מאמר שיטה

בידוד וזיהוי זני חיידקים מעורם של דו-חיים יבשתיים

DOI:

10.3791/67862

⸱

17 ביוני 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Life, Health, and Environmental Sciences (MeSVA), University of L'Aquila

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זוהי שיטה לדגימה ובידוד של חיידקים הניתנים לתרבות מהמיקרוביוטה העורית של סלמנדרות פלתודונטיות אירופאיות (סוג Speleomantes). כאן, אנו מציגים פרוטוקול לדגימת עור סלמנדרה עם ספוגיות ועיבודם באמצעות גישות ניתנות לתרבות. אנו מתארים דגימה, בידוד והקמה של תרבית אקסנית עם אפיון זן חיידקים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המיקרוביוטה היא מרכיב חיוני של אורגניזמים גבוהים יותר, כאשר המיקרוביוטה העורית תורמת באופן משמעותי להגנה של האורגניזם מפני גורמים חיצוניים. אין שיטה סטנדרטית לדגימת קהילות חיידקי עור של Speleomantes (Amphibia: Plethodontidae) לגישת התרבות המיקרוביאלית. כדי לטפל בכך, פיתחנו פרוטוקול מעשי לבידוד חיידקים מעורם של אנשים ושיטת עבודה מומלצת לטיפול ואחסון דגימות. השלבים פשוטים: המטושים מאוחסנים בתמיסת מלח פיזיולוגית בתוספת גליצרול בעת הדגימה. לאחר העברתם במעבדה, ניתן לאחסן ספוגיות בטמפרטורה של +4 מעלות צלזיוס למשך 10 ימים לכל היותר כדי להבטיח את שלמות הקהילה המיקרוביאלית. מחקר זה מציע תובנות מעניינות לגבי חקירת המיקרוביוטה העורית של מיני דו-חיים יבשתיים, כגון אלה השייכים לסוג Speleomantes. גישה זו תורמת ליישום, ניטור ושימור של מינים בסכנת הכחדה ועשויה לשפר את הידע על תפקוד המיקרוביוטה בבריאות ובאקולוגיה של דו-חיים. לפרוטוקול זה עשויה להיות גם משמעות רחבה יותר לחקר המיקרוביום בתרחישים רבים של שימור חיות בר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל האורגניזמים מכילים מגוון של סימביונטים מיקרוביאליים על משטחי האפיתל, הרקמות והאיברים שלהם1. העור הוא הממשק העיקרי בין הפונדקאי לסביבתו, ומספק בית גידול למיקרואורגניזמים מגוונים2. העור הוא האיבר הגדול ביותר של בעלי חוליות ומשמש כמחסום בפני תוקפנות מכנית, כימית ומיקרוביאלית3. עם זאת, חשיפה רחבה זו של העור לתנאי הסביבה הופכת אותו ככל הנראה לגבול האקולוגי הקריטי ביותר המתווך את האינטראקציה של האורגניזם עם גורמים ביוטיים וא-ביוטיים חיצוניים4.

מיקרוביוטת העור של דו-חיים נחקרה באופן אינטנסיבי בעשור האחרון, והקשר בין הקהילה המיקרוביאלית הזו למארח שלה נחקר לעומק 5,6,7,8,9,10. המגוון הביולוגי של מיקרוביוטת העור נקבע במידה רבה על ידי סוג המארח (כלומר, קהילה ספציפית למין), אך גורמים סביבתיים נוספים יכולים לקדם מגוון בין-ספציפי גבוה יותר11. למיקרוביוטת העור של דו-חיים יש הרכב ייחודי מבעלי חיים אחרים. ידוע כי הוכח כי לדו-חיים יש מערכת יחסים הדדית עם חיידקי העור שלהם, המסוגלים לסנתז תרכובות אנטי-מיקרוביאליות או להגן על המארח שלהם מפני מחלות זיהומיות מתעוררות12.

