מאמר שיטה

אפיון הרכבה עצמית הפיכה תלויה ב-pH של קולואידים זהב מצופים עמילואיד בטא 1-40

DOI:

10.3791/67856

⸱

21 במרץ 2025

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, State University of New York Geneseo College

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים שיטה שיטתית המתארת את ההרכבה העצמית הכמעט הפיכה של אגרגטים זהב 20 ננומטר מצופים עמילואיד בטא 1-40 (Aβ 1-40). הרשת הכמעט הפיכה התלויה בגודל ננו בין פפטידים הייתה בקורלציה עם חומצות אמינו ספציפיות או חלקים של מונומר Aβ 1-40.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האפיון של Aβ 1-40 המצופה על פני משטחי החלקיקים הקולואידים של ננו-זהב נערך באמצעות ספקטרוסקופיה של תהודה פלזמונית פני השטח (SPR) ומיקרוסקופ אלקטרונים (TEM). ההסטה התלויה ב-pH שנצפתה של פס ה-SPR של חלקיקי זהב 20 ננומטר מצופים Aβ 1-40 הייתה בקורלציה עם חילופי צבירה ודיגרגציה שנצפתה בתמונות TEM. pH של ~4 גרם לקונפורמציה פרושה, ו-pH של ~10 גרם לקונפורמציה מקופלת של Aβ 1-40 על פני הזהב. תהליך צבירה הפיך זה נצפה על ידי הדמיית ראמאן כאשר ה-pH השתנה בהדרגה מ-pH 4 ל-pH 10. ראינו שינוי מורפולוגיה תלוי pH ב-Aβ 1-40 על פני הזהב, שם נצפו אגרגטים שקופים ב-pH 4. עם זאת, ראינו הבדלים עדינים מאוד בספקטרום ספקטרוסקופיית ראמאן (SERS) משופר פני השטח בין תנאי pH 4 ו-pH 10, כאשר ההבדל הבולט ביותר הוא צפיפות ספקטרלית באזור של 250 ס"מ-1 ו-1750 ס"מ-1. באופן ספציפי, ניתוח המצב של הצבירה ההפיכה הצביע על כך שהאגרגטים נוצרו על ידי הקונפורמציה הפרושה של Aβ 1-40 שהייתה מעורבת בקטע טבעת הבנזן של טירוזין ופנילאלנין. לעומת זאת, פירוק האגרגטים היה קשור לשינויים קונפורמטיביים בקיפול החלבון של Aβ 1-40 הכוללים היסטידין, גלוטמין, מתיונין וחומצה אספרטית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפיברילוגנזה של פפטידים עמילואיד בטא 1-40 (Aβ 1-40) או 1-42 (Aβ 1-42) נחקרה בהרחבה כמרכיב קריטי בהיווצרות פלאק עמילואיד המהווים גורם למחלת אלצהיימר 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 ,11. המנגנון העיקרי בפיבריוגנזה הוא אוליגומריזציה של פפטידים Aβ 1-40 או Aβ 1-42 ליצירת מצטבר חלבון נוירוטוקס, ומחקר מקיף נערך כדי להבין את המנגנונים של האופן שבו מונומרים יוצרים את האוליגומרים 12,13,14. נקטנו בגישה של בחינת פפטידים עמילואידוגניים היוצרים אגרגטים על פני משטח ננו-זהב וזיהוי גורמים האחראים לרשת בין פפטידים המרוחקים משטח הזהב 15,16,17,18,19,20,21,22.

Aβ 1-40 מאמצים קונפורמציה פרושה (A) בתנאים חומציים (pH ~4) וקונפורמציה מקופלת (B) בתנאים בסיסיים (pH ~10). צפינו בחלקיקי קולואיד זהב מצופים Aβ 1-40 מפוזרים ב-pH ~10 ואגרגטים גדולים של קולואיד זהב מצופה Aβ 1-40 ב-pH~4 (איור 1)23,24. הקונפורמציה הפרושה של Aβ 1-40, בתנאים חומציים, מעדיפה רשת פפטידים בין מונומרים Aβ 1-40 על פני פני השטח של ננו-חלקיקי זהב, וכתוצאה מכך נוצרים אגרגטים קולואידים זהב (ראה A באיור 1). כאשר המונומר Aβ 1-40 מחזיק את הקונפורמציה המקופלת ב-pH בסיסי או ניטרלי, Aβ 1-40, המונומרים אינם מתחברים לאגרגטים, וננו-חלקיקי הזהב המצופים נשארים כחלקיקים מפוזרים בודדים (ראה B באיור 1). אנו יכולים, אם כן, לחקור את התהליך של האופן שבו פפטידים Aβ 1-40 עוברים שינויים קונפורמטיביים ברשת ויוצרים אגרגטים על ידי מדידת הסטת פס ה-SPR על פני מגוון תנאי pH 25,26,27,28,29,30,31.

בדקנו כמה גדלים שונים של ננו-חלקיקי זהב ומצאנו שקולואיד הזהב של 20 ננומטר הציג את תהליך ההרכבה העצמית ההפיך הבולט ביותר של מונומרים Aβ 1-40 בתגובה לשינוי חיצוני ב-pH (איור 2). זוהי אינדיקציה ברורה לשינוי הפיך בקונפורמציה של פפטידים, כאשר תנאים חומציים (A) גורמים לקונפורמציה פרושה, משפרים את הרשת ומובילים לצבירה של קולואידים מזהב. המצב הבסיסי (B) נמצא כגורם לקונפורמציה מקופלת של מונומרים 26,27,28,29,30,31.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת ננו-חלקיקי זהב מצופים Aβ 1-40

