלי

  1. מטא-אנליזה ספציפית לוריאנט ונורמליזציה של פרמטרים
    1. סקר את הספרות הנוכחית כדי לאסוף גרסאות תת-יחידות מזוהות עם מוליכות ערוץ נתונים אלקטרופיזיולוגית (gGABAA), זמן השבתה (השבתת τ), זמן עלייה (עלייהτ) ומשרעת זרם מקסימלית (Imax). ספק את קומפוזיציות יחידות המשנה, סוג התא ומדידות מסוג פרא עבור כל מקרה. סמן את הווריאנטים ואת הבקרות שלהם בהתאם (למשל, ידוע עבור וריאנטים עם מאפיינים ביופיזיים מזוהים ובקרה ידועה למדידות מסוג פרא עבור כל וריאנט).
    2. השג ציוני פתוגניות של AlphaMissense עבור גרסאות עם מאפיינים ביופיזיים מזוהים.
      הערה: עיין בסעיף פרוטוקול 1.3 לפרטים נוספים.
    3. צור מסגרת נתונים עם תת-יחידה ומיקום חומצות אמינו עבור כל גרסה, חומצות האמינו המקוריות והמשתנות, ציון הפתוגניות והפרמטרים הביופיזיקליים המתקבלים מהספרות. כדי למנוע אי התאמות ניסיוניות, לנרמל את הפרמטרים הביופיזיים עבור וריאנטים מזוהים כשינויים פי X במדידות מסוג בר.
  2. ניתוח גרסאות השוואתי לפי מאפיינים מבניים ותפקודיים
    1. ארגן את הגרסאות החזויות על מסגרת נתונים; בהתאם (למשל, צפוי עבור וריאנטים ללא ספרות זמינה על המאפיינים הביופיזיים שלהם).
    2. סווג את הגרסאות לפי מיקומן ברצף חומצות האמינו ובמבנה השלישוני. הוסף פרמטרי סיווג מבניים (למשל, לוקליזציה בסלילי אלפא, סלילים, יריעות בטא, תחומים חוץ-תאיים, תוך-תאיים או טרנסממברניים, רירית נקבוביות, קשירת אגוניסטים, אינטראקציות חלבון-חלבון) על מסגרת הנתונים וספק מידע עבור כל וריאנט ביחס למיקום חומצות האמינו שלהם.
    3. סווג את הגרסאות לפי המרחק שלהן למרכז הממברנה וציר הנקבוביות. הוסף מרחק לציר הנקבוביות ומרחק לפרמטרים של מרכז הממברנה במסגרת הנתונים.
    4. לנתח את המתאם בין פרמטרים מבניים וביופיזיים על פני וריאנטים ידועים. במידת האפשר, הערך את הגרסאות החזויות ביחס למתאמים שהתקבלו.
  3. בניית מודל סינפסה ונוירונים
    1. השתמש ב-Brian245, סימולטור עצבי בקוד פתוח שפותח בפייתון למידול וסימולציה של רשתות עצביות מתפרצות, כדי לבנות מודל ביופיזיקלי רב-תאורי של סינפסה GABAergic על נוירון פירמידלי היפוקמפוס מבוסס מוליכות רב-תאית.
    2. תכנן את המודל מבוסס המוליכות על ידי הגדרת קינטיקה של שער תעלת יונים, פרמטרים פסיביים ואקטיביים ומוליכות פוסט-סינפטית. הגדר את המודל מבוסס המוליכות כפי שניתן בקובץ משלים 2, המתאר את המשוואות המשמשות במודל.
      1. הגדר את קיבול הממברנה (Cm) כ-1 μF/cm2 ואת ההתנגדות התוך-תאית (Ra) כ-200 Ω.ס"מ.
      2. השתמש במוליכות מסוג הודג'קין-האקסלי שהשתנתה עבור נוירונים פירמידליים בהיפוקמפוס39 עם gL = 0.0003 S/cm2, gK = 0.036 S/cm2, EL = -76.5 mV, ENa = 50 mV ו- EK = -90 mV.
