מאמר שיטה

ניתוח ביטוי אונקוגנים עם שינויים ב-pH בקו תאי צינור הלבלב

DOI:

10.3791/67843

⸱

11 באפריל 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Research Centre, Asian Healthcare Foundation, AIG Hospitals, 2Department of Biochemistry, Osmania University, 3Department of Medical Gastroenterology, Asian Institute of Gastroenterology (AIG) Hospitals

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מתאר פרוטוקול לבחינת ההשפעות של שינוי pH על ביטוי אונקוגן באמצעות ניתוח RNA-seq של קו תאי צינור הלבלב.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגורם הרביעי המוביל למוות הקשור לסרטן, אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC), הוא בעל שיעור הישרדות של 12% לחמש שנים. למחלה זו יש פרוגנוזה גרועה והיא מאופיינת במיקרו-סביבה סטרומלית נוקשה, המהווה אתגר מוחשי בטיפול בה. לחולי דלקת לבלב כרונית יש סיכון גבוה פי 10 לפתח PDAC; בחולים אלה, ה-pH הצינורי יורד מ-pH 8.0 ל-pH 6.0 עקב אי ספיקת ביקרבונט והסביבה הדלקתית. מטרתנו הייתה להבין את תפקידה של הסביבה החומצית שנצפתה בדלקת לבלב כרונית על ביטוי אונקוגן בקו תאי צינור הלבלב.

לכן, 80% תאי אפיתל צינור לבלב אנושי הודגרו ב-pH 6.0 עד pH 7.2 למשך 6 שעות. סך ה-RNA מהתאים עובד כדי להעשיר את סך ה-mRNA בדגימות. ביטוי הגנים הוערך באמצעות ריצוף הדור הבא (NGS) של שכפולים ביולוגיים. ניתוח RNA-seq בוצע בעזרת כלי מקוון, וזוהו הגנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי (FCs < ± 2.0); היו 90, 148 ו-109 גנים מווסתים ו-20, 14 ו-23 גנים מווסתים ב-pH 6.0, 6.5 ו-7.0, בהתאמה. ארבעה אונקוגנים היו מווסתים ב-pH 6.0, שבעה היו מווסתים ב-pH 6.5 ושבעה היו מווסתים ב-pH 7.0. הגנים הנפוצים שהיו מווסתים ב-pH 6.0, pH 6.5 ו-pH 7.0 היו חלבון-טירוזין קינאז ספציפי לתאי לימפוציטים (LCK) [pH 6.0, FC: 2.93; pH 6.5, FC: 2.93; pH 7.0, FC: 3.32], פרוטו-אונקוגן FGR, טירוזין קינאז ממשפחת Src (FGR) [pH 6.0, FC: 4.17; pH 6.5, FC: 5.25; pH 7.0, FC: 5.09], ו-ArfGAP עם תחום SH3, אנקירין חוזר, ותחום PH 3 (ASAP3) [pH 6.0, FC: 2.37; pH 6.5, FC: 3.84; pH 7.0, FC: 2.51]. הסביבה החומצית מעוררת הפעלה של פרוטו-אונקוגנים, מה שעלול לעורר התחלת גידול בדלקת לבלב כרונית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC) היא אחד מסוגי הסרטן הראשוניים ומדורגת במקום הרביעי מבין סוגי הסרטן מבחינת מספר מקרי המוות הקשורים1. שיעור תמותה גבוה יותר ניכר בקרב חולי PDAC, ועל פי מחקרים אחרונים, שיעור ההישרדות לחמש שנים הוא 12% בלבד. חולים עם דלקת לבלב כרונית מתועדת, מחלה הגורמת לדלקת בלבלב2, הם בעלי סיכוי גבוה יותר (בערך פי 15-16) לפתח PDAC3. ישנם סוגים שונים של שיתוק מוחין עם אטיולוגיות שונות, כגון CP 4 הקשור לאלכוהול, תורשתי ואידיופט. ידוע כי התנאים הקיימים במהלך CP מובילים להיווצרות אבנים מסויידות, התפתחות תאים סרטניים ואפילו סוכרת. השכיחות של PDAC גבוהה בחולים עם דלקת לבלב כרונית תורשתית5.