  1. הוסף נפח של 1 מ"ל של מים מזוקקים נטולי יונים ל-1 מ"ג של Aβ 1-40 ליופיליזציה (MW: 4.2 kDa, טוהר HPLC 98%) באמצעות מחט מזרק. מערבבים את התמיסה עם מערבל מערבולת למשך כ-30 שניות ומוודאים שלא נצפים חלקיקים מוצקים בתמיסה בטמפרטורת החדר (RT; ~20 מעלות צלזיוס).
    1. הכן את כל תמיסות המלאי באמצעות מים דה-יונים ומזוקקים (~18 MΩ·cm).
    2. זיהוי ספקטרוסקופי של הריכוז על ידי שימוש בספיגת טירוזין ב-275 ננומטר32, שיש לו מקדם הכחדה מולקולריε-275 מתוך 1390 ס"מ-1· מ-1.
    3. אחסן פתרונות מלאי של Aβ 1-40 ב-80 מעלות צלזיוס. (ראה טבלת חומרים למוצרים המסחריים של Aβ 1-40.)
  2. הפשירו את תמיסת מלאי הפפטידים כ-5 דקות לפני איסוף הנתונים. מערבבים נפח של 8 מיקרוליטר של תמיסת הפפטיד עם 800 מיקרוליטר של חלקיקי זהב קולואידים בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. הוסף נפח של 4.2 מ"ל מים מזוקקים דה-יונים ולאחר מכן מערבולת את הדגימה למשך 10 שניות 30,31,33,34.
  3. קבע את הריכוז של פפטידים Aβ 1-40 ל -1.8 ננומול וטווח את היחס בין פפטידים Aβ 1-40. מספר הקולואידים של הזהב נע בין ~500:1 ל~2000:125.

2. שינוי pH איטרטיבי וניטור שינוי פס SPR מתאים

  1. הגדר את טמפרטורת התמיסה לערך קבוע (למשל, 25 מעלות צלזיוס) באמצעות יחידת בקרת הטמפרטורה של ספקטרופוטומטר אינפרא אדום אולטרה סגול (UV-Vis-NIR).
  2. עקוב אחר ה-pH הראשוני של תמיסת הדגימה באמצעות מד pH והגדר אותו למעט מתחת ל-pH 7. אסוף את ספקטרום הספיגה בטווח שבין 400 ננומטר ל -1000 ננומטר.
  3. שנה את ה-pH של הדגימה ל-~pH 4 (כלומר, pH 4.0 ±-0.3) על ידי הוספת נפחי 10 מיקרוליטר של 0.1 M HCl ואסוף את ספקטרום הספיגה בין 400 ננומטר ל-1000 ננומטר.
  4. שנה את ה-pH של הדגימה ל-~pH 10 (כלומר, pH 10 ±-0.3) על ידי הוספת נפחי 10 מיקרוליטר של 0.1 M NaOH ואסוף את ספקטרום הספיגה בין 400 ננומטר ל-1000 ננומטר.
  5. שנה את ה-pH בין pH 4 ל-pH 10 עם HCl ו-NaOH 10 פעמים ואסוף את ספקטרום הספיגה ברציפות ב-25 ±-0.2 מעלות צלזיוס29,30.
    הערה: עבור כל פתרונות הדגימה, הצפיפות האופטית של שיא פס ה-SPR נשמרה סביב 0.2. צפוי אפקט חיץ עקב תמיסת המאגר השיורית בתמיסה. לפיכך, ערך ה-pH הסופי נקבע לאחר אישור שיווי המשקל. ערך ה-pH נמדד ישירות בתא קובטה דגימה באמצעות אלקטרודת מיקרו pH, בעלת דיוק של ±0.005 pH.
  6. השג את מערך הנתונים של הקוד הסטנדרטי האמריקאי להחלפת מידע (ASCII) של אורכי גל כפונקציה של ספיגה. חלץ את המיקום הממוצע של פסגות הרצועה באמצעות תוכנית Peak Fit .
    1. התווה את מערך הנתונים כדי להציג את הצפיפות האופטית כפונקציה של אורך גל (nm) באמצעות הפונקציה Plot .
    2. סמן אורכי גל שיא התחלתיים λ1, λ2 ו- λ3 על ידי בחירת מיקומם המשוער בנתונים המשורטטים והתאמת הנתונים באמצעות פונקציית RUN .
    3. השג את הגרף המכיל את השיא המרכזי של כל אחד (λi), XCi, עם השטח של כל פס (Ai).
  7. ייצא את מיקומי השיא והאזורים שחולצו לתוכנית גיליון אלקטרוני וחשב את מיקום השיא הממוצע ב-pH נתון.
    1. קבע את גורם השקלול ai של כל מרכז שיא λi על ידי השוואת שטח הרצועה (Ai) לשטח הכולל של כל הרצועות כ: figure-protocol-1.
    2. חלץ את מיקום השיא הממוצע, figure-protocol-2 (pH) באמצעות Eqn. (1).
      figure-protocol-3(1)
  8. צור תרשים הפיכות באמצעות התהליך הבא:
    1. טבל את מיקומי השיא הממוצעים, figure-protocol-4, כפונקציה של כל מספר "פעולה", n כלעומת figure-protocol-5 n. הפוך את מספר הפעולה, n, ל-1 עבור הדגימה לפני הוספת החומצה ב-~pH 7. הגדל את מספר הפעולה ב-1 בכל פעם, שנה את ה-pH ל-~pH4 עם HCl או את ה-pH ל-~pH 10 עם NaOH. הפוך את n למצב חומצי (כלומר, ~pH 4) ואי-זוגי למצב בסיסי (כלומר, pH 10).
    2. נתח את מיקום השיא בכל n, figure-protocol-6 (n) = λ(n), באמצעות הנוסחה30
      figure-protocol-7(2)
      הערה: ייצג מיקום שיא ממוצע התחלתי ב-n = 1 על ידי A. בטא את הפרמטרים B ו-C כשינוי מיקום השיא התלוי ב-n. הפוך את הפרמטר D כמשרעת של גורם השיכוך, E, של חזרה. השתמש בפונקציית הסינוס כדי להציג את הגליות של מיקום השיא כפונקציה של n.
    3. העבר את מערך הנתונים של (x, y) לתוכנת Origin ושרטוט.
    4. צור את הפונקציה המותאמת אישית הניתנת ב- Eqn. (2) תחת פונקציית התאמת עקומה לא ליניארית של ניתוח. הקלד את הערכים הראשוניים A, B, C, D ו- E ולחץ על RUN כדי להשלים את ההתאמה.
  9. הדמיית TEM
    1. צור את דגימות ה-TEM של קולואידים זהב 20 ננומטר מצופים Aβ 1-40 עם רשתות נחושת מצופות Formvar. בדוק את הדגימות עם TEM המופעל ב-80 קילו וולט.
    2. אסוף תמונות בהגדלה נומינלית של 28,000x או 71,000x במצלמה דיגיטלית CCD (AMT) של 4 מגה-פיקסל מדגם XR-40. אסוף את תמונות ה-TEM עבור זהב 20 ננומטר מצופה Aβ 1-40 בכל מספר פעולה n = 1 (~pH 7), n = 2, 4, 6, 8 ו-10 (pH 4), ו-n = 3, 5, 7 ו-9 (pH 10).