בידוד החיידקים מהעור מושג בדרך כלל לאחר ביצוע שלבים שונים. השלב הראשון כולל קבלת איסוף דגימות מייצג על ידי מטוש והימנעות מזיהום חיצוני. הדגימות המיקרוביאליות תלויות במי מלח או חיץ סטריליים. השלמת נוזלי תרחיף עם מגנים (למשל, גליצרול) עשויה לשפר את שלמות קהילת החיידקים במהלך העברה במעבדה13,14. לאחר העברתן למעבדה, ניתן לעבד דגימות באופן מיידי או לאחר זמן קצר כדי לשמור על שלמות הקהילה המיקרוביאלית. הגישה המיקרוביאלית הקלאסית כוללת עיבוד דגימה על ידי דילול סדרתי כדי להפחית את צפיפות החיידקים ולהבטיח הפרדה טובה יותר של המושבה על לוחות הפטרי. לאחר מכן מדללים דגימות וסדרתיות על מדיה לא ספציפית ולא סלקטיבית כגון אגר לוריא-ברטאני (LBA)15, סויה טריפטית (TSA)16, תמצית שמרי טריפטון אגר (TYEA)17,18,19, או נוטריאנט (NA)20 התומכים בצמיחה של מגוון רחב של חיידקים. נעשה שימוש בהעשרה לא סלקטיבית במהלך הדגימה והעיבוד מכיוון שיש צורך לתרבית מגוון רחב של חיידקים. שיטות הפס או הצלחת המפוזרת מפזרות את התרחיף המיקרוביאלי באופן שווה על פני השטח של אגר21. ההתפלגות האחידה מאפשרת למינים מיקרוביאליים שונים הקיימים בדגימה ליצור מושבות נפרדות. לאחר הדגירה בטמפרטורה של 20-37 מעלות צלזיוס למשך 2-7 ימים, המושבות המיקרוביאליות נספרות ומובחנות על סמך מורפולוגיה. האפיון המורפולוגי של מושבת החיידקים בוצע על בסיס פיגמנטציה, צורה, גובה, שוליים, אטימות ומשטח. מושבות מבודדות היטב בדילולים הגבוהים ביותר עוברות תת-תרבית לצלחות אגר טריות כדי לטהר תרביות מיקרוביאליות. טוהר המושבות מובטח על סמך אחידות התאים והזיקה לצביעה גראם. ניתן לבצע גם מספר בדיקות ביוכימיות או מולקולריות כדי לבדוק את טוהר המושבות22. ניתן לאחסן את התרביות הטהורות של זנים מבודדים על שכבות אגר ב-4 מעלות צלזיוס לשימוש לטווח קצר או לשמר לטווח ארוך ב-80 מעלות צלזיוס ב-cryoprotectants (למשל, יחס גליצרול לבינוני של 20:80 או 50:50)23.

בפרוטוקול זה, אנו מדווחים על גישת הפרקטיקה הטובה ביותר לבידוד חיידקים ממיקרוביוטת העור של סלמנדרות מערות Speleomantes , דו-חיים יבשתיים לחלוטין שיכולים לחיות הן בסביבות פני השטח והן בסביבות תת-קרקעיות24. בהתחשב בהיעדר פרוטוקולים מיושמים אוניברסליים בספרות, מחקר זה נועד לפתח שיטות עבודה מומלצות לדגימה ושימור דגימות מיקרוביוטה עוריות מהדו-חיים היבשתיים הללו. כדי לבחון את הפרוטוקול הזה, השתמשנו בסלמנדרת המערות האיטלקית (Speleomantes italicus) כמודל, ודגמנו 12 פרטים מאוכלוסיית מערות שממוקמת באברוצו (איטליה). הפרטים נאספו ביד ונבדקו שוב ושוב (לפחות 5 פעמים) בצידי הגב, הגחון והצד. המקלונים המשומשים הושרו במים מזוקקים סטריליים. לאחר מכן טבלו המטושים בתמיסת מלח פיזיולוגית של 0.9% עם ובלי תוספת גליצרול. עם העברתה למעבדה נבדק שימור הדגימה בתנאים שונים: טמפרטורת חדר בלתי מבוקרת, 4 מעלות צלזיוס ו-20 מעלות צלזיוס למשך 10 ימים. קהילות מיקרוביאליות ניתנות לתרבות הושוו באמצעות שיטות מבוססות תרבית על מדיה גנרית וסלקטיבית למחצה (LBA, TSYEA, TSA, NA).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג את שיטות העבודה המומלצות להשגה וטיפול בדגימות עור של Speleomantes לגישה מיקרוביולוגית ניתנת לתרבות לבידוד זני חיידקים. החומר השימושי בשלבים הבאים מופיע בטבלת החומרים. הפרוטוקול עוקב אחר הנחיות הטיפול בבעלי חיים של סעיף 11 של DPR 357/97 באישור המשרד לאיכות הסביבה האיטלקי (PNM 74554 מיום 22/04/2024).

