הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שימוש במכלול In Vivo לבניית פלסמיד ביעילות גבוהה

2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67870

⸱

7 בפברואר 2025

 , 
1College of Medicine, Department of Biochemistry, Microbiology, and Immunology, University of Saskatchewan

במאמר זה

סיכום

הרכבה in vivo היא שיטת שיבוט בלתי תלויה בקשירה המסתמכת על אנזימי תיקון DNA פנימיים בחיידקים כדי להרכיב שברי DNA על ידי רקומבינציה הומולוגית. פרוטוקול זה הוא גם חסכוני בזמן וגם בעלות יתר, מכיוון שנדרשים מעט ריאגנטים, ויעילות השיבוט יכולה להגיע עד 99%.

תקציר

הרכבה in vivo (IVA) היא שיטת שיבוט מולקולרית המשתמשת באנזימים פנימיים הקיימים בחיידקים המקדמים רקומבינציה בין-מולקולרית של שברי DNA להרכבת פלסמידים. שיטה זו מתפקדת על ידי הפיכת שברי DNA עם אזורים של 15-50 bp של הומולוגיה לזני Escherichia coli מעבדה נפוצים והחיידקים משתמשים במסלול התיקון הבלתי תלוי ב-RecA כדי להרכיב את שברי ה-DNA לפלסמיד. שיטה זו מהירה וחסכונית יותר משיטות שיבוט מולקולאריות רבות המסתמכות על הרכבה חוץ גופית של פלסמידים לפני הפיכתם לזני E. coli . הסיבה לכך היא ששיטות במבחנה דורשות רכישה של אנזימים מיוחדים וביצוע תגובות אנזימטיות עוקבות הדורשות דגירה. עם זאת, בניגוד לשיטות מבחנה , IVA לא הוכח בניסוי כמרכיב פלסמידים ליניאריים. כאן אנו חולקים את פרוטוקול IVA המשמש את המעבדה שלנו להרכבה מהירה של פלסמידים ושברי DNA תת-שיבוט בין פלסמידים עם מקורות שונים של שכפול וסמני עמידות לאנטיביוטיקה.

מבוא

שיבוט מולקולרי מקיף סדרה של טכניקות מעבדה הדרושות לייצור פלסמידים המכילים DNA רקומביננטיספציפי 1. טכניקות אלה בכל מקום פועלות לעתים קרובות כצוואר בקבוק בזרימת העבודה הניסיונית2. טכניקות שיבוט מולקולאריות רבות מסתמכות על הרכבה של שברי DNA במבחנה באמצעות סדרה של תגובות אנזימטיות לפני הפיכתם לזן מארח (למשל, Escherichia coli DH5a) להגברה 3,4,5,6,7. מכיוון ששיטות הרכבת פלסמיד במבחנה מסתמכות על אנזימים, רכישה או טיהור של אנזימים יכולים להיות יקרים וגוזלים זמן.

הרכבה in vivo (IVA) היא שיטת שיבוט מולקולרית המסתמכת על רקומבינציה בין-מולקולרית של שברי DNA במארח מתאים 8,9,10,11,12. הבסיס לשיטה זו היה התצפית כי זני שיבוט נפוצים של E. coli יכולים לתווך רקומבינציה בין-מולקולרית של פריימר חד-גדילי עם פלסמיד שנבקע על ידי אנזימי הגבלה13. השימוש ב-PCR ליצירת קצוות DNA הומולוגיים להרכבת פלסמיד ב-E. coli תואר בשנות ה-90 ושיטה זו נקראה רקומבינציה PCR 3,14. היעילות של PCR רקומבינציה דווחה כ-50%14. עם זאת, שיטה זו לא אומצה באופן נרחב, ככל הנראה בשל העלות הגבוהה של פריימרים והסיכון להכנסת מוטציות לא רצויות באמצעות פולימראזות בנאמנות נמוכה כדי להגביר שברי DNA גדולים. חסרונות אלה היו משמעותיים בשנות ה-90 וניתן היה להימנע מהם על ידי שימוש בשיטות שיבוט חוץ גופיות כגון שיבוט בתיווך אנזימי הגבלה.

בשנים האחרונות עלות הפריימרים ירדה, ופולימראזים מסחריים חדשים הגדילו את הנאמנות של הגברת PCR. כתוצאה מכך, PCR רקומבינציה נבדק מחדש כטכניקת שיבוט מולקולרית מהירה וחסכונית ומותג מחדש כ-IVA 2,9,15,16. עם היתכנות מוגברת, IVA נחקרה עוד יותר, והשיטה עברה אופטימיזציה כדי להגיע ליעילות שיבוט של עד 99%16. אופטימיזציות זיהו מאפיינים של DNA הומולוגי, כגון מספר זוגות בסיסים וטמפרטורת התכה, הממקסמים את יעילות הרקומבינציה in vivo 2,16. ניתוח נוסף הראה כי ניתן להרכיב ביעילות עד 6 מקטעי DNA הנעים בין 150 bp ל-7 kbp על ידי IVA15. בנוסף, הקבוצה שלנו השתמשה לאחרונה ב-IVA כדי להרכיב סדרת פלסמיד עם קלטות עמידות שונות לאנטיביוטיקה ומקורות השכפול17. במחקר זה, שיבוט IVA היה יעיל ביותר (71-100%) עם מספר קטן של שיבוטים שנבדקו עבור כל פלסמיד (n = 2)17. כאן אנו מתארים את פרוטוקול ה-IVA המשמש את המעבדה שלנו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תכנן פריימרים או שברי DNA עם קצוות הומולוגיים

  1. השתמש בתוכנת עיבוד תמלילים או בתוכנת ניתוח DNA מיוחדת כדי להרכיב באופן מלאכותי את הפלסמיד הרצוי.
    הערה: לעתים קרובות מועיל לקודד בצבע מקטעי DNA ממקורות שונים ולהדגיש אזורים הומולוגיים שישמשו בשלבי הרכבה במורד הזרם. בנוסף, זה גם מועיל לקודד DNA הומולוגי בצבע כדי להבטיח הרכבה כיוונית.
  2. תכנן פריימרים הנקשרים לכל מקטע DNA ומכילים 15-50 bp מרצף ה-DNA ההומולוגי (איור 1)2,15.
    1. ליעילות מוגברת של IVA, ודא שלמקטעי DNA הומולוגיים יש טמפרטורות התכה של 47-52 מעלות צלזיוס2.
      הערה: ניתן לקבוע את טמפרטורת ההיתוך באמצעות תוכנה מקוונת18 או הנוסחה: טמפרטורת התכה = 64.9 + 41 * (nG + nC - 16.4)/(nA + nT + nG + nC), כאשר n = מספר G, C, A או T ברצף 6,19.
    2. הימנע מפריימרים עם רצפים שחוזרים על עצמם כמו CATCATCATCATCATCATCAT המקודדים לתג HIS מכיוון שהם יכולים להציג חוסר יציבות20. אם יש צורך ברצף חומצות אמינו חוזר סופי ליישומים כמו הכנסת תג poly-HES, השתמש בקודונים חלופיים כמו CATCACCATCATCACCAC כדי להפחית את החזרה על רצף חומצות הגרעין.
      הערה: ניתן להזמין פריימרים מכל ספק מועדף. אם עומדים לסנתז שברי DNA, יש לשלב קצוות הומולוגיים בשבר ה-DNA המסונתז.

2. הגברה של מוצרי DNA המכילים קצוות הומולוגיים

  1. לבודד DNA פלסמיד או תבניות DNA גנומיות באמצעות ערכות בידוד DNA סטנדרטיות זמינות מסחרית או ליזה אלקליין 6,17.
  2. השתמש בתבנית DNA (משלב 2.1) ובפריימרים המכילים אזורים הומולוגיים (שלב 1.2) בתגובת PCR עם פולימראז זמין מסחרית בנאמנות גבוהה. כדי להגביל את העברת תבנית ה-DNA בתגובות במורד הזרם, השתמש בכמות נמוכה של תבנית DNA (20 pg-1 ng) בכל תגובה. עיין בהמלצות היצרן עבור רכיבי תערובת תגובת PCR ספציפיים לאנזים ותנאי מחזור PCR מומלצים. המשך עם תגובת ה-PCR.
    1. הגדר את תגובות ה-PCR (50 מיקרוליטר) כדי להגביר את מקטעי ה-DNA המוצגים באיור 2 כך שיכילו 100 מיקרומטר של dNTPs, 0.2 מיקרומטר מכל פריימר DNA, תבנית DNA (50 pg של pSU19 ו-1 ng של pSU18mCherry), תערובת חיץ תגובת PCR 1x המכילה Mg2+ (ריכוז סופי של 2 מ"מ), ו-1 U של DNA פולימראז בנאמנות גבוהה.
    2. השתמש בתוכנית רכיבה על אופניים PCR למגע כדי להגביר את pSU19 ו-mCherry (איור 2). הגדר את שלב הדנטורציה הראשוני ל-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואחריו 10 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 55 מעלות צלזיוס -0.5 מעלות צלזיוס למחזור למשך 15 שניות, ו-72 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת ולאחר מכן, 20 מחזורים נוספים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 50 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו-72 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. השלם את מחזור ה-PCR עם שלב הארכה אחרון ב-72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
      הערה: אם יש להגביר עמוד שדרה של פלסמיד, התאם את כמות תבנית ה-DNA על סמך המשקל המולקולרי: עם ~20 pg/1 kbp של DNA פלסמיד לכל 50 מיקרוליטר של תגובת PCR (50 pg של DNA עבור pSU19 (מוצג)). בנוסף, התאם את מחזורי ה-PCR כדי למזער את מספר המוטציות שהוכנסו במהלך ההגברה: להגברה של עמוד השדרה של הפלסמיד מספיקים רק 20-25 מחזורי PCR.
  3. לאחר השלמת תגובת ה-PCR, הסר אליקוט (2 מיקרוליטר) של תגובת ה-PCR, שלב עם צבע טעינה (לריכוז פי 1), והפרד שברי DNA על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז21. השתמש בטרנס-תאורה אולטרה סגול (UV) או LED כדי לדמיין שברי DNA שהיגרו בג'ל האגרוז. קבעו אם תוצרי PCR הם ייחודיים והשוו מוצרים עם סולם ה-DNA כדי לבדוק אם הם המשקל המולקולרי הצפוי (איור 2). אם לא מוצגים תוצרי PCR במשקל המולקולרי הנכון, עיין בהמלצות היצרן לאופטימיזציה של תגובת ה-PCR.
    הערה: כאשר תוצרי ה-PCR אינם ייחודיים אך יש מקטע DNA בשפע המתאים למשקל המולקולרי הצפוי, ניתן להימנע מתגובת PCR נוספת.
  4. אם קיימים מספר שברי DNA בג'ל האגרוז, הסר את שבר ה-DNA המתאים למשקל המולקולרי הצפוי מג'ל האגרוז והשתמש בערכת מיצוי ג'ל אגרוז כדי לשחזר את שבר ה-DNA.
  5. כדי להסיר DNA תבנית מתילציה מתגובות ה-PCR, הוסף 1 מיקרוליטר של DpnI ישירות לצינור התגובה. דגרו את התגובות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות עד לילה.
    הערה: שלב אופציונלי זה מומלץ מאוד כדי להגביל את כמות ה-DNA של התבנית המועברת קדימה בתגובות במורד הזרם. עם זאת, ניתן לדלג על שלב זה אם משתמשים בריכוזים נמוכים מאוד של תבנית DNA בתגובת ה-PCR.
  6. השתמש בערכת טיהור חומצות גרעין כדי להסיר שאריות אנזימים, מלחים, דימרים פריימר ותוצרי DNA מולקולאריים נמוכים לא רצויים אחרים הנובעים מבדיקות אנזימטיות.
    הערה: ניתן לדלג על שלבים 2.1-2.6 אם מקטעי DNA מסונתזים.
  7. כמת את ריכוז ה-DNA של שברי ה-DNA המטוהרים על ידי ספקטרופוטומטריה או הערכת ג'ל.

3. IVA (איור 3)

  1. חשב את כמות ה-DNA הנדרשת לכל תגובת IVA (מומלץ 25-50 ננוגרם של DNA פלסמיד). השתמש בכמויות גבוהות יותר של DNA פלסמיד עבור פלסמידים בעלי משקל מולקולרי גבוה יותר (למשל, עבור פלסמידים של 2.3 kbp, השתמש ב-25 ננוגרם של פלסמיד, אך כאשר הפלסמידים הם 9 kbp, השתמש ב-50 ננוגרם בכל תגובה). לחשב את נפח ה-DNA הדרוש לתגובה; השתמש ביחס מולרי של 1:3 או 1:5 של פלסמיד: הכנס DNA.
    הערה: ניתן להשתמש במחשבוני ביו מקוונים או בנוסחאות המפורטות להלן כדי לחשב את הכמות המולרית של שבר DNA דו-גדילי ולקבוע את היחס המולרי של כל שבר DNA.
    אנו משתמשים בנוסחה הבאה כדי לחשב את הכמות המולרית של שבר DNA דו-גדילי: pmol = (משקל ב- ng) × 1,000 / (זוגות בסיס × 650 דלטונים). בנוסף, ניתן לחשב יחסים מולאריים על ידי: הכנסת מסה (g) = יחס מולארי רצוי של הכנסה/פלסמיד × מסה של פלסמיד (g) × יחס של הכנסה לאורכי פלסמיד6.
  2. שלב את הנפח המחושב של הפלסמיד והכנס DNA לצינור מיקרו-צנטריפוגה מקורר מראש של 1.5 מ"ל והשאר על קרח.
  3. העבירו את הפלסמיד והכנסו את תערובת ה-DNA משלב 3.2 לתוך אליקוט (25-100 מיקרוליטר) של E. coli מופשר מבחינה כימית (למשל E. coli DH5a;22).
    הערה: נפח התאים המוסמכים המשמשים תלוי בנפח הפלסמיד והכנסת תערובת ה-DNA; תערובת זו לא תעלה על 10% נפח התאים המוכשרים.
  4. המשך עם טרנספורמציה של הלם חום23.
    1. דגרו את התערובת של E. coli ו-DNA בעלי יכולת כימית על קרח למשך 30 דקות.
    2. מעבירים לאמבט מים של 42 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, ואז מעבירים את הצינור לקרח למשך 2 דקות.
    3. העבירו אספטית LB לצינור כדי להרכיב את הנפח ל -1 מ"ל.
    4. העבירו את הנפח של 1 מ"ל לצינור תרבית זכוכית והניחו באינקובטור רועד המוגדר ב-37 מעלות צלזיוס, 220 סל"ד או הטמפרטורה המומלצת להתאוששות זן החיידקים ו/או הפלסמיד (טווח טיפוסי בין 25 מעלות צלזיוס ל-37 מעלות צלזיוס) ולאפשר ייצור של סמן בחירת האנטיביוטיקה המקודד בפלסמיד.
  5. לאחר שהתאים התאוששו במשך 30 דקות עד שעה, הפקידו אליקוט (100 מיקרוליטר של 1,000 מיקרוליטר) של תגובת הטרנספורמציה על מצע ברירה מוצק והשתמשו במפזר תאים סטרילי כדי לפזר את האליקוט על פני צלחת תרבית האגר. אסוף את שאר התאים שעברו טרנספורמציה על ידי צנטריפוגה (13,000 × גרם למשך דקה אחת), השליך את הסופרנטנט, השהה מחדש את כדור התא ב-100 מיקרוליטר של מדיה סטרילית, והפקיד על מצע בחירה מוצק כאמור לעיל. אפשר לנוזל להיספג במדיה מוצקה למשך 30 דקות, הפוך את לוחות התרבות. ולהניח אותם בחממה למשך הלילה בטמפרטורה המומלצת לזן החיידקים ו/או הפלסמיד.

4. הקרנה להרכבת פלסמיד נכונה

  1. לאחר הדגירה (שלב 3.5), הסר את צלחות התרבות מהחממה וספיר את המושבות על ידי ספירה ישירה אם יש מספר מושבות חיידקים מבודדות על כל צלחת תרבות. בחר מספר מושבות (1-10) להקרנה כדי לקבוע אם הן מכילות את הפלסמיד המורכב הרצוי.
    1. העבירו אמצעי גידול סטריליים בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה לצינורות תרבית סטריליים (זכוכית או פלסטיק). חסנו את אמצעי התרבות על ידי נגיעה במושבה אחת עם מחט העברה סטרילית או לולאה והעבירו את התאים לתוך אמצעי צינור התרבות בעזרת מחט ההעברה. מניחים את צינורות התרבות בחממה רועדת ודוגרים למשך 16-18 שעות בטמפרטורה המומלצת לזן החיידקים ו/או הפלסמיד (טווח אופייני בין 25 מעלות צלזיוס ל-37 מעלות צלזיוס).
  2. למחרת, בודד DNA פלסמיד מתרביות החיידקים על ידי ליזה אלקליין6 או באמצעות ערכת בידוד פלסמיד זמינה מסחרית בהתאם להוראות היצרן.
  3. קבע אם הפלסמידים מורכבים כהלכה.
    1. כמת את ריכוז ה-DNA של הפלסמידים המבודדים על ידי ספקטרופוטומטריה או הערכת ג'ל.
    2. השתמש ב-aliquot (50-150 ננוגרם) של DNA פלסמיד לתגובת עיכול הגבלה אבחנתית (נפח סופי של 10 מיקרוליטר). בחר אנזימי הגבלה על סמך המקום שבו הם צפויים לבקע את ה-DNA של הפלסמיד המורכב.
      הערה: אנו ממליצים על שתי תגובות נפרדות: (1) טיפול ב-DNA פלסמיד עם אנזים הגבלה הצפוי לבקע את הפלסמיד באתר יחיד ו-(2) טיפול ב-DNA פלסמיד עם שני אנזימי הגבלה הצפויים לכרות את כל או חלק משבר ה-DNA שהוכנס. אנזימי הגבלה זמינים מסחרית ויש להשתמש בהם בהתאם להוראות היצרן.
    3. לאחר השלמת תגובת אנזים ההגבלה, שלב עם טעינת צבע (לריכוז פי 1), טען את כל התערובת על ג'ל אגרוז והפרד את שברי ה-DNA על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז21. השתמש בטרנס-תאורה UV או LED כדי לדמיין את שברי ה-DNA שנדדו בג'ל האגרוז. השווה מקטעי DNA מוגבלים עם סולם המשקל המולקולרי כדי לקבוע אם הם המשקל המולקולרי הצפוי (איור 4). שימו לב לפלסמידים עם דפוסי הגבלת האנזים הצפויים (הנקראים שיבוטים חיוביים); השליכו את הצינורות המכילים פלסמידים שאין להם את דפוס ההגבלה הצפוי (הנקראים שיבוטים שליליים).
  4. כדי להבטיח שלשיבוטים חיוביים יש את רצף הנוקלאוטידים הצפוי, שלח מספר של שיבוטי פלסמיד חיוביים לריצוף.
    הערה: מומלץ ריצוף פלסמיד שלם (למשל, ריצוף ננו-נקבוביות).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בכתב יד זה, כדוגמה לשימוש ב-IVA, עקבנו אחר זרימת העבודה של IVA שסופקה כדי לשכפל מחדש את מסגרת הקריאה הפתוחה של mCherry לאתר השיבוט המרובה של פלסמיד pSU19 כדי ליצור פלסמיד זהה ל-pSU19mCherry (איור 3)17. פריימרים המתאימים ל-IVA תוכננו על סמך שלבי פרוטוקול 1.1 ו-1.2. לאחר מכן, נעשה שימוש בערכת בידוד פלסמיד לבידוד pSU19 ו-pSU18mCherry, ששימשו כתבניות לתגובות PCR כדי להגביר את עמוד השדרה של הפלסמיד ולהכניס DNA, בהתאמה (שלב פרוטוקול 2.1). עמוד השדרה של הפלסמיד pSU19 הוגבר ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השלב הקריטי ביותר לשיבוט IVA מוצלח הוא שבר ה-DNA ועיצוב הפריימר. יעילות IVA משופרת מאוד כאשר שברים הומולוגיים מתוכננים להיות באורך של לפחות 15 bp עם טמפרטורת התכה של כ-47-52 מעלות צלזיוס. מחקר מפורט הבוחן את האופטימיזציה של עיצוב מקטעי IVA פורסם16. צעד חשוב נוסף ליעילות שיבוט גבוהה הוא שימוש בכמה שפחות DNA של תבנית בשלבי הגברת PCR. כדי להפחית עוד יותר את העברת ה-DNA של התבנית, אנו מטפלים בתגובות ה-PCR שלנו לאחר המחזור עם DpnI כדי לבקע DNA תבנית מתילית. ז...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

HGB ממומן על ידי מלגות לתארים מתקדמים בקנדה - תוכנית לתואר שני ממועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC) ופרס דוקטורט של דיקן (אוניברסיטת ססקצ'ואן). עבודה זו נתמכה על ידי מענק NSERC Discovery (RGPIN-2021-03066), קרנות סטארט-אפ (ל-JLT) מאוניברסיטת ססקצ'ואן וקרן קנדה לחדשנות ע"ש ג'ון ר. אוונס (מענק מספר 42269 ל-JLT). המחברים מודים למר אריק טומבס על שסיפק את הצילום של כימות ה-DNA על ידי ספקטרוסקופיה UV.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 kb פלוס סולם DNAFroggaBioDM015-R500סמן משקל מולקולרי DNA
AccuReady M ערוץ יחיד 0.5-10 ומיקרו; Lבולדוג ביוBPP020פיפטות להעברת נוזל
AccuReady M ערכת פיפטור חד ערוץבולדוג ביוBPK100פיפטות להעברת נוזל
אגרביושופ קנדהAGR003.1חומר ממצק למדיום גידול
AgaroseBiobasicD0012הכינו ג'לי אגרוז לאלקטרופורזה של DNA
ביומטרה Analytikjena846-2-070-301תרמו-ציקלר
לצינורות תרבית זכוכיתFisher Scientific14-957-91כובעים לשימוש חוזר לצינורות תרבית זכוכית
פריימרים DNAטכנולוגיות DNA משולבותN/Aלקשור ולהגביר DNA תבנית בתגובת PCR
DpnI ניו אינגלנד BiolabsR0176Sלבקע תבנית מתילציה DNA בעקבות הגברת PCR
EcoRIניו אינגלנד BiolabsR3101Lאנזים הגבלה, מגיע עם מאגר מתאים
מיקרו-צינורות אפנדורף 1.5 מ"לSarstedt72.690.300מיקרו-צינור, 1.5 מ"ל, בסיס חרוטי, PP, מכסה שטוח מחובר, סיומים יצוקים וחלל כתיבה חלבי
אתידיום ברומידפישר סיינטיפיקAAL0748203 חומר הדמיה/אינטרקלציה של DNA,
ערכת מיני-הכנה רעילה EZ-10 עמודת ספין פלסמיד DNAביו-בייסיקBS614בידוד DNA פלסמיד מתרביות חיידקים לילה
מערכת GelDoc Go-GelBio-Rad12009077 הדמיית DNA ג'לים צינורות
תרבית זכוכיתFisher Scientific14-925Eצינורות תרבית זכוכית
myGel  מערכת מיני אלקטרופורזהמערכת Z742288 Sigma-Aldrichהמשמשת לאלקטרופורזה ג'ל
NanoDrop OneThermo FisherND-ONE-Wקביעת ריכוז DNA
ניקוי PCR לריצוף DNAביו-בייסיקBT5100טיהור מוצרי PCR 
צלחת פטריSarstedt82.1473.011צלחת פטרי 92 x 16 מ"מ, PS, שקופה, עם מצלמות אוורור
קצה פיפטה, 1000 ומיקרו; LSarstedt70.305קצות פיפטה ל 100-1000 ומיקרו;
L קצה פיפטה, 2.5 ומיקרו; LSarstedt70.3010.265קצות פיפטה עד 2.5 ומיקרו; L
קצה פיפטה, 20 ומיקרו; LSarstedt70.3020.200קצות פיפטה עד 20 ומיקרו;
L קצה פיפטה, 200 ומיקרו; LSarstedt70.3030.020טיפים לפיפטה עבור 1-200 ומיקרו; L
מלח (NaCl)פישר סיינטיפיקS271-10רכיב של מדיום גידול חיידקים (10 גרם/ליטר)
צינורות PCR בודדים של 0.2 מ"ל עם מכסה שטוחצינורות FroggaBioTF-1000PCR
טריפטון (בקטריולוגי)BioShop CanadaTRP402.5רכיב של מדיום גידול חיידקים (10 גרם/ליטר)
VeriFi DNA פולימראזPCR BiosystemsPB10.42-01פולימראז בנאמנות גבוהה, מאגר ה-PCR המכיל Mg2+ ו-dNTPs מסופק עם רכישה
Xba Iניו אינגלנד BiolabsR0145Sאנזים הגבלה, מגיע עם
תמצית שמריםBioShop CanadaYEX401.205רכיב של מדיום גידול חיידקים (5 גרם/ליטר)
כובעי מתאימה

מקורות

  1. Bertero, A., Brown, S., Vallier, L. Methods of cloning. Basic Science Methods for Clinical Researchers. Chapter 2, Academic Press. 19-39 (2017).
  2. Garcia-Nafria, J., Watson, J. F., Greger, I. H. IVA cloning: A single-tube universal cloning system exploiting bacterial in vivo assembly. Sci Rep. 6, 27459(2016).
  3. Bubeck, P., Winkler, M., Bautsch, W. Rapid cloning by homologous recombination in vivo. Nucleic Acids Res. 21 (15), 3601-3602 (1993).
  4. Avilan, L. Assembling multiple fragments: the Gibson assembly. Methods Mol Biol. 2633, 45-53 (2023).
  5. Stukenberg, D., et al. The Marburg Collection: A Golden Gate DNA assembly framework for synthetic biology applications in Vibrio natriegens. ACS Synth Biol. 10 (8), 1904-1919 (2021).
  6. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  7. Engler, C., Marillonnet, S. Golden Gate cloning. Methods Mol Biol. 1116, 119-131 (2014).
  8. Ma, H., Kunes, S., Schatz, P. J., Botstein, D. Plasmid construction by homologous recombination in yeast. Gene. 58 (2-3), 201-216 (1987).
  9. Cao, P., Wang, L., Zhou, G., Wang, Y., Chen, Y. Rapid assembly of multiple DNA fragments through direct transformation of PCR products into E. coli and Lactobacillus. Plasmid. 76, 40-46 (2014).
  10. Conley, E. C., Saunders, V. A., Saunders, J. R. Deletion and rearrangement of plasmid DNA during transformation of Escherichia coli with linear plasmid molecules. Nucleic Acids Res. 14 (22), 8905-8917 (1986).
  11. Conley, E. C., Saunders, V. A., Jackson, V., Saunders, J. R. Mechanism of intramolecular recyclization and deletion formation following transformation of Escherichia coli with linearized plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 14 (22), 8919-8932 (1986).
  12. Sung, W. L., Zahab, D. M. Site-specific recombination directed by single-stranded crossover linkers: specific deletion of the amino-terminal region of the beta-galactosidase gene in pUC plasmids. DNA. 6 (4), 373-379 (1987).
  13. Mandecki, W. Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 83 (19), 7177-7181 (1986).
  14. Jones, D. H., Howard, B. H. A rapid method for recombination and site-specific mutagenesis by placing homologous ends on DNA using polymerase chain reaction. Biotechniques. 10 (1), 62-66 (1991).
  15. Kostylev, M., Otwell, A. E., Richardson, R. E., Suzuki, Y. Cloning should be simple: Escherichia coli DH5alpha-mediated assembly of multiple DNA fragments with short end homologies. PLoS One. 10 (9), e0137466(2015).
  16. Chen, F., et al. Simplified plasmid cloning with a universal MCS design and bacterial in vivo assembly. BMC Biotechnol. 21 (1), 24(2021).
  17. Braun, H. G., Kanwal, N., Rivera Lopez, L. F., Thomassin, J. L. Generation of a plasmid series for rapid sub-cloning and use in various Enterobacteriaceae. J Biosci Bioeng. 138 (6), 478-487 (2024).
  18. Kibbe, W. A. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator. Nucleic Acids Res. 35 (Web Server issue), W43-W46 (2007).
  19. Wallace, R. B., et al. Hybridization of synthetic oligodeoxyribonucleotides to phi chi 174 DNA: the effect of single base pair mismatch. Nucleic Acids Res. 6 (11), 3543-3557 (1979).
  20. Bzymek, M., Lovett, S. T. Instability of repetitive DNA sequences: The role of replication in multiple mechanisms. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (15), 8319-8325 (2001).
  21. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923(2012).
  22. Sambrook, J., Russell, D. W. The inoue method for preparation and transformation of competent E. coli: "ultra-competent" cells. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  23. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  24. Fürste, J. P., et al. Molecular cloning of the plasmid RP4 primase region in a multi-host-range tacP expression vector. Gene. 48 (1), 119-131 (1986).
  25. Bäumler, A. J., et al. Identification of a new iron regulated locus of Salmonella typhi. Gene. 183 (1-2), 207-213 (1996).
  26. Godiska, R., et al. Linear plasmid vector for cloning of repetitive or unstable sequences in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 38 (6), e88(2010).
  27. Watson, J. F., Garcia-Nafria, J. In vivo DNA assembly using common laboratory bacteria: A re-emerging tool to simplify molecular cloning. J Biol Chem. 294 (42), 15271-15281 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

שכפול מולקולריהרכבת מקטעי DNAEscherichia Coliהגברה באמצעות PCRאלקטרופורזה של ג'ל אגרוזטרנספורמציה באמצעות הלם תרמיסלקציה אנטיביוטיתעיכול באמצעות אנזימי הגבלה
שימוש במכלול In Vivo לבניית פלסמיד ביעילות גבוהה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.