3. הדמיית ראמאן וחקירת הצבירה ההפיכה

  1. הנח 100 מיקרוליטר של תמיסה על דיסק נציץ (קוטר של 1 ס"מ) עבור כל דגימה בפעולה מספר n. דגימות יבשות למשך הלילה לפני המדידה.
  2. אסוף תמונות אור לבן בכל מספר פעולה n. הכן את הדגימה הנפרדת על דיסק נציץ מכיוון שה-pH השתנה ברציפות בין ~pH 4 ל-~pH 10 עבור כל פעולה מספר n (איור 3).
  3. אסוף את תמונת ה-Raman בכל מספר פעולה n עם לייזר באורך גל של λ = 633 ננומטר בהספק של 0.5 ± 0.05 mW עם רזולוציה מרחבית של ~0.43 μm ברשת המורכבת מ-100 ×-100 פיקסלים עם זמן אינטגרציה של 500 ms/ספקטרום עבור האזור שבין ~200 ס"מ-1 ל- ~2,800 ס"מ-1 (איור 4).
  4. שרטט את הספקטרום המייצג עבור כל n מיושר כפונקציה של n ובנה את ספקטרום ה-SERS התלת מימדי כפונקציה של n עבור Aβ1-40 מצופה זהב 20 ננומטר (איור 5A). השתמש בחלק העליון view של ספקטרום ה-SERS התלת מימדי כמפת קווי מתאר (איור 5B) על מנת לחלץ את המצבים הספציפיים הקשורים למצב pH מסוים (כלומר, ~pH 4 ו-~pH 10). חלץ את כל התכונות הספקטרליות המשופרות רק ב-nזוגי או רק ב-nאי-זוגי.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עם ההצמדה של Aβ 1-40 על פני השטח של חלקיקי הזהב הננו-קולואידים, פס ה-SPR סביב מקסימום הספיגה של 530 ננומטר הוסט באופן משמעותי לאדום למצב שיא של ~650 ננומטר כאשר התמיסה נעשתה חומצית יותר (pH 4)35. יחד עם תמונות TEM, זיהינו כי מאפיינים ספקטרוסקופיים שנצפו ב-pH 4 תואמים להיווצרות אגרגטים קולואידים של זהב עם קונפורמציה פרושה סבירה ורשת עם מונומרים Aβ 1-40 שנפרשו מסביב הנספגים על פני הזהב30. ראינו כי המונומרים Aβ 1-40 מתהפכים בחזרה לקונפורמציה המקופלת בתנאים בסיסיים (pH 10), וכתוצאה מכך עיוות של האגרגטים בצורה כמעט הפיכה. תהליך כמעט-הפיך זה ניכר מהחלפת שיא הפס הממוצע (figure-results-1(n)), שנע בין אורך גל קצר לארוך יותר, והמורפולוגיה המפוזרת לעומת המצטברת בתמונות TEM בין תנאים בסיסיים (pH = 10) וחומציים (pH = 4). נצפה בעבר שחלק ממונומר Aβ 1-40 נשאר פרוש גם לאחר שהתמיסה הוחזרה לתנאים בסיסיים36. סרטון 1 מציג את שינוי הצבע התלוי ב-pH של Aβ 1-40 וקולואיד זהב חשוף של 20 ננומטר.

לשם השוואה, נערכה חקירת כשות pH של קולואיד זהב חשוף של 20 ננומטר (איור 5C ו-D). ככל שפעולת שינוי ה-pH התקדמה, היא הראתה את צמיחת האשכולות של קולואידים הזהב ב-SPR band shoft, תמונות TEM כמו גם תמונות אור לבן. באופן מעניין למדי, היו כמה קווים ספקטרליים של SERS התלויים ב-nאי-זוגי ו-nזוגי. לדוגמה, ב-nזוגי (pH ~4), הקו ב-275 ס"מ-1, שהוקצה כמצב הקשור ל-Aun (n = 5, 6, 12, 16, 20, 58)37 או מצב של Au-Cl-ligand38 נצפה באופן אינטנסיבי. מצד שני, עבור nזוגי, ב-1008 ס"מ-1 נצפה str39 ו-CH2 wag39, עיוות CH2 40 נצפו בהרחבה ב-1291 ס"מ-1.

