יצירת רקמת שריר הלב האנושית בתלת מימד באמצעות כתיבה אלקטרו-ספינינג נמס של פיגומי פוליקפרולקטון ותאי לב שמקורם ב-hiPSC

ייצור רקמות פונקציונליות מהונדסות לב אנושיות טומן בחובו הבטחה גדולה ליישומים בעלי השפעה גבוהה. אלה משתרעים מפיתוח מודלים של רעילות לב תרופתית ומחלות לב אנושיות ועד ליצירת רקמות טיפוליות בגדלים רלוונטיים¹. למרות שב-15 השנים האחרונות חלה התקדמות משמעותית בתחום, ייצור שריר הלב האנושי בעל חיקוי גבוה מסוכל כיום על ידי קשיים בשחזור הארגון המבני והמכני המורכב של מקבילו הטבעי².

בצד הביולוגי, טכנולוגיית התכנות מחדש המהפכנית של התאים פתחה את האפשרות לפתח תאים טיפוליים ספציפיים לחולה. נכון לעכשיו, תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (hiPSCs) הם המקור היחיד לקרדיומיוציטים אנושיים בהקשר מותאם אישית. ניתן להשיג תפוקה גבוהה של קרדיומיוציטים בעקבות פרוטוקולי התמיינות חזקים ^3,4. נושא מפתח הוא מידת ההתבגרות כאשר קרדיומיוציטים אנושיים שמקורם ב-hiPSC (hiPSC-CMs) המשמשים כיום מציגים פנוטיפ לא בוגר בתנאי התמיינות דו-ממדיים קונבנציונליים⁵. זה קשור לעובדה שהארגון המבני של רקמת הלב מורכב מאוד, שונה לחלוטין מתרבויות דו-ממדיות קונבנציונליות. כמו כן, שריר הלב מורכב מתאי לב וכלי דם שונים, כולל לא-מיוציטים כגון פיברובלסטים לבביים, שריר חלק ותאי אנדותל, המסודרים בצורה מסודרת באמצעות מבנה תלת מימדי ספציפי, המאפשר שאיבת דם יעילה ^6,7. לפיכך, יש צורך ברקמות מיני לב אנושיות מובנות מאוד המורכבות מכל סוגי התאים העיקריים כדי ליצור רקמות ביומימטיות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית.

יישום גישות ייצור ביולוגי חדשות יכול לשבור את הקיפאון הזה. בין אלה, כתיבה אלקטרו-ספינינג נמס (MEW), טכנולוגיית הדפסת תלת מימד מתקדמת מסוגלת לספק דיוק ורזולוציה גבוהים. ב-MEW, שדה חשמלי משמש להפקדת פולימר מותך בצורת סיבים בטווח הגודל של התא, סדר גודל קטן יותר מהדפסת תלת מימד קונבנציונלית של מידול תצהיר התמזגות (FDM), וכתוצאה מכך מבני פיגומים מוגדרים מאוד ^8,9. MEW הוכח כמסוגל לתרגם קומפלקס בעיצוב סיליקו למטריצה מודפסת ולכוונן תכונות פיזיקליות בתלת מימד כך שיתאימו לאלו של רקמת הלב¹⁰. באמצעות טכנולוגיית MEW, ניתן להדפיס רשתות פולימריות בצורות ומבנים שונים, אשר בשילוב עם הידרוג'לים ידידותיים לתאים רכים, יוצרים רקמות מרוכבות המחקות את הסביבה המיקרו-מקרו-מכנית של שריר הלב הבוגר^{המקומי 11,12}. הוכח כי שינוי העיצוב של פיגום MEW 3D משנה את הפונקציונליות המתקבלת (מעברי סידן)¹⁰, ומבסס את הבסיס להבנת יחסי הצורה-פונקציה במערכת תלת מימדית מבטיחה זו.

כאן, מסופק פרוטוקול מפורט לייצור רקמות מיני לב אנושיות מתכווצות מ-hiPSC-CMs ופיברובלסטים לבביים אנושיים שמקורם ב-iPSC (hiPSC-CFs) ושילובם בתוך הידרוג'ל פיברין מחוזק במבנים מודפסים בתלת מימד MEW. תוספת של פיברובלסטים הייתה בשימוש נרחב במערכות תלת מימד שונות כדי לשפר את הישרדות hiPSC-CMs ולשמור על מבנה הרקמות, אך השימוש בה במערכות 3D-MEW עדיין לא נחקר¹³. הטכנולוגיה המתוארת כאן מספקת פלטפורמה רב-תכליתית לחוקרים שמטרתם לפתח מודלים מדויקים של רקמת לב עם יישומים כגון הבנת מנגנוני מחלה, טוקסיקולוגיה פרה-קלינית וסינון תרופות. מודל זה מתאים להערכת הרעילות הלבבית של תרופות מבוססות כגון אנתרציקלינים (למשל, דוקסורוביצין), מעכבי טירוזין קינאז, וטיפולים מתפתחים כמו תאי T (CAR-T) קולטני אנטיגן כימריים, אשר נקשרו לתפקוד לקוי של הלב¹⁴. יתר על כן, המודל טומן בחובו פוטנציאל משמעותי בקידום הרפואה הרגנרטיבית על ידי מתן אפשרות לבדיקה של ביו-חומרים, דיו ביולוגי וטיפולים מבוססי תאים שמטרתם לשפר את תפקוד הלב ולשקם רקמת שריר הלב במצבים כמו אוטם שריר הלב.

פרטי הריאגנטים והציוד המשמש במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הגדרת מדיה וריאגנטים

