מאמר שיטה

מדידת זרימה-ציטומטריה בתפוקה גבוהה של מכאנוטיפ תאי המבוססת על קרע ואספקה של בדיקות מתח DNA לתאים

DOI:

10.3791/67852

⸱

13 ביוני 2025

 , 
1College of Biological Sciences, University of Minnesota

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה זו מודדת את נטייתו של התא לקרוע דופלקסים משותקים של DNA המציגים ליגנד כדי לדווח על כוחות משיכה תאיים יחסיים. אוליגואים פלואורסצנטיים קרועים מועברים לתא ומנותחים על ידי ציטומטריית זרימה, ומתעדים את ההיסטוריה המכנית של התא. זה מאפשר מדידה בתפוקה גבוהה של יצירת כוח סלולרי בהקשר של מכנינוטיפ תאי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כוחות מכניים מנחים תהליכים תאיים קריטיים רבים, ופנוטיפ מכני תאי, או מכנוטיפ, מופרע במחלות רבות. השיטה הנפוצה ביותר לכימות כוחות תאיים היא מיקרוסקופ כוח משיכה, הלוכד באופן מסורתי את הכוחות שהתאים מפעילים על סביבתם על ידי מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה של תאים המעוותים מצעים אלסטיים המכילים חרוזים פלואורסצנטיים, הסטת מיקרו-פוסטים או שינוי הקונפורמציה של חיישני מתח מולקולרי משותקים. אנו מציגים כאן שיטה בעלת תפוקה גבוהה למדידת כוחות משיכה תאיים יחסיים באמצעות בדיקות מתח DNA מבוססות וכימות באמצעות ציטומטריית זרימה. ישנם חמישה שלבים כלליים המעורבים בשיטה זו המתוארים להלן. ראשית, ביטוי וטיהור של אינטגרין ליגנד אכיסטטין בעל זיקה גבוהה התמזג לתג HUH המקשר ל-DNA; שנית, הכנת בדיקות דופלקס DNA המכילות כתבים וליגנד; שלישית, הכנת פני השטח וקיבוע בדיקות; רביעית, ביצוע ניסוי "קרע ומסירה" של מד מתח-קשירה וקריאת זרימה. לבסוף, נתאר ניתוח נתונים ופרשנות של תוצאות ניסויים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כוחות מכניים מנחים תהליכים תאיים קריטיים רבים, החל מנדידה1 להתמיינות תאי גזע2 ועד ליכולתו של תא T להיקשר לתא האנטיגןהנכון 3 ולהיות מופעל על ידו. משתנים מכניים אינם מווסתים במחלה וכתוצאה מכך הבדלים מדידים בפנוטיפ המכני התאי, או המכנוטיפ, של תאים 4,5. מכאנוטיפ הוא מונח גג לתכונות המכניות של תאים ורקמות ויכול לכלול פרמטרים כמו התכווצות, נדידה, הידבקות ועיוות. נוקשות תאים או רקמות היא ההיבט השכיח ביותר של המכאנוטיפ הנמדד מכיוון שניתן למדוד אותו בתפוקה גבוהה. לדוגמה, תאים סרטניים הם לרוב נוקשים יותר מתאים רגילים בעוד שתאים גרורתיים לרוב תואמים יותר 6,7. יצירת כוח על ידי תאים היא היבט חשוב של המכנוטיפ שהשתנה במחלה8 מכיוון שהוא בודק אינטראקציות ספציפיות בין תא לסביבה. מיקרוסקופ כוח משיכה הוא השיטה הנפוצה ביותר למדידת ייצור כוח תאי וכולל ציפוי תאים על מצעים אלסטיים מעוותים המשובצים בחרוזים פלואורסצנטיים או על מערכים של מיקרו-פוסטים ומעקב אחר שינויים בתנועת החרוזים או בסטייה לאחר כדי לחשב את הכוחות המופעלים על ידי תאים. חיישני מתח מולקולרי שימשו גם למדידת כוחות משיכה ומציעים את היתרון של רגישות לגדלים קטנים יותר של כוח וכוחות מדידה הנוצרים על ידי זוגות קולטני ליגנד ספציפיים 9,10. עם זאת, מדידת כוחות סלולריים עם חיישני TFM ומתח מולקולרי מסורתיים מסתמכת על הדמיה ברזולוציה גבוהה, מה שמגביל את תפוקת המדידה.

לאחרונה התאמנו בדיקות מתח DNA-דופלקס לקריאת תפוקה גבוהה של יצירת כוח תאי בהקשר של מכנינוטיפ תאי11 (איור 1). בקצרה, דופלקסי DNA המותאמים מבדיקות מד המתח (TGT)12 המשותקות בבארות של לוחות 96 בארות באמצעות כימיה של ביוטין-נייטרווידין של גדיל "העוגן"13. ניתן לכוונן את כוח הקרע הנדרש של דופלקסי TGT על ידי שינוי מיקום הביוטין על גדיל העוגן, מה שמשנה את הגיאומטריה של הדופלקס וכתוצאה מכך קונפורמציה של שחרור רוכסן כוח קרע נמוך (איור 2A) או קונפורמציה של גזירה בכוח קרע גבוה (איור 2B). גדיל העוגן מכיל ביוטין ומרווה פלואורסצנטי, בעוד שגדיל ה"ליגנד" של ה-DNA מכיל בדיקה פלואורסצנטית וליגנד המזהה קולטן פני תא המעורב בחישה מכנית כגון אינטגרין. הליגנד מקושר קוולנטית לדנ"א (איור 3) באמצעות שימוש בתג היתוך מקשר דנ"א שנקרא תג HUH שהתמזג לליגנד14,15. תגי HUH הם תחומים קטנים של אנדונוקלאז HUH המעורבים בשכפול ויראלי ותהליכים אחרים המזהים רצף/מבנה של 9 bp של DNA חד-גדילי, חותכים אותו ויוצרים תוספת פוספוטירוזין קוולנטית לקצה 5' של ה-DNA המנופח.

תאים המצופים על גבי בדיקות אלה נקשרים לליגנד וקורעים אחוז מהבדיקות ביחס לכוחות שהם מייצרים. גדיל הליגנד הפלואורסצנטי הקשור לקולטן שלו מועבר לאחר מכן לתא. לפיכך, ההיסטוריה המכנית של התאים נרשמת בתאים המעניינים באמצעות גודל הקרינה שלהם. ניתן לכמת את הקרינה באמצעות ציטומטריית זרימה. אנו קוראים לשיטה זו Rupture and Deliver-TGTS או RAD-TGTs. שיטה זו לא רק מודדת את הקרינה ובכך את הכוח היחסי שנוצר על ידי אלפי תאים בבת אחת, אלא גם קריאת ציטומטריית הזרימה מציעה את הפוטנציאל של מיון התאים לפי המכנוטיפ שלהם, מה שמאפשר קריאות אומיקס במורד הזרם, כמו גם CRISPR-KO או מסכי תרופות שעשויים לזהות גנים או תרופות המשנים את המכנוטיפ התאי.

בפרוטוקול שלהלן, אנו מדגימים כיצד להכין ולבצע ניסוי RAD-TGT. נדגיש את הביטוי והטיהור של סוג של HUH המכונה WDV (מווירוס גמד חיטה) בפני עצמו כדי לשמש כבקרה שלילית ולהתמזג לאכיסטטין, ליגנד הקושר היטב משפחה של קולטני הידבקות המעבירים כוח בין התא לסביבה המכונה אינטגרינים קושרי RGD, כדי לשמש כתנאי ניסוי. מכאן, נדגים כיצד להכין RAD-TGTs לשימוש ניסיוני. נסביר כיצד להמשיך בניסויים וכיצד לנתח את הנתונים המתקבלים. אנו גם נדגיש יישום של RAD-TGTs על ידי מדידת האופן שבו מעכב ROCK משנה כוחות מתווכים באינטגרין בתאי CHO-K1 (איור 4). לסיכום, אנו מקווים שפרוטוקול זה ישמש ככניסה למכניביולוגיה ללא קשר לניסיון קודם; התחום נמצא בשלב ההתחלתי שלו וכל הרקעים חיוניים להבנה נוספת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ביטוי וטיהור HUH