בניגוד למורפולוגיה הברורה של צבירה תלוית pH והפיכה שנצפתה על ידי הדמיית אור לבן, היו הבדלים עדינים יחסית בתכונות הספקטרליות בספקטרום SERS בין nodd ל-nזוגי. כקירוב ראשון, צפיפות הקו הספקטרלי באזור שבין 250 ס"מ-1 ל-1750 ס"מ-1 הייתה גבוהה יותר עבור nאי-זוגי מאשר nזוגי. הקווים הספקטרליים באזור טביעות האצבע, 1250 ס"מ-1 ו-1750 ס"מ-1 (רצועות אמיד I, II ו-III ) עבור nאי-זוגי הראו מאפיינים ספקטרליים פחות פתורים, מה שמרמז על התרחבות או עלייה בצפיפות הספקטרלית. באיור 6, מפת קווי מתאר הניתנת באיור 5B (איור 6B) אורגנה עם אותות SERS ב-761 ס"מ-1 (אדום) ו-1395 ס"מ-1 (כחול), המייצגים את הדגשים ב-nאי-זוגי ו-nזוגי, בהתאמה (איור 6C). כספקטרום SERS מייצג עבור nאי-זוגי ו-nזוגי, ספקטרום SERS ב-n = 7 (אדום) ו-n = 4 (כחול) מוצגים בחלק העליון (איור 6A). על מנת להראות את ההתאמה להיסט פס ה-SPR עבור זהב מצופה Aβ1-40 20 ננומטר, תרשים היסט הפס באיור 3 מוצג בצד (איור 6D).

בעוד שיש לנו נתונים ראשוניים על ההקצאה המלאה של ספקטרום ה-SERS הנצפה, אנו מציינים כאן כמה תכונות בולטות של היסט ראמאן. הקווים הספקטרליים ו(ההקצאות הסבירות) המוגדרים ב-n אי-זוגי הם בעיקר באזור הנמוך מ-1000 ס"מ-1: 394 ס"מ-1 (Trp)41,42,43, 761 ס"מ-1 (שלו, אלא)39,44,45,46,47, 875 ס"מ-1 (תזוזה אינדולית NH, מתיחת C-C של Met)39, 974 ס"מ-1 (Glu, C-COO- מתיחה של Asp, מצב הקשור לציטראט)39,48,49. היסט הרמאן המשופר ב-nאפילו הראה מאפיינים ספקטרוסקופיים משמעותיים באזור טביעות האצבע (אמיד I, II ו-III): 1166 ס"מ-1 (עיוות N-H+ של טיר)39,41, 1227 ס"מ-1 (Ala-Pro-Gly, Amide III)39,50,51, 1395 ס"מ-1 (COO- מתיחה סימטרית או CH2- CH3- מספריים של Glu)39,48, 1585 ס"מ-1 (מתיחת טבעת CC של Phe, מתיחה אסימטרית של קרבוקסילט -Au, COO- מתיחה של ציטראט, עיוות של טבעת בנזן)39,41,45,46,47,49,52, 1592 ס"מ-1 (מתיחת Phe, Tyr, C=C של Tyr, מתיחת CC של הטבעת ב-Phe, מתיחת טבעת בנזן ו-COO- מתיחה ב-Phe ו-Tyr, ומתיחה אסימטרית של OH)39,41,48,50,51 ו-1628 ס"מ-1 (תת-שיא אמיד I ייחודי למבני β גיליונות בין-מולקולריים 53, C=O ומצבי הרטט המצומדים CN/NH של עמוד השדרה של החלבון שמקורם במבנים מקבילים מסוג β גיליון, הצטברות של Aβ54 מצטבר, סלילים אקראיים, β סיבובים, β סיכות שיער48. הרצפים המופיעים עבור nאי-זוגי או nזוגי מוצגים באיור 7. בסך הכל, עבור nאפילו המקביל לצבירה הפיכה או קונפורמציה פרושה של Aβ 1-40, Phe/Tyr המכיל טבעת בנזן, מתיחה סימטרית של מצב מספריים COO-, CH2- CH3- של Glu, ועיוות -NH+ של Tyr היו מעורבים באופן משמעותי בשינוי הקונפורמציה של הפפטיד. במהלך פירוק הצבירה שנצפתה כאשר פפטידים אימצו את הקונפורמציה המקופלת המתאימה למצבים הבולטים ב-nodd, נראה כי Glu, Asp, Met, His ו-Ala היו מעורבים.

figure-results-2
איור 1: הספיגה והמורפולוגיה התלויה ב-pH. ספקטרום הספיגה ב-pH 4 (A) ו-pH 10 (B) עבור ננו-חלקיקי זהב מצופים Aβ 1-40 (20 ננומטר), ותמונות ה-TEM המתאימות, סקיצות של חלקיקים מצטברים/מפוזרים ותמונות של תמיסות בבקבוקונים. A הוא הקונפורמציה הפרושה של מונומרים Aβ 1-40 בתנאים חומציים, ו-B הוא הקונפורמציה המקופלת בתנאים בסיסיים. דיאגרמות של מונומרים Aβ 1-40 בכל קונפורמציה ומורפולוגיה של אגרגציה/פיזור מוצגות ליד תמונות TEM. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 2: הפיכות הרכבה-עצמית תלויה בגודל ננו. השינוי של מיקום השיא הממוצע של רצועת ה- SPR, figure-results-4, כפונקציה של מספר הפעולה, n, עבור כל הגדלים שנבדקו של חלקיקי קולואיד זהב. ערכי ה-pH המשוערים והשלב המקביל של האגרגטים המוצגים באיור 1 ניתנים גם כן. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 3: figure-results-6 ותמונות TEM/אור לבן בכל מספר פעולה. כפונקציה של מספר הפעולהfigure-results-7, n, שורטט יחד עבור Aβ 1-40 מצופה זהב 20 ננומטר (עיגולים סגורים) וקולואיד זהב 20 ננומטר (עיגולים פתוחים) ומוצג עם תמונות TEM מייצגות (A ו-C)/אור לבן (B ו-D) במספרי פעולה נבחרים (n = 1, 2, 3, 7 ו-8 המסומנים על ידי חיצים מפוענחים) עבור Aβ1-40 מצופה זהב 20 ננומטר (A ו-B) וקולואיד זהב 20 ננומטר (C ו-D). גופן שחור מציין pH 7, גופן כחול מציין pH 4 וגופן אדום מציין pH 10. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-8
איור 4: אור לבן מייצג ותמונת ראמאן. תמונת האור הלבן, תמונת רמאן וספקטרום SERS עבור (A) n = 2 ו- (B) n = 3; i) תמונת אור לבן בשדה ראייה רחב, ii) תמונת אור לבן באזור בו נאספה תמונת Raman (מסומנת על ידי ריבוע אדום ב-i)), iii) תמונת Raman של שני רכיבים משולבים, iv) תמונת Raman של רכיב 1 ו-v) ספקטרום SERS של iv), vi) תמונת Raman של רכיב 2, ו-vii) ספקטרום SERS של vi). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-9
איור 5: מפת קווי המתאר של ספקטרום SERS עבור nאי-זוגי, nזוגי ו-nall. (A) המפה התלת-ממדית של ספקטרום SERS באזור של 250 ס"מ-1 ו-1750 ס"מ-1 כפונקציה של n עבור Aβ1-40 מצופה זהב 20 ננומטר עם מפת קווי מתאר המוצגת ב-(B) בחלק העליון. (C) המפה התלת-ממדית של ספקטרום SERS באזור של 250 ס"מ-1 ו-1750 ס"מ-1 כפונקציה של n עבור זהב 20 ננומטר עם מפת קווי מתאר המוצגת ב-(D) בחלק העליון. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-10
איור 6: מפת קווי המתאר של ספקטרום SERS. מפת קווי המתאר של ספקטרום SERS כפונקציה של n (1-10). (A) ספיגה ב-1395 ס"מ-1 (כחול) ו-761 ס"מ-1 (אדום). (ב-ד) הפאנל התחתון מציג את ספקטרום SERS והפאנל הימני מציג את משרעת שינוי עוצמת האות של אותות SERS בכל n. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-11
איור 7: רצפים בולטים של Aβ1-40. הרצפים שהוקצו למעורבות משמעותית ב-nodd (המתאים להיווצרות קונפורמציה מקופלת) מסומנים על ידי חיצים אדומים כלפי מטה, ואלה שהוקצו למעורבות משמעותית ב-nזוגי (המתאים להיווצרות קונפורמציה פרושה) מסומנים על ידי חיצים כחולים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

סרטון 1: שינוי צבע תלוי pH של Aβ1-40 וקולואיד זהב חשוף של 20 ננומטר. אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיקול קריטי במחקרים על קונפורמציה של פפטידים הוא תחזוקת הדגימות, שכן דגימות יתדרדרו אם יאוחסנו בצורה לא נכונה. דגימות הפפטיד התקבלו בצורה ליופילית והחלו להתפרק ברגע שהתייבשו במים מזוקקים נטולי יונים, גם כאשר הם אוחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. טוהר קולואיד הזהב אומת על ידי ניתוח בקרת איכות. על מנת לשמור על יציבות הקולואידים, הם אוחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולא הוקפאו. תמיסות קולואיד הזהב הוכנו טריות לכל ניסוי מכיוון שתמיסת חיץ המלחים תערער את יציבות קולואיד הזהב. תמיסות HCl ו-NaOH הוכנו טריות לכל ניסוי.

האתגרים הטכניים של קריאה ורישום ידני של ה-pH של התמיסה במכשירים עדינים תוך שינוי ה-pH בין 4 ל-10 מגבילים את דיוק התוצאות המדווחות שלנו. לפיכך, לא ראינו תוצאות עקביות בעוצמת אותות ה-SERS. זה ככל הנראה הכניס שגיאה למשרעת ששימשה לעלילת קווי המתאר. עבודה עתידית לאימות המצבים הקשורים ל-nזוגי או nזוגי עשויה להכניס מוטציות שיחליפו את חומצות האמינו ברצף Aβ 1-40 שאנו מדווחים כי הן מעורבות בשינוי הקונפורמציה של החלבון, כגון שאריות טירוזין או אספרגין בודדות.

"האינטראקציה בין מונומר Aβ1-40 למשטח הזהב נחשבת לאינטראקציה דיפולית, ורמת קשרי המימן הועלתה בעבודה על ידי H. Schmidbauer et al.55. בעבודה נפרדת, חקרנו ספקטרוסקופיה של SERS כפונקציה של כמות Aβ1-40 בתנאי חומצי, היא חילצה את תצורת הספיחה התלויה בגודל ננו56. עבור זהב של 20 ננומטר, הועלתה השערה שקשר C=C או -C-N של היסטידין (His) יתחיל את הספיחה; עבור זהב של 80 ננומטר, לעומת זאת, מצב נשימה טבעתי בנזן של פנילאלנין (Phe) או טירוזין (Tyr) הגיע לפני השטח של הזהב כדי להתחיל את הספיחה. תהליך הספיחה של Aβ1-40 על פני הזהב בתנאים ניטרליים או בסיסיים (pH ~10) נחשב לשמירה על קולואיד הזהב המצופה Aβ1-40 כהידרופילי מכיוון שלא נוצרו משקעים במצב מימי. עם זאת, המשקעים נצפו ב-pH 4, מה שמרמז על כך שהאגרגטים היו הידרופוביים.

תמונות TEM ותמונות האור הלבן מראות רק בעקיפין עדות לצבירה. ניסינו לבצע ספקטרוסקופיה של דיכרואיזם מעגלי (CD) כדי לתאם את המורפולוגיה שנצפתה בצבירה ההפיכה עם המבנים המשניים. עם זאת, קווי הבסיס המפזרים מנעו מאיתנו להשיג אותות CD הניתנים לשחזור. במקום זאת, השתמשנו בספקטרוסקופיה של ראמאן, והתמקדנו יותר במצבים המשופרים כאשר צבירה (קונפורמציה פרושה של Aβ1-40) התרחשה תחת pH ~4 או כאשר פירוק (קונפורמציה פרושה של Aβ1-40) תחת pH ~10. לפיכך, ההשערה הטובה ביותר לזיהוי המבנה המשני בעבודה זו הוגבלה לניטור הצמתים הקשורים למבנים המשניים. זה הודגם בתצפית על גיליון β ב-1628 ס"מ-1, במיוחד בתנאי pH 4.

מחקר זה צפה רק בשינוי בקונפורמציה של פפטידים עבור קולואידים זהב בקוטר 20 ננומטר וחקר רק n עד 10. ניתן לשנות את תכונות הקונפורמציה והצבירה של פפטיד Aβ 1-40 על ידי גודל החלקיק שהם סופגיםל-56. לכן, נדרשת עבודה נוספת כדי להבין את המאפיינים של הפפטידים המבוססים על רשת בין מונומרים לאלה המושפעים מהמאפיינים הפיזיקליים של משטח הספיחה. בתנאים שבדקנו, רק קולואידים זהב בקוטר 20 ננומטר הראו הפיכות של מורפולוגיה הצבירה, והמנגנונים של האופן שבו קוטר הקולואיד משפיע על הפיכות תכונה זו אינם ידועים. הגדלת n עד 20 יכולה לספק תובנות נוספות לגבי מידת ההפיכות התלויה במצב של מורפולוגיה הצבירה. חקירות אלה על האופן שבו גודל קולואיד הזהב משפיע על צבירת פפטיד בטא עמילואיד יניבו תובנות חשובות לגבי המנגנונים המולקולריים של פתולוגיה של מחלת אלצהיימר.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים עם עבודה זו לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ק.י. נתמך על ידי מענק NSF-MRI #2117780. קרן Geneseo תמכה בשלב הראשוני של פרויקט זה. א.י. אסירת תודה למלגת מחקר הקיץ של בוגרי המחלקה לכימיה ב-SUNY Geneseo (פרס רודס '19 ופרס ליפקוביץ '20) ומלגת מחקר הקיץ לתואר ראשון של קרן דרייפוס על תמיכתם.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
עמילואיד בטא פפטיד 1-40 (Aβ <תת>1– 40 פפטיד)r-פפטיד (בוגארט, ג'ורג'יה, ארה"ב)A-1156-2
CCD מצלמה דיגיטליתAMTXR-40 4 מגה-פיקסל CCD 
מים מזוקקים נטולי יונים ממערכת המים Milli-Q-Millipore Sigma (ברלינגטון, מסצ'וסטס, ארה"ב)מקפיא Milli-Q IQ 7000
-86 oCThermo ScientificRevco Chilly Willy  מזהה יחידה מסדרת RLE 187004 מספר build 40.04
קולואיד זהב (10 ננומטר)Ted Pella, Inc. (רדינג, קליפורניה, ארה"ב)15703-20
קולואיד זהב (100 ננומטר)Ted Pella, Inc. (רדינג, קליפורניה, ארה"ב)15711-22
קולואיד זהב (15 ננומטר)Ted Pella, Inc. (רדינג, קליפורניה, ארה"ב)15704-20
קולואיד זהב (20 ננומטר)Ted Pella, Inc. (רדינג, קליפורניה, ארה"ב)15705-20
קולואיד זהב (30 ננומטר)טד פלה בע"מ (רדינג, קליפורניה, ארה"ב)15706-21
קולואיד זהב (40 ננומטר)טד פלה בע"מ (רדינג, קליפורניה, ארה"ב)15707-21
קולואיד זהב (50 ננומטר)טד פלה בע"מ (רדינג, קליפורניה, ארה"ב)15708-21
קולואיד זהב (60 ננומטר)טד פלה בע"מ (רדינג, קליפורניה, ארה"ב)15709-22
קולואיד זהב (80 ננומטר)Ted Pella, Inc. (רדינג, קליפורניה, ארה"ב)15710-22
דיסקי נציץ V1AFM בדרגה הגבוהה ביותר 10 מ"מTed Pella Inc.#50
תמיסה סטנדרטית של חומצה הידרוכלורית, 1.0 NFlukaLot # SHBB4705V        318949-2L
מאקרו קוורץ קובט נתיב אור 10 מ"ממדע זבוב האש אלקטרודה מיקרו pH מסוג 1-MC-Path10 מ"מ
HORIBAדגם 9618S (MFG מס' 9Y8E0050)
תוכנית Peak Fit(נורת'המפטון, מסצ'וסטס, ארה"ב)OriginPro2018b (64 סיביות) b9.5.5.409 (אקדמי)
pH 4.00 תמיסת חיץ VWRCat מס' 34170-127
pH 7.00 תמיסת חיץ פישר כימיקלSB107-4 לוט 191041
מד pHHORIBAדגם F-72G (MFG מס' B27M0017)
טיפים לפיפט   טיפים מקסי 1– 5 מ"לפישר   02-707-467
טיפים לפיפט 10 מ"לפישר02-717-135
טיפים לפיפט 1000 מ"לפישר02-717-156
טיפים לפיפט 1– 200 מ"לפישר02-717-143
פיפטר פישר מותג עלית 0.5– 5 מ"לפישרQU05317
פיפטר פישר מותג עלית 100– 1000 מ"לפישרQU01672
פיפטר פישר מותג עלית 10– 100 מ"לפישרMU10985
פיפטר פישר מותג עלית 1– 10 מ"לפישרMU08178
תמיסת נתרן הידרוקסיד 1.0 מ'פלוקהלוט#05096BPV    319511-2L
TEMFEI CoMorgagni דגם 268 
צינורות PCR של TempAssure, כובעים שטוחים, טבעי בארה"ב. 0.2 מ"ל צינורות בודדים בעלי דופן דקה עם כובעים שטוחים חלביים מחוברים
ספקטרופוטומטר UV-Vis-NIRVarianCARY 5000 UV1106M074
WI Tec alpha300R מיקרוסקופ רמאן קונפוקליWITec-Oxford InstrumentXMB3000-3001
מקור פוליפרופילן מדעי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kirschner, D. A., et al. Synthetic peptide homologous to beta protein from Alzheimer disease forms amyloid-like fibrils in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (19), 6953-6957 (1987).
  2. Lomakin, A., Chung, D. S., Benedek, G. B., Kirshner, D. A., Teplow, D. B. On the nucleation and growth of amyloid -protein fibrils: detection of nuclei and quantitation of rate constants. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1125-1129 (1996).
  3. Walsh, D. M., Lomakin, A., Benedek, G. B., Condron, M. M., Teplow, D. B. Amyloid -protein fibrillogenesis. J Biolog Chem. 272 (3), 22364-22372 (1997).
  4. Lambert, M. P., et al. nonfibrillar ligands derived from Ab1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (11), 6448-6453 (1998).
  5. Bucciantini, M., et al. Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature. 416 (6880), 507-511 (2002).
  6. Walsh, D. M., et al. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature. 416 (6880), 535-539 (2002).
  7. Rocha, S., et al. Adsorption of amyloid beta-peptide at polymer surfaces: A neutron reflectivity study. ChemPhysChem. 6 (12), 2527-2534 (2005).
  8. Attanasio, F., et al. Carnosine inhibits Ab1-42 aggregation by perturbing the H-bond network in and around the central hydrophobic cluster. ChemBioChem. 14 (5), 583-592 (2013).
  9. Politi, J., Spadavecchia, J., Iodice, M., de Stefano, L. Oligopeptide-heavy metal interaction monitoring by hybrid gold nanoparticle based assay. Analyst. 140 (1), 149-155 (2015).
  10. Moshe, A., Landau, M., Eisenberg, D. Preparation of Crystalline samples of amyloid fibrils and oligomers. Methods Mol Biol. 1345, 201-210 (2016).
  11. Scarff, C. A., Ashcroft, A. E., Radford, S. E. Characterization of amyloid oligomers by electrospray ionization-ion mobility spectrometry-mass spectrometry (ESI-IMS-MS). Methods Mol Biol. 1345, 115-132 (2016).
  12. Sabaté, R., Gallardo, M., Estelrich, J. Temperature dependence of the nucleation constant rate in β amyloid fibrillogenesis. Int J Biol Macromol. 35 (1-2), 9-13 (2005).
  13. Niraula, T. N., et al. Pressure-dissociable reversible assembly of intrinsically denatured lysozyme is a precursor for amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (12), 4089-4093 (2004).
  14. Miller, A. E., et al. Behavior of β-Amyloid 1-16 at the air-water interface at varying pH by nonlinear spectroscopy and molecular dynamics simulations. J Phys Chem A. 115 (23), 5873-5880 (2011).
  15. Majzika, A., et al. Functionalization of gold nanoparticles with amino acid, -amyloid peptides and fragment. Colloids Surf B Biointerfaces. 81 (1), 235-241 (2010).
  16. Liu, L., et al. Electrochemical detectionof β-amyloid peptides on electrode covered with N-terminus-specific antibody based on electrocatalytic O2 reduction by Aβ(1-16)-heme-modified gold nanoparticles. Biosens Bioelectron. 49, 231-235 (2013).
  17. Elbassal, E. A., et al. Gold Nanoparticles as a Probe for Amyloid-β Oligomer and Amyloid Formation. J Phys Chem C Nanomater Interfaces. 121 (36), 20007-20015 (2017).
  18. Olmedo, I., et al. How changes in the sequence of the peptide CLPFFD-NH2 can modify the conjugation and stability of gold nanoparticles and their affinity for beta-amyloid fibrils. Bioconjug Chem. 19 (16), 1154-1163 (2008).
  19. Xu, Y., et al. Attenuation of the aggregation and neurotoxicity of amyloid peptides with neurotransmitter-functionalized ultra-small-sized gold nanoparticles. Eng Sci. 6, 53-63 (2019).
  20. John, T., Gladytz, A. K., Martin Clemens, L. L., Risselada, H. J., Abel, B. Impact of nanoparticles on amyloid peptide and protein aggregation: A review with a focus on gold nanoparticles. Nanoscale. 45, 20894-20913 (2018).
  21. Li, J., et al. Reduced aggregation and cytotoxicity of amyloid peptides by graphene oxide/gold nanocomposites prepared by pulsed laser ablation in water. Small. 10 (21), 4386-4394 (2014).
  22. Araya, E., et al. Gold nanoparticles and microwave irradiation Inhibit beta-amyloid amyloidogenesis. Nanoscale Res Lett. 3, 435(2008).
  23. Barrow, C. J., Yasuda, A., Kenny, P. T., Zagorski, M. G. Solution conformations and aggregational properties of synthetic amyloid beta-peptides of Alzheimer's disease. Analysis of circular dichroism spectra. J Mol Biol. 225 (4), 1075-1093 (1992).
  24. Wood, S. J., MacKenzie, L., Maleeff, B., Hurle, M. R., Wetzel, R. Selective inhibition of Ab fibril formation. J Biolog Chem. 271 (8), 4086-4092 (1996).
  25. Yokoyama, K. Nanoscale Surface Size Dependence in Protein Conjugation. Advances in Nanotechnology. , Nova Science Publishers. New York, NY. (2010).
  26. Yokoyama, K. Nanoscale Protein Conjugation. Advances in Nanotechnology. , Nova Science Publishers. New York, NY. (2010).
  27. Yokoyama, K. Modeling of Reversible Protein Conjugation on Nanoscale Surface in Computational Nanotechnology: Modeling and Applications with MATLAB. , CRC Press. Boca Raton. (2011).
  28. Yokoyama, K. Nano Size Dependent Properties of Colloidal Surfaces. Colloids: Classification, Properties and Applications. , Nova Science Publishers. New York, NY. (2012).
  29. Yokoyama, K. Controlling Reversible Self-Assembly Path of Amyloid Beta Peptide over Gold Colloidal Nanoparticle's Surface. Nanoscale Spectroscopy with Applications. , CRC Press, Taylor and Francis Group, LLC. (2013).
  30. Yokoyama, K., et al. Nanoscale size dependence in the conjugation of amyloid beta and ovalbumin proteins on the surface of gold colloidal particles. Nanotechnology. 19, 375101(2008).
  31. Yokoyama, K., Welchons, D. R. The conjugation of amyloid beta protein on the gold colloidal nanoparticles' surfaces. Nanotechnology. 18, 105101(2007).
  32. Edelhoch, H. Spectroscopic determination of tryptophan and tyrosine in proteins. Biochemistry. 6 (7), 1948-1954 (1967).
  33. Yokoyama, K., et al. Examination of adsorption orientation of amyloidogenic peptides over nano-gold colloidal particles surfaces. Int J Mol Sci. 20 (21), 5354-5380 (2019).
  34. Yokoyama, K., Ichiki, A. Oligomerization and Adsorption Orientation of Amyloidogenic Peptides over Nano-Gold Colloidal Particle Surfaces. Advances in Chemistry Research. , NOVA Science Publishers. New York, NY. (2020).
  35. Fan, X., Zheng, W., Singh, D. J. Light scattering and surface plasmons on small spherical particles. Light Sci Appl. 3, e179(2014).
  36. Yokoyama, K., et al. Microscopic investigation of reversible nanoscale surface size dependent protein conjugation. Int J Mol Sci. 10 (5), 2348-2366 (2009).
  37. Vishwanathan, K. Symmetry of gold neutral clusters Au3-20 and normal modes of vibrations by using the numerical finite difference method with density-functional tight-binding (DFTB) approach. Arch Chem Res. 2 (1), 4(2017).
  38. Gao, P., Weaver, M. J. Metal-adsorbate vibrational frequencies as a probe of surface bonding: halides and pseudohalides at gold electrodes. J Phys Chem. 90, 4057-4063 (1986).
  39. Stewart, S., Fredericks, P. M. Surface-enhanced raman spectroscopy of peptides and proteins adsorbed on an electrochemically prepared silver surface. Spectrochim Acta AMol Biomol Spectrosc. 55 (7-8), 1615-1640 (1999).
  40. Palings, I., et al. Assignment of fingerprint vibrations in the resonance Raman spectra of rhodopsin, isorhodopsin, and bathorhodopsin: Implications for chromophore structure and environment. Biochem. 26 (9), 2544-2556 (1987).
  41. Szekeres, G. P., Kneipp, J. SERS probing of proteins in gold nanoparticle agglomerates. Front Chem. 7, 30(2019).
  42. Lin, V. J. C., Koenig, J. L. Raman studies of bovine serum albumin. Biopolymers. 15 (1), 203-218 (1976).
  43. Hornemann, A., Drescher, D., Flemig, S., Kneipp, J. Intracellular SERS hybrid probes using BSA-reporter conjugates. Anal Bioanal Chem. 405 (19), 6209-6222 (2013).
  44. Dong, J., et al. Metal binding and oxidation of amyloid-beta within isolated senile plaque cores: Raman microscopic evidence. Biochemistry. 42 (10), 2768-2773 (2003).
  45. Carey, P. R. Biochemical Applications of Raman and Resonance Raman Spectroscopies. , Academic Press. New York, NY. (1982).
  46. Harada, I., Takeuchi, H. Raman and Ultraviolet Resonance Raman Spectra of Proteins and Related Compounds. Spectroscopy of Biological Systems : Advances in Infrared and Raman Spectroscopy. , Wiley. Chichester, UK. (1986).
  47. Overman, S. A., Thomas, G. J. Jr Raman markers of nonaromatic side chains in an α-helix assembly: Ala, Asp, GGly, Ile, Leu, Lys, Ser, and Val residues of phage fd subunits. Biochemistry. 38 (13), 4018-4027 (1999).
  48. Talaga, D., et al. Total internal reflection tip-enhanced Raman spectroscopy of tau fibrils. J Phys Chem B. 126 (27), 5024-5032 (2022).
  49. Grys, D. -B., et al. Citrate coordination and bridging of gold nanoparticles: The role of gold adatoms in AuNP aging. ACS Nano. 14 (7), 8689-8696 (2020).
  50. Guo, T., et al. Full-scale label-free surface-enhanced Raman scattering analysis of mouse brain using a black phosphorus-based two-dimensional nanoprobe. Appl Sci. 9 (3), 398-408 (2019).
  51. Walther, M., Plochocka, P., Fischer, B., Helm, H., Uhd Jepsen, P. Collective vibrational modes in biological molecules investigated by Terahertz time-domain spectroscopy. Biopolymers. 67 (4-5), 310-313 (2002).
  52. Lochocki, B., et al. label-free fluorescence and Raman imaging of amyloid deposits in snap-frozen Alzheimer's disease human brain tissue. Commun Biol. 4 (1), 474-486 (2021).
  53. Palombo, F., et al. Detection of Aβ plaque-associated astrogliosis in Alzheimer's disease brain by spectroscopic imaging and immunohistochemistry. Analyst. 143 (4), 850-857 (2018).
  54. Khoury, Y. E., et al. Raman imaging reveals accumulation of hemoproteins in plaques from Alzheimer's diseased tissues. ACS Chem Neurosci. 12 (15), 2940-2945 (2021).
  55. Schmidbaur, H., Raubenheimer, H. G., Dobrzańska, L. The gold-hydrogen bond, Au-H, and the hydrogen bond to gold Au∙∙∙H-X. Chem Soc Rev. 43 (1), 345-380 (2014).
  56. Yokoyama, K., et al. Protein corona formation and aggregation process of amyloid beta 1-40 coated gold nano-colloids. Langmuir. 40 (3), 1728-1746 (2024).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Reversible AggregationPH Dependent Self AssemblySurface Plasmon ResonanceTransmission Electron MicroscopySurface Enhanced Raman SpectroscopyProtein FoldingColloidal AggregationPeptide Conformation

מאמרים קשורים