      3. התאם את התפלגות הצפיפות של תעלות NaV על פני gNa כ-0.05 S/cm2 עבור סומה, 0.5 S/cm2 עבור מקטע התחלתי של אקסון (AIS) וצומת של Ranvier (NR), ו-0.005 S/cm2 עבור דנדריטים. הגדר את gK ו-gNa כ-0 במקטעים מיאליניים.
      4. בנה קינטיקה של שער תעלות יונים עבור NaV ו-KV כמתואר בקובץ משלים 2.
      5. הציגו זרמים סינפטיים (Isyn) כסיכום של כל הסינפסות הגלוטמטרגיות וה-GABAergic בתא. כלול גם זרם מתווך קולטן AMPA מהיר (IAMPA) וגם זרם איטי בתיווך קולטן NMDA (INMDA) בזרם הגלוטמטרגי (Iglu). כלול רק זרם מהיר בתיווך קולטן GABAA בזרם GABAergic (IGABA). נניח שכמות קבועה של גלוטמט משתחררת לסינפסה עבור כל ספייק פרה-סינפטי; לכן, הפעלת הקולטנים תלויה בזמן ספייק (sAMPA ו-sNMDA) וסך מוליכות הקולטנים (gAMPA ו-gNMDA) משקף את כמות הגלוטמט המשתחררת על ידי כל אירוע.
      6. השתמש במודל הסינפטי כמתואר בקובץ משלים 2.
        הערה: להסבר מפורט על המשוואות, ראה קובץ משלים 2 המתאר את המשוואות המשמשות במודל.
    3. השג את הקוטר שנמדד בניסוי עבור סומה ונויריטים ואת האורך של כל תא נויריט ודפוסי הסתעפות מהספרות הקודמת46,47. צמצם את המורפולוגיה האמיתית של הנוירונים למודל רב-תאים, על ידי חלוקת התא למספר תאים, המשמר במדויק את מבנה ההסתעפות הראשי ושומר על סימטריה דו-צדדית.
    4. הגדר את המורפולוגי (אורך וקוטר המקטע; כלומר, d_soma: 30 מיקרומטר; l_AH: 5 מיקרומטר; d_AH_i: 1.5 מיקרומטר; d_AH_f: 1.3 מיקרומטר; l_AIS: 40 מיקרומטר; d_axon: 1 מיקרומטר; l_myseg: 100 מיקרומטר; l_NR: 2 מיקרומטר; l_AxTer: 4 מיקרומטר; d_AxTer: 2 מיקרומטר; l_approx: 100 מיקרומטר; l_apmed: 100 מיקרומטר; l_apdis: 200 מיקרומטר; d_approx_i: 4 מיקרומטר; d_approx_f: 3 מיקרומטר; d_apmed : 2 מיקרומטר; d_apdis: 2 מיקרומטר; l_apLM: 70 מיקרומטר; d_apLM: 2 מיקרומטר; l_nAcDbasal: 400 מיקרומטר; d_nAcDbasal: 1.4 מיקרומטר; l_nAcDbasal_stem: 20 מיקרומטר; d_nAcDbasal_stem: 1.5 מיקרומטר) ופרמטרים ביופיזיים (כפי שניתן בסעיף 2.3.2) עבור כל תא של מודל הנוירונים הפירמידליים46,47 כפי שמפורט גם בסקריפט פייתון (קובץ משלים 3: GABAAvar.py).
    5. קבע את הפרמטרים הביופיזיים עבור מודל הסינפסה GABAergic על ידי הערכת מדידות הבקרה מסוג הבר שהתקבלו בשלב 2.1.1.
  4. לתכנן את הטופולוגיה של מודל הנוירונים ולהקצות פרמטרים מורפולוגיים וביופיזיים, הכוללים ציון הסידור המרחבי והקשרים ההדדיים של התאים, על סמך המידע המורפולוגי וההסתעפות שהושג בעבר. הקצה את הפרמטרים המורפולוגיים המתאימים (למשל, אורך וקוטר המקטע) והביופיזיקה (סעיף 2.3.2) לכל תא של המודל, כמתואר בקובץ משלים 3: GABAAvar.py.
  5. בניית סינפסות והזרקת זרם
    1. צור את הפעילות הפרה-סינפטית באמצעות SpikeGeneratorGroup (מחלקה מספריית Brian2) כפי שמופיע ב-"GABAAvar.py" (קובץ משלים 3). חבר את מחולל הספייק לתא היעד של נוירון המודל באמצעות מחלקת Synapses כדי לדגמן קשרים סינפטיים.
    2. הגדר זרם קבוע מתמשך (I inj) כ-0.85nA ומקם בסומה כדי לחקות את פעילות תת-הסף המונעת על ידי עומס זרם יוני בסיסי בזמן נתון כמתואר בקובץ משלים 3: GABAAvar.py.
  6. כדי לבנות צגי הקלטה, הקלט עקבות מתח מתאי יעד באמצעות StateMonitor.
  7. בנה והפעל את הרשת.
    1. בנה את הרשת עם נוירון המודל, חיבורים וצגים באמצעות רשת.
    2. הגדר את שלב הזמן של הסימולציה על ידי defaultclock.dt (למשל, 0.01 אלפיות השנייה).
    3. הפעל את הסימולציה ברשת באמצעות network.run(T*ms), כאשר T מוגדר כ- 1,000 אלפיות השנייה בדוגמה.
  8. בדיקת ההשפעה של מוטציות שגויות בקולטן GABAA
    1. הגדר את ההשפעה של כל מוטציה שגויה על קינטיקה של הערוץ באמצעות הפרמטרים הביופיזיקליים שנאספו בשלב 2.1.1.
    2. הפעל את הגירוי על ידי שינוי פרמטרים אלה ושרטט את התוצאות באמצעות "matplotlib.pyplot" כפי שמופיע ב-"GABAAvar.py" (קובץ משלים 3).
  9. בדוק שילובי פרמטרים כדי לנתח את השינויים בדפוסי הירי ובקצבי הירי. התוויית תוצאות להשוואה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה משתמש בגישה רב-ממדית כדי לחזות ולאפיין את הגרסאות הפתוגניות בתת-היחידה γ2 של קולטן GABAA , מרכיב מרכזי בפתופיזיולוגיה של אפילפסיה. באמצעות שימוש במודלים חיזויים, מודלים מולקולריים, שימור אבולוציוני, בחינה מבנית, ניתוח מתאם וסימולציות עצביות, גישה זו משפרת את סיווג הווריאנטים, עם רלוונטיות משמעותית לחקר אפילפסיה ואולי לשימוש קליני. הסיכום הכולל של המתודולוגיה מוצג באיור 1.

...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על ידי יישום שילוב של גנטיקה חישובית, מודלים מולקולריים וסימולציות עצביות, לגישה המוצגת במאמר זה יש פוטנציאל לשפר את הסיווג של גרסאות קולטן GABAA, ולהציע תובנות חשובות הן למחקר אפילפסיה והן ליישומים קליניים. ניתוח מקיף לזיהוי ותעדוף של מוטציות פתוגניות חזויות מוצג ומורחב למסגרת שעשויה לגשר על הפער בין השפעות הווריאנטים על פנוטיפ חלבון ותאי. הערכת ההשפעה של פעילות קולטן GABAA אפילפטוגנית על סימולציה של נוירונים פירמידליים בהיפוקמפוס מאפשרת שכפול של פנוטיפ במבחנה<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל המחברים מצהירים שאין להם ניגודי אינטרסים הקשורים לעבודה זו.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים ל-Çağla Koca על סיועה בבניית תא העצב של המודל.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
בריאן2 אוניברסיטת סורבון, INSERM, CNRS, מכון החזון, צרפת; אימפריאל קולג' לונדון, בריטניה2.8.0.4סטימברג ואחרים, 2019 (https://pypi.org/project/Brian2/ )
שרת dbNSFP   Genos Bioinformatics LLC, ארה"בגרסה 3.0ליו ואחרים, 2020 (http://database.liulab.science/dbNSFP) (https://sites.google.com/site/jpopgen/dbNSFP)
תקווה   המרכז לאינפורמטיקה מולקולרית וביו-מולקולרית CMBI, אוניברסיטת רדבוד, הולנד 1.1.1Venselaar et al., 2010 (https://www3.cmbi.umcn.nl/hope/)
ג'לוויו   אוניברסיטת דנדי, בריטניהJV2ווטרהאוס ואחרים, 2009 (https://www.jalview.org/)
מחברת Jupyterפרויקט Jupyter, ארה"בhttps://jupyter.org/install 
פיטוןקרן התוכנה של פייתון, ארה"ב3.13https://www.python.org/downloads/
פרוטר   ETH ציריך, שוויץגירסה 1.0Omasits, et al., 2014 (https://wlab.ethz.ch/protter/start/)
R קרן R לחישוב סטטיסטי, ארה"בגרסת R 4.3.2   https://www.r-project.org/ 
RStudioתוכנת Posit, PBC, ארה"בRStudio 2023.12.1+402 מהדורת "Ocean Storm"https://posit.co/downloads/

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Claussnitzer, M., et al. A brief history of human disease genetics. Nature. 577 (7789), 179-189 (2020).