מצבים פיזיולוגיים מסוימים בלבלב של חולי CP עשויים להועיל להתחלת מחלות אחרות; אלה כוללים את הסביבה הדלקתית, אנזימי עיכול פעילים וה-pH החומצי של מיץ הלבלב6. מגוון רחב של מחקרים מתבצעים בתחום הדלקת, שכן דלקת יוצרת כאוס בתפקוד התקין של האיבר 7,8,9. עם זאת, חוסר איזון בוויסות ה-pH הוא תופעה נוספת שעלולה לעורר את התחלת הצמיחה הבלתי מבוקרת של תאים10. מיץ הלבלב של אנשים בריאים הוא אלקליין, המסייע לנטרל את הכימה החומצית המיוצרת על ידי הקיבה. לעומת זאת, מיץ הלבלב נשאר חומצי בחולי CP בגלל הפרשת ביקרבונט לא מספקת. רמות נמוכות של ביקרבונט אינן יכולות לנטרל לחלוטין את המיץ, מה שגורם לסביבה מעט חומצית בתוך צינור11.

מחקרים קודמים מצביעים על כך שתאי סרטן מסתגלים ומשגשגים בסביבות חומציות12. במקרים כאלה, מצבים הקיימים בתהליך של דלקת לבלב כרונית מרמזים על סביבה נוחה להתפשטות וגרורות של תאים אלה13. לפיכך, המחקר שלנו נועד להעריך את השינויים המורפולוגיים בתאי צינור הלבלב האנושיים ולהעריך ביטוי אונקוגן בתנאים מעט חומציים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. החייאת קו התאים

  1. רכשו את קו תאי צינור הלבלב הרגיל האנושי (HPDEC / H6C7) והחיו את התאים במדיום טרי.
    1. הפשירו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
    2. הכינו טרי מדיום שלם וסננו אותו באמצעות פילטר מזרק.
      הערה: מדיום שלם מכיל את מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS).
    3. מוסיפים 6 מ"ל מהמדיום השלם לצינור חרוטי טרי של 15 מ"ל, מוסיפים את תרחיף התאים המופשר ומערבבים אותו היטב.
    4. צנטריפוגה המתלה ב -1,800 × גרם למשך 6 דקות. השליכו את הסופרנטנט, הוסיפו 1 מ"ל של מדיום תרבית לגלולה וערבבו בעדינות.
      הערה: מדיום תרבית מכיל DMEM עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% אנטיביוטיקה של עט/סטרפטוקוקוקוק.
    5. הוסף את התאים טיפה לבקבוק T-25 המכיל 4 מ"ל של מדיום תרבית ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.

2. שינוי ה-pH של מדיום התרבות

  1. הכן 100 מ"ל של תמיסות מלאי חיץ נתרן פוספט 0.5 M עם ערכי pH של 6.0, 6.5 ו-7.0 כאמור בטבלה 1.
  2. בדוק את ה-pH עם מד pH והתאם אותו באמצעות 1 N HCl/1 M NaOH.
  3. עקר את המאגרים במכסה זרימת אוויר למינרי עם מסנן מזרק של 0.45 מיקרומטר.
    הערה: ניתן לאחסן את המאגר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
  4. הכן אמצעי תרבית עם ערכי pH של 6.0, 6.5 ו-7.0 על ידי הוספת 20 מ"ל של מאגר נתרן פוספט סטרילי 0.5 M עם ה-pH המתאים ל-80 מ"ל של מדיום תרבית.
  5. הוסף את המדיה עם ה-pH השונה לתאי צינור הלבלב האנושיים המשולבים של 85-90%, ובדוק את השינויים המורפולוגיים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר במרווחים של שעה למשך 6 שעות.

3. בידוד RNA

הערה: יש להשתמש בכפפות סטריליות לבידוד RNA מהתאים ויש לטהר את המשטח באמצעות 100% אתנול.