1. הכנת מדיה

  1. יש לחשב ולשקול את כמות המרכיבים באבקה (עיין בהוראות היצרן לכמות האבקה המשמשת ל-LBA, TSYEA, TSA, NA או מדיה אחרת).
  2. עקוב אחר הוראות היצרן כדי להמיס את החומרים במים מזוקקים. בהתאם למדיום ולמוצר הנרכש, ייתכן שיידרשו שלבי רתיחה.
  3. הביאו את המדיום לנפח הסופי כאשר החומרים מתמוססים לחלוטין ושולטים ב-pH. אם הערך גבוה או נמוך מהצפוי, כוונן אותו באמצעות הפתרונות המוצעים בהוראות היצרן. תמיסות HCl ו-NaOH משמשות בדרך כלל להפחתת והעלאת ה-pH, בהתאמה.
  4. מוסיפים אגר (2% משקל/נפט), מחממים עד 95 מעלות צלזיוס, ומרתיחים כדקה להמסת האגר לפני החיטוי.
  5. עקר את המדיום על ידי חיטוי, בהתאם להוראות היצרן. תהליכי חיטוי נפוצים כוללים 121-134 מעלות צלזיוס לטיפול של 15-30 דקות.
  6. לאחר החיטוי, יש לקרר את מדיום האגר לסביבות 45-50 מעלות צלזיוס ולשפוך אותו לצלחות פטרי סטריליות מתחת לקולט אדים שעוקר בעבר
  7. לאחר ההתמצקות, סמן את הלוחות לפי הסוג הבינוני ותאריך ההכנה.

2. איסוף דוגמאות

  1. שטפו את עור הסלמנדרה (סוג Speleomantes) במים מזוקקים סטריליים כדי להסיר את קהילות החיידקים החולפות.
  2. אסוף ספוגיות עור מדו-חיים באמצעות ספוגיות כותנה סטריליות במבחנה. שפשפו בעדינות את המקלונים על פני העור כדי לאסוף דגימות מיקרוביאליות מבלי לפגוע באדם.
    1. העבירו ספוגית ספוגה במים מזוקקים סטריליים מכל צד של כל הגוף, כולל כל הגפיים, חמש פעמים (חמש משיכות קדימה ואחורה) כדי לדגום את הפרטים.
      הערה: לא מומלץ ליטול תוספים עם תוספים, שכן הם עלולים להזיק לאנשים.
    2. יש להניח את המקלונים בשפופרות המכילות תמיסת מלח פיזיולוגית (0.9% NaCl) בתוספת גליצרול (20%).
  3. מערבבים את הדגימה עם התמיסה, דוחפים את הספוגית לכיוון דפנות הצינור תוך סחיטת הצינור וסיבוב הספוגית ביסודיות (10 פעמים בכיוון השעון ו-10 פעמים נגד כיוון השעון).
  4. לאחר הערבוב, סגור את הספוגית בתוך הצינור והעביר את הדגימות המיקרוביולוגיות למעבדה, תוך שמירה על הדגימה ב-4 מעלות צלזיוס עד לניתוח המיקרוביאלי.
    הערה: כל השלבים מבוצעים באמצעות חומר סטרילי וכפפות חדשים לכל אדם כדי למנוע זיהום וחשיפת המפעיל למזהמים ביולוגיים וכימיים.