1. ציפוי מקדים של לוחות תרבית תאים
   1. הכן את מכסת המניות של Matrigel Growth Factor Reduced (MGFr). מפשירים בקבוקון אחד של MGFr למשך הלילה במקרר על קרח. במכסה מנוע סטרילי, באמצעות קצות קירור ושמירה על הציר והצינורות על קרח כל הזמן, הכינו מינויים בנפח מתאים על ידי דילול המלאי 1:1 ב-RPMI 1640 L-גלוטמין קר (RPMI).
      הערה: עבור תרבית hiPSC וזריעה של hiPSC-קרדיומיוציטים (hiPSC-CMs), נעשה שימוש בדילולים שונים של MGFr. דילול ציפוי MGFr עבור hiPSCs משתנה בהתאם לקו התאים הספציפי. עם זאת, ברגע שמגיעים לשלב הקרדיומיוציטים, משתמשים בדילול של 1:80 ללא קשר לקו התאים.
   2. לציפוי לוחות תרבית תאים, יש להפשיר לאט את המספר הנדרש של עליונות MGFr על קרח ולדלל אותם עוד יותר ב-RPMI קר, 1:180 לתרבית hiPSC (100 מיקרוליטר של MGFr ב-9 מ"ל RPMI) ו-1:80 לציפוי מחדש של hiPSC-CMs (100 מיקרוליטר של MGFr ב-4 מ"ל של RPMI).
      1. הוסף מיד את ה-MGFr המדולל בנפח של 1 מ"ל לבאר עבור צלחות של 6 בארות (תחזוקת hiPSC) ו-0.5 מ"ל לבאר עבור צלחות של 12 בארות (ציפוי מחדש של hiPSC-CMs). אחסן את הצלחות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפני השימוש (עד שבוע).
         הערה: יש לחמם צלחות מצופות MGFr ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני זריעת התאים. לפני ציפוי התאים, יש לשאוב את הנוזל מהצלחת המצופה MGFr.
   3. עבור תרבית hiPSC-CFs, יש לצפות צלוחיות T75 או T175 ב-0.1% ג'לטין למשך 15 דקות לפחות בטמפרטורת החדר (RT) לפני השימוש, בנפח של 5 מ"ל עבור T75 או 10 מ"ל עבור צלוחיות T175. לאחר הדגירה יש לשאוב את הנוזל לפני זריעת התאים.
2. מדיה לתרבית תאים
   1. לתרבית hiPSC, יש להשתמש ב-Complete Essential 8 Medium (E8 Medium) על ידי הוספת תוסף Essential 8 (50x) ל-Essential 8 Basal Medium.
   2. להתמיינות קרדיומיוציטים, הכינו:
      1. RPMI/B27 ללא אינסולין (-INS medium): יש לערבב 500 מ"ל RPMI ו-10 מ"ל B27 ללא תוסף אינסולין; RPMI/B27 (בינוני B27): מערבבים 500 מ"ל RPMI ו-10 מ"ל תוסף B27.
   3. לטיהור קרדיומיוציטים (מדיום לקטט), הוסף 2 מ"ל של 1 M לקטט ל-500 מ"ל של RPMI 1640 ללא גלוקוז. ניתן לאחסן את המדיום בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד חודש.
   4. לציפוי מחדש של קרדיומיוציטים (Replating Medium), תוסף B27 בינוני עם 10% תחליף סרום נוק-אאוט (KSR) ו-10 מיקרומטר של Y27.
      הערה: KSR היא פורמולה מוגדרת ונטולת סרום המחליפה FBS בפרוטוקולי תרבית ESC ו-iPSC.
   5. לצורך התמיינות ותחזוקה של פיברובלסטים (יום 11 ואילך), הכינו את מדיום הגידול השלם של פיברובלסטים 3 (FGM3) כפי שצוין על ידי היצרן. הוסיפו את חבילת התוספים שלה (סרום עגל עוברי 0.1 מ"ל/מ"ל, אינסולין אנושי רקומביננטי 5 מיקרוגרם/מ"ל וגורם גדילה פיברובלסטים בסיסי אנושי של 1 ננוגרם/מ"ל, FGF2) למדיום הבסיסי FGM3.
      הערה: כדי לקדם התפשטות פיברובלסטים, מומלץ להגדיל את ריכוז FGF2 ל-10 ננוגרם/מ"ל.
   6. ליצירת רקמת לב תלת מימדית ושימוש בתחזוקה, הכינו:
      1. מדיום ליצירת רקמות: תוסף B27 בינוני עם 1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S), 10% KSR ו-10 מיקרומטר של Y27. מדיום לתחזוקת רקמות: הכן מדיום B27 עם 1% P/S ואפרוטינין (0.1% (משקל/נפח); 33 מיקרוגרם/מ"ל).
         הערה: אפרוטינין מאפשר שלמות ג'ל פיברין במהלך זמן התרבית, מונע את פירוקו ושומר על התאים בתוך ההידרוג'ל. לכן, מומלץ מאוד להוסיף אותו למדיום באותו יום בו נוצרת הרקמה.
3. פתרונות מלאי של מולקולות קטנות וגורמי גדילה
   1. CHIR-99021 (CHIR): עבור מעכב GSK3 ומפעיל איתות Wnt, הכינו תמיסת מלאי של 10 מילימטר על ידי המסתה ב-DMSO. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
      הערה: קווי ה-hiPSC עשויים להגיב לטיפול ב-CHIR בצורה שונה. ייתכן שתידרש אופטימיזציה של ריכוז CHIR. מומלץ לבצע בדיקת CHIR של 6-10 מיקרומטר.
   2. C59, מעכב Wnt: הכן תמיסת מלאי של 10 מ"מ על ידי המסתה ב-DMSO. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
   3. Y-27632, מעכב ROCK (Y27): הכן מלאי של 10 מ"מ על ידי המסתו ב-DMSO. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך עד חודש. הריכוז הסופי תלוי בסוג תא המטרה. השתמש ב-2 מיקרומטר (1/5000) עבור hiPSCs וב-10 מיקרומטר (1/1000) עבור hiPSC-CMs, hiPSC-CFs ויצירת רקמות.
      הערה: Y27 מקדם את הישרדות התאים על ידי דיכוי מוות תאים בתרחיף במהלך הניתוק. השתמש בו בעת הקטיף כדי למנוע מוות מוגזם של תאים.
   4. חומצה רטינואית: הכינו תמיסת מלאי של 30 מ"מ על ידי המסתה בכלורופורם. אחסן את המינונים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד שנתיים.
   5. FGF2 (גורם גדילה פיברובלסטי אנושי רקומביננטי, גם FGF-b, מקדם התפשטות פיברובלסטים): הכינו תמיסת מלאי של 50 מיקרוגרם/מ"ל על ידי המסתה במים סטריליים. יש לאחסן את המינונים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
   6. SB431542 (SB), מעכב איתות TGFß1: הכן תמיסת מלאי של 10 mM על ידי המסתה ב-DMSO. יש לאחסן את המינונים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
      הערה: הוסף אותו למדיום פיברובלסטים כדי לשמור על מצב CFs ולמנוע מעבר מיופיברובלסטים (הפנוטיפ הפתולוגי המתעורר במהלך פיברוזיס) בתרבית דו-ממדית.
4. פתרונות מלאי לפיברין הידרוג'ל
   1. פיברינוגן: הכן תמיסת מלאי של 200 מ"ג/מ"ל. ראשית, טוחנים את גושי הפיברינוגן לאבקה דקה באמצעות כלים סטריליים בתוך מכסה תא. יש להוסיף תמיסת NaCl חמה של 0.9% (משקל/נפח) ולשמור אותה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד להמסה מלאה. אחסן את המינונים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד שנה; בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע.
      הערה: בגלל הצמיגות שלו ב-4 מעלות צלזיוס, הפשירו אותו ושמרו אותו ב-RT מתישהו לפני שלב יצירת הרקמות כדי שניתן יהיה לזרוק אותו בצורה מדויקת. אם לא ניתן לזרוק אליקוט בקלות בעת שימוש חוזר, מומלץ להשליך אותו ולהשתמש בחדש.
   2. תרומבין: הכן תמיסת מלאי של 100 U/mL על ידי המסת טרומבין בסטרילי 60% PBS + 40% מים. אחסן את המינונים ב-20 מעלות צלזיוס עד שנה ב-4 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים.
      הערה: לפני השימוש, הפשירו אותו ושמרו אותו על קרח עד להשלמת שלב יצירת הרקמות.
   3. אפרוטינין: הכינו תמיסת מלאי של 33 מ"ג/מ"ל על ידי המסת אפרוטינין במים סטריליים (100 מ"ג אבקה ב-3.04 מ"ל מים). אחסן את המינונים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד שנה.
5. פתרונות לניתוח
   1. מאגר FACS (ציטומטריית תאים): הכן תמיסת PBS (ללא Mg²⁺ ו-Ca²⁺) בתוספת 2.5 מ"מ של EDTA ו-5% (v/v) FBS.

2. תרבית ומעבר iPSC אנושי

הערה: ההליכים המדווחים כאן בוצעו עם מספר קווי hiPSC, כולל UCSFi001-A (זכר, מתנה אדיבה של פרופסור ברוס קונקלין, מכוני דיוויד ג'יי גלדסטון), ESi044-A (זכר), ESi007-A (נקבה) ו-ESi044-C (נקבה) קווים בריאים ו-ESi107-A (קו חולה נשי של עמילואידוזיס לבבי) עם התאמות קלות הנוגעות למדיום תרבית hiPSC, דילול מעבר וריכוז CHIR. הפרוטוקול מכיל את הפרטים הספציפיים לשימוש ב-UCSFi001-A. כל דגירות תרבית התאים בפרוטוקול זה מבוצעות בתנאי לחות של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ ו-96%.

1. קו תרבית hiPSC על צלחות 6 בארות מצופות מראש של 1:180 MGFr. שמור אותם על מדיום E8 כדי להבטיח פלוריפוטנטיות.
   הערה: כדי למנוע התמיינות ספונטנית, חשוב להימנע מצמיחת יתר של תרבויות. לכן, בצע מעבר hiPSC כאשר התאים מתכנסים 80%-90%.
2. למעבר תאים, שאפו את המדיום הישן, שטפו בארות פעמיים עם 1 מ"ל של תמיסת EDTA של 0.5 מ"מ מדוללת ב-PBS (Mg²⁺- ו-Ca²⁺-free) לבאר, ודגרו במשך 7 דקות ב-EDTA/PBS ב-RT כדי לשבש הידבקויות בין-תאיות.
3. שאפו את ה-EDTA/PBS וקצרו את התאים, ניתקו אותם על ידי פיפטינג נמרץ עם מיקרו-פיפטה של 1000 מיקרוליטר עם 1 מ"ל של מדיום E8 על פני הבאר עד לניתוק התאים. אוספים אותם בצינור צנטריפוגה סטרילי.
   הערה: הימנע מפיפטינג יותר מ-10-15 פעמים, מכיוון שהוא יגביר את התמותה מ-hiPSC.
4. מנפח זה, בצע דילולים של 1:15-1:20 וזרע את התאים על צלחות 6 בארות מצופות MGF במדיום E8 + 2 מיקרומטר של Y27. שמרו על Y27 רק ב-24 השעות הראשונות לאחר הזריעה כדי למנוע רעילות מחשיפת יתר.
   הערה: התאם את יחס הפיצול עבור קווי hiPSC אחרים כדי לשמור על התאים לא ממוינים ועל מורפולוגיה בריאה למשך 4-5 ימים.
5. לאחר 24 שעות, שאפו בינוני ישן והוסיפו טמפרטורת חדר טרייה E8 בינונית מספיק ליומיים (בדרך כלל 3-4 מ"ל). לאחר מכן, החלף את המדיום כל יום למשך 3-4 ימים.
   הערה: תדירות המעבר תלויה בכל שורת תאים; הימנע מלהגיע ל-100% מהמפגש. hiPSCs צריכים לגדול במושבות גדולות, שטוחות וקומפקטיות עם גיאומטריה מצולעת, קצוות מוחלקים ויחס גרעין/ציטופלזמה גבוה.

3. בידול קרדיומיוציטים אנושיים

הערה: עבור יצירת קרדיומיוציטים מ-hiPSCs (hiPSC-CMs), הפרוטוקול המתואר מבוסס על מתודולוגיית ההתמיינות החד-שכבתית המשמשת את Lian et ^al.3,15 ו-Burridge et ^al.4. עם תחזוקה נאותה, ניתן להבדיל בין hiPSC על פני 30 מעברים רצופים עם יעילות בידול גבוהה. סימנים להתנהגות חריגה מתגלים על ידי התמיינות ספונטנית או כישלון רציף של יותר מ-4 התמיינות. מומלץ לבצע בקרות קבועות, כולל בדיקת מיקופלזמה.

1. כדי ליזום התמיינות לבבית, קצור hiPSCs במפגש של 80%-90% כמתואר בשלב מעבר התא לעיל (שלב 2). תאי זרעים בצלחות 12 בארות מצופות MGFr 1:180 התאמת דילולים מפוצלים להשגת חד-שכבות תאים קומפקטיות ב-90% מהמפגש לאחר 48-72 שעות של זריעה. עבור קו תאים זה, בצע דילול של 1:10, והתאים ישיגו מפגש לאחר 72 שעות.
   הערה: בפרוטוקול זה, הדילולים הותאמו לפי נפח, לא לפי מספר התאים, כדי למנוע שונות תלוית משתמש. אם המצב החד-שכבתי לא יושג תוך 72 שעות לאחר הציפוי, סביר מאוד שתהליך ההתמיינות לא יצליח. במקרה כזה, רצוי להשליך את הניסיון ולהפעיל מחדש, תוך הבטחת יעילות מעבר אופטימלית.
2. כאשר חד-שכבות מתייצבות, מתחיל תהליך ההתמיינות, הנחשב מעתה והלאה ליום 0. לאחר מכן, שנה את המדיום למדיום -INS בתוספת 8 מיקרומטר של CHIR, מפעיל האיתות Wnt, ודגר את הצלחת למשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס (1 מ"ל לבאר).
   הערה: טיטראט ריכוז CHIR בין 6-12 מיקרומטר עבור כל קו iPSC לאינדוקציה יעילה של מזודרם. בשלב זה צפויה רמה גבוהה של מוות תאי, המהווה סימן לתהליך אופטימלי.
3. יום 1: למחרת יש לשאוב את המדיום מכל באר ולשטוף את התאים עם RPMI ללא תוספי תזונה (0.5 מ"ל לבאר). לאחר מכן, הוסף 1.5 מ"ל של מדיום -INS טרי ודגר תאים למשך יומיים.
   הערה: שלבי הכביסה מבוצעים במהלך כל החלפת המדיה כדי להסיר פסולת, תאים מתים ושאריות תוספים.
4. יום 3: כדי לגרום למפרט שושלת לב, החלף את המדיום ב-1.5 מ"ל של מדיום -INS בתוספת 5 מיקרומטר של מעכב Wnt C59 למשך 48 שעות.
   הערה: כאן נוצר קומפלקס GSK3, ו-ß-catenin מתפרק, מה שמוביל לשושלת מזודרמלית לבבית. ניתן להבחין גם במוות תאי מסוים לאחר שלב זה.
5. יום 5: יש לשטוף ולהחליף במדיום INS טרי למשך 48 שעות בנפח של 1.5 מ"ל לבאר, כדי לקדם התרחבות של אבות לבביים.
6. יום 7: מיום זה ואילך, התאים נשמרים במדיום B27, עם החלפת מדיה כל 2-3 ימים.
   הערה: התאם את כמויות המדיה ל-2.5 מ"ל לבאר כדי לדלג על החלפת מדיום במהלך סוף השבוע, אך רק לאחר הגעה למצב זה. בדרך כלל, hiPSC-CMs מתחילים להכות באופן ספונטני בימים 7-9. ראשית, ההתכווצות תיצפה כאשכולות מבודדים ולא מתואמים, אך תוך מספר ימים, תרביות בעלות טוהר גבוה אמורות ליצור שכבה חד-שכבתית אחידה.
7. לאחר השגתם, חד-שכבות התכווצות אלה (בדרך כלל ביום 10) נתונות לתהליך ברירה מטבולית המורכב משני מחזורים של 72 שעות במדיום לקטט המופרדים על ידי שלב ציפוי מחדש כדי לחסל תאים שאינם קרדיומיוציטים ולהעשיר את טוהר התרבית.
8. יום 10, שלב טיהור ראשון (^לקטט ראשון): שטפו את התאים הפועמים במדיום לקטט (0.5 מ"ל לבאר) ודגרו אותם עם 1 מ"ל לבאר של מדיום לקטט למשך 72 שעות.
   הערה: שלב הכביסה חייב להיעשות עם מדיום לקטט או RPMI 1640 נטול גלוקוז בסיסי כדי להסיר לחלוטין את כל העקבות של מדיום הגלוקוז הקודם (B27).
9. יום 13: שטפו ותנו לתאים להתאושש מסבב הטיהור הראשון עם 1.5 מ"ל לבאר של מדיום B27 למשך יומיים.
10. יום 15 (שלב ציפוי מחדש): בין שני מחזורי הטיהור, נתק את החד-שכבות על ידי שטיפה עם EDTA/PBS ודגירה עם TrypLE למשך 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס (0.5 מ"ל לבאר).
    הערה: זמן הדגירה תלוי בכל שורת תאים.
11. נתק את התאים באמצעות מיקרופיפטה של 1000 מיקרוליטר ושחזר אותם עם 0.5 מ"ל לבאר של מדיום B27 בתוספת 10% KSR (v/v) בצינור צנטריפוגה סטרילי.
    הערה: קרדיומיוציטים רגישים למתח גזירה ופיפטינג חזק, לכן נסו להימנע מצעדי פיפטינג חוזרים ונשנים. אפשרויות אחרות לדיסוציאציה של hiPSC-CM עם נזק נמוך יותר יכולות להיות שימוש ב-TrypLE 10x או קולגנאז עם DNase. מטב את זמן הדגירה כדי להבטיח שהוא מספיק לניתוק תאים מבלי לגרום נזק לתאים או לדרוש פיפטינג מוגזם, מה שעלול לפגוע בשלמות התא.
12. צנטריפוגה 10 דקות ב-100 x גרם ב-RT וציפוי מחדש בלוחות 12 בארות מצופים 1:80 MGFr עם מדיום ציפוי מחדש. זרע אותם ב -1 מ"ל לבאר.
    הערה: פעולה זו תסיר עודפי תאים מתים ומטריצה שהופקדו במהלך ההתמיינות, מכיוון שמאוחר יותר עלולה להיות להם השפעה שלילית על יצירת הרקמות.
13. יום 16: לאחר 24 שעות של ציפוי מחדש, הסר את Y27 ו-KSR ושמור את התאים במדיום B27 לפני שלב הטיהור הבא (בדרך כלל 48-72 שעות).
14. יום 18: שלב הטיהור השני (לקטט 2). כמו במחזור הראשון, יש לשטוף ולדגור את התאים במדיום לקטט למשך 72 שעות (1 מ"ל לבאר).
    הערה: מחזורי טיהור יכולים לשפר את טוהר התרבית בעד 30%, כפי שנצפה על ידי ניתוח ציטומטריית זרימה של סמן הקרדיומיוציטים cTNT (טרופונין לב T) (לא מוצג). תהליך זה מפחית בעיקר את הפיברובלסטים ואת שאר זיהום ה-hiPSC. למרות שלא נקבעה רמת הטוהר המינימלית המקובלת הנדרשת להמשך ייצור רקמות מבלי לפגוע בתשואה, מומלץ להשתמש בתרביות בטוהר של לפחות 85%-90%. רמת טוהר זו תומכת בחיבור קרדיומיוציטים משופר, משפרת את חוזק ההתכווצות של הרקמה הסופית ותומכת בשחזור בין ניסויים.
15. יום 21: לאחר השלמת טיהור הלקטט, יש לשמור על קרדיומיוציטים מטוהרים במדיום B27 עד לשימוש בהם, עם החלפת מדיה תכופה (כל 2-3 ימים).
    הערה: עיכוב בשימוש יפחית את תפוקת התאים מכיוון שיהיה קשה יותר לנתק אותם. לפיכך, רצוי להשתמש בהם בין היום בו מסתיים טיהור הלקטט השני ופחות משבוע נוסף.