  2. Savatt, J. M., Myers, S. M. Genetic testing in neurodevelopmental disorders. Front Pediatr. 9, 526779(2021).
  3. Hoischen, A., Krumm, N., Eichler, E. Prioritization of neurodevelopmental disease genes by discovery of new mutations. Nat Neurosci. 17, 764-772 (2014).
  4. Holmes, G., Ben-Ari, Y. The neurobiology and consequences of epilepsy in the developing brain. Pediatr Res. 49, 320-325 (2001).
  5. Rivera, C., Voipio, J., Kaila, K. Developmental switches in GABAergic signalling: the K+-Cl- cotransporter KCC2 and carbonic anhydrase CAVII. J Physiol. 562, 27-36 (2005).
  6. Goetz, T., et al. GABA(A) receptors: structure and function in the basal ganglia. Prog Brain Res. 160, 21-41 (2007).
  7. Guerrini, R., et al. Monogenic epilepsies: disease mechanisms, clinical phenotypes, and targeted therapies. Neurology. 97 (17), 817-831 (2021).
  8. Matricardi, S., et al. Current advances in childhood absence epilepsy. Pediatr Neurol. 50 (3), 205-212 (2014).
  9. Sands, T. T., Choi, H. Genetic testing in pediatric epilepsy. Curr Neurol Neurosci Rep. 17 (5), 45(2017).
  10. Møller, R. S., et al. The contribution of next generation sequencing to epilepsy genetics. Expert Rev Mol Diagn. 15 (12), 1531-1538 (2015).
  11. Møller, R. S., et al. From next-generation sequencing to targeted treatment of non-acquired epilepsies. Expert Rev Mol Diagn. 19 (3), 217-228 (2019).
  12. Richards, S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 17 (5), 405-424 (2015).
  13. Rehm, H. L., et al. The landscape of reported VUS in multi-gene panel and genomic testing: time for a change. Genet Med. 25 (12), 100947(2023).
  14. Katsonis, P., et al. Genome interpretation using in silico predictors of variant impact. Hum Genet. 141 (10), 1549-1577 (2022).
  15. Arslan, A. Pathogenic variants of human GABRA1 gene associated with epilepsy: a computational approach. Heliyon. 9 (9), e20218(2023).
  16. Abdullah, N. K., Arslan, A. Integrated bioinformatic approach for precision medicine: prediction of human GABRG2 gene pathogenic variants, characterized with cellular pathology and epilepsy phenotype severity. SDU J Nat Appl Sci. 28 (33), 300-315 (2024).
  17. Arslan, A. Algorithmic assessment reveals functional implications of GABRD gene variants linked to idiopathic generalized epilepsy. Int J Neurosci. 135 (5), 533-543 (2025).
  18. Kang, J. Q., Macdonald, R. L. Molecular pathogenic basis for GABRG2 mutations associated with a spectrum of epilepsy syndromes, from generalized absence epilepsy to Dravet syndrome. JAMA Neurol. 73 (8), 1009-1016 (2016).
  19. Komulainen-Ebrahim, J., et al. Novel variants and phenotypes widen the phenotypic spectrum of GABRG2-related disorders. Seizure. 69, 99-104 (2019).
  20. Lorenz-Guertin, J. M., et al. γ2 GABA(A)R trafficking and the consequences of human genetic variation. Front Cell Neurosci. 12, 265(2018).