3. חיסון ודגירה

  1. מערבבים היטב את הדגימה המיקרוביולוגית לפני העיבוד.
  2. הכן דילולים סדרתיים של הדגימה העורית עם תמיסת מלח (0.9% NaCl), הנעים בין 10-1 ל 10-6.
  3. חסנו 100 מיקרוליטר של דגימה כפי שהיא ודילול סדרתי על צלחות האגר המוכנות. בעזרת לולאה סטרילית בצורת L, פס את הדגימה על פני מדיום האגר, והפיץ אותה באופן שווה מבלי להפעיל לחץ מוגזם כדי למנוע פגיעה באגר.
  4. הפוך את הצלחות המחוסנות בחממה בטמפרטורה של 20-25 מעלות צלזיוס למשך 3-5 ימים. טווח טמפרטורות זה נוח לגידול חיידקים מזופיליים ופסיכוטרופיים סביבתיים רבים המאכלסים עור דו-חיים.
    הערה: כל השלבים מבוצעים באמצעות חומר סטרילי מתחת למכסה מנוע למינרי שעוקר בעבר. חמישה שכפולים עצמאיים מוכנים לכל יחידת ניסוי. מכיוון שצפיפות ההתחלה אינה ידועה ובלתי צפויה, הכללת מגוון רחב של דילולים תמיד מועילה.

4. טיהור וזיהוי זנים

  1. בחר מושבות חיידקים עם מורפולוגיות מובחנות לניתוח נוסף לאחר הדגירה.
    1. ראשית, בחר מושבות מבודדות היטב כדי למנוע זיהום או חפיפה והימנע מאזורים צפופים שבהם מושבות עלולות להתמזג. יתר על כן, בחר מושבות בעלות מראה שונה (למשל, צבע, גודל, צורה, קצה, משטח או מרקם) כדי להבטיח דגימה של מינים או זנים שונים פוטנציאליים.
      הערה: שלב זה חיוני לבחירת זני החיידקים השונים הניתנים לגידול של מיקרוביוטת העור.
  2. תת-תרבות המושבות הנבחרות.
    1. העבירו מושבה מבודדת היטב של צלחת האגר המקורית באופן אספטי לצלחת אגר טרייה באמצעות לולאת חיסון. פס את המושבה כדי לבודד אותה ואז לדגור אותה כראוי.
    2. חזור על שלב זה מספר פעמים על צלחות אגר טריות כדי לקבל תרביות טהורות מכל חיידק מבודד עד שהמושבות המבודדות נראות דומות. חזור על תת-תרבות באמצעות מדיה סלקטיבית וגנרית.
      הערה: שילוב של טיפול אספטי, בדיקה ויזואלית ומיקרוסקופית וזיהוי מולקולרי מבטיח מתח ללא זיהום.
  3. בדוק את טוהר התרביות המיקרוביאליות על ידי תצפיות מיקרוסקופיות (ממטרות פי 5 עד פי 100), זיקה לצביעה בגרם (קיבוע מושבות, צביעה ותצפית), ובדיקות ביוכימיות (למשל, בדיקת קטלאז, אוקסידאז, אוראז ותסיסת סוכר)21,25.
    הערה: תרביות טהורות צריכות להראות מורפולוגיה אחידה של מושבה, מאפיינים מיקרוסקופיים עקביים ותכונות ביוכימיות.
  4. לבצע זיהוי מולקולרי.
    1. חלץ DNA ממושבות חיידקים מטוהרות ובצע ריצוף גנים 16S rRNA כדי לזהות את מיני החיידקים. בצע הגברת PCR של הגן 16S rRNA באמצעות פריימרים אוניברסליים חיידקיים, ולאחר מכן ריצוף והשוואה עם רצפים ידועים במאגרי מידע כגון GenBank26.
  5. הקמת תרביות ביו-בנק.
    1. בדוק את הסטריליות של תרביות אקסניות (או טהורות) על ידי חיסונן למדיום לא סלקטיבי ובדיקת היעדר גידול של מזהמים. אחסן תרביות אקסניות לשימוש לטווח בינוני וארוך טווח.
      הערה: השיטות הסטנדרטיות כוללות פסים של מושבות על סלטות אגר של המדיום הסלקטיבי ואחסון בטמפרטורת החדר, השעיית התרבית בתמיסות מלאי שהוכנו עם תערובת של המדיום הסלקטיבי וגליצרול (20:80 או 50:50), או ליופיליזציה של תרבית מרק (ייבוש בהקפאה) והקפאה ב-80 מעלות צלזיוס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זרימת העבודה של הגישה הניסיונית מודגמת באיור 1.