  1. טרנספורמציה של Escherichia coli עם פלסמיד WDV (± Echistatin), כ-1.5 מיקרוליטר של ~50 ננוגרם/מיקרוליטר פלסמיד לכל טרנספורמציה, ולגדול על לוחות אגר אמפיצילין.
  2. יש לחסן 5 מ"ל LB עם מושבה אחת ולגדל למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  3. יש לחסן 1 ליטר של LB בתרבית הלילה ולגדל עד ש-OD600 מגיע ל-~0.8.
  4. הורד את הטמפרטורה ל-18 מעלות צלזיוס, השרתה עם איזופרופיל 500 מיקרומטר β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), ודגירה למשך הלילה.
  5. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב -3,750 × גרם למשך 30 דקות. השהה מחדש את הגלולה עם 40 מ"ל של מאגר ליזה (300 מ"מ NaCl, 50 מ"מ Tris pH 7.5, 1 מ"מ EDTA).
  6. ליזה את התאים עם סוניקציה של 3 x 90 שניות על קרח במחזור עבודה של 70%, הספק 7. יש לסובב בטמפרטורה של 24,000 × גרם למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולשפוך את הסופרנטנט לתוך צינור חדש של 50 מ"ל.
  7. הכניסו תמיסת שרף Ni-NTA לצינור חרוטי של 15 מ"ל (1 מ"ל של תרחיף חרוזים/ליטר תרבית), סובבו ב-700 × גרם למשך 2 דקות והוציאו את הסופרנטנט.
  8. הוסף 6 מ"ל מים לשרף וחזור על תהליך הכביסה בשלב 1.7.
  9. חזור על הכביסה פעמיים עם מאגר כביסה (300 מ"מ NaCl, 50 מ"מ טריס [pH 7.5], 1 מ"מ EDTA, 20 מ"מ אימידזול) במקום מים. השעו מחדש את החרוזים ב -5 מ"ל של מאגר כביסה.
  10. הוסף את תמיסת החרוזים (שלב 1.9) לתאים הליזה (שלב 1.6) וערבב היטב. סובב את התאים והחרוזים הליזים למשך שעה לפחות ב-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: למשך שארית פרוטוקול זה, לעולם אל תתנו לשרף להתייבש ואספו את כל הדגימות הזורמות דרך העמודה.
  11. יוצקים את התערובת על עמוד של 20 מ"ל ואוספים את הזרימה. שטפו את העמוד עם 4 x 25 מ"ל של מאגר כביסה.
  12. יש לשטוף עם 1 x 10 מ"ל של מאגר פליטה (300 מ"מ NaCl, 50 מ"מ טריס [pH 7.5], 1 מ"מ EDTA, 250 מ"מ אימידזול) לתוך צינור טרי של 15 מ"ל, לאסוף פליטה מוקדמת ומאוחרת בנפרד (פליטה מוקדמת היא 1 מ"ל הראשונה, פליטה מאוחרת היא 1 מ"ל האחרון).
  13. נתח את כל השברים שנאספו באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE) כדי להבטיח שה-HUH נאסף במהלך הפליטה (ראה איור משלים S1). לקבלת התוצאות הטובות ביותר, טען ג'ל 4-20% והפעל אותו במשך 45 דקות ב-35 וואט ו-200 וולט.
  14. הוסף את החלבון המופשט לצינורות דיאליזה ודגר למשך הלילה במאגר דיאליזה (זהה למאגר ליזה) ב-4 מעלות צלזיוס. כדי להסיר את תג ה-HIS, הוסף ULP1 ללא חומר הפחתה ישירות לחלבון המנוקה לפני הכנסת החלבון לצינור הדיאליזה.
  15. למחרת בבוקר, הכינו שרף Ni-NTA כמתואר בשלבים 1.7-1.9 ודגרו עם החלבון הדיאליזה. יוצקים את תערובת החלבון ושרף Ni-NTA לעמודה ואוספים את הזרימה. שטפו את העמוד עם 10 מ"ל של מאגר דיאליזה ואספו כל זרימה.
  16. העריכו את השבר שנאסף ב-SDS-PAGE בהתאם להגדרות לעיל כדי לוודא שהחלבון קיים, והתרכזו לריכוז הרצוי באמצעות מסנן אולטרה-צנטריפוגלי של 15 מ"ל עם חתך משקל מולקולרי של 10 kDa (ראה איור משלים S1).
    הערה: ריכוז החלבון הסופי האידיאלי הוא בין 40 מיקרומטר ל-100 מיקרומטר.

2. הכנת RAD-TGT

  1. הרכיבו דופלקסים ביחס מולארי של 1.1:1 של גדיל עוגן (עם מרווה) לגדיל ליגנד (עם פלואורופור) בריכוז סופי של 40 מיקרומטר גדיל ליגנד בתמיסה של 10 מ"מ טריס (pH 7.5), 50 מ"מ NaCl ו-1 מ"מ EDTA.
  2. חישול על ידי דגירה ב-98 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ואחריה קירור בטמפרטורת החדר למשך שעה; הגן מפני אור.
    הערה: דגימות בנפח נמוך מתאדות בקלות ויכולות להיות קשות לשחזור מלא. הכן נפח גדול מהנדרש.
  3. להגיב את הדופלקסים המחוסמים עם HUH (תוך שימוש בריכוז הגדיל הכי פחות שופע בעת חישול; במקרה זה, גדיל הליגנד) ביחס מולארי של 1:2 בריכוז סופי של דופלקס 10 מיקרומטר ו-20 מיקרומטר HUH בתמיסה המכילה 1 מ"מ MnCl2, 50 מ"מ HEPES (pH 8), 50 מ"מ NaCl.
  4. דגרו את התגובה למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס במחזור תרמי או בלוק חום מוגן אור. לאחר הדגירה, הסר מהאש והשתמש במיניפוגה עליונה כדי לסובב את ה-TGTs שהורכבו כעת. או צלחת את ה-TGTs מיד או אחסן ב-4 מעלות צלזיוס בחושך.

3. הכנת משטח

  1. מיד עם פתיחת צלחת תחתונה מזכוכית של 96 בארות, יש לכסות את כל הבארות בנייר כסף דביק כדי לשמר בארות שאינן בשימוש לשימוש מאוחר יותר. השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את נייר הכסף מעל הבארות המעניינות (רצוי בארות ללא קצה) והוסף 100 מיקרוליטר PBS קר לבארות הרצויות.
    הערה: לאחר הוספת נוזלים לבארות, אל תתנו לבארות להתייבש. אם מתרחש ייבוש, ספיחה לא ספציפית של ביומולקולות לפני השטח תשפיע לרעה על הנתונים. שמור 100 מיקרוליטר של נפח עודף ברציפות בבאר כדי למנוע ייבוש.
  2. מוסיפים 200 מיקרוליטר PBS קר לבארות, מערבבים בעדינות פיפטה פי 2-5 ומסירים 200 מיקרוליטר PBS. חזור על הפעולה בסך הכל שלוש כביסות.
    הערה: בעת הוספה והוצאה של נוזלים מהבארות, שמור את קצה הפיפטה על קצה הבאר בזווית של 45 מעלות כדי למנוע הפרעה למשטח. עשה זאת עבור כל הטיפול בצלחת למעט בעת ציפוי תאים.
  3. עבור בארות ניסוי, הכינו תמיסה של 0.1 מ"ג/מ"ל Biotinylated-BSA ב-PBS והוסיפו 80 מיקרוליטר מהתמיסה לבארות הרצויות. עבור בארות בקרה, הכינו את אותה תמיסה בתוספת של 18.75 מיקרוגרם/מ"ל פיברונקטין והוסיפו 80 מיקרוליטר לבארות המתאימות. פיפטה מערבבים בעדינות את כל הבארות המשמשות, מניחים את המכסה על הצלחת ומכסים בנייר כסף. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה.
  4. הסר 80 מיקרוליטר נפח מהבארות ושטוף את הבארות על ידי חזרה על שלב 3.2. הוסף 80 מיקרוליטר של 0.1 מ"ג/מ"ל נויטראוודין בתמיסת PBS באותו אופן כמו שלב 3.3.
  5. לאחר הדגירה, הסר 80 מיקרוליטר נפח מהבארות וחזור על שלב 3.2. לדלל את ה-TGTs המורכבים (שלב 2 של הכנת RAD-TGT) ל-0.1 מיקרומטר בתמיסה PBS ו-80 מיקרוליטר לבארות באופן דומה לשלב 3.3. או לכסות את הבארות בנייר כסף דבק ולאחסן בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס או להגן מפני אור ולדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת לפני שתמשיך בניסויים.
    הערה: אנו ממליצים להתייחס לשלב 3.5 כנקודת עצירה ולהמתין עד למחרת כדי להמשיך בניסויים.

4. פרוטוקול ניסוי RAD-TGT

  1. לאחר של-TGTs היה מספיק זמן להיצמד, שטפו את הבארות (ראה שלב 3.2) פי 3 עם PBS, ולאחר מכן שתי שטיפות עם מדיה נטולת סרום. השאירו את התקשורת בבארות לאחר הכביסה הסופית. הוסף 200 מיקרוליטר PBS לבארות ההיקפיות כדי להפחית את השפעות הקצה ולהעביר את הצלחת לחממה של 37 מעלות צלזיוס כדי לחמם את הצלחת מראש.
  2. אחזר את התאים המעניינים במפגש ~80%, ושאף את המדיה ואחריה הוספה ושאיפה של PBS לשטיפת התאים. מוסיפים נפח מתאים של טריפסין ומניחים את הצלחת באינקובטור תרבית תאים של 37 מעלות צלזיוס עד שהתאים מתנתקים (~5-10 דקות).
  3. לאחר ניתוק התאים, הוסף את הנפח המקורי של מדיה תאית שלמה המשמשת לשמירה על תאים לצלחת והשעיה מחדש עם פיפטה סרולוגית. הוסף את מתלה התא לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
  4. צנטריפוגה של התאים ב-300 × גרם למשך 4 דקות, שואבים את המדיה ומשהים מחדש את הגלולה ב-PBS. חזור על צנטריפוגה ושאיפה, ולאחר מכן השהה מחדש ב-5 מ"ל של מדיה נטולת סרום וחזור על צנטריפוגה ושאיפה. השעו מחדש את התאים ב~2 מ"ל של מדיה נטולת סרום.
  5. קבע את צפיפות התאים התלויים והתאם את הריכוז כרצונך.
    הערה: אנו שואפים לצלחת ~15,000 תאים לבאר כך שאנו מכינים את התאים להיות בריכוז של 150,000 תאים/מ"ל, מה שמאפשר ציפוי של 15,000 תאים ב-100 מיקרוליטר של תאים תלויים.
    1. אופציונלי: אם יש לבדוק את ההשפעה של תרופות או חומרים פרמקולוגיים אחרים, הוסף את הריכוז המתאים של התרופה לתאים והחזיר את התאים לחממה. אפשר זמן טרום דגירה מספיק לפני שתמשיך לשלב הבא.
  6. אחזר את הצלחת מהחממה (שלב 4.1) והסר את נפח המדיה שנותר מהשטיפה מבארות הניסוי בצלחת המחוממת מראש. יש לשטוף פעם אחת עם המדיה הרצויה. פיפטה בזהירות 100 מיקרוליטר מהתאים התלויים לבארות הרצויות. העבירו את התאים המצופים לחממה למשך 90 דקות.
    הערה: פיפט את התאים למרכז הבארות בעדינות, מנסה לשמור על הפיפטה אנכית.
  7. לאחר הדגירה, הסר ~125-170 מיקרוליטר נפח מהבארות. במידת הצורך יש לשטוף את התאים בעדינות עם 200 מיקרוליטר PBS מחומם. מוסיפים 50 מיקרוליטר טריפסין לכל באר ומחזירים את הצלחת לחממה עד שהתאים מתחילים להתנתק (5-10 דקות).
    הערה: ודא שהבאר לעולם לא מתייבשת וכי לא מתרחשת ניסיון יתר.
  8. הוסף 160 מיקרוליטר של מאגר זרימה טרי שהוכן (1 מ"מ EDTA, 2% אלבומין סרום בקר, ב-PBS קר) לבארות. פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים, להוסיף 196 מיקרוליטר של תרחיף תאים זה לצינורות PCR ואחריהם 4 מיקרוליטר של פרופידיום יודיד, ולערבב בעדינות. הכן דגימת בקרה אחת ללא פרופידיום יודיד כדי לשמש כבקרה לשער כדאיות.
  9. הניחו את הצינורות בדלי קרח כשהמכסה חוסם את האור והמשיכו למדוד את עוצמת הקרינה בעזרת ציטומטר זרימה.

5. איסוף וניתוח נתונים

  1. נתח כל דגימה בעזרת ציטומטר זרימה. שאפו לאסוף לפחות 2,000 תאים בודדים חיים לכל דגימה.
    הערה: צמצם את החשיפה לאור עבור דגימות שטרם נותחו ושמור על קרח.
  2. לאחר איסוף כל הנתונים, העבירו את הקבצים לתוכנה לבחירתכם ושדרו את התאים.
    1. שער לתאים לפי אזור פיזור קדימה (FSC-A) לעומת אזור פיזור צדדי (SSC-A).
    2. שער לסינגלטים בתוך אוכלוסיית התאים לפי FSC-A לעומת גובה פיזור קדימה (FSC-H).
    3. שער לתאים חיים מאוכלוסיית הסינגלט על ידי הגדרת שער אנכי על ההיסטוגרמה של עוצמת שטח הפרופידיום יודיד בערך הגבוה ביותר עבור בקרת ללא יודיד פרופידיום שהוכנה בשלב 4.8. כל האירועים שאינם חורגים מהשער הם תאים חיים
    4. הגדר שער אנכי על היסטוגרמה של עוצמת שטח Cy5 (Cy5-A) של הסינגלטים כדי להסיר כל אירוע שאינו פלואורסצנטי בערוץ Cy5-A הנגרם על ידי פסולת תאים. ודא שהשער האנכי הזה הוא בערך נמוך מהתאים הלא מסומנים שנותחו אך גדול מ-0 עוצמת פלואורסצנט.
    5. כדי לנתח אוכלוסיות תאים, הגדר שער ביסקטור באחוזוןה-99 של כל בקרה שלילית בהתאמה.
    6. החל שער באותה עוצמה כמו תנאי הניסוי המתאימים, ואסוף את אחוז התאים החורגים משער הבקרה השלילי עבור כל תנאי.
      הערה: ניתן להשוות אחוזים ישירות בין שכפולים ביולוגיים באמצעות ניתוח סטטיסטי מתאים; ראה נתונים מייצגים.
  3. לנתח את הנתונים באמצעות פלואורסצנציה חציונית Cy5, לחלק את העוצמה החציונית של ליגנד-WDV בחציון של ה-WDV בלבד ולהשוות ערכים אלה בין שכפולים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להדגים את התועלת וקלות השימוש ב-RAD-TGTs, ניתחנו את ההשפעות של מעכבי Rho Kinase (ROCK) על המכנוטיפ של תאי CHO-K1. מסלול ה-ROCK מעורב בארגון אקטין והפעלת מיוזין. מחקרים קודמים שהשתמשו ב-TGTs הראו כי עיכוב ROCK מפחית את הקרע של TGTs גזירה 16,17,18. TGTs גזירה או כוח גבוה מדווחים על כוחות התכווצות המופעלים באמצעות הידבקויות מוקדיות, בעוד ש-TGTs עם רוכסן או כוח נמוך רגישים לכוחות תאיים נמוכים יותר המעורבים בהדבקה הראשונית, התפשט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סיפקנו פרוטוקולים כיצד להגדיר ולבצע ניסויי RAD-TGT במטרה לעודד מדענים במדעי החיים לשלב מכני בזרימת העבודה שלהם. יתרון מרכזי של RAD-TGTs, במיוחד עבור אלה עם יכולות ייצור חלבון, הוא השימוש באנדונוקלאזות HUH כדי לקשור ליגנדים לדופלקס DNA בנאמנות גבוהה ללא כל קישור צולב ו/או טיהור כימי. אנדונוקלאזות HUH מקיפות משפחה של נוקלאזות הנקשרות ל-DNA חד-גדילי באופן ספציפי לאתר. HUHs מעניינים במיוחד, שכן לאחר הקשירה, הם מבקעים את עמוד השדרה של ה- DNA ויוצרים תוספת קוולנטית עם קצה 5' שנחשף לאחרונה. תגו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W.R.G. מכיר במימון מה-NIH R35GM119483. Biorender שימש ליצירת סכמות דמויות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
15 מ"ל צינור חרוטיSarstedt62.554.205
96 באר צלחת תחתונה מזכוכיתCellvisP96-1.5H-N
רדיד צלחת PCR דבקתרמו פישר מדעיAB-0626
AmpicillinApex Bioresearch Products 25-530
Bio-Rad 20 מ"ל עמודהBio-Rad7321010
Biotinylated BSAThermo Fisher Scientific29130
BL21 (DE3) מוסמך E. coliNew England BiolabsC2527H
סרום בקר אלבומיןתרמו פישרBP9703100
תרמופישר 51030284
צנטריפוגהתרמו פישר 75009521
מדעי CHO-K1ATCCCCL-61
צינורות דיאליזהתרמו פישרPI88242
DMSOתרמו פישר סיינטיפיקD12345
EDTAתרמו פישר מדעיS311-100
זרימה ציטומטרBDAccuri C6 פלוס
FlowJo BDFlowJo v10.10
HEPESThermo Fisher ScientificBP310-1
ImidazoleThermo Fisher ScientificO3196-500
IPTGIBI ScientificIB02125
LB agarFisher ScientificBP1425-500
מעמד ליגנדטכנולוגיות DNA משולבותבעיצוב המשתמש oligoGCT ATA AAC TCA CCG TAA TTT TTT GGC CCG CAG CGA CCA CCC TTT /3Cy5Sp/
Lysogeny Broth (LB)Thermo Fisher ScientificBP1426-500
MnCl2Thermo Fisher ScientificM87-100
NaClThermo Fisher ScientificBP358-212
NeutrAvidinProtein Thermo Fisher Scientific31000
Nickel-NTA שרף תרמו פישר סיינטיפיק88222
PBSקורנינג21-031-CV
צלחת פטריVWR25384-342
תמיסת יודיד פרופידיוםקיימןכימיקלים 10008351
ג'ל SDS-PAGEBio-Rad4561096
סרום מדיה ללא סרוםתרמו פישר מדעיA4124801Gibco Optimem בשימוש, מדיות אלטרנטיביות ללא סרום הן בסדר לשימוש
ב-Shear Anchor Strandטכנולוגיות DNA משולבותשתוכננו על ידי המשתמש oligo/5IAbRQ//iBiodT/G GGT GGT CGC TGC GGG CC
SonicatorThermo Fisher Scientific15-345-139
Thermal CyclerBio-Rad1861096
TrisThermo Fisher ScientificBP152-500
TrypinThermo Fisher Scientific12605036
מסנן אולטרה-צנטריפוגלי, חיתוך 10 kDaAmikon
Unzipping Anchor Strandטכנולוגיות DNA משולבותשתוכננו על ידי המשתמש oligo/5IAbRQ/GG GTG GTC GCT GCG GGC C/3Bio/
WDV פלסמידAddGene
פלסמידAddGene226985
Y-27632Selleck ChemicalsS1049משוחזר ב-DMSO
חממת תרבית תאים מדעיתמדעי 226983-WDV-Echistatin

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Puleo, J. I., et al. Mechanosensing during directed cell migration requires dynamic actin polymerization at focal adhesions. J Cell Biol. 218 (12), 4215-4235 (2019).
  2. He, L., Ahmad, M., Perrimon, N. Mechanosensitive channels and their functions in stem cell differentiation. Exp Cell Res. 374 (2), 259-265 (2019).
  3. Feng, Y., et al. Mechanosensing drives acuity of αβ T-cell recognition. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (39), E8204-E8213 (2017).
  4. Kai, F., Laklai, H., Weaver, V. M. Force matters: Biomechanical regulation of cell invasion and migration in disease. Trends Cell Biol. 26 (7), 486-497 (2016).
  5. Chapman, M., Rajagopal, V., Stewart, A., Collins, D. J. Critical review of single-cell mechanotyping approaches for biomedical applications. Lab Chip. 24 (12), 3036-3063 (2024).
  6. Swaminathan, V., et al. Mechanical stiffness grades metastatic potential in patient tumor cells and in cancer cell lines. Cancer Res. 71 (15), 5075-5080 (2011).
  7. Graybill, P. M., Bollineni, R. K., Sheng, Z., Davalos, R. V., Mirzaeifar, R. A constriction channel analysis of astrocytoma stiffness and disease progression. Biomicrofluidics. 15 (2), 024103(2021).
  8. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS One. 7 (2), e32572(2012).
  9. Yasunaga, A., Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors. Phys Biol. 17 (1), 011001(2019).
  10. Liu, Y., Galior, K., Ma, V. P. -Y., Salaita, K. Molecular tension probes for imaging forces at the cell surface. Acc Chem Res. 50 (12), 2915-2924 (2017).
  11. Pawlak, M. R., et al. RAD-TGTs: high-throughput measurement of cellular mechanotype via rupture and delivery of DNA tension probes. Nat. Commun. 14 (1), 2468(2023).
  12. Wang, X., Ha, T. Defining single molecular forces required to activate integrin and notch signaling. Science. 340 (6135), 991-994 (2013).
  13. Jo, M. H., Cottle, W. T., Ha, T. Real-time measurement of molecular tension during cell adhesion and migration using multiplexed differential analysis of tension gauge tethers. ACS Biomater Sci Eng. 5 (8), 3856-3863 (2019).
  14. Tompkins, K. J., et al. Molecular underpinnings of ssDNA specificity by Rep HUH-endonucleases and implications for HUH-tag multiplexing and engineering. Nucleic Acids Res. 49 (2), 1046-1064 (2021).
  15. Lovendahl, K. N., Hayward, A. N., Gordon, W. R. Sequence-Directed Covalent Protein-DNA Linkages in a Single Step Using HUH-Tags. J Am Chem Soc. 139 (20), 7030-7035 (2017).
  16. Kim, K. A., Vellampatti, S., Hwang, S. H., Kim, B. C. DNA-based single molecule force sensor for characterization of α 5 β 1 integrin tension required for invadopodia formation and maturation in cancer cells. Adv Funct Mater. 32 (28), 2110637(2022).
  17. Wang, X., et al. Integrin molecular tension within motile focal adhesions. Biophys J. 109 (11), 2259-2267 (2015).
  18. Ma, R., et al. Molecular mechanocytometry using tension-activated cell tagging. Nat Methods. 20 (11), 1666-1671 (2023).
  19. Pal, K., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. Ubiquitous membrane-bound DNase activity in podosomes and invadopodia. J Cell Biol. 220 (7), e202008079(2021).
  20. Kim, K. A., Vellampatti, S., Kim, B. C. Characterization of integrin molecular tension of human breast cancer cells on anisotropic nanopatterns. Front Mol Biosci. 9, 825970(2022).
  21. Wang, Y., Zhao, Y., Sarkar, A., Wang, X. Optical sensor revealed abnormal nuclease spatial activity on cancer cell membrane. J Biophotonics. 12 (5), e201800351(2019).
  22. Zhao, Y., Sarkar, A., Wang, X. Peptide nucleic acid based tension sensor for cellular force imaging with strong DNase resistance. Biosens Bioelectron. 150, 111959(2020).
  23. Rashid, S. A., et al. All-covalent nuclease-resistant and hydrogel-tethered DNA hairpin probes map pN cell traction forces. ACS Appl Mater Interfaces. 15 (28), 33362-33372 (2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Traction Force MicroscopyTension Gauge TetherIntegrin Ligand EchistatinCell Mechanical ForcesHigh Throughput MeasurementCell IsolationFluorescence Intensity

מאמרים קשורים