  21. Korpi, E. R., Gründer, G., Luddens, H. Drug interactions at GABA(A) receptors. Prog Neurobiol. 67 (2), 113-159 (2002).
  22. Rudolph, U., Möhler, H. GABA-based therapeutic approaches: GABAA receptor subtype functions. Curr Opin Pharmacol. 6, 18-23 (2006).
  23. Whiting, P. J. GABAA receptors: a viable target for novel anxiolytics. Curr Opin Pharmacol. 6, 24-29 (2006).
  24. Arslan, A. Extrasynaptic δ-subunit containing GABAA receptors. J Integr Neurosci. 20 (1), 173-184 (2021).
  25. Arslan, A. Distinct roles of gamma-aminobutyric acid type A receptor subtypes: a focus on phasic and tonic inhibition. J Neurobehav Sci. 2, 72-76 (2015).
  26. Sente, A., et al. Differential assembly diversifies GABAA receptor structures and signalling. Nature. 604 (7904), 190-194 (2022).
  27. Masiulis, S., et al. GABAA receptor signalling mechanisms revealed by structural pharmacology. Nature. 565 (7740), 454-459 (2019).
  28. Hernandez, C. C., Macdonald, R. L. A structural look at GABAA receptor mutations linked to epilepsy syndromes. Brain Res. 1714, 234-247 (2019).
  29. Landrum, M. J., et al. ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence. Nucleic Acids Res. 46 (D1), 1062-1067 (2018).
  30. Liu, X., Jian, X., Boerwinkle, E. dbNSFP: a lightweight database of human non-synonymous SNPs and their functional predictions. Hum Mutat. 32 (8), 894-899 (2011).
  31. Liu, X., et al. dbNSFP v4: a comprehensive database of transcript-specific functional predictions and annotations for human nonsynonymous and splice-site SNVs. Genome Med. 12 (1), 103(2020).
  32. Alirezaie, N., et al. ClinPred: prediction tool to identify disease-relevant nonsynonymous single-nucleotide variants. Am J Hum Genet. 103 (4), 474-483 (2018).
  33. Feng, B. J. PERCH: a unified framework for disease gene prioritization. Hum Mutat. 38 (3), 243-251 (2017).
  34. Tian, Y., et al. REVEL and BayesDel outperform other in silico meta-predictors for clinical variant classification. Sci Rep. 9 (1), 2204(2019).
  35. Brünger, T., et al. Conserved patterns across ion channels correlate with variant pathogenicity and clinical phenotypes. Brain. 146 (3), 923-934 (2023).
  36. Guo, F., et al. Identifying protein-protein interface via a novel multi-scale local sequence and structural representation. BMC Bioinformatics. 20 (Suppl 15), 483(2019).
  37. Cheng, J., et al. Accurate proteome-wide missense variant effect prediction with AlphaMissense. Science. 381 (6664), eadg7492(2023).
  38. Omasits, U., et al. Protter: interactive protein feature visualization and integration with experimental proteomic data. Bioinformatics. 30 (6), 884-886 (2014).
  39. Venselaar, H., et al. Protein structure analysis of mutations causing inheritable diseases: an e-Science approach with life scientist friendly interfaces. BMC Bioinformatics. 11 (548), 548(2010).
  40. Hernandez, C. C., et al. Altered channel conductance states and gating of GABAA receptors by a pore mutation linked to Dravet syndrome. eNeuro. 4 (1), (2017).
  41. Baulac, S., Huberfeld, G., Gourfinkel-An, I. First genetic evidence of GABA(A) receptor dysfunction in epilepsy: a mutation in the γ2-subunit gene. Nat Genet. 28 (1), 46-48 (2001).
  42. Waterhouse, A. M., et al. Jalview version 2-a multiple sequence alignment editor and analysis workbench. Bioinformatics. 25 (9), 1189-1191 (2009).
  43. Troshin, P. V., et al. Java bioinformatics analysis web services for multiple sequence alignment-JABAWS:MSA. Bioinformatics. 27 (14), 2001-2002 (2011).
  44. Troshin, P. V., et al. JABAWS 2.2 distributed web services for bioinformatics: protein disorder, conservation and RNA secondary structure. Bioinformatics. 34 (11), 1939-1940 (2018).
  45. Stimberg, M., Brette, R., Goodman, D. F. M. Brian 2, an intuitive and efficient neural simulator. eLife. 8, e47314(2019).
  46. Traub, R. D., et al. A model of a CA3 hippocampal pyramidal neuron incorporating voltage-clamp data on intrinsic conductances. J Neurophysiol. 66 (2), 635-650 (1991).
  47. Hodapp, A., et al. Dendritic axon origin enables information gating by perisomatic inhibition in pyramidal neurons. Science. 377 (6613), 1448-1452 (2022).
  48. Abdulzahir, A., et al. Changes in memory, sedation, and receptor kinetics imparted by the β2-N265M and β3-N265M GABAA receptor point mutations. Int J Mol Sci. 24 (6), 5637(2023).
  49. Fisher, J. L. A mutation in the GABAA receptor alpha1 subunit linked to human epilepsy affects channel gating properties. Neuropharmacology. 46 (5), 629-637 (2004).
  50. Gallagher, M. J., et al. The juvenile myoclonic epilepsy GABAA receptor alpha1 subunit mutation A322D produces asymmetrical, subunit position-dependent reduction of heterozygous receptor currents and α1 subunit protein expression. J Neurosci. 24 (24), 5570-5578 (2004).
  51. Hernandez, C. C., et al. Dravet syndrome-associated mutations in GABRA1, GABRB2 and GABRG2 define the genetic landscape of defects of GABAA receptors. Brain Commun. 3 (2), fcab033(2021).
  52. Lin, S. X. N., et al. Correlations of receptor desensitization of gain-of-function GABRB3 variants with clinical severity. Brain. 147 (1), 224-239 (2024).
  53. Krampfl, K., et al. Molecular analysis of the A322D mutation in the GABA receptor α-subunit causing juvenile myoclonic epilepsy. Eur J Neurosci. 22 (1), 10-20 (2005).
  54. Shen, D., et al. De novo GABRG2 mutations associated with epileptic encephalopathies. Brain. 140 (1), 49-67 (2017).
  55. Janve, V. S., et al. Epileptic encephalopathy de novo GABRB mutations impair γ-aminobutyric acid type A receptor function. Ann Neurol. 79 (5), 806-825 (2016).
  56. Scheller, M., Forman, S. A. Coupled and uncoupled gating and desensitization effects by pore domain mutations in GABAA receptors. J Neurosci. 22 (19), 8411-8421 (2002).
  57. Hernandez, C. C., et al. GABAA receptor coupling junction and pore GABRB3 mutations are linked to early-onset epileptic encephalopathy. Sci Rep. 7 (1), 15903(2017).
  58. Homanics, G. E., et al. A gain-of-function mutation in the GABA receptor produces synaptic and behavioral abnormalities in the mouse. Genes Brain Behav. 4 (1), 10-19 (2005).
  59. Jatczak-Śliwa, M., et al. GABAA receptor β2E155 residue located at the agonist-binding site is involved in the receptor gating. Front Cell Neurosci. 14 (2), 2(2020).
  60. Đurišić, N., et al. SAHA (vorinostat) corrects inhibitory synaptic deficits caused by missense epilepsy mutations to the GABAA receptor γ2 subunit. Front Mol Neurosci. 11, 89(2018).
  61. Bai, Y. F., et al. Pathophysiology of and therapeutic options for a GABRA1 variant linked to epileptic encephalopathy. Mol Brain. 12 (1), 92(2019).
  62. Macdonald, R. L., et al. Mutations linked to generalized epilepsy in humans reduce GABA(A) receptor current. Exp Neurol. 184 (Suppl 1), S58-S67 (2003).
  63. Buhr, A., et al. Functional characterization of the new human GABA(A) receptor mutation β3(R192H). Hum Genet. 111 (2), 154-160 (2002).
  64. Jumper, J. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  65. Sperk, G., et al. GABA(A) receptor subunits in the rat hippocampus I: immunocytochemical distribution of 13 subunits. Neuroscience. 80 (4), 987-1000 (1997).
  66. Connor, J. X., et al. A GABAA receptor α1 subunit tagged with green fluorescent protein requires a β subunit for functional surface expression. J Biol Chem. 273 (44), 28906-28911 (1998).
  67. Kittler, J. T., et al. Analysis of GABAA receptor assembly in mammalian cell lines and hippocampal neurons using γ2 subunit green fluorescent protein chimeras. Mol Cell Neurosci. 16 (4), 440-452 (2000).
  68. Oflaz, F. E., Son, ÇD., Arslan, A. Oligomerization and cell surface expression of recombinant GABAA receptors tagged in the δ subunit. J Integr Neurosci. 18 (4), 341-350 (2019).
  69. Arslan, A., et al. Cytoplasmic domain of δ subunit is important for the extra-synaptic targeting of GABAA receptor subtypes. J Integr Neurosci. 13, 617-631 (2014).
  70. Lombardi, J. P., et al. Visualizing GABAA receptor trafficking dynamics with fluorogenic protein labeling. Curr Protoc Neurosci. 92 (1), 97(2020).
  71. Gadhia, A., et al. Functional analysis of epilepsy-associated GABAA receptor mutations using Caenorhabditis elegans. Epilepsia Open. 9 (4), 1458-1466 (2024).
  72. Ritter, D. M., et al. In silico predictions of KCNQ variant pathogenicity in epilepsy. Pediatr Neurol. 118, 48-54 (2021).
  73. Holland, K. D., et al. Comparison and optimization of in silico algorithms for predicting the pathogenicity of sodium channel variants in epilepsy. Epilepsia. 58 (7), 1190-1198 (2017).
  74. Leong, I. U., et al. Assessment of the predictive accuracy of five in silico prediction tools, alone or in combination, and two metaservers to classify long QT syndrome gene mutations. BMC Med Genet. 16, 34(2015).
  75. Tang, B. Optimization of in silico tools for predicting genetic variants: individualizing for genes with molecular sub-regional stratification. Brief Bioinform. 21 (5), 1776-1786 (2020).
  76. Dong, C., et al. Comparison and integration of deleteriousness prediction methods for nonsynonymous SNVs in whole exome sequencing studies. Hum Mol Genet. 24 (8), 2125-2137 (2015).
  77. Kircher, M., et al. A general framework for estimating the relative pathogenicity of human genetic variants. Nat Genet. 46 (3), 310-315 (2014).
  78. Anderson, D., Lassmann, T. An expanded phenotype centric benchmark of variant prioritisation tools. Hum Mutat. 43 (5), 539-546 (2022).
  79. Roy, R., Al-Hashimi, H. M. AlphaFold3 takes a step toward decoding molecular behavior and biological computation. Nat Struct Mol Biol. 31, 997-1000 (2024).
  80. Hollingsworth, S. A., Dror, R. O. Molecular dynamics simulation for all. Neuron. 99 (6), 1129-1143 (2018).
  81. Imrie, F., et al. AutoPrognosis 2.0: democratizing diagnostic and prognostic modeling in healthcare with automated machine learning. PLOS Digit Health. 2 (6), e0000276(2023).
  82. Zhu, S., et al. Structure of a human synaptic GABAA receptor. Nature. 559 (7712), 67-72 (2018).
  83. Sun, C., Zhu, H., Clark, S. Cryo-EM structures reveal native GABAA receptor assemblies and pharmacology. Nature. 622, 195-201 (2023).
  84. Scott, S., Aricescu, A. R. A structural perspective on GABAA receptor pharmacology. Curr Opin Struct Biol. 54, 189-197 (2019).
  85. Kim, J. J., et al. Shared structural mechanisms of general anaesthetics and benzodiazepines. Nature. 585 (7824), 303-308 (2020).
  86. Stimberg, M., et al. Equation-oriented specification of neural models for simulations. Front Neuroinform. 8, 6(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

GABAa Receptor VariantsMissense VariantsEpileptogenic MutationsHippocampal Pyramidal NeuronsPathogenic Mutation PredictionMolecular ModelingNeural SimulationEnsemble PredictorsEvolutionary ConservationConductance Based Model

Related Articles