figure-results-1
איור 1: זרימת העבודה של הדגימה, הטיפול והעיבוד של דגימות העור של הדו-חיים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתחנו פרוטוקול שיטות עבודה מומלצות להשגת קהילת חיידקים הניתנים לגידול ממיקרוביוטת עור דו-חיים והדגמנו זאת על Speleomantes italicus. כפי שהודגם ביישום לעיל, יש לנקוט במספר צעדים כדי להבטיח בידוד מיקרוביאלי מוצלח מעור דו-חיים. איסוף, תוך שימוש בטכניקת ספוגית עדינה וחומרים סטריליים, חשוב מאוד כדי לאסוף מספיק חומר מיקרוביאלי ולמנוע זיהום. הובלה ואחסון בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, כאשר המטושים מכוסים בתמיסת מלח בתוספת גליצרול, חיוניים לשימור כדאיות החיידקים עד לניתוח נוסף. ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מכירים בתמיכה הכספית מאוניברסיטת ל'אקווילה במסגרת הפרויקטים "Progetti di Ateneo per la Ricerca di base 2024 UNIVAQ: אקוטוקסיקולוגיה של סלמנדרות המערות האירופיות בסכנת הכחדה" ו-"Analisi delle divergenze inter- e intraspecifiche del microbiota dei pletodontidi europei - FFORIC24.35" על ידי Biodiversa+, השותפות האירופית למגוון ביולוגי, בהקשר של Sub-BioMon - פיתוח ובדיקה של גישות לניטור המגוון הביולוגי התת-קרקעי בפרויקט קארסטי במסגרת פרויקט קול קורא משותף לשנים 2022–2023 BiodivMon, והתוכנית הלאומית לשיקום וחוסן (NRRP), משימה 4, רכיב 2, השקעה 1.1, קול קורא למכרז מס' 1409 שפורסם ב-14.9.2022 על ידי משרד האוניברסיטאות והמחקר האיטלקי (MUR), במימון האיחוד האירופי - NextGenerationEU- קוד פרויקט: P2022CYF9L, שם הפרויקט האם מיני מערות פקולטטיביים מניעים מזהמי מתכת לסביבות תת-קרקעיות? (METALCAVE) - E53D23015380001.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Lauria-Bertani agarMerk MilliporeL3027
סויה טריפטית אגרMerk Millipore22091
תמצית שמרי סויה טריפטון AgarMerk Millipore17221
Nutrient AgarMerk Millipore70148
תמיסת גליצרולMerk Millipore49781