4. בידול פיברובלסטים לבביים אנושיים

הערה: כדי להשיג פיברובלסטים לבביים אנושיים (hiPSC-CFs) מ-hiPSCs, הפרוטוקול הבא מבוסס על המתודולוגיה הדו-פאזית המשמשת את Zhang et ^al.16. הצעד הראשון הוא השגת תאים אפיקרדיאליים (hiPSC-EpiCs) על ידי הפעלה מחדש של מסלול איתות Wnt לאחר השראת מזודרם קרדיוגני. לאחר מכן, hiPSC-EpiCs נחשפים למעכבי התפתחות כלי דם ול-FGF2 כדי להשיג פיברובלסטים לבביים תוך 18 יום.

1. הבטח תחזוקה, קציר וצפיפות זריעה של hiPSC כמתואר בפרוטוקול הבידול hiPSC-CMs. תרבית hiPSCs על צלחות 12 בארות מצופות 1:180 MGFr כדי להתחיל את ההתמיינות.
2. כאשר מושגות חד-שכבות hiPSC קומפקטיות (יום 0), הוסף מדיום -INS בתוספת 5 מיקרומטר של CHIR (1.5 מ"ל לבאר) למשך 48 שעות.
   הערה: ריכוז CHIR טיטראט עבור כל קו hiPSC לאינדוקציה יעילה של מזודרם.
3. יום 2: שואבים וזורקים את המדיום, שוטפים את התאים עם RPMI ומחליפים אותו ב-1.5 מ"ל של מדיום INS טרי למשך 24 שעות.
   הערה: כמו בפרוטוקול hiPSC-CMs, יש לשטוף תאים במהלך כל החלפת מדיה; בהתאם לכל שלב, השתמש במדיום הבסיסי המתאים ללא תוספת.
4. יום 3: דגירה של תאים עם מדיום -INS המכיל 5 מיקרומטר של C59 (מעכב Wnt) למשך 48 שעות (1.5 מ"ל לבאר).
5. יום 5: לציפוי מחדש של תאים מזודרמליים לבביים, נתק את התאים על ידי שטיפה עם EDTA/PBS ודגירה עם TrypLE למשך 5 דקות ב-37 מעלות צלזיוס (0.5 מ"ל לבאר). אסוף את התאים ב-0.5 מ"ל לבאר של מדיום בסיסי Advance DMEM (ADMEM) וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-300 x g ב-RT.
6. זרעו אותם בצלחות 1:180 MGFr מצופות מראש של 12 בארות (1 מ"ל לבאר) בצפיפות של 20,000 תאים/ס"מ². לציפוי מחדש, השתמש ב-ADMEM בתוספת 5 מיקרומטר של CHIR, 2 מיקרומטר של חומצה רטינואית, 10% KSR (v/v) ו-10 מיקרומטר של Y27.
7. יום 6: לאחר 24 שעות לאחר הציפוי מחדש, יש לרענן את המדיום כדי להסיר 27 Y27 ולהפחית את KSR ל-2%. שמור על אותם ריכוזי CHIR וחומצה רטינואית למשך 48 שעות נוספות כדי להשיג התפתחות של פנוטיפ אפיקרדיאלי.
8. יום 8: תאי תרבית עם תוסף ADMEM בתוספת 2% של KSR למשך 72 שעות כדי לקדם את הייצור של חד-שכבות אפיקרדיאליות.
   הערה: נראה כי hiPSC-EpiCs הם תאים גדולים שטוחים או בצורת קובייה המקובצים למושבות בודדות. בנקודת זמן זו, בעת ביצוע סבבי ההתמיינות הראשונים, ניתן לנתח סמנים אופייניים של תאים אפיקרדיאליים כגון WT1 (אנטיגן גרעיני), ZO1 (אנטיגן ממברנה ציטופלזמית) ו-TCF21 (אנטיגן ציטופלזמי) על ידי FACS (ציטומטריית תאי זרימה) או IF (צביעה אימונופלואורסצנטית) (לא מוצג).
9. יום 11: לציפוי מחדש של תאי אפיקרדיאליים, יש לנתק את שטיפת hiPSC-EpiCs עם EDTA/PBS ולדגור עם TrypLE למשך 5 דקות ב-37 מעלות צלזיוס (0.5 מ"ל לבאר). אסוף את התאים במדיום FGM3 (0.5 מ"ל לבאר) ובצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-300 x גרם ב-RT.
10. צבחו מחדש את hiPSC-EpiCs בצלחות 12 בארות מצופות ג'לטין 0.1% בצפיפות תאים של 10,000 תאים/ס"מ². השתמש במדיום FGM3 בתוספת 10 מיקרומטר של SB (מעכב איתות TGFß1 כדי למנוע מעבר מיופיברובלסטים, בדרך כלל במהלך תרבית על פלסטיק) ו-10 מיקרומטר של Y27 (רק במשך 24 השעות הראשונות).
11. למחרת, רענן את מדיום הפיברובלסטים (FGM3 + 10 מיקרומטר של SB) כל יומיים עד לקבלת hiPSC-CFs, כך שסך הכל כ-18 ימים לכל התהליך.
    הערה: hiPSC-CFs צריכים להציג מורפולוגיה בצורת ציר. כאן, יש לנתח את הביטוי של סמן הפיברובלסטים DDR2 בטכניקות FACS ו-IF (ראה שלבים 7.1-7.2).
12. לאחר שתרבית hiPSC-CFs מתכנסת, בצע מעברי תאים 1:3 בצלוחיות T75 או T175 מצופות מראש מג'לטין. התאים מגיעים למפגש של 90% תוך 4-6 ימים בערך. כדי לנתק hiPSC-CFs, השתמש בפרוטוקול הקציר TrypLE המתואר לציפוי מחדש של hiPSC-EpiCs; כאן אין צורך ב־27 יו' כדי לעבור.
13. שמור על hiPSC-CFs ב-FGM3 בינוני + 10 מיקרומטר של SB עד לשימוש בהם או הקפיא אותם במעבר נמוך בצפיפות תאים של 1-3 מיליון תאים לכל קריוטיוב.
    הערה: מומלץ לשמור על hiPSC-CFs למשך 6 מעברים לכל היותר לפני הפשרת תאים חדשים, שכן בתרבית בצלוחיות פלסטיק לטווח ארוך, התאים מתחילים להתמיין לפנוטיפ מיופיברובלסטים מכווץ יותר.

5. ייצור פיגומי כתיבה אלקטרו-ספינינג נמסים (MEW).

הערה: פרוטוקול זה משתמש בהומופולימר פולי ε-קפרולקטון (PCL) בדרגה רפואית להדפסת פיגומים סיביים, באמצעות מדפסת MEW שתוכננה במיוחד למטרה זו על ידי QUT, אוניברסיטת קווינסלנד לטכנולוגיה¹⁰.

1. הכן מלאי פולימר PCL להדפסה. טען גרגירי PCL למזרק פלסטיק של 3 מ"ל Luer-lock המחובר למחט של 23 גרם והמיס אותם בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים בתנור, תוך לחיצה עדינה על הבוכנה כדי להסיר בועות בזמן שהפולימר נמס. הכן מספר מזרקים ואחסן אותם ב-RT, מכיוון ש-PCL מתמצק במהירות.
2. ביום ההדפסה, הכניסו את המזרק לתא החימום וחברו אותו לצינור אספקה N₂ בלחץ. הפעל ציוד MEW, הגדר את ווסתי הטמפרטורה ל-80/65 מעלות צלזיוס (תא/זרבובית), ושמור את המזרק למשך 30 דקות כדי להבטיח התכה נכונה של הפולימר.
3. מתחת למזרק יש את לוחית הקולט, ממונעת וניתנת להזזה בכיווני XY על ידי תוכנה תואמת (Mach3). הזז את לוחית האספן (בקרת סמני מחשב) עד שראש ההדפסה יונח על קצה אחד של הלוח או בכל מיקום רצוי, והתאם את המרחק בין תא החימום ללוחית הקולט (מרחק הקולט) באופן ידני ל-10 מ"מ (מישור Z).
   הערה: יש לבדוק מרחק זה בניסוי כדי להגיע לקוטר סיבים נתון. ככל שמרחק האספן קצר יותר, כך הסיב עבה יותר ולהיפך.
4. סגור את דלת הציוד, המחבר אוטומטית את אספקת השדה החשמלי. הגדר את המתח ב-7 קילו וולט ולחץ N₂ ב-2 פסים כדי שיוכל לבלוט דרך קצה ה-23 G בעת ההדפסה.
   הערה: על ידי אספקת כרך גבוהtagנוצר הבדל פוטנציאלי בין קצה המזרק לצלחת הקולט (עשויה מפלדת אל חלד). לאחר מכן, הטיפה המצטברת בזרבובית על ידי הלחץ המסופק הופכת טעונה אלקטרוסטטית, ויוצרת את חרוט טיילור, הנוסע לעבר לוחית הקולט. ניתן לכוונן מתח ולחץ כדי לשנות את מידות הסיבים הסופיות. פרמטרים של לחץ גבוה יוציאו סיבים עבים יותר, וידרשו מתח מוגבר לייצוב הסיבים. התוכנה מבוססת על בקרה מספרית ממוחשבת (CNC), כך שגיאומטריות פיגומים נכתבות כקוד G ומוזנות לתוכנית, השולטת בתנועת ה-XY ובמהירות מנוע לוחית הקולט. לכן, לפני הדפסת הפיגומים הסופיים, מומלץ להדפיס כל קוד G כשלב קודם לקבלת סילון יציב הבונה סיבים מוגדרים ללא כל מראה סליל או הקצפה. לשם כך, בצע אופטימיזציה של הפרמטרים על ידי שינויים קטנים בכל פעם, כלומר, 0.1 בר ללחץ אוויר, 0.1 קילוואט למתח ו-60-100 מ"מ/דקה למהירות אספן; זה יבטיח התנהגות חרוט טיילור של הסילון.
5. בחר את קוד ה-G המעוצב בתוכנה כדי להדפיס פיגומים עם גיאומטריית דפוס מרובע. דוגמה זו של קוד G מדפיסה רשתות מרובעות בנות 15 שכבות בגודל 6 ס"מ על 6 ס"מ עם נקבוביות בצורת ריבוע של 0.5 מ"מ על 0.5 מ"מ.
6. כדי להדפיס סיבים שהופקדו במדויק (כלומר, סיבים חופפים), התאם את מהירות הקולט ל-1080 מ"מ לדקה.
   הערה: התאם את כרךtagה, לחץ, מהירות אספן ופרמטרים של מרחק אספן בכל ציוד MEW כדי להגדיר קוטר סיבים מדויק (מיקרומטר). מעבר להשפעת הפרמטרים שהוזכרו קודם לכן, הגדלת מהירות הקולט מביאה לסיבים דקים יותר, בעוד שהקטנתה מייצרת סיבים עבים יותר. הגדרות הפרמטרים בפרוטוקול זה מאפשרות הדפסת סיבים בקוטר של 10-15 מיקרון.
7. לחץ על כפתור START בתוכנה כדי להתחיל להדפיס. הסר בזהירות את הפיגום מהאספן לאחר סיום ההדפסה.
   הערה: לטיפול קל יותר בפיגום לאחר ההדפסה, מומלץ להדפיס אותו על פיסת זכוכית גדולה יותר מהפיגום, המאובטחת לבסיס הקולט בעזרת סרט דבק.
8. חותכים את הרשת המודפסת בעזרת אגרוף בקוטר 6 מ"מ כדי לקבל את הפיגומים הסופיים לייצור רקמות.
9. מכיוון שרשתות PCL הן הידרופוביות מאוד, טפל בהן במשך 5 דקות עם פלזמת O₂/ארגון כדי להגביר את ההידרופיליות שלהן ולקדם אינטראקציה עם פיברין ותאים.
   הערה: אופציונלי, טיפול NaOH של 0.1 N למשך 15 דקות, ואחריו שטיפות PBS נרחבות, עובד גם הוא.
10. יש לעקר רשתות על ידי טבילה באתנול 70% למשך 30 דקות, לשטוף בהרחבה במים מזוקקים סטריליים למשך 30 דקות ולהשאיר לייבוש.
    הערה: בצע תהליך זה בצלחת פטרי סטרילית ובתוך מכסה מנוע סטרילי. אין לייבש לחלוטין את הרשתות עד שמשתמשים בהן כדי למנוע את הדבקתן לצלחת וכתוצאה מכך עיוות.

6. ייצור ותחזוקה של רקמות מיני פיברין

הערה: יצירת רקמות מיני תלת מימדיות של שריר הלב האנושי מסתמכת על עטיפה של תאי לב שמקורם ב-hiPSC בתוך הידרוג'לים פיברין בשילוב עם פיגומי MEW המספקים תמיכה סיבית. הפרוטוקול הבא הותאם מגישות התכנון ההנדסי ששימשו את Breckwoldt et ^al.17 ו-Ronaldson-Bouchard et ^al.18.

1. נתק את hiPSC-CMs כמתואר לעיל בשלב הציפוי מחדש (3.10-3.11) של פרוטוקול הבידול hiPSC-CMs (קציר TrypLE). השעו מחדש את כדור התא במדיום ליצירת רקמות כדי לספור את התאים בתא נויבאואר.
2. נתק את hiPSC-CFs כמו בשלב הקציר של hiPSC-CMs עם TrypLE. השתמש ב-3 מ"ל של TrypLE עבור T75, 5 מ"ל עבור צלוחיות T175, ובאותו נפח להשבתת דגירה של TrypLE. לבסוף השעו מחדש את גלולת התא במדיום ליצירת רקמות, כמו עבור CMs, מכיוון שהם הולכים להיות מעורבבים ומתורבתים באותה מדיה.
3. ספרו את התאים בתא נויבאואר. חשב את המספר הכולל המדויק של התאים הדרושים לזריעה של כל הרקמות.
   הערה: פרוטוקול זה מעסיק מיליון תאים לרקמה, המורכבים מ-80% CMs ו-20% CFs, כלומר 800,000 CMs ו-200,000 CFs. כמויות אחרות, כגון סה"כ של 1.5 ו-3 מיליון לרקמה, ניתנות גם הן להשגה באמצעות תרגול.
4. מערבבים וכדורים את סך התאים הדרושים בצינור חדש (Cell Mix), 5 דקות ב-300 x g ב-RT. ודא שהגלולה יבשה לחלוטין ושמור אותה על קרח עד לזריעה. חשב את הנפח הכולל של הידרוג'ל הנדרש לזריעת כל הרקמות.
   הערה: פרוטוקול זה דורש 35 מיקרוליטר לרקמה (עבור גודל פיגום בקוטר 6 מ"מ) לצפיפות סופית הקרובה ל-30 מיליון תאים/מ"ל, אך ניתן להגדיל אותו, כפי שכבר הוזכר בשלב 6.4 לעיל. כל הידרוג'ל פיברין מורכב מ-6 מ"ג/מ"ל פיברינוגן בתוספת 5 תרומבין U/mL יחד עם מדיום יצירת הרקמות, שבו תאים מושעים מחדש. עבור הידרוג'ל של 35 מיקרוליטר, יחס הפיברינוגן/תרומבין הוא 1.05 מיקרוליטר / 1.8 מיקרוליטר. מומלץ נפח סופי נוסף של 10% של הידרוג'ל כדי למנוע אובדן נפח עקב שגיאות פיפטה. דוגמה: עבור 10 רקמות, השעו מחדש את התאים ב-350 מיקרוליטר + 10%, כלומר 385 מיקרוליטר כנפח קצה כולל.
5. השהה מחדש את תערובת התאים בנפח הנדרש של מדיום יצירת רקמות. מערבבים בזהירות, הימנעות מהיווצרות בועות.
   הערה: עבור 10 רקמות, יש להשעות מחדש 10 מיליון תאים (80 ס"מ: 20 CFs) ב-374.5 מיקרוליטר של מדיום ליצירת רקמות (נפח כולל של הידרוג'לים פחות הכמות הכוללת של פיברינוגן הנדרשת לסך הרקמות, כלומר 10.5 מיקרוליטר).
6. מוסיפים את נפח הפיברינוגן הנדרש ומערבבים בזהירות. עבור 10 רקמות, הוסף 10.5 מיקרוליטר פיברינוגן לתערובת התאים, ויוצר את תערובת ההידרוג'ל. שמור את זה ב-RT.
   הערה: חיוני להימנע מפיפטינג חוזר מדי כדי שכוחות הגזירה לא ישפיעו על כדאיות hiPSC-CMs. מומלץ לחתוך חתיכה מקצה קצה הפיפטה בעזרת אזמל סטרילי ולאחר מכן להשעות איתו מחדש את תערובת ההידרוג'ל כדי להפחית את נזקי הגזירה.
7. כדי למנוע הידבקות פיברין לצלחת, יש לערבב זרעי הידרוג'ל במשטח פוליטטרפלואורואתילן (PTFE). פיפטה מחצית מנפח הרקמה (17.5 מיקרוליטר), שתישאר כטיפה, ותעשה זאת עבור המספר הכולל של הרקמות.
   הערה: אין להכין יותר מ-10 טישו בכל פעם, מכיוון שהן עלולות להתייבש.
8. הניחו פיגום PCL על גבי כל טיפה והוסיפו את הנפח הנותר (17.5 מיקרוליטר). ודא שהפיגום שקוע לחלוטין.
   הערה: היו מוכנים לפיפטינג בשתי הידיים, מכיוון שהתגובה מהירה מאוד. רקמה אחת בכל פעם.
9. הוסף את הכמות הנדרשת של תרומבין (1.8 מיקרוליטר) ביד הלא דומיננטית שלך וערבב במהירות את ההידרוג'ל עם היד הדומיננטית (פיפטינג לפחות 2-3 פעמים).
   הערה: רצוי לערבב על ידי פיפטינג פחות מהנפח הכולל, כדי למנוע היווצרות בועות (30 מיקרוליטר). אם נוצרת בועת אוויר, דוקרים אותה במהירות בעזרת מחט.
10. חזור על השלב הקודם עבור כל רקמה.
    הערה: רצוי לתרגל טכניקה זו ללא תאים עד להבטחת טיפול טוב.
11. דגרו את הרקמות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי להשלים את פילמור הפיברין.
12. הרימו בעדינות כל טישו מהקצה בעזרת פינצטה סטרילית והניחו אותם בצלחות של 12 בארות עם 2 מ"ל לבאר של מדיום יצירת הרקמות בתוספת 33 מיקרוגרם/מ"ל של אפרוטינין. יש להניח טישו אחד לכל באר.
    הערה: אין להרים אותם במרכז ההידרוג'ל כך שהתאים עלולים להינזק מכוח מכני. במידת הצורך, השתמש במרית.
13. דגרו על הרקמות למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: זה קריטי לשמור על אפרוטינין במדיום תרבית הרקמה מיום הייצור ואילך, שכן נצפה כי השמטת אפרוטינין במהלך 24 השעות הראשונות, גם אם מתווסף מאוחר יותר, מובילה לניתוק חלקי של התאים מהרשת וההידרוג'ל. זה פוגע בכיסוי התאים המלא הדרוש לשלמות הרקמה הסופית.
14. למחרת, רענן את המדיום עם 2 מ"ל של מדיום תחזוקת הרקמות, והסר שאריות KSR ו-Y27. החלף את המדיום כל יומיים משם והלאה.

7. ניתוח שיטתי של פוטנציאל ההתמיינות הלבבית של תפקוד hiPSC ומיני רקמות

1. ניתוח ציטומטריית זרימה
   הערה: תאים מנותחים באמצעות שיטת הציטומטריה "מיון תאים מופעל פלואורסצנטי" (FACS) כדי לקבוע את היעילות של התמיינות hiPSC. כל השלבים מבוצעים בתנאי טמפרטורת החדר.
   1. לפרק תרביות תאים לתרחיף תאים בודדים (קציר TrypLE), הן hiPSC-CMs והן CFs בנפרד.
   2. השעו מחדש את הגלולה ב-250,000 תאים/מ"ל במאגר FACS והוציאו לפחות 1 מ"ל לכל צינור. יש לדגור למשך 30 דקות כדי למנוע קשירת נוגדנים לא ספציפיים.
   3. תאי צנטריפוגה ב-300 x גרם ב-RT למשך 5 דקות והשליכו את הסופרנטנט.
      הערה: כל שלבי הצנטריפוגה מבוצעים בתנאים אלה.
   4. כדי לזהות אנטיגנים תוך-תאיים, תקן וחלחלחל את קרומי התאים עם ערכת חדירות תאים. ראשית, דגרו על התאים עם תגובתי A (תיקון) למשך 30 דקות וצנטריפוגה (כמו בשלב 7.1.3).
   5. לאחר מכן, דגרו על תאים עם Reactive B (Perm) בתוספת הנוגדן הראשוני למשך 30 דקות. השתמש ב-100 מיקרוליטר של תגובתי לכל צינור.
      1. עבור hiPSC-CMs, השתמש בנוגדני cTNT של עכבר (טרופונין T לבבי, סמן של CM) בדילול של 1/200. עבור hiPSC-CFs, השתמש בנוגדני DDR2 של עכבר (קולטן קולגן, סמן CF) בדילול של 1/500.
         הערה: כדי לעצור את כל התגובות, הוסף 1 מ"ל של מאגר FACS לכל צינור לפני הצנטריפוגה.
   6. דגירה למשך 15 דקות עם נוגדן משני נגד עכבר Alexa-Fluor 488 מדולל 1/100 במאגר FACS.
   7. שטפו 3 פעמים עם PBS, צנטריפוגה בין שטיפות (בהתאם לאותם תנאים כמו בשלב 7.1.3), ולבסוף השעו מחדש את גלולת התא ב-400 מיקרוליטר של PBS. ניתוח בציטומטר או במכשיר דומה.
2. ניתוח צביעה אימונופלואורסצנטית (IF)
   1. עבור תרביות תאי לב דו-ממדיות, זרעו את שני סוגי התאים בנפרד על 1:80 MGFr או 0.1% ג'לטין מצופה מראש מערכת באר תא תרבית מבוססת שקופיות. צלחת כ-80,000 תאים^/סמ "ר כדי להגיע למספיק מפגש תאים לניתוח. עבור רקמות מיני תלת מימדיות, העבירו אותן בעדינות בעזרת פינצטה לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 2 מ"ל.
   2. השליכו את מדיום התא ושטפו תאים או רקמות עם PBS פעמיים. תקן את הדגימות עם 10% פורמלין (v/v) ב-RT; 15 דקות לתא שקופיות ושעה אחת למיני רקמות.
      זהירות: פורמלין מסוכן בשאיפה ויש לטפל בו במכסה אדים.
   3. השלך את מאגר הקיבוע ושטוף 5 דקות עם PBS שלוש פעמים. אחסן את הדגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ב-PBS עד לשימוש בהן.
   4. כדי לחדור את קרום התא, דגרו את התאים עם 0.1% Triton X-100 (v/v) למשך 10 דקות או רקמות תלת מימד עם 1% Tween-20 למשך 15 דקות ב-RT. לאחר מכן, שטפו 5 דקות עם PBS שלוש פעמים.
   5. כדי להפחית קשירת נוגדנים לא ספציפיים, טפל בדגימות בתמיסת אלבומין בסרום בקר (BSA) של 3% (v/v) למשך 30 דקות ב-RT.
   6. הכן תמיסות נוגדנים ראשוניות ב-PBS בתוספת 1% BSA כדי לחסום קשרים לא ספציפיים ולדגור אותם למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
      1. עבור hiPSC-CMs דו-ממדיים, השתמש בדילול של 1/400 של נוגדן עכבר אנטי-לבבי α-ACTN (אקטינין סרקומרי). עבור רכיבי hiPSC-CF דו-ממדיים, השתמש בדילול 1/500 של נוגדן עכבר Anti-DDR2. עבור רקמות תלת מימד, שלב את שני הנוגדנים הספציפיים ל-CM ו-CF.
   7. למחרת, שאפו את תמיסת הנוגדנים ובצעו 3 שטיפות עם PBS ב-RT, 5 דקות כל אחת.
   8. יש לדלל את הנוגדנים המשניים (Alexa-Fluor 488 ו-Alexa-Fluor 594) ב-1/200 ולדגור למשך שעה אחת ב-RT בחושך כדי לזהות נוגדנים ראשוניים של עכבר וארנב, בהתאמה. חזור על שטיפת ה-PBS שלוש פעמים.
   9. כדי להכתים את הגרעינים, דגרו דגימות עם דילול של 1/500 של 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) למשך 20 דקות ב-RT בחושך. חזור על שטיפת ה-PBS שלוש פעמים ואחסן את הדגימות ב-4 מעלות צלזיוס ב-PBS.
   10. לבחון את הדגימות במיקרוסקופ קונפוקלי, לרכוש תמונות ולעבד אותן בתוכנה מתאימה כמו פיג'י.
   11. עבור רקמות מיני תלת מימד, העבירו אותן בזהירות עם PBS בין שני כיסויי זכוכית כדי לאפשר הדמיה טובה.
       הערה: מומלץ לטבול בשמן פי 40 או מטרה גבוהה יותר כדי להשיג תמונות Z-stack ברזולוציה גבוהה.
3. ניתוח כדאיות תאים
   הערה: מבחן Alamar Blue (AB) משמש למדידת פעילות מטבולית של תאים, הקשורה ישירות לכדאיות התאים ברקמות מיני לב תלת מימדיות. בצע את כל התהליך תוך הגנה על דגימות מפני אור ובתנאים סטריליים.
   1. הכן תמיסת AB של 10% (v/v) במדיום RPMI 1640 ללא אדום פנול (מכיוון שהוא עלול להפריע למדידה קולורימטרית).
   2. העבירו בזהירות רקמות מיני לב לצלחת של 48 בארות עם פינצטה סטרילית. דגירה של מבנים עם 300 מיקרוליטר של תמיסת AB לרקמה למשך שעה ו-30 דקות (התאם את הזמן בניסוי) ב-37 מעלות צלזיוס.
      הערה: כאשר תאים מפחיתים רזזורין באמצעות פעולת אנזימים מטבוליים, ייווצר שינוי צבע במדיום התרבית, אשר יימדד על ידי ספקטרופוטומטריה ב-570 ננומטר ו-600 ננומטר.
   3. למדידה, אסוף 100 מיקרוליטר לרקמה של תמיסת ה-AB המטבולית בצלחת של 96 בארות וקרא ספיגות.
      הערה: ניתן לתרבית דגימות לאחר ניתוח זה על ידי שינוי המדיום למדיום תחזוקת רקמות פעם נוספת.
4. ניתוח התכווצות
   הערה: רקמות מיני לב מתחילות לפעום באופן ספונטני, בדרך כלל 1-2 ימים לאחר יצירת הרקמות.
   1. מדוד ידנית את תדירות הפעימות על ידי התבוננות ברקמות תחת המיקרוסקופ האופטי (פעימות לדקה). אם נמדדות רקמות רבות בו זמנית, שמור על הצלחות חמות לפני כל קריאה.
      הערה: ככל שהטמפרטורה יורדת, גם קצב ההכאה מתחיל לרדת.
   2. להערכת התכווצות לב מורחבת, השג סרטוני מיקרוסקופיה אופטית של הרקמות הפועמות. ב-4x כדי ללכוד מישור גדול יותר או ב-10x מאזורי רקמה שונים. הקלט בסביבות 30 שניות לסרטון (לפחות 3 פעימות).
   3. השתמש בקצב פריימים של לפחות 30 פריימים לשנייה ושמור את הסרטון בפורמט .AVI.
      הערה: כאן, סרטונים נותחו עם אלגוריתם נקודת מעקב מותאם אישית שפותח עבור MATLAB¹⁰. בשיטה זו ניתן להשיג את מהירות ההתכווצות, התזוזה המקסימלית של ההתכווצות (משרעת) וכיוון ההתכווצות עבור כל סרטון.
   4. הפעל ישירות את האלגוריתם ב-MATLAB עבור הסרטונים הכלולים בתיקיית הניתוח. הוא יספק אוטומטית מסמך תוצאות Excel עם הערכים של מהירות התכווצות למסגרת, משרעת התכווצות למסגרת, זווית כיווץ (כיוון) וסטיות התקן בהתאמה¹⁰.
   5. הכפל את 'מהירות ההתכווצות לפריים' ברזולוציית המצלמה (מיקרומטר/פיקסל) ובקצב הפריימים של המצלמה (פריימים/שניות). זה ייתן את הערך הסופי של מהירות ההתכווצות (מיקרומטר לשנייה).
   6. הכפל את 'משרעת ההתכווצות למסגרת' ברזולוציית המצלמה (מיקרומטר/פיקסל), וזה ייתן את הערך הסופי של משרעת ההתכווצות (מיקרומטר).
      הערה: ניתן יהיה לנתח קינטיקה של כיווץ לעומק באמצעות תוכנה כגון MUSCLEMOTION, כפי שנדון במקום אחר^19,20. מערך ההדמיה חייב ללכוד לפחות 60 פריימים לשנייה לניתוח עם התוכנה.

אפיון תאי לב שמקורם ב-hiPSC דו-ממדיים
על מנת ליצור רקמות לב מולטי-פנוטיפיות, hiPSC-CMs ו-hiPSC-CFs מובחנים באופן עצמאי ומאופיינים במבחנה. עם אופטימיזציה מתאימה ותחזוקה קפדנית, הפרוטוקול הבא יביא לתפוקת hiPSC-CMs של מעל 80% בסביבות היום התשיעי של ההתמיינות, מה שיוביל לתאים פועמים באופן ספונטני (איור 1A). יתר על כן, העשרת טוהר על ידי ברירה מטבולית מבטלת במידה רבה את ה-non-hiPSC-CMs, וכתוצאה מכך תרביות המורכבות מיותר מ-90% מהתאים המבטאים חלבון טרופונין לבבי (cTNT+) ביום ה-21 (איור 1B). חד-שכבות פעימות חזקות אלה מראות ביטוי של חלבון האקטינין הסרקומרי המתכווץ (ACTN) על ידי צביעת IF (איור 1C, D).

מצד שני, הצלחתו של פרוטוקול זה מסתמכת על יצירת פיברובלסטים ספציפיים ללב באמצעות אינדוקציה במצב אפיקרדיאלי ביניים. כאן, לאחר הפעלה מחדש של איתות Wnt על ידי CHIR, תאי אפיקרדיאלים מתקבלים ביום 8 מאבות מזודרם לבביים (איור 2A). hiPSC-EpiCs אלה הם תאים גדולים המקובצים למושבות בודדות, שכאשר מצפים מחדש עם מדיום פיברובלסטים, מולידים תאי פיברובלסטים לבביים עם מורפולוגיה בצורת ציר (איור 2C). לפיכך, לאחר 18 ימים של התמיינות, hiPSC-CFs מציגים למעלה מ-90% ביטוי של DDR2 על ידי ניתוח FACS (איור 2B). קולטן הקולגן הזה, שמאופיין כסמן CF, ניתן להבחין בו גם על-ידי צביעת IF (איור 2D).

איור 1: ציר הזמן של התמיינות hiPSC-CMs ואפיון אימונופלואורסצנציה וזרימה ציטומטרית. (A) התוכנית הכוללת של התמיינות של CMs הנגזרת מ-hiPSCs ושלבי טיהור. (B) כימות ציטומטריית זרימה של טוהר hiPSC-CMs (אחוז תאי cTNT+ ) ביום 21. (C) תמונת ניגודיות פאזה מייצגת של תאים לאחר שלבי הטיהור (יום 21). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (D) תמונה קונפוקלית של hiPSC-CMs מובחנים לחלוטין מוכתמים ב-ACTN (ירוק) וגרעינים מוכתמים ב-DAPI (כחול). סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ציר הזמן של התמיינות hiPSC-CFs ואפיון אימונופלואורסצנציה וזרימה ציטומטרית. (A) התוכנית הכוללת של התמיינות CFs שמקורם בתאי hiPSC-אפיקרדיאלים. (ב) כימות ציטומטריית זרימה של טוהר hiPSC-CFs (אחוז מתאי DDR2+ ) ביום 18 ותמונת ניגודיות פאזה מייצגת של התרבית (C); סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (D) תמונה קונפוקלית של hiPSC-CFs מוכתמים ב-DDR2 (ירוק) וגרעינים מוכתמים ב-DAPI (כחול). סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דור פיגומי PCL על ידי MEW
התכונות המכניות של הפיגומים נקבעות על פי המספר הכולל של השכבות, צפיפות הסיבים, הקוטר, ההתפלגות וגיאומטריית הנקבוביות. אלה היבטים בסיסיים שיכולים להשפיע מאוד על התנהגות התאים. לאחר הקמתו, הגדרת הציוד (איור 3A) ובהתאם להגדרות ההדפסה המתוארות בפרוטוקול זה (7 kV, מרחק אספן 10 מ"מ, 2 בר, ראש/זרבובית 80/65 °C, מהירות אספן 1080 מ"מ לשנייה וקצה מזרק 23 G), נוצרו פיגומים מרובעים של 15 שכבות עם גיאומטריית נקבוביות מרובעת של 500 מיקרומטר x 500 מיקרומטר (איור 3B). סיבי PCL הופקדו שכבה אחר שכבה בצורה נכונה, והציגו קוטר סיבים של כ-15 מיקרומטר.

איור 3: ציוד MEW וייצור פיגומים סיביים. (א) הגדרת MEW (i) ותוכנת Mach3 (ii); מבט על ראש המדפסת ולוחית האספן (iii), והיווצרות חרוט טיילור במהלך ההדפסה (iv). (B) תמונות ניגודיות פאזה של הפיגומים המרובעים הסיביים (i) והגברה של שקיעת הסיבים המדויקת (ii). סרגל קנה המידה = 250 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

אפיון פונקציונליות של רקמת מיני לב תלת מימדית
לאחר דיסוציאציה של תא בודד, תערובת התאים המורכבת מ-8:2 hiPSC-CMs:hiPSC-CFs נזרעו בתוך הידרוג'לים של פיברין על פיגומי MEW PCL (איור 4A). לאחר שעה אחת של דגירה ב-37 מעלות צלזיוס, פיברין נוצר ביציבות, עם תאים המפוזרים באופן אחיד בכל הג'ל, ומכסים את כל נקבוביות הרשת (איור 4B). זה חשוב מכיוון ש-hiPSC-CMs הם לרוב לא מיטוטיים, ולא ניתן להסתמך על צמיחת תאים כדי למלא את הנקבוביות כמו בסוגי תאים אחרים. התאים העידו על עיצוב מחדש מהיר של המטריצה שמסביב על ידי התארכות התאים, עם פעימה ספונטנית מקומית כבר יומיים לאחר הציפוי. ניתוח צביעת IF הראה פיזור תאים מעורב של התאים לאורך הג'ל, באינטראקציה עם רשת PCL, כאשר רוב ה-CMs (ACTN+ VIM-) מרווחים עם VIM+ ACTN- hiPSC-CFs. hiPSC-CMs מציגים מבנה סרקומר מאורגן היטב המסומן על ידי צביעת חלבון ACTN במרווחים קבועים (איור 4C). רקמות לב של מיליון תאים הראו התכווצות יציבה לאורך כל הרשת, עם תדירות פעימות של כ-30 פעימות בדקה ביום השביעי (28.93 ± 11.2, ממוצע ± SD). יכולת תפקודית זו נשמרה לאורך כל ימי התרבית, עם ירידה קטנה עד היום ה-14 (17.18 ±-12.6, ממוצע ±-SD) (איור 4D). בעת ניתוח פעילות מטבולית, רקמות הראו ששומרות על כדאיות התאים לאורך כל התרבית, ללא שינויים משמעותיים, כאן נותח כיום 7 לעומת . יום 14 (איור 4E). לבסוף, ניתוח נקודת המעקב של הרקמות לאחר שבוע אחד הראה מהירות התכווצות של 38.53 מיקרומטר לשנייה ± 19.8 (ממוצע ± SD, n=16) ומשרעת התכווצות של 28.91 מיקרומטר ±-15 (ממוצע ± SD, n=16) (איור 4F).

איור 4: יצירת מיני רקמות לב תלת-ממדיות אנושיות ואפיון מבנה הרקמה, הפונקציונליות והכדאיות של התאים. (A) התוכנית הכוללת של יצירת רקמות המשלבת תאי לב שמקורם ב-hiPSC, פיגומים מודפסים MEW ואנקפסולציה של פיברין הידרוג'ל. (B) תמונות ניגודיות פאזה מייצגות של רקמות מיני פועמות. סרגל קנה מידה = 250 מיקרומטר. (C) תמונת מחסנית Z קונפוקלית של ארגון רקמות תלת מימדיות; hiPSC-CMs מוכתמים ב-ACTN (ירוק), hiPSC-CFs מוכתמים ב-VIM (אדום), וגרעינים מוכתמים ב-DAPI (כחול). רשת MEW מסומנת על ידי ראשי חצים. סרגל קנה מידה = 250 מיקרומטר. (D) התפתחות קצב הפעימות של הרקמות מדור ליום 14. הנתונים מיוצגים כממוצע עם SD של N = 3, n = 2-4. (E) כדאיות התאים (מנותחת על ידי פעילות מטבולית) של רקמות בין הימים 7 ל-14. הנתונים מיוצגים כממוצע עם SD של N = 3, n = 3-6. (F) ניתוח התכווצות של רקמות מיני לב פועמות באופן ספונטני לאחר שבוע אחד. מהירות ההתכווצות (מיקרומטר לשנייה) ומשרעת ההתכווצות (מיקרומטר) מיוצגות כממוצע עם SD (n = 16). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

למחברים אין ניגודי אינטרסים.