  1. הסר את מצע התרבות ושטוף את התאים במי מלח חוצץ פוספט (PBS).
  2. מניחים את הצלחת על קרח, מוסיפים PBS לבאר ואז מגרדים את התאים בעזרת מגרד תאים.
    הערה: כמות ה- PBS שנוספה אמורה להספיק בכדי לכסות את התאים לגירוד. אין צורך להוסיף נפח גבוה של PBS.
  3. אוספים את התרחיף בצינור טרי ומצנטריפוגה בחום של 8,000 × גרם למשך 10 דקות. השליכו את הסופרנטנט.
  4. הוסף מאגר ליזה המכיל β-מרקפטואתנול לגלולה ופיפטה אותו למעלה ולמטה למשך 5-10 דקות על קרח.
  5. הוסף נפח שווה של 70% אתנול לליזאט וערבב היטב. אין מערבולת.
  6. הוסף את התמיסה לעמוד קרום הסיליקה, צנטריפוגה ב->8,000 × גרם למשך 30 שניות, והשליך את הזרימה דרך.
  7. הוסף מאגר כביסה לדגימה וצנטריפוגה ב->8,000 × גרם למשך 30 שניות. צנטריפוגה את הצינור הריק למשך דקה אחת בטמפרטורה של >8,000 × גרם.
  8. הוסף 30-50 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז לעמוד והשאיר אותו למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה של העמוד ב->8,000 ×גרם למשך 5 דקות.
    הערה: ניתן לאחסן דגימות RNA בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

4. RNA-seq/טרנסקריפטום

  1. הערכת תקינות RNA
    1. בדוק את תקינות ה-RNA בביו-אנלייזר על ידי נטילת 1 מיקרוליטר (25-500 ננוגרם) וערבוב עם 5 מיקרוליטר של מאגר צבע.
    2. מערבל את התמיסה בחום של 500 × גרם למשך דקה אחת וסובב בקצרה.
    3. הפעל תגובת שרשרת פולימראז (PCR) חד-שלבית עבור כל דגימה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות ולאחר מכן, קח את הצינורות ודגר אותם על קרח למשך 2 דקות לפני הניתוח עם ביו-אנלייזר.
  2. RNA כולל מדולל rRNA
    1. הוסף 5 מיקרוגרם של RNA כולל, 50 מיקרוליטר של מאגר הכלאה ו-1-3 מיקרוליטר של תערובת בדיקה לצינור PCR טרי.
    2. בצע את השלבים הבאים: שלב ראשון, דנטורציה ב-70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות; שלב שני, הכלאה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות; ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
    3. בשפופרת טרייה, הוסף 500 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים ואת הדגימה; הניחו את התערובת על מעמד מגנטי למשך דקה אחת עד שהתמיסה תתבהר.
    4. השליכו בזהירות את הסופרנטנט. הסר את הצינור, שטוף את החרוזים על ידי הוספת 500 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז, והנח את התערובת בחזרה על המעמד המגנטי למשך דקה אחת. הסר את הסופרנטנט ברגע שהתמיסה מתבהרת.
    5. חזור על התהליך פי 5-7. מוסיפים 200 מיקרוליטר של מאגר הכלאה ומערבבים כראוי. שמור את הצינורות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    6. מוסיפים לתערובת הנ"ל 100 מיקרוליטר של בדיקת RNA, מערבבים בעדינות ומדגרים את התערובת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    7. סובב בקצרה את הצינור לפני הנחתו על המעמד המגנטי למשך דקה אחת.
    8. אספו את הסופרנטנט השקוף המכיל את הרנ"א המדולדל ב-rRNA בשפופרת טרייה.
  3. פיצול RNA
    1. בשפופרת PCR טרייה, הוסף 8-10 מיקרוליטר של RNA כולל מדולדל rRNA (500 ננוגרם/גרם), 1 מיקרוליטר של מאגר פי 10 ו-1 מיקרוליטר של RNase III.
    2. מערבבים את התמיסה על ידי הקשה וסיבוב קצר.
    3. הנח את הצינורות במחזור תרמי למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    4. בשפופרת טרייה, הוסף 5 מיקרוליטר של חרוזים קושרים חומצות גרעין ולאחר מכן, הוסף 90 מיקרוליטר של תרכיז תמיסת קשירה.
    5. הוסף לתערובת הנ"ל 30 מיקרוליטר משברי ה- RNA ו -150 מיקרוליטר של 100% אתנול. מערבבים את הדגימה על ידי פיפטינג פי 10, ודוגרים אותה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    6. הנח את הצינורות על המעמד המגנטי עד שהתמיסה תתבהר. הסר והשליך את הסופרנטנט.
    7. שטפו את החרוזים עם 150 מיקרוליטר אתנול בזמן שהצינורות נמצאים על מעמד מגנטי; הניחו לתערובת לעמוד במשך 30 שניות ואז הסירו את הסופרנטנט.
    8. השאירו את הצינורות על מעמד מגנטי למשך 1-2 דקות כדי לאפשר לאתנול שנותר להתאדות.
    9. הוסיפו לחרוזים 12 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז שחוממו מראש, וערבבו את הדגימה על ידי פיפטינג 10 פעמים.
    10. דגרו את הדגימה למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. הניחו את הצינורות על מעמד מגנטי ואספו את הסופרנטנט ברגע שהוא צלול.
  4. הכנת ספרייה והכנת cDNA
    1. הוסף 3 מיקרוליטר מדגימת ה-RNA המפוצלת לצינור PCR ולאחר מכן הוסף 5 מיקרוליטר של תערובת הכלאה. מערבבים את הדגימה על ידי פיפטינג כמה פעמים ולאחר מכן סובבו את הדגימה בקצרה.
    2. שמור את הצינורות במחזור תרמי למשך 10 דקות ב-65 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן 5 דקות ב-30 מעלות צלזיוס.
    3. הוסף 10 מיקרוליטר של מאגר קשירה ו-2 מיקרוליטר של תערובת אנזימי קשירה לתמיסה לעיל. דגרו את התגובה במחזור תרמי למשך שעה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.
    4. מוסיפים תערובת מאסטר טרנסקריפטאז הפוך לתערובת הקשירה ודוגרים בחום של 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן דגירה על קרח.
  5. הגברה של cDNA
    1. הוסף 6 מיקרוליטר של cDNA (500 ננוגרם) לצינור PCR טרי ולאחר מכן הוסף 46 מיקרוליטר של תערובת PCR מקודדת משפופרת המכילה 46 מיקרוליטר של אנזים פולימראז בנאמנות גבוהה ו-1 מיקרוליטר של פריימרים ברקוד 3'.
    2. הגדר את תנאי ה-PCR כדלקמן: שלב ראשון, החזק ב-94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; שלב שני, מחזורים ב-94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו-50 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות; שלב שלישי, 16 מחזורים ב-94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 62 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו-68 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. החזק את התגובה ב-68 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    3. טהר את ה-cDNA המוגבר על ידי חזרה על שלבים 4.3.5 עד 4.3.10 והחלף את דגימת ה-RNA המפוצלת בתוצר ה-PCR שהתקבל בשלב הקודם.
    4. נתח את דגימת ה-RNA המטוהר ברצף (NGS) כדי ליצור נתונים בצורה של קבצי FASTq.

5. ביואינפורמטיקה

  1. פתחו את כלי ה-galaxy הזמין באינטרנט על ידי העתקת הדבקת הקישור: https://usegalaxy.org ללשונית החיפוש של הדפדפן.
  2. בביקור הראשון באתר זה, הירשם לפרופיל על ידי לחיצה על הכניסה או על אפשרות ההרשמה בפינה השמאלית העליונה.
  3. לאחר יצירת חשבון, היכנס לחשבון על ידי מילוי השם הציבורי/שם המשתמש והסיסמה.
  4. העלה את קבצי ה-FASTq שהתקבלו לאחר ניתוח RNA-seq על ידי לחיצה על אפשרות ההעלאה בחלונית הצד השמאלי.
  5. בחר את הכלי cutadapt מקטע הכלים בחלונית השמאלית. כלי זה יחתוך רצפים באיכות נמוכה.
    הערה: כעת ניתן להשתמש בקובץ זה למיפוי.
  6. לחץ על כפתור הכלי בחלונית הצד השמאלי וחפש את כלי כוכב ה-RNA. מלא את הפרטים באופן הבא: השתמש בקובץ הפלט של cutadapt, בחר את גנום הייחוס כגנום ייחוס אנושי (hg38) ושנה את אורך הרצף הגנומי סביב צמתים מבוארים ל-36. בחר את הפלט כספירת גנים ולחץ על אפשרות כלי ההפעלה בפינה השמאלית העליונה.
    הערה: כלי זה יפיק קובץ BAM.
  7. בחר את הכלי ספירת תכונות מאפשרויות הכלי והעלה את קבצי ה-BAM שהתקבלו לאחר ניתוח כוכבי RNA. הגדר את איכות המיפוי המינימלית לכל אפשרות קריאה באפשרויות סינון הקריאה ל-10, ולחץ על אפשרות כלי ההפעלה בפינה השמאלית העליונה.
  8. פתח את קובץ הפלט של featurecount מהחלונית הימנית והעתק את הנתונים לגיליון אלקטרוני. חשב את שינוי הקיפול ביחס לבקרה על ידי חלוקת מספר ספירות הקריאה שהתקבלו במבחן במספר ספירות הקריאה שהתקבלו בפקד בפקודה =log (שינוי קיפול, 2).
    הערה: שינוי קיפול <-2.0 נחשב כמצביע על הורדת רגולציה ושינוי קיפול > 2.0 נחשב להורדת רגולציה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שינויים מורפולוגיים
הדגירה של תאי צינור הלבלב האנושיים בתווך חומצי שינתה את המורפולוגיה של התאים. דפוס תאים צפוף ודחוס הביא לתאים מפוזרים בתנאים חומציים, ומוות תאים הופך בולט עם הזמן. בהשוואה לתאים רגילים המכילים מדיום, תאי צינור התכווצו וקטנו בגודלם. שינוי דרסטי בשיעור התמותה נצפה לאחר 6 שעות של דגירה. אחרי 24 שעות, מספר התאים ירד, והתאים נראו במצב סטרס (איור 1, איור 2 ואיור 3). לפיכך, תקופת הדגירה הוארכה ל-6 שע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה זו פותחה כדי לקבוע את ההשפעות של תנאים חומציים על תאי אפיתל צינור הלבלב האנושיים שאינם סרטניים בחזרות ביולוגיות. שינוי ב-pH של המדיום גרם לתאים להיות במצב לחץ, ונצפה שינוי במורפולוגיה. התאים תורבבו ב-pH 6.0, 6.5 או 7.0 במשך 24 שעות וניטרו כל שעה כדי לייעל את תקופת הדגירה לניסויים נוספים. ראינו שינוי במורפולוגיה לאחר 4 שעות של דגירה, ושיעור תמותת התאים עלה לאחר 6 שעות של דגירה ב-pH חומצי. לכן, דגרנו את התאים במשך 6 שעות לפני שהמשכנו בניתוח ביטוי הגנים.

גני...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רנוקה גודשלוואר אסירת תודה ל-DBT על שסיפק לה את המלגה. רנוקה גודשלוואר מודה על העזרה שקיבלה מהמחלקה לביוכימיה, אוניברסיטת אוסמניה (היידראבאד) ולד"ר V. V. Ravikanth על הדרכתו בעת ניתוח נתוני ה-NGS. ד"ר מ. ססיקלה מכיר בסיוע הכספי שהתקבל מ-ICMR, משרד הבריאות, ממשלת הודו (מענק מס' 94/2020/5582/Proteomics-Adhoc/BMS).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות צנטריפוגה מדורגים 15 מ"ל (פלקון) טרסונס 500031משמש להכנת דגימות 
צינורות צנטריפוגה מדורגים 50 מ"ל (פלקון)טרסונים 500041משמש להכנת דגימה 
מכשיר Agilent 2100 BioanalyzerAgilentAgilent G2938AInstrment להערכת איכות RNA 
תמיסה אנטיביוטית אנטי-פטריית 100x נוזליתHimediaA002-100 מ"למשמשת למניעת זיהום 
מגרד תאים עם להב מסתובבHimedia TCP223גירוד ואיסוף התאים
CO2 incubator ניו ברונסוויקגלקסי 170 Sמשמש לדגירת התרבות 
מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco, גלוקוז גבוה HimediaAL007S-500 מ"למדיום המשמש לתרבית התאים
תמיסת מלח פוספט חוצץ של Dulbecco 1xHimediaTL1006-500mLשטיפת תאים
גלקסי (https://usegalaxy.org)כלי מקוון לעיבוד נתוני NSG 
HI FBS (מקור: אוסטרליה)Gibco10100-147משמש לגידול תאים 
קו תאי אפיתל צינור הלבלב האנושי (HPDEC / H6C7)Addex BioT0018001קו תאים צינור הלבלב
ערכת RNA-Seq כוללת ערכת v2הכנת דגימת RNA4475936 תרמו פישר זרימת
אוויר
Na2HPO4 DiabasicSigma AldrichS3264-250Gנתרן פוספט הכנת חוצץ 
NaH2PO4 MonobasicSigma AldrichS3139-250Gהכנת בופר נתרן פוספט 
NovaSeq 6000Illumina3376672סיקוונסר 
משטח דלתא Nunclon (צלחת 6 בארות)Thermo Scientific140675תרבית התאים 
צנטריפוגה ספסלית בקירורThermo Scientific Sorvall ST 8Rמשמש לצנטריפוגה
RiboMinus Eukaryote System v2Thermo Fisher ScientificA15026rRNA Depletion Kit 
ערכת Rneasy Mini Qiagen74104לבידוד סה"כ RNA מהתאים 
המחזור התרמיEppendorfE950040025תגובת PCR 
אמבט מים Equitron#8406Mהפשרת דגימה
ערכת למינריתערכת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Franck, C., et al. Advanced pancreatic ductal adenocarcinoma: Moving forward. Cancers (Basel). 12 (7), 1955(2020).
  2. Kong, X., Sun, T., Kong, F., Du, Y., Li, Z. Chronic pancreatitis and pancreatic cancer. Gastrointest Tumors. 1 (3), 123-134 (2014).
  3. Jura, N., Archer, H., Bar-Sagi, D. Chronic pancreatitis, pancreatic adenocarcinoma and the black box in-between. Cell Res. 15 (1), 72-77 (2005).
  4. Kloppel, G. Chronic pancreatitis, pseudotumors and other tumor-like lesions. Mod Pathol. 20 (Suppl 1), S113-S131 (2007).
  5. Schneider, A., Whitcomb, D. C. Hereditary pancreatitis: a model for inflammatory diseases of the pancreas. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 16 (3), 347-363 (2002).
  6. Boedtkjer, E., Pedersen, S. F. The acidic tumor microenvironment as a driver of cancer. Annu Rev Physiol. 82, 103-126 (2020).
  7. Coussens, L. M., Werb, Z. Inflammation and cancer. Nature. 420 (6917), 860-867 (2002).
  8. Balkwill, F., Mantovani, A. Inflammation and cancer: back to Virchow. Lancet. 357 (9255), 539-345 (2001).
  9. Clevers, H. At the crossroads of inflammation and cancer. Cell. 118 (6), 671-674 (2004).
  10. Kato,, et al. Acidic extracellular microenvironment and cancer. Cancer Cell Int. 13 (1), 89(2013).
  11. Hegyi, P., Maléth, J., Venglovecz, V., Rakonczay, Z. Jr Pancreatic ductal bicarbonate secretion: challenge of the acinar acid load. Front Physiol. 2, 36(2011).
  12. Ibrahim-Hashim, A., Estrella, V. Acidosis and cancer: from mechanism to neutralization. Cancer Metastasis Rev. 38 (1-2), 149-155 (2019).
  13. Vakkila, J., Lotze, M. T. Inflammation and necrosis promote tumour growth. Nat Rev Immunol. 4 (8), 641-648 (2004).
  14. Zepecki, J. P., et al. Regulation of human glioma cell migration, tumor growth, and stemness gene expression using a Lck targeted inhibitor. Oncogene. 38 (10), 1734-1750 (2019).
  15. Kim, R. K., et al. Role of lymphocyte-specific protein tyrosine kinase (LCK) in the expansion of glioma-initiating cells by fractionated radiation. Biochem Biophys Res Commun. 402 (4), 631-636 (2010).
  16. Hu, Y., et al. Requirement of Src kinases Lyn, Hck and Fgr for BCR-ABL1-induced B-lymphoblastic leukemia but not chronic myeloid leukemia. Nat Genet. 36 (5), 453-461 (2004).
  17. Sharp, N. A., Luscombe, M. J., Clemens, M. J. Regulation of c-fgr proto-oncogene expression in Burkitt's lymphoma cells: effect of interferon treatment and relationship to EBV status and c-myc mRNA levels. Oncogene. 4 (8), 1043-1046 (1989).
  18. Hui, A. B., Lo, K. W., Yin, X. L., Poon, W. S., Ng, H. K. Detection of multiple gene amplifications in glioblastoma multiforme using array-based comparative genomic hybridization. Lab Invest. 81 (5), 717-723 (2001).
  19. Fang, Z. Y., et al. Proteomic identification and functional characterization of a novel ARF6 GTPase-activating protein, ACAP4. Mol Cell Proteomics. 5 (8), 1437-1449 (2006).
  20. Okabe, H., et al. Isolation of development and differentiation enhancing factor-like 1 (DDEFL1) as a drug target for hepatocellular carcinomas. Int J Oncol. 24 (1), 43-48 (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

pHRNA

מאמרים קשורים