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McFall-Ngai, M., et al. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3229-3236 (2013).
  2. Belkaid, Y., Tamoutounour, S. The influence of skin microorganisms on cutaneous immunity. Nat Rev Immunol. 16 (6), 353-366 (2016).
  3. Kligman, A. M. What is the 'true' function of skin. Exp Dermatol. 11 (2), 159-187 (2002).
  4. Ross, A. A., Rodrigues Hoffmann, A., Neufeld, J. D. The skin microbiome of vertebrates. Microbiome. 7 (1), 79(2019).
  5. Kueneman, J. G., et al. Community richness of amphibian skin bacteria correlates with bioclimate at the global scale. Nat Ecol Evol. 3 (3), 381-389 (2019).
  6. Rebollar, E. A., MartínezUgalde, E., Orta, A. H. The amphibian skin microbiome and its protective role against chytridiomycosis. Herpetologica. 76 (2), 167(2020).
  7. Wuerthner, V. P., HernándezGómez, O., Hua, J. Amphibian skin microbiota response to variable housing conditions and experimental treatment across space and time. J Herpetol. 53 (4), 324(2019).
  8. HernándezGómez, O., Wuerthner, V., Hua, J. Amphibian host and skin microbiota response to a common agricultural antimicrobial and internal parasite. Microb Ecol. 79 (1), 175-191 (2020).
  9. SotoCortés, E., et al. Host species and environment shape the skin microbiota of Mexican axolotls. Microb Ecol. 87 (1), 98(2024).
  10. Cramp, R. L., McPhee, R. K., Meyer, E. A., Ohmer, M. E., Franklin, C. E. First line of defence: the role of sloughing in the regulation of cutaneous microbes in frogs. Conserv Physiol. 2 (1), cou012-cou012 (2014).
  11. Colston, T. J., Jackson, C. R. Microbiome evolution along divergent branches of the vertebrate tree of life: what is known and unknown. Mol Ecol. 25 (16), 3776-3800 (2016).
  12. Rebollar, E. A., et al. The skin microbiome of the neotropical frog Craugastor fitzingeri: inferring potential bacterialhostpathogen interactions from metagenomic data. Front Microbiol. 9, 466(2018).
  13. Li, X., Ricke, S. C. Comparison of cryoprotectants for Escherichia coli lysine bioavailability assay culture. J Food Process Preserv. 28 (1), 39-50 (2004).
  14. Patra, J. K., Das, G., Das, S. K., Thatoi, H. Isolation, Culture, and Biochemical Characterization of Microbes. In A Practical Guide to Environmental Biotechnology. , Springer. Singapore. (2020).
  15. Bertani, G. Studies on lysogenesis i. J Bacteriol. 62 (3), 293-300 (1951).
  16. Forbes, B. A., Sahm, D. F., Weissfeld, A. S. Diagnostic Microbiology. , Mosby. St Louis. (2007).
  17. O'Reilly, T., Niven, D. F. Tryptoneyeast extract broth as a culture medium for Haemophilus pleuropneumoniae and Haemophilus parasuis to be used as challenge inocula. Can J Vet Res. 50 (3), 441(1986).
  18. O'Reilly, T., Rosendal, S., Niven, D. F. Porcine haemophili and actinobacilli: characterization by means of API test strips and possible taxonomic implications. Can J Microbiol. 30 (10), 1229-1238 (1984).
  19. Niven, D. F. The cytochrome complement of Haemophilus parasuis. Can J Microbiol. 30 (6), 763-773 (1984).
  20. Lapage, S., Shelton, J. E., Mitchell, T. Methods in Microbiology. , Academic Press. London. (1970).
  21. Smibert, R. M. General Characterization. Manual of Methods for General Bacteriology. , American Society for Microbiology. Washington, DC. (1981).
  22. Sharma, N., Sharma, N., Sharma, S., Sharma, P., Devi, B. Identification, Morphological, Biochemical, and Genetic Characterization of Microorganisms. Basic Biotechniques for Bioprocess and Bioentrepreneurship. , Elsevier, Academic Press. (2023).
  23. Hubálek, Z. Protectants used in the cryopreservation of microorganisms. Cryobiology. 46 (3), 205-229 (2003).
  24. Lanza, B., Pastorelli, C., Laghi, P., Cimmaruta, R. A review of systematics, taxonomy, genetics, biogeography and natural history of the genus Speleomantes Dubois, 1984 (amphibia caudata plethodontidae). Atti Museo Civ St Natl, Trieste. 52, 5-135 (1984).
  25. Cappuccino, J. G., Welsh, C. T. Microbiology: A Laboratory Manual, Global Edition. , Pearson Education Limited: Pearson. Essex, England. (2017).
  26. Farda, B., et al. The "Infernaccio" gorges: microbial diversity of black deposits and isolation of manganesesolubilizing bacteria. Biology (Basel). 11 (8), 1204(2022).
  27. Lunghi, E., et al. Thermal equilibrium and temperature differences among body regions in European plethodontid salamanders. J Therm Biol. 60, 79-85 (2016).
  28. Woodhams, D. C., et al. Hostassociated microbiomes are predicted by immune system complexity and climate. Genome Biol. 21 (1), 23(2020).
  29. Stolp, H., Starr, M. P. Principles of Isolation, Cultivation, and Conservation of Bacteria. The Prokaryotes. , Springer. Berlin, Heidelberg. (1981).
  30. El Baz, S., et al. Resistance to and accumulation of heavy metals by actinobacteria isolated from abandoned mining areas. Sci World J. 2015 (1), 761834(2015).
  31. Le Pioufle, O., Declerck, S. Reducing water availability impacts the development of the arbuscular mycorrhizal fungus Rhizophagus irregularis MUCL 41833 and its ability to take up and transport phosphorus under in vitro conditions. Front Microbiol. 9, 1254(2018).
  32. Freitas, F., Alves, V. D., Reis, M. A. M. Advances in bacterial exopolysaccharides: from production to biotechnological applications. Trends Biotechnol. 29 (8), 388-398 (2011).
  33. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J Vis Exp. (63), e3064(2012).
  34. De Paoli, P. Biobanking in microbiology: from sample collection to epidemiology, diagnosis and research. FEMS Microbiol Rev. 29 (5), 897-910 (2005).
  35. Dal Pizzol, M., et al. Antifungal efficacy and safety of cycloheximide as a supplement in OptisolGS. Drug Des Devel Ther. 15, 2091-2098 (2021).
  36. Overmann, J. Principles of Enrichment, Isolation, Cultivation, and Preservation of Prokaryotes. The Prokaryotes. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2013).
  37. Madhuri, R. J., et al. Recent Approaches in the Production of Novel Enzymes from Environmental Samples by Enrichment Culture and Metagenomic Approach. Recent Developments in Applied Microbiology and Biochemistry. , Elsevier, Academic Press. (2019).
  38. BaichmanKass, A., Song, T., Friedman, J. Competitive interactions between culturable bacteria are highly nonadditive. Elife. 12, e83398(2023).
  39. Cevallos, M. A., et al. Genomic characterization of antifungal Acinetobacter bacteria isolated from the skin of the frogs Agalychnis callidryas and Craugastor fitzingeri. FEMS Microbiol Ecol. 98 (12), fiac126(2022).
  40. Lauer, A., Simon, M. A., Banning, J. L., Lam, B. A., Harris, R. N. Diversity of cutaneous bacteria with antifungal activity isolated from female fourtoed salamanders. ISME J. 2 (2), 145-157 (2008).
  41. Niederle, M. V., et al. Skinassociated lactic acid bacteria from North American bullfrogs as potential control agents of Batrachochytrium dendrobatidis. PLoS One. 14 (9), e0223020(2019).
  42. MuletzWolz, C. R., et al. Antifungal bacteria on woodland salamander skin exhibit high taxonomic diversity and geographic variability. Appl Environ Microbiol. 83 (9), e00186-e00217 (2017).
  43. Woodhams, D. C., et al. Antifungal isolates database of amphibian skin-associated bacteria and function against emerging fungal pathogens. Ecology. 96 (2), 595-595 (2015).
  44. Woodhams, D. C., et al. Interacting symbionts and immunity in the amphibian skin mucosome predict disease risk and probiotic effectiveness. PLoS One. 9 (4), e96375(2014).
  45. Pessier, A. P. An overview of amphibian skin disease. Sem Avian Exot Pet Med. 11 (3), 162-174 (2002).
  46. HernándezGómez, O., Hua, J. From the organismal to biosphere levels: environmental impacts on the amphibian microbiota. FEMS Microbiol Rev. 47 (1), fuad002(2023).
  47. Stevens, E. J., Bates, K. A., King, K. C. Host microbiota can facilitate pathogen infection. PLoS Pathog. 17 (5), e1009514(2021).
  48. Kostanjšek, R., Prodan, Y., Stres, B., Trontelj, P. Composition of the cutaneous bacterial community of a cave amphibian, Proteus anguinus. FEMS Microbiol Ecol. 95 (3), fiz007(2019).
  49. Indriani, S., Karnjanapratum, S., Nirmal, N. P., Nalinanon, S. Amphibian skin and skin secretion: an exotic source of bioactive peptides and its application. Foods. 12 (6), 1282(2023).
  50. Gao, Y., et al. Targeted modification of a novel amphibian antimicrobial peptide from Phyllomedusa tarsius to enhance its activity against MRSA and microbial biofilm. Front Microbiol. 8, 628(2017).
  51. Wang, Y., Zhang, Y., Lee, W., Yang, X., Zhang, Y. Novel peptides from skins of amphibians showed broad-spectrum antimicrobial activities. Chem Biol Drug Des. 87 (3), 419-424 (2016).
  52. Barra, D., Simmaco, M. Amphibian skin: a promising resource for antimicrobial peptides. Trends Biotechnol. 13 (6), 205-209 (1995).
  53. RollinsSmith, L. A. The importance of antimicrobial peptides (AMPs) in amphibian skin defense. Dev Comp Immunol. 142, 104657(2023).
  54. RomeroContreras, Y. J., et al. Bacteria from the skin of amphibians promote growth of Arabidopsis thaliana and Solanum lycopersicum by modifying hormonerelated transcriptome response. Plant Mol Biol. 114 (3), 39(2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים