ניתוח תת-אוכלוסיות טסיות על ידי ציטומטריית זרימה רב-צבעונית

Zoi Laspa; Anne-Katrin Rohlfing; Meinrad P. Gawaz

doi:10.3791/67878

מאמר שיטה

ניתוח תת-אוכלוסיות טסיות על ידי ציטומטריית זרימה רב-צבעונית

DOI:

10.3791/67878

⸱

10 ביוני 2025

Zoi Laspa¹ , Anne-Katrin Rohlfing¹ , Meinrad P. Gawaz¹

¹Department of Cardiology and Angiology, University Hospital Tübingen, University of Tübingen

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ציטומטריית זרימה רב-צבעונית עבור טסיות יכולה לזהות תת-סוגים חדשים של טסיות דם בתוך תת-אוכלוסיות טסיות קלאסיות, כגון טסיות מנוחה, אגרגטוריות, פרוקו-קרישה ואפופטוטיות. זה מאפשר השוואה של דפוסי תת-אוכלוסייה שונים המושרים על ידי אגוניסטים שונים של טסיות דם. כאן מתואר בפירוט הליך להקמת פאנל ציטומטריית זרימה רב צבעוני.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טסיות דם, או טרומבוציטים, הם תאי דם קטנים ללא גרעין הממלאים תפקיד מכריע בהמוסטזיס ופקקת. פגמים בתפקודי טסיות הדם עלולים לגרום לדימום או לאירועים טרומבוטיים בחולים עם מחלות לב וכלי דם. לכן, חשוב לאפיין את הטסיות באופן פנוטיפי כדי להיות מסוגל להקצות תת-אוכלוסיות טסיות לתפקוד טסיות הדם. גירוי של טסיות דם אנושיות עם אגוניסטים ומפעילים של טסיות גורם לשינויים מורפולוגיים ופיזיולוגיים בטסיות הדם, המלווים בשינויים באוכלוסיית הקולטנים על פני השטח. זה מוביל לתת-אוכלוסיות טסיות מגוונות מבחינה תפקודית. תת-אוכלוסיות טסיות מוגדרות קלאסית הן טסיות מנוחה, אגרגטורית, פרוקו-קרישה ואפופטוטית. כדי לאפיין את ההשפעה של אגוניסטים על תת-סוגים של טסיות דם, הקמנו בדיקה באמצעות ציטומטריית זרימה רב-צבעונית המורכבת מ-10 נוגדנים וצבעים שונים (anti-CD62P, anti-CD63, anti-CD61, anti-CD41, anti-CD42b, anti-Integrin_αIIbβ3 (שיבוט: PAC-1), anti-CXCR4, anti-ACKR3, Annexin V, Zombie NIR). טסיות דם אנושיות מבודדות הודגרו באגוניסטים של טסיות דם ונצבעו בנוגדנים וצבעים ספציפיים מצומדים לפלואורופור. לאחר מכן, הם נמדדו על ידי ציטומטריית זרימה. זה מאפשר לנו להגדיר תת-סוגים ספציפיים לאגוניסטים בתוך ארבע תת-האוכלוסיות הקלאסיות. לסיכום, השילוב של סמני הפעלה (anti-CD62P, anti-CD63, anti-Integrin_αIIbβ3 (שיבוט: PAC-1)), סמנים דלקתיים (anti-CXCR4, anti-ACKR3) וסמנים אפופטוטיים (Annexin V, Zombie NIR) המרכיבים את פאנל ציטומטריית הזרימה בן 10 הצבעים המתואר בכתב יד זה פותח את האפשרות להגדיר תת-סוגים נוספים של טסיות דם שיכולים להיות קשורים לתפקוד טסיות ספציפי. ניתן ליישם שיטה זו במחקר בסיסי על תפקוד טסיות דם ופיזיולוגיה, כמו גם בהגדרת תת-סוגים חדשים של טסיות דם במודלים של מחלות ומחקרי חולים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טרומבוציטים, הנקראים גם טסיות דם, הם תאי דם קטנים ונטולי גרעין החיוניים להמוסטזיס ולהתפתחות פקקת ^1,2. הם יכולים להיות מופעלים על ידי אגוניסטים שונים של טסיות דם. אגוניסטים קלאסיים ופיזיולוגיים של טסיות דם הם אדנוזין דיפוספט (ADP), הנקשר לקולטני P2Y12 ו-P2Y1, טרומבין המפעיל טסיות דם דרך קולטני PAR1 ו-PAR4, וקולגן המקיים אינטראקציה עם גליקופרוטאין VI. ניתן להחליף קולגן בניסויים במבחנה בפפטיד הקשור לקולגן (CRP-XL)^3,4. לאחרונה, הוכח כי המין גורם להפעלת טסיות דם על ידי אינטראקציה של קולטן דמוי לקטין מסוג C (CLEC-2) וגליקופרוטאין VI (GPVI), מה שמבסס את המין כמפעיל/אגוניסט טסיות דם אנדוגני^חדש ^5,6. מספר מצבים פתולוגיים יכולים להוביל להמוליזה, וכתוצאה מכך לשחרור המין המכיל ברזל ברזל חופשי. כל אגוניסטים אלה של טסיות הדם משנים את ביטוי קולטני פני השטח על טסיות הדם. השינוי של קולטני פני השטח וקרום הפלזמה תלוי בחוזק ובריכוז של אגוניסט טסיות ^הדם ^7,8,9. לכן, חשוב לאפיין פנוטיפית טסיות דם כדי להיות מסוגל להקצות תת-אוכלוסיות טסיות לתפקוד טסיות הדם.

שיטות עתירות מימדים כמו זרימה ציטומטרית גילו כי טסיות יוצרות תת-אוכלוסיות בעלות פונקציות מובהקות. ניתן לסווג את תת-האוכלוסיות לפי סמני פני שטח שונים. בספרות ידוע כי קיימות שתי תת-אוכלוסיות טסיות נפרדות: הפרו-קרישה, המאופיינת בהחצנת פוספטידילסרין, והפנוטיפ המצטבר המפעיל אינטגרין α_IIIbβ_3.בנוסף לסמני ההפעלה הקלאסיים, ניתן להשתמש בצבעי פלואורסצנטיות כגון גלוטתיון-S-ארילאוקסיד (GSAO) המזהה את תפקוד המיטוכונדריה ומתח חמצוני לסיווג נוסף, למשל, טסיות דם פרוקו-קרישיות לפי מצבן המטבולי¹⁰. זה מאפשר להבחין בין היווצרות נקבוביות מעבר לחדירות מיטוכונדריאלית (MPTP) פנוטיפ טסיות דם¹¹.

Heemskerk ואחרים הראו על ידי ניתוח חשיפה לפוספטידילסרין (PS) ופעילות אינטגרין_{α IIb}β₃כי אוכלוסיות טסיות שונות יכולות לשלוט בשלבי קרישה שונים וכי נדרשים מפעילים חזקים כגון תרומבין וקולגן לחשיפה לפוספטידילסרין¹². יתר על כן, הפעלת טסיות הדם על ידי GPVI עם קולגן או קונוולקסין אגוניסט GPVI ספציפי אחראית בעיקר להיווצרות טסיות דם פרוקו-קרישיות דבקות. כמו כן, חומצה ארכידונית, המובילה להפעלת טסיות דם על ידי ייצור טרומבוקסאן A2 על ידי ציקלואוקסיגנאז, גורמת לחשיפה ל-PS¹³. עם זאת, חומצה ארכידונית היא, בהשוואה לתרומבין או קולגן, מפעיל טסיות חלש¹⁴. Van Velzen et al. העריכו גם אנטיגנים של פני השטח של טסיות הדם (CD42a/b, CD36, CD41, CD61) וסמני הפעלה (PAC-1, CD63, CD62P) בשתי מדידות נפרדות¹⁵. בנוסף, ואן ולזן ועמיתיו הצליחו לנתח דם מחולי טרומבסטניה ולהשוות את תת-האוכלוסיות בין חולים בריאים לחולים. הינדל ועמיתיו מדדו את ההשפעה של פרוסטציקלין על תת-אוכלוסיות טסיות לאחר טיפול בטרומבין ו-CRP-XL עם שני פאנלים בודדים המורכבים מארבעה סמנים כל אחד (PAC-1, Annexin V, CD62P, CD42b, או CDCD154, CD62P, CD63, CD42b)¹⁶. לאחרונה נעשה שימוש בציטומטריית זרימה רב-צבעונית להגדרת תת-אוכלוסיות טסיות מנוחה (CD42b⁺, PAC1^-, CD62P^-, Annexin V^-), אגרגטוריות (CD42b⁺, PAC1⁺, CD62P⁺, Annexin V^-) פרוקו-קרישה (CD42b⁺, PAC1^-, CD62P⁺, Annexin V⁺) ואפופטוטיות (Cd42b^-, PAC1^-, CD62P^-, Annexin V⁺) ^7,17. Laspa et al. הרחיבו/חידדו את גישת ציטומטריית הזרימה הרב-צבעונית על ידי הוספת נוגדנים כנגד קולטני הכימוקין CXCR4 ו-ACKR3¹⁸. בהתבסס על הספרות הזמינה, זהו פאנל הציטומטר הראשון בעל 10 צבעים עבור טסיות דם אנושיות מבודדות המאפשר זיהוי של 10 אנטיגנים שונים על טסיות בודדות (רמת תא בודד) בתוך אוכלוסייה של טסיות דם אנושיות מבודדות בצינור אחד. לפיכך, ניתן למדוד בו זמנית פוטנציאל הפעלה, הידבקות וצבירה, קולטני כימוקין ופוטנציאל אפופטוטי של תא בודד כדי להבחין עוד יותר בתת-האוכלוסייה הקיימת. לפיכך, הוא משלים את ג'ונסון ועמיתיו, שהגדירו את ארבע תת-האוכלוסיות העיקריות עם ארבעה סמנים (מנוחה, פרוקו-קרישה, אגרגטורית, אפופטוטית)¹⁷. לכן, קביעת בדיקת ציטומטריית זרימה רב-צבעונית מאפשרת השוואה בין אגוניסטים שונים של טסיות ביחס לדפוס ההפעלה שלהם ולהיווצרות תת-סוגים של טסיות בתוך תת-אוכלוסיות טסיות קלאסיות.

השיטה יכולה לשמש למחקר בסיסי בנוגע לניתוח תפקוד טסיות הדם והפיזיולוגיה. יתר על כן, ניתן לבצע את בדיקת ציטומטריית הזרימה הרב-צבעונית המבוססת עבור טסיות דם אנושיות עם טסיות דם שנרכשו במחקרי חולים, למשל, חקר מחלות לב וכלי דם ואירועים טרומבוטיים, כדי לפענח את תת-אוכלוסיות הטסיות הנגרמות על ידי מחלות אלו ואת השפעות הטיפולים על פנוטיפים מושרים אלה. לדוגמה, מולר ועמיתיו הראו כי תת-אוכלוסיות הטסיות יכולות להיות שונות בחולי היצרות אבי העורקים¹⁹. הידע שנצבר עשוי להציע פתחים חדשים להתערבויות פרמצבטיות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איסוף וטיפול בדם למטרות מחקר אושרו על ידי ועדת האתיקה בפקולטה לרפואה של אוניברסיטת אברהרד קארלס ובית החולים האוניברסיטאי של טובינגן (הצבעת אתיקה 238/2018B02), ומתודולוגיות המחקר תואמות את הסטנדרטים שנקבעו בהצהרת הלסינקי. תורמים בריאים נתנו הסכמה מדעת בכתב לאיסוף דם. מאפייני הבסיס לתורמים בריאים מפורטים בטבלה 1. איור 1 נותן סקירה כללית של פרוטוקול ציטומטריית הזרימה.

1. בידוד טסיות דם אנושיות מדם מלא

הערה: הנחיות ISTH בוצעו מבחינת איסוף דגימות, חוסמי עורקים ובחירת נוגדי קרישה על מנת להבטיח אופן סטנדרטי לבידוד טסיות²⁰.

הכנת מאגר
1. חומצה-ציטראט-דקסטרוז (ACD) נוגד קרישה: ממיסים 12.50 גרם Na 3-Citrat (85 מ"מ C₆H₅Na₃O₇ x 2 H₂O), 6.82 גרם חומצה ציטראט (71 מ"מ) ו-10.00 גרם גלוקוז (111 מ"מ) ב-475 מ"ל של אקווה דסטילטה. התאם את ה-pH עם 1 M NaOH ל-4.69. ממלאים עד 500 מ"ל באקווה דסטילטה. לאחר מכן, מסננים מעקרים את המאגר ושומרים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  הערה: כל הפתרונות מעוקרים בפילטר עם מערכת סינון מונעת ואקום, המשתמשת בקרום פוליאתר סולפון זרימה מהירה בגודל 0.22 מיקרומטר.
2. המאגר של טירוד (פי 10): שוקל 80.00 גרם NaCl, 10.15 גרם NaHCO₃ ו-1.95 גרם KCl והוסף אקווה דסטילטה ל-1 ליטר. מסנן מעקר את המאגר ושומר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
3. מאגר HEPES של Tyrode (1x; 137 מ"מ NaCl, 2.8 מ"מ KCl, 12 מ"מ NaHCO₃, 5 מ"מ גלוקוז, 10 מ"מ HEPES): מערבבים 10 מ"ל של מאגר 10x Tyrode ו-90 מ"ל של aqua destillata. ממיסים 0.1 גרם גלוקוז ו-0.1 גרם אלבומין בסרום בקר (BSA). התאם את ה-pH עם חומצה 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזינאתי-סולפונית (HEPES) ל-7.4. הגדר 10 מ"ל של המאגר של Tyrode ל-pH 7.4 והתאם את ה-pH של 90 מ"ל השיורי של Tyrode ל-7.4 עם 1 N HCl ל-pH 6.5.
  הערה: BSA יכול לנקות כמה כימיקלים, כגון המין. במקרה זה, חשוב להכין את המאגר של 1x Tyrode ללא BSA. יש לאפשר לכל המאגרים להתחמם לטמפרטורת החדר או ל-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
איסוף דגימות דם
1. הכינו לכל תורם מזרק אחד של 10 מ"ל עם 2 מ"ל נוגד קרישה ACD ותנו לו להסתגל לטמפרטורת החדר או ל-37 מעלות צלזיוס באמצעות אינקובטור. שמור על מקדם הדילול של 1:5 (ACD: דם).
  הערה: השתמש במזרקים קטנים או גדולים יותר כדי לשאוב דגימות דם. מאגר ACD קר עלול להפעיל מראש את טסיות הדם ולפגוע בתוצאות.
2. השתמש במחט פרפר (21 גרם) כדי לאסוף לאט את דם התורם במזרקי ACD שחוממו מראש. פתח את צינור חוסם העורקים לפני מילוי המזרק כדי למנוע הפעלה מוקדמת.
  הערה: מזרקים עם מחט גדולה יותר יכולים למזער את ההפעלה הנגרמת על ידי גזירה של טסיות הדם.
3. העבירו לאט את דם ה-ACD לצינור תגובה של 15 מ"ל. השתמש בדם מיד כדי למנוע הפעלה מוקדמת של טסיות הדם.
בידוד טסיות דם
1. צנטריפוגה של דם ה-ACD למשך 20 דקות ב-209 x g (טמפרטורת החדר, RT) ללא בלמים. הכן 25 מ"ל של מאגר HEPES של Tyrode's pH 6.5 בצינור תגובה של 50 מ"ל.
2. העבירו בעדינות את הפלזמה העשירה בטסיות המתקבלת (PRP, שכבה עליונה) לתוך צינור התגובה של 50 מ"ל המכיל את מאגר Tyrode-HEPES, pH 6.5.
3. השאירו כ-1 מ"ל של PRP מעל מעיל האפי ואריתרוציטים כדי למנוע זיהום בתאי דם אחרים.
4. צנטריפוגה את המתלה ב-430 x גרם למשך 10 דקות ב-RT כדי לגלול את טסיות הדם. השעו בזהירות את הגלולה המתקבלת ב-200-300 מיקרוליטר של המאגר של טירוד, pH 7.4.
5. השתמש במונה תאים כדי לקבוע את ספירת טסיות הדם. התאימו את ספירת הטסיות עם pH של מאגר HEPES של Tyrode: 7.4 עד 200 x 10³ טסיות דם/מיקרוליטר. ראה שלב 3 לעיבוד נוסף של כתמי טסיות דם.

2. בחירה וטיטרציה של נוגדנים לזרימה ציטומטרית

מבחר נוגדנים וצבעים
1. בחר את הנוגדנים והצבעים עם פלואורופורים מתאימים לציטומטר הזרימה²¹. שימו לב לתצורת המסנן המומלצת על ידי יצרן ציטומטר הזרימה. דוגמה לסמני טסיות ותצורת פלואורופור ניתנת בטבלה 2 ובאיור 2 עבור הציטומטר הבא: BD LSR Fortessa עם תצורת לייזר: סגול (402 ננומטר), כחול (488 ננומטר), צהוב/ירוק (561 ננומטר), אדום (640 ננומטר).
  הערה: השתמש בפלואורוכרומים בהירים יותר עבור אנטיגנים בעלי ביטוי נמוך יותר. לדוגמה, הפלואורוכרומים הבהירים BV412 ו-BV650 שימשו לקולטני הכימוקין בעלי הביטוי החלש (ACKR3 ו-CXCR4)22,23,24.
טיטרציה של נוגדנים וצבעים
1. ערכו טיטרציה של הנוגדנים כדי למצוא את ריכוז העבודה הנכון. לצורך טיטרציה, השתמש בטסיות דם אנושיות מבודדות משלב 1 ובסדרת ריכוז של הנוגדן.
  הערה: ריכוזי העבודה שניתנו על ידי היצרן הם בדרך כלל נקודת התחלה טובה לסדרת הריכוזים.
  1. אם עובדים עם אנטיגנים שמתבטאים רק בטיפול, הפעילו את הטסיות לפני הצביעה כדי לוודא שניתן לזהות גם תאים שליליים וחיוביים. לדוגמה, PAC-1 נקשר רק לאינטגרין מופעל α_IIbβ₃. לכן, הפעל חזק את טסיות הדם כדי לקבל אות חיובי ובהיר, למשל, עם 10 מיקרוגרם/מ"ל של פפטיד הקשור לקולגן (CRP; ראה איור 3).
טיטרציה של דגימות
1. בודדו את הטסיות האנושיות כמו בשלב 1 והתאימו את ספירת הטסיות ל-1 x 10⁶ טסיות לכל דגימה.
  1. עבור קולטנים שאינם זקוקים להפעלה לפני הצביעה: CD61, CD42b, CD41, CXCR7, CXCR4 השתמש בדגימה אחת לא מוכתמת ודגימה מוכתמת לכל נוגדן. עבור קולטנים/סמנים שצריך להפעיל עם, למשלample, 10 מיקרוגרם/מ"ל של CRP-XL לפני הצביעה: PAC1, CD63, CD62P, Annexin V, Zombie NIR, השתמש בדגימה אחת מופעלת ואחת לא מופעלת 15,25,26.
2. הפעל את הטסיות (1 x 10⁶ טסיות לכל דגימה) במידת הצורך למשך 30 דקות עם 10 מיקרוגרם/מ"ל CRP-XL. לאחר מכן, דגרו על הטסיות המבודדות (1 x 10⁶ טסיות דם לדגימה) למשך 30 דקות עם ריכוזים שונים של הנוגדן או הצבע המצומד לפלואורוכרום והוסיפו 300 מיקרוליטר של מאגר קשירת אנקסין 1x כדי לדלל את הדגימה (דוגמאות לריכוזים ניתנות בטבלה 3).
3. מדוד 10,000 אירועים עבור כל מדגם.
4. חשב את מדד הכתמים המציג את ההפרדה האופטימלית בין האוכלוסייה החיובית והשלילית עבור כל נוגדן, כפי שמוצג באיור משלים 1.
5. שרטט את אינדקס הכתם עבור כל ריכוז של נוגדן כדי למצוא את הריכוז האופטימלי.

3. צביעה לזרימה ציטומטרית

הערה: ראה טבלה 4 לדוגמא מכתים עם ארבעה מפעילי טסיות דם שונים (CRP-XL, ADP, תרומבין, המין).

צריך להכין את המין טרי. ממיסים את האבקה ב-1.4 M NaOH לתמיסה של 3 M ומחממים אותה ל-96 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ב-450 סל"ד. לאחר מכן, יש לדלל אותו עם H₂O מזוקק לתמיסת מלאי של 3 מ"מ.
לאחר התאמת ספירת הטסיות (לכל דגימה: 1 x 10⁶ טסיות דם), הפעל את הטסיות בצינור עם מפעילי הטסיות למשך 30 דקות ב-RT כמפורט בטבלה 4.
הוסף 43.3 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים לדגימות ודגר את הטסיות למשך 30 דקות ב-RT בחושך.
לאחר הדגירה, יש לדלל את הדגימות עם 300 מיקרוליטר של מאגר קשירת אנקסין 1x (10 מ"מ HEPES/NaOH, pH 7.4, 140 מ"מ NaCl, 2.5 מ"מ CaCl₂) כך שחלבון Annexin V יוכל להיקשר לפוספטידילסרין בצד החיצוני של קרום התא. מדוד את הדגימות מיד.
הערה: מדוד את הדגימות מיד לאחר ההכנה. מכיוון שהדגימות אינן קבועות, עיכוב הכנת הדגימה והמדידה יכול להגדיל את השונות של התוצאות. קיבוע פוגע בכריכת נספח V.

4. הגדרת פיצוי ומדידת פלואורסצנטיות מינוס בקרה אחת (FMO).

הערה: לפני הקלטת נתונים, הפעל הגדרת פיצוי. ציטומטר זרימה מחשב אוטומטית את הגדרות הפיצוי; עיין במדריכים הרגילים של ציטומטר הזרימה להליך הפיצוי המסוים. עם זאת, השתמש בבקרות פיצוי עם תאים או עם חרוזים.

הגדרת פיצויים
1. לפיצוי עם חרוזים, הכינו 150 מיקרוליטר של מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) עבור כל פלואורופור עם טיפה אחת של חרוזים ו-1 מיקרוליטר של הנוגדן המצומד לפלואורסצנטי.
2. עקוב אחר תגובתיות המין של החרוזים. השתמש ב-IgGκ נגד עכבר ובבקרה שלילית של מיקרו-חלקיקי פוליסטירן. כדי לפצות על נספח V, סמן חרוזי PE/Cy7 עם נוגדן PE/Cy7 אנטי-אנושי CD62L המצומד לאותו פלואורופור כמו נספח V.
3. השתמש בחרוזי פיצוי תגובתיים-אמין עבור הצבע המגיב לאמין. השתמש בשתי טיפות של חרוזים חיוביים וטיפה אחת של חרוזים שליליים ב-150 מיקרוליטר של PBS עם 1 מיקרוליטר של הצבע. בדוק שחרוזי הפיצוי המגיבים לאמין מגיבים עם הצבע ומראים אות חיובי. בדוק שהחרוזים השליליים אינם מגיבים עם הצבע המגיב לאמין, ומציגים אות שלילי.
  הערה: עבור Zombie NIR APC-Cy7, השתמש בחרוזים תגובתיים שליליים וחיוביים.
4. דגרו את דגימות הפיצוי למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
5. הפעל כל צינור פיצוי בנפרד ושער על אוכלוסיית החרוזים הבודדים בהתבסס על FSC ו-SSC. אוכלוסיית החרוזים מופיעה כאוכלוסייה מרוכזת אחת קטנה. צייר שער סביב אוכלוסייה זו.
6. הצג את ההיסטוגרמות עבור כל שפופרת פיצוי והתאם את ערכי הפיצוי עד שהפסגות החיוביות של הנוגדנים והצבעים השונים אינן חופפות. לאחר מכן, מדוד כל צינור פיצוי בודד ותן לזליגה של הפלואורופורים להיות מחושבת לפי ה-SOP של היצרן.
7. המשך ברכישת ניסוי הצביעה בפועל עם טסיות הדם האנושיות המבודדות (ראה שלב 3 וטבלה 4). כוונן את מתח ה-SSC/FSC לפני המדידה כדי למצוא את אוכלוסיית טסיות הדם. מכיוון ש-CD61 מתבטא בכל מקום על טסיות הדם, בדוק עם סף הקרינה הזה אם ניתן לזהות כל גודל של טסיות הדם.
8. לאחר מכן, מדוד 20,000 אירועים לדגימה.
מדידת FMO
1. הכן לכל סמן פקד FMO לפי טבלה 5. על מנת להיות מסוגל לקבוע את החפיפה של כל הסמנים, הכינו דגימות לא מגורות ומגורות.

5. ניתוח נתונים

ניתוח עם תוכנת ניתוח נתונים של ציטומטריית זרימה (איור 4)
1. גרור ושחרר את קבצי FSC לתוכנה. הגדר עם בקרת FMO את האוכלוסייה החיובית עבור כל סמן.
  1. קבע FMOs על ידי התוויית כל פקד FMO מול כל סמן בתרשים נקודות. זה הופך את הזליגה לערוצים אחרים גלויה. השתמש בשער FMO עם זליגת הקרינה הגבוהה ביותר כגבול לאוכלוסייה החיובית עבור דגימות 10 הצבעים המטופלות.
ניתוח עם ניתוח ציטומטריית זרימה מבוסס ענן (איור 5)
1. פתח את התוכנה וצור מערך נתונים חדש. גרור ושחרר את קבצי ה-FCS שנרכשו עם ציטומטר הזרימה.
2. התחל את הניתוח על-ידי יצירת זרימת עבודה. מטריצת הפיצוי נוצרת אוטומטית מקבצי הנתונים הגולמיים.
3. הפעל ניתוח UMAP עם ההגדרות הבאות: שכנים: 15, מרחק מינימלי: 0.4; רכיבים: 2; מטרי: אוקלידי; קצב למידה: 1; תקופות: 200; אתחול הטמעה: ספקטרלי. בחר את כל הקבצים ואת כל 10 הסמנים (תכונות).
4. הוסף ניתוח Phenopraph כמשימה חדשה והפעל את הניתוח עם ההגדרות הבאות: K השכנים הקרובים ביותר: 20; מדד מרחק: אוקלידי; ריצות לובן: 1; מספר תוצאות: 1.
5. הוסף משימת שער כדי לציין את האשכולות שנוצרו. לאחר הפעלת הניתוח, ניתן להציג את הנתונים בכתמים שונים, אותם ניתן לייצא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ישנן שתי אפשרויות לניתוח הנתונים הגולמיים שנאספו על ידי פאנל ציטומטריית זרימה רב צבעוני. אפשרות אחת היא לנתח אותו באופן ידני עם תוכנת הניתוח (איור 3 ואיור 4). לכן, יש לגרור ולשחרר את הנתונים הגולמיים לחלון התוכנה. ראשית, יש למצוא את התאים על ידי התאמת סולם SSC/FSC במצב התצוגה של תרשים הפיזור כדי להציג את אוכלוסיית הטסיות כענן נקודות מובהק. לאחר מכן, ניתן להגדיר את התאים החיוביים עבור כל סמן באמצעות הדגימות הלא מטופלות והמטופלות על ידי הבאת התצוגה למצב היסטוגרמה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ציטומטריית זרימה מרובת צבעים מאפשרת להגדיר אשכולות/תת-אוכלוסיות טסיות מובחנות הקשורות לפונקציות בדידות 12,17,18. מכרעת לתוצאות תת-האוכלוסיות וביטוי פני השטח של הקולטן היא איכות הטסיות האנושיות המבודדות. לכן, שלב מרכזי אחד בפרוטוקול המוצג הוא הכנת טסיות הדם. יש לבודד אותם בעדינות כדי למנוע הפעלה לפני טיפול מדגמי עם אגוניסטים שונים. גם כאשר מיושמת השיטה להשוואה בין מחלות שונות, חשוב להוציא לאט לאט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרויקט נתמך על ידי קרן המחקר הגרמנית (DFG) - פרויקט מספר 335549539 - GRK 2381.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מאגר כריכה פי 10	Invitrogen, קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב	88-8103-74	Buffer
אדנוזין דיפוספט (ADP)	בדיקה ו-go Labordiagnostica GmbH Lemgo, גרמניה	70212	אגוניסט טסיות דם
נספח V PE-Cyanine7	Invitrogen, קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב	88-8103-74	צבע
anti-CD41 AF 700	BioLegend, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב	303728	נוגדנים
אנטי-CD41 Alexa Fluor 700	BioLegend, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב	303727	נוגדנים
אנטי-CD42b PerCP/ציאנין5.5	BioLegend, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב	303918	נוגדנים
anti-CD61 BV605	BD Bioscience פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי, ארה"ב	744382	נוגדנים
נוגדן נגד CD62P PE	בקמן קולטר, בריאה, קליפורניה, ארה"ב	IM1759U	נוגדנים
אנטי-CD63 PE/Cy5	Abcam, קמבריגד, בריטניה	נוגדן 234251 ab
anti-CXCR4 BV650	BD Bioscience פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי, ארה"	ב 740599	נוגדנים
אנטי-CXCR7 BV421	BD Bioscience פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי, ארה"ב	566234	נוגדנים
anti-PAC-1 FITC	BD Bioscience פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי, ארה"ב	340507	נוגדנים
אלבומין בסרום בקר (BSA)	Applichem, דרמשטדט, גרמניה	A1391-חומצת
ציטריט	Carl Roth, קרלסרוהה, גרמניה	6490.1-CRP-XL
	CambCol Laboratories, Ely, בריטניה	CRP-XL	אגוניסט טסיות דם
D-(+)-גלוקוז	סיגמא אולדריץ' ושות', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב	G7528-Dubecco
' s פוספט חוצץ מלח (PBS)	Sigma Aldrich Co, סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב	D8537-Hemin
	Sigma Aldrich Co., סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב	H9039-10G	טסיות דם אגוניסט
HEPES	Carl Roth, קרלסרוהה, גרמניה	9105.3-אשלגן
כלורי	Carl Roth, קרלסרוהה, גרמניה	6781.3-נתרן
כלורי	Carl Roth, קרלסרוהה, גרמניה	3957.1-נתרן
מימן קרבונט	Sigma Aldrich Co, סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב
401676-Thrombin	רוש		אגוניסט טסיות 10602400001
תלת-סודיום ציטראט-דיהידרט	Applichem, דרמשטדט, גרמניה		1416551211-זומבי
NIR	BioLegend, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב	423105	צבע מגיב אמין

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Freedman, J. E. Molecular regulation of platelet-dependent thrombosis. Circulation. 112 (17), 2725-2734 (2005).
Koupenova, M., Kehrel, B. E., Corkrey, H. A., Freedman, J. E. Thrombosis and platelets: an update. Eur Heart J. 38 (11), 785-791 (2016).
van der Meijden, P. E. J., Heemskerk, J. W. M. Platelet biology and functions: new concepts and clinical perspectives. Nat Rev Cardiol. 16 (3), 166-179 (2019).
Li, Z., Delaney, M. K., O'Brien, K. A., Du, X. Signaling During Platelet Adhesion and Activation. Arterioscl Thrombosis Vas Biol. 30 (12), 2341-2349 (2010).
Oishi, S., et al. Heme activates platelets and exacerbates rhabdomyolysis-induced acute kidney injury via CLEC-2 and GPVI/FcRgamma. Blood Adv. 5 (7), 2017-2026 (2021).
Bourne, J. H., et al. Heme induces human and mouse platelet activation through C-type-lectin-like receptor-2. Haematologica. 106 (2), 626-629 (2021).
Rohlfing, A. K., et al. cGMP modulates hemin-mediated platelet death. Thromb Res. 234, 63-74 (2024).
Chu, Y., Guo, H., Zhang, Y., Qiao, R. Procoagulant platelets: Generation, characteristics, and therapeutic target. J Clin Lab Anal. 35 (5), e23750(2021).
Sodergren, A. L., Ramstrom, S. Platelet subpopulations remain despite strong dual agonist stimulation and can be characterised using a novel six-colour flow cytometry protocol. Sci Rep. 8 (1), 1441(2018).
Agbani, E. O., Poole, A. W. Procoagulant platelets: generation, function, and therapeutic targeting in thrombosis. Blood. 130 (20), 2171-2179 (2017).
Agbani, E. O., et al. Coordinated Membrane Ballooning and Procoagulant Spreading in Human Platelets. Circulation. 132 (15), 1414-1424 (2015).
Heemskerk, J. W., Mattheij, N. J., Cosemans, J. M. Platelet-based coagulation: different populations, different functions. J Thromb Haemost. 11 (1), 2-16 (2013).
Rukoyatkina, N., et al. Multifaceted effects of arachidonic acid and interaction with cyclic nucleotides in human platelets. Thromb Res. 171, 22-30 (2018).
Taylor, M. L., Misso, N. L. A., Stewart, G. A., Thompson, P. J. Differential Expression of Platelet Activation Markers CD62P and CD63 Following Stimulation with PAF, Arachidonic Acid and Collagen. Platelets. 6 (6), 394-401 (1995).
van Velzen, J. F., Laros-van Gorkom, B. A., Pop, G. A., van Heerde, W. L. Multicolor flow cytometry for evaluation of platelet surface antigens and activation markers. Thromb Res. 130 (1), 92-98 (2012).
Hindle, M. S., Spurgeon, B. E. J., Cheah, L. T., Webb, B. A., Naseem, K. M. Multidimensional flow cytometry reveals novel platelet subpopulations in response to prostacyclin. J Thromb Haemost. 19 (7), 1800-1812 (2021).
Johnson, L., Lei, P., Waters, L., Padula, M. P., Marks, D. C. Identification of platelet subpopulations in cryopreserved platelet components using multi-colour imaging flow cytometry. Sci Rep. 13 (1), 1221(2023).
Laspa, Z., et al. Hemin-induced platelet activation is regulated by the ACKR3 chemokine surface receptor and has implications for passivation of vulnerable atherosclerotic plaques. FEBS J. 291 (24), 5420-5434 (2024).
Mueller, K. A. L., et al. Macrophage Migration Inhibitory Factor Promotes Thromboinflammation and Predicts Fast Progression of Aortic Stenosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 44 (9), 2118-2135 (2024).
Jourdi, G., et al. Consensus report on flow cytometry for platelet function testing in thrombocytopenic patients: communication from the SSC of the ISTH. J Thromb Haemost. 21 (10), 2941-2952 (2023).
Flores-Montero, J., et al. Fluorochrome choices for multi-color flow cytometry. J Immunol Meth. 475, 112618(2019).
Clemetson, K. J., et al. Functional expression of CCR1, CCR3, CCR4, and CXCR4 chemokine receptors on human platelets. Blood. 96 (13), 4046-4054 (2000).
Rohlfing, A. K., et al. ACKR3 regulates platelet activation and ischemia-reperfusion tissue injury. Nat Commun. 13 (1), 1823(2022).
Rath, D., et al. Expression of stromal cell-derived factor-1 receptors CXCR4 and CXCR7 on circulating platelets of patients with acute coronary syndrome and association with left ventricular functional recovery. Eur Heart J. 35 (6), 386-394 (2014).
Hashemzadeh, M., et al. A comprehensive review of the ten main platelet receptors involved in platelet activity and cardiovascular disease. Am J Blood Res. 13 (6), 168-188 (2023).
Moroi, M., Farndale, R. W., Jung, S. M. Activation-induced changes in platelet surface receptor expression and the contribution of the large-platelet subpopulation to activation. Res Pract Thromb Haemost. 4 (2), 285-297 (2020).
Busuttil-Crellin, X., et al. Guidelines for panel design, optimization, and performance of whole blood multi-color flow cytometry of platelet surface markers. Platelets. 31 (7), 845-852 (2020).
Fink, A., et al. The Subtilisin-Like Protease Furin Regulates Hemin-Dependent Ectodomain Shedding of Glycoprotein VI. Thromb Haemost. 123 (7), 679-691 (2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

UMAP

ניתוח תת-אוכלוסיות טסיות על ידי ציטומטריית זרימה רב-צבעונית

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים