Method Article

זיהוי FISH רגיש לפולימורפיזם נוקלאוטידי יחיד של שעתוק RNA ריבוזומלי ספציפי ללוקוס ב-Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/67881

⸱

March 28th, 2025

 , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, Stony Brook University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול מתאר שיטת פלואורסצנטיזציה רגישה לפולימורפיזמים בודדים של נוקלאוטידים בודדים (SNP-FISH) כדי להבחין בין תעתיקי RNA ריבוזומליים שמקורם בלוקוס ה-DNA הריבוזומלי של כרומוזום X או Y ב-Drosophila melanogaster.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על מנת להבטיח שמספיק RNA ריבוזומלי (rRNA) יתועתק לתפקוד הריבוזום, הגנומים מכילים מאות כפילויות טנדם של הרצפים המקודדים rRNAs, המרכיבים אזורים הנקראים מיקומי DNA ריבוזומלי (rDNA). הגנומים של אורגניזמים רבים מכילים יותר מלוקוס rDNA אחד המופץ על פני כרומוזומים שונים, ו-rRNA עשוי להיות מועתק ממספר מיקומי rDNA או רק ממיקום יחיד. שינויים במקורות שעתוק rRNA מצביעים לעתים קרובות על מצוקה ריבוזומלית. עם זאת, ההומוגניות של rRNA חוסמת את ההבחנה אם rRNA מועתק ממיקום rDNA מרובה או יחיד. כאן, אנו מתארים שיטה המשתמשת בפלואורסצנציה רגישה לפולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד בהכלאה באתרה (SNP-FISH) כדי להבחין בשעתוק rRNA בין מיקומי rDNA של Drosophila melanogaster על כרומוזומי X ו-Y. שיטה זו ממנפת גרסאות rRNA ספציפיות ללוקוס כדי לאפשר זיהוי קל של מקור שעתוק ה-rRNA ברזולוציה של תא בודד. ניתן ליישם בדיקה זו על כל סוג של תא דרוזופילה וניתן להתאים אותה לשימוש במערכות אחרות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ה-RNA הריבוזומלי 18S, 5.8S ו-28S (rRNAs) הנדרשים לתפקוד הריבוזום מתועתקים במשותף במתקן יחיד הנקרא 45S pre-rRNA. שלושת ה-rRNAs מופרדים בתוך ה-45S pre-rRNA על ידי שני רצפי מרווח מתועתקים פנימיים (ITS) ומשני צדיהם רצפי מרווח מתועתקים חיצוניים (ETS) בקצה 5' ו-3'. כל רצפי המרווחים הללו מוסרים מה-45S pre-rRNA כדי שה-rRNA הבוגרים ישולבו בריבוזומים (ראה1). על מנת לענות על הביקוש הגבוה לייצור rRNA הדרוש לתמיכה בפעילות הריבוזום, כל הגנומים האיקריוטיים מכילים מאות עותקים של רצף 45S. עותקים אלה מקובצים יחד בחזרות דו-צדדיות, ויוצרים אזורים גנומיים הנקראים מיקומי DNA ריבוזומלי (rDNA). רוב הגנומים האיקריוטיים מכילים מספר מיקומי rDNA המפוזרים על פני כרומוזומים נפרדים (ראה2). היתירות הגבוהה של עותקי 45S פירושה שיש בדרך כלל הרבה יותר עותקי 45S מהדרוש לתמלול, ורוב עותקי 45S שקטים מבחינת תמלול וקבורים בהטרוכרומטין3. פעילות השעתוק אינה אחידה על פני מיקומי rDNA, ושונות בשעתוק לוקוס rDNA נצפית באופן נרחב על פני אורגניזמים 4,5,6, מה שמצביע על כך שעתוק 45S מווסת באופן דיפרנציאלי במיקומי rDNA בודדים. השתקת rDNA ברחבי הלוקוס נצפתה בצמחים, חסרי חוליות וחולייתנים 7,8,9,10, מה שמצביע על כך שהשתקת rDNA ברחבי הלוקוס היא מנגנון עיקרי לוויסות מינון rRNA 11. שעתוק rRNA הוא שלב רגולטורי מרכזי בייצור ריבוזום, ושינויים בשעתוק rRNA המווסתים את פעילות התרגום הם מאפיין חשוב הן של התמיינות נורמלית והן של מצבי מחלה12. שינויים בשעתוק לוקוס rDNA קשורים גם להפחתה בסך עותק ה-rDNA מספר13. לפיכך, שעתוק rDNA ספציפי ללוקוס שונה עשוי להיות אינדיקטור חשוב לפיזיולוגיה תאית משובשת.

בעוד שנראה כי השתקה ספציפית ללוקוס היא מקור עיקרי לוויסות שעתוק rRNA, המנגנונים הקובעים את ההשתקה הזו ומכוונים אילו אתרי rDNA פעילים מבחינה שעתוק אינם ידועים ברובם. ההומוגניות של רצפי rDNA מקשה על הערכת שעתוק לוקוס rDNA בודד, ומונעת ניתוח נרחב של פעילות שעתוק rDNA ספציפית ללוקוס. ייתכן שניתן יהיה להתגבר על אתגר זה על ידי ניצול השונות המבנית ורצף הנוקלאוטידים הבודדים בין עותקי rDNA בתוך אותו גנום 4,5,6,13. חלק מהגרסאות הללו עשויות להיות משותפות בין רוב או כל העותקים בלוקוס בודד, וליצור הפלוטיפים ייחודיים של לוקוס rDNA של מספר גרסאות המבדילות בין לוקוס rDNA. ואכן, מיפוי עדכני של וריאנטים של rDNA למיקומים ספציפיים על ידי קונסורציום טלומיר לטלומרים חשף וריאנטים משותפים של rDNA ספציפיים ללוקוס בגנום האנושי14. מפות מיקום rDNA כאלה עשויות לאפשר זיהוי של שעתוק ספציפי ללוקוס ממערכי נתונים של ריצוף; עם זאת, הזמינות של מפות אלה נותרה מוגבלת כיום ולא קל להפיק אותן. מכיוון שלוקוסי rDNA שוכנים רק על כרומוזומי המין ב-Drosophila melanogaster (לוקוס אחד על כל כרומוזום X ו-Y)15, לוקוס ה-rDNA של כרומוזום Y נעדר מנקבות XX. בידוד טבעי זה ממיקום כרומוזום Y פירושו שניתן לזהות בקלות וריאנטים של פולימורפיזם נוקלאוטידי יחיד (SNP) בין מיקומי ה-rDNA X ו-Y בריצוף קריאה קצרה כמו כל וריאנט הקיים בזכרים (XY) אך נעדר מנקבות (XX). ניתן לבדוק במהירות SNPs שזוהו בעבר בזני דרוזופילה לא גנוטיפיים באמצעות ריצוף PCR ו-Sanger פשוט של DNA מזכרים ונקבות. יתר על כן, הזמינות של זני דרוזופילה עם כרומוזום X שאין לו לוקוס rDNA16 פירושה שניתן לבודד לוקוסי rDNA בודדים X ו-Y בנפרד לאפיון rDNA SNP מדויק עוד יותר. זיהוי קל זה של וריאנטים SNP בין מיקומי ה-rDNA של דרוזופילה מאפשר לקבוע הפלוטיפים ייחודיים של X ו-Y rDNASNP 13. אתרי rDNA של כרומוזום X הם גם בדרך כלל שקטים לחלוטין אצל זכרי דרוזופילה, אך שני מיקומי כרומוזום X משועתקים בנקבות10,17, מה שהופך את דרוזופילה למערכת שימושית לחקר השתקת rDNA ברחבי המקום.

הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) היא כלי רב עוצמה להמחשת נוכחותם של רצפי RNA או DNA ספציפיים בתוך התאים הבודדים של רקמה. תוויות FISH מכוונות לרצפי RNA או DNA באמצעות בדיקות אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס המצומדות לפלואורופורים. בדיקות FISH נדרשות בדרך כלל להיות באורך ~20 נוקלאוטידים על מנת לספק קשירת מטרה יציבה מספיק כדי שניתן יהיה להמחיש אותה, אך בדיקות באורך כה רב יכולות גם להיקשר בקלות לרצפים שאינם מטרה הנבדלים זה מזה בנוקלאוטיד בודד בלבד (איור 1A). לעומת זאת, בדיקות קצרות מספיק כדי להעניק ספציפיות של נוקלאוטיד יחיד אינן נקשרות בצורה יציבה מספיק להדמיה. כדי לאזן את הספציפיות והיציבות, FISH SENSITIVITY-SNP (SNP-FISH) משלב בדיקה פלואורסצנטית ארוכה אנטי-סנס ~26 נוקלאוטיד עם מסכת חישה לא פלואורסצנטית אוליגונוקלאוטיד שנקשר לכל הפרטים מלבד קצה 5' של הגשושית18. מסכה זו משאירה רק את 10 הנוקלאוטידים הגדולים ביותר של הגשושית חד-גדיליים וזמינים לקשירת מטרה (איור 1B). החלק החד-גדילי הקצר הזה של הגשושית מעניק ספציפיות למטרה אך מונע תגובתיות צולבת עם רנ"א שיש להם אפילו אי-התאמה אחת עם 10 הנוקלאוטידים הללו (איור 1B). ברגע שקצה ה-5' של הגשושית קושר את המטרה שלו, תזוזה פסיבית של גדיל מסירה את המסכה מהבדיקה, ומאפשרת לאזור 3' לקשור את המטרה ויוצרת תיוג מטרה יציב (איור 1B)18. לכן, SNP-FISH יכול לדמיין באופן דיפרנציאלי רנ"א שנבדלים ב-SNP יחיד על ידי שימוש בזוג בדיקות שיש להן פלואורופורים שונים שכל אחד מהם משלים SNP אחר אך חולק מסכה משותפת (איור 1C). למרות ששיטה זו מגייסת רק בדיקה מצומדת פלואורופור אחת ל-SNP המטרה, ניתן להשתמש באיגום מספר ערכות מסכות בדיקה למספר SNPs בתוך הפלוטיפ rDNA משותף כדי להגביר את הזיהוי הרגיש ל-SNP של rRNA יחיד (איור 1D). יתר על כן, מכיוון ש-rRNA מתומלל כל כך בשפע, ניתן לדמיין בקלות תעתיקי rRNA בניסויי FISH באמצעות מספר קטן של תוויות פלואורסצנטיות לכל RNA. דרישה נמוכה זו לפלואורופור לכל RNA פירושה ש-SNP-FISH יכול לדמיין rRNAs מלוקוס ספציפי עם כמה SNPs ייחודיים בלבד. שיטה זו יכולה לזהות בקלות שעתוק rRNA ספציפי ללוקוס במגוון רקמות דרוזופילה ושלבי התפתחות17. הוא יעיל במיוחד בתאי גזע זכריים של דרוזופילה, המשתנים בין שעתוק Y-rDNA בלעדי לביטוי משותף של אתרי rDNA של כרומוזום X ו-Y במהלך גיל13. כאן, אנו מספקים פרוטוקול SNP-FISH להמחשת תעתיקי rRNA מובהקים של X ו-Y באשך הדרוזופילה כדי להשיג את המטרה הכוללת של הערכת השתקת rRNA ספציפית למיקום. שיטה זו משתמשת בארבעה SNPs שאופיינו בעבר בין מיקומי ה-rDNA בכרומוזומי X ו-Y של זן הדרוזופילה הנפוץ במעבדה y1w1 (איור 1D).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת מאגרים וריאגנטים

הערה: יש להשתמש בטכניקה נטולת RNase לאורך שלבים 1, 3 ו-4, ויש להשתמש בריאגנטים מוסמכים ללא RNase.

  1. במכסה מנוע כימי, הכינו 40 מ"ל של פורמלדהיד 4% בתמיסת קיבוע PBS 1x על ידי הוספת 10 מ"ל של 16% פורמלדהיד ו-4 מ"ל 10x PBS ללא RNase ל-26 מ"ל מים ללא RNase. מחלקים למכסות של 1 מ"ל ושומרים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס תוך 30 דקות מההכנה. ניתן לאחסן את תמיסת הקיבוע בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים.
    זהירות: התמיסה מכילה פורמלדהיד. טפל בכפפות ובציוד הגנה אישי מתאים והשליך אותו בבטחה.
  2. הכן 10 מ"ל של מאגר הכלאה על ידי ערבוב של 1 מ"ל של 20x תמיסת מלח-נתרן ציטראט (SSC) נטול RNase, 1 גרם דקסטרן סולפט, 100 מיקרוליטר של 100 מ"ג/מ"ל Saccharomyces cerevisiae tRNA, 100 מיקרוליטר של 200 מ"מ קומפלקס ריבונוקלאוזיד ונדיל, 1 מ"ל של 5% BSA נטול RNase, 1 מ"ל של פורממיד נטול יונים בשילוב עם 6 מ"ל מים ללא RNase. מחלקים לתוך 1 מ"ל בצינורות מיקרופוגה של 1.5 מ"ל ושומרים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד חודש.
  3. הכן 50 מ"ל של מאגר כביסה על ידי הוספת 5 מ"ל של 20x SSC נטול RNase, 5 מ"ל של פורממיד נטול יונים, 50 מיקרוליטר של Triton-X עד 40 מ"ל של מים ללא RNase. יש לאחסן בטמפרטורת החדר בחושך עד חודש.
  4. הכן 10 מ"ל של מאגר בידוד DNA על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של 1M Tris-HCl pH 7.5-8.0, 20 מיקרוליטר של 0.5M EDTA ו-50 מיקרוליטר של 5M NaCl ל-9.8 מ"ל מים.

2. גנוטיפ מדגם עבור SNPs rRNA ספציפיים ל-X ו-Y

  1. אספו נקבות וזכרים הומוזיגוטיים הומוזיגוטיים בודדים המכילים את אותו כרומוזום X בצינורות של 0.2 מ"ל וצננו על הקרח.
  2. שלב 50 מיקרוליטר של מאגר בידוד DNA עם 0.5 מיקרוליטר של 20 מ"ג / מ"ל פרוטאינאז K לדגימה.
  3. הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר בידוד DNA / Proteinase K לדגימת הדרוזופילה והומוגניזציה של הדגימה באמצעות קצה פיפטה.
  4. דגירה של דגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ולאחר מכן 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. העבירו 40 מ"ל של דגימה (הימנעו מפסולת בעלי חיים) לצינור נקי של 1.5 מ"ל.
  5. הגבר בנפרד כל אזור יעד SNP מכל דגימת DNA על ידי PCR באמצעות ריכוז של 10 מיקרומטר של זוגות הפריימר הבאים: 18S SNP קדימה + הפוך; ITS1 SNP קדימה + אחורה; 28S SNP קדימה + אחורה. רצף הפריימר וגודל אמפליקון ה-PCR הצפוי נמצאים בטבלה 1.
  6. השתמש באלקטרופורזה של ג'ל כדי להפריד את כל דגימת ה-PCR על ג'ל 1% אגרוז 1x TAE כדי לאשר את תוצר ה-PCR הצפוי. גדלי המוצרים הצפויים מפורטים בטבלה 1.
  7. בודד מוצר PCR מהג'ל באמצעות כל ערכת מיצוי ג'ל זמינה מסחרית.
  8. רצף תוצרי PCR על ידי ריצוף Sanger. דגימות רצף בשני הכיוונים באמצעות תגובות בודדות נפרדות עבור פריימר F ו-R עבור כל מטרה.
  9. קבע את וריאנט ה-SNP של כרומוזום X במיקומים בטבלה 2 בדגימת DNA נקבה לא מזווגת. הפלוטיפ X הצפוי מתואר בטבלה 2.
  10. התבונן במיקומי SNP בכרומטוגרמה של רצף דגימות DNA זכריות. הסקת גרסת SNP של כרומוזום Y המבוססת על גרסת X SNP שכבר נקבעה בכל עמדת SNP. הפלוטיפ Y הצפוי מתואר בטבלה 2.
שם פריימררצףגודל אמפליקון צפוי
18S SNP FGACTACCATGGTTGCAACGG652 נ"ב
18S SNP RTTCACCTCGCGTCGTCGTAAT
ITS1 SNP FCTTGCGTGTTACGGTTTTC955 נ"ב
ITS1 SNP RACAGCATGGACTGCGATATG
28S SNP FATGCGTAGAAGTGTTTGGCG598 נ"ב
28S SNP RGCCGACTTCCCTTACCTACTA

טבלה 1: רצפי פריימר לריצוף SNPs של rDNA. זוגות פריימר להגברת אזורי rDNA המכילים SNPs שאופיינו בעבר באזורי 18S, ITS1 ו-28S rDNA. רצף אוליגונוקלאוטידים פריימר וגודל אמפליקון PCR צפוי מפורטים.

הפלוטיפעמדת SNPרצף
X rDNA18 ש1603-ATACTTGTATTTTTTCATATG-1625
ITS1-12873-CGTTAATAAATATTTGTAATT-2895
ITS1-23115-GAAAATCGAAGAAACAAAATT-3137
28 ש5932-AACAAAAATGCCTAACTATAT-5954
Y rDNA18 ש1603-ATACTTGTATCTTTTCATATG-1624
ITS1-12873-CGTTAATAAACATTTGTAATT-2895
ITS1-23115-GAAAATCGAAAAAACAAAATT-3137
28 ש5932-AACAAAAATGGCTAACTATAT-5954

טבלה 2: הפלוטיפים צפויים של rDNA. SNPs צפויים במיקומי rDNA של כרומוזום X ו-Y בזן Drosophila y1w1 . SNP מסומן בהדגשה ומסומן בקו תחתון. המיקום רשום על סמך רצף 45S rRNA קונצנזוס (קובץ משלים 1).

3. דיסקציה של האשכים, קיבוע וחדירות

  1. נקה סטריאומיקרוסקופ, תחנת עבודה, צלחת ניתוח ומלקחיים עם 70% אתנול (או טיפול אחר ב-RNase).
  2. תחת סטריאומיקרוסקופ, נתח את דרוזופילה כדי לבודד אשכים ב-PBS נטול RNAse 1x. אחזו באמצע הבטן של החיה עם זוג מלקחיים אחד ותפסו את קצה הבטן עם זוג מלקחיים נוסף כדי למשוך בעדינות את החיה זו מזו. האשכים יתנתקו מהחיה וניתן להפריד אותם עוד יותר באמצעות מלקחיים. אסוף 30 - 40 אשכים לכל דגימה.
  3. בעזרת מלקחיים מרימים אשכים ומעבירים אותם מכלי החיתוך לצינור מיקרופוגה של 1.5 מ"ל המכיל 0.5 מ"ל של PBS 1x נטול RNase.
  4. שאפו PBS והוסיפו 1 מ"ל של תמיסת קיבוע. דגירה בטמפרטורת החדר על שייקר אגוזים למשך 30 דקות.
  5. שטפו פעמיים עם 1 מ"ל של PBS 1x ללא RNase למשך 5 דקות כל אחד על שייקר אגוזים. שאפו 1x PBS והוסיפו 1 מ"ל של אתנול 70% ללא RNase (EtOH). יש לדגור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה על שייקר אגוזים.

4. דגי RNA ריבוזומליים רגישים ל-SNP

  1. שאפו אתנול והוסיפו 1 מ"ל של מאגר כביסה. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות על שייקר מזמין, ולאחר מכן 2 דקות של צינור במנוחה זקופה.
  2. מערבבים בדיקות ומסכות עם מאגר הכלאה, מה שיוצר 100 מיקרוליטר של נפח כולל לדגימה. בדיקה, רצפי מסכות ותוויות פלואורופור מפורטים בטבלה 3. בעת שימוש בכל 4 ה-SNPs, הכינו 80 מיקרוליטר של מאגר הכלאה, 1 מיקרוליטר כל אחד מ-10 מיקרומטר Y-SNP בדיקה (סה"כ 4 מיקרוליטר), 1 מיקרוליטר כל אחד מ-10 מיקרומטר X-SNP בדיקה (סה"כ 4 מיקרוליטר), ו-3 מיקרוליטר כל אחד ממסכה משותפת של 10 מיקרומטר (סה"כ 12 מיקרוליטר)
  3. שאפו את מאגר הכביסה, ואז הוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסת הכלאה. מרחו סרט שקוף על שולי הצינור, עטפו בנייר אלומיניום להגנה מפני אור, ודגרו באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפחות.
  4. הוסף 1 מ"ל של מאגר כביסה לדגימה מבלי לשאוב את תמיסת ההכלאה. דגירה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך.
  5. שאפו מאגר כביסה, ולאחר מכן הוסיפו 1 מ"ל של מאגר כביסה לדגימה. דגירה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך.
  6. שאפו את מאגר הכביסה והוסיפו 50 מיקרוליטר של מדיית הרכבה. ניתן להרכיב דגימות מיד על שקופיות או לאחסן עד שבוע בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפני ההרכבה.
עמדת SNPאוליגונוקלאוטידרצףפלואורופור מצומד 3 אינץ'
18 שבדיקת X SNPAAAAAATACAAGTATTTAATCACATAאלכסה 488
בדיקת Y SNPAAAAGATACAAGTATTTAATCACATAאלכסה 647
מסכהTATGTGATTAAATACT
ITS1-1בדיקת X SNPAAATATTTATTAACGGTAAGGATATTאלכסה 488
בדיקת Y SNPAAATGtttattaacggtaaggatattאלכסה 647
מסכהAATATCCTTACCGTTA
ITS1-2בדיקת X SNPGTTTCTTCGATTTTCATGTTCGAAACאלכסה 488
בדיקת Y SNPGTTTTTTCGATTTTCATGTTCGAAACאלכסה 647
מסכהGTTTCGAACATGAAAA
28 שבדיקת X SNPTTAGGCATTTTTGTTTTTTACTTGAAAAאלכסה 488
בדיקת Y SNPTTAGCCATTTTTGTTTTTTACTTGAAAAאלכסה 647
מסכהTTTTCAAGTAAAACAA

טבלה 3: רצפי בדיקה ומסכה עבור rDNA SNP-FISH. עמדות ה-SNP מודגשות באותיות מודגשות. חלק הבדיקה שנקשר למסכה אוליגונוקלאוטיד מודגש. מפורטות דוגמאות לפלואורופורים מצומדים מתאימים בגודל 3 אינץ', אך ניתן להשתמש בכל פלואורופורים תואמים.

5. הכנת דגימות להדמיה

  1. בעבודה תחת סטריאומיקרוסקופ מנתח, השתמש בפיפטה בעלת פתח רחב כדי להעביר את הדגימה לשקופית מיקרוסקופ.
  2. בעזרת מלקחיים, סדרו את האשכים בשורה כדי להקל על מציאת דגימות בעת הדמיה (אין צורך בכיוון ספציפי). כסו את הדגימה עם כיסוי. כתם את הכיסוי קצוות עם מגבון טישו כדי להסיר עודפי מדיית הרכבה.
  3. אטום את שולי הכיסוי בעזרת לק. יש להשאיר את ההחלקה בחושך בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לייבוש הלק. ניתן להשתמש בשקופיות באופן מיידי להדמיה קונפוקלית או לאחסן אותן עד חודש בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפני ההדמיה.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תוצאות ריצוף מגנוטיפ SNP צפויות לזהות הבדלים ב-SNP בין מיקומי ה-X וה-Y rDNA. SNPs אלה מזוהים על ידי הערכה ישירה של מיקומי ה-SNP ברצף כרומטוגרמות (איור 2). לריצוף של דגימות נקבות צפוי להיות אות ריצוף יחיד במיקום SNP, מה שמצביע על הומוזיגוטיות SNP בין שני כרומוזומי X (איור 2A). תוצאות ריצוף מדגם גברים צפויות להיות בעלות שיא כפול במיקום SNP (איור 2B). בהתבסס על הגנוטיפ של כרומוזום X שנקבע מריצוף דגימה נשית, ניתן להסיק כי הווריאנט שאינו X הוא SNP rDNA של כרומוזום Y (כלומר, X = T, Y = C עבור ריצוף 18S SNP באיור 2). לחלופין, שיא ריצוף יחיד במיקום SNP בדגימה הזכרית יצביע על הומוזיגוטיות בין מיקומי rDNA זכריים ונקביים במיקום SNP זה, ומיקום זה לא יהיה שמיש עבור rRNA SNP-FISH.

בעקבות הפרוטוקול עבור SNP FISH, ניתן לדמיין דגימות על ידי הרכבה על שקופיות ולהניח אותן מתחת להחלקת כיסוי אטומה, ואחריה מיקרוסקופיה קונפוקלית. באמצעות הבדיקות המפורטות בטבלה 3, אות ה-rRNA הנגזר מ-Y מזוהה על ידי פליטת Alexa Fluor 647 ואות ה-rRNA הנגזר מ-X מזוהה על ידי פליטת Alexa Fluor 488. אותות rRNA צפויים להיצפה בגרעין, שניתן לזהות כחור דל DAPI בגרעין (איור 3A). קל במיוחד לזהות את הגרעין בתאי נבט בשל הגרעין והגרעין הגדולים שלהם (איור 3A). האות החלש יכול להימצא בדרך כלל גם בציטופלזמה (איור 3), אך זהו אות לא ספציפי שניתן לזהות גם בדגימות ללא rRNA המכיל SNP משלים (כלומר, אות Y בתאים חסרי Y rDNA או אות X בתאים חסרי X rDNA; איור 3B-C). יתר על כן, לפעמים ניתן לזהות תיוג משותף מלאכותי של X ו-Y rRNA במרכז הסומטי, אפילו בדגימות שחסרות מיקומי X או Y rDNA (איור 3B-C, חיצים צהובים). לפיכך, יש להשתמש רק באותות גרעיניים כדי להעריך שעתוק ספציפי למיקום. לרוב התאים, במיוחד תאים סומטיים, צפוי להיות רק אות Y rRNA, מה שמצביע על כך ש-rRNA מועתק באופן בלעדי ממיקום ה-Y rDNA (איור 3A, עיגול מקווקו צהוב וחץ אדום)10,17. עם זאת, ביטוי משותף של X ו-Y rRNA מזוהה לעתים קרובות בתאי נבט, במיוחד תאי גזע של קו הנבט13 (איור 3A, עיגולים מנוקדים לבנים). אותות rRNA X ו-Y בתאים המבטאים במשותף יכולים להיות סמוכים וליצור גרעין יחיד (איור 3A, תא עליון), או יכולים להיות נפרדים, וליצור שני גרעינים (איור 3A, תא תחתון). הדוגמאות באיור 3 מסופקות מ-rDNA SNP-FISH באמצעות ערכות בדיקה המכוונות לשני SNPs בלבד (שני ה-SNPs של ITS1), מה שמדגים שרק שני SNPs נחוצים עבור rDNA SNP-FISH. עם זאת, אותות חזקים יותר נצפים בעת שימוש בבדיקות המכוונות לכל ארבעת ה-SNPs13.

בקרות שליליות הן הכללה חשובה לבדיקה זו כדי לאשר שבדיקות אינן מגיבות עם יעד SNP שגוי, במיוחד כאשר פותרים לראשונה את השיטה. בקרות שליליות של כרומוזום X כוללות כל מצב שחסר כרומוזום X rDNA, כגון זכרים המכילים כרומוזום X עם מחיקת rDNA. הבקרות השליליות של כרומוזום X צפויות לזהות רק אות Y rRNA ולא X rRNA (איור 3B). בקרות שליליות של כרומוזום Y כוללות כל מצב שחסר כרומוזום Y rDNA. כמה דוגמאות למצבים אלה הם רקמות נקביות XX, רקמות מזכרים חסרי כרומוזום Y, או זכרים המכילים כרומוזום Y עם מחיקת rDNA15. הבקרות השליליות של כרומוזום Y צפויות לזהות רק אות X rRNA ואין להן אות Y rRNA הניתן לזיהוי (איור 3C). שים לב שפקדים אלה חשובים לא רק לקביעת ספציפיות הבדיקה, אלא גם לקביעת כל רקע או חפצים של האות. ניתן להשתמש במדויק בכל בדיקות או תנאי בדיקה חדשים המספקים ספציפיות בבקרות כאלה כדי לזהות שעתוק rDNA ספציפי למיקום.

תנאים גנטיים, התפתחותיים או סביבתיים שונים עשויים לשנות את הסבירות ש-rDNA מועתק באופן בלעדי ממיקום ה-rDNA של כרומוזום Y13,17. ניתן לכמת את תדירות שעתוק ה-rDNA מלוקוס בודד או ממספר מיקומים ולהשוות ישירות בין דגימות. על מנת להשוות כמותית הבדלים בשעתוק לוקוס rDNA, כל תא חייב להיות מסווג בנפרד כדומיננטי Y, דומיננטי משותף או דומיננטי X. תאים מסווגים כדומיננטיים ב-Y ו-X רק אם רק האות המתאים מזוהה. כל תא עם אותות Y ו-X rRNA נחשב לדומיננטי, גם אם אות אחד חלש בהרבה מהשני. לפיכך, תאים המכילים אותות X ו-Y חזקים מאוד נחשבים מבחינה איכותית זהים לתאים עם Y חזק ו-X חלש או אותות X חזקים ו-Y חלשים. ניתן להשוות את האחוז הכולל של כל התאים בכל הדגימות בכל קטגוריה בין דגימות על ידי מבחן חי בריבוע. בעוד שבדיקה זו פועלת היטב כדי לקבוע באופן איכותי אם לוקוס rDNA מסוים מתומלל או לא, לא ראינו הערכות עקביות בין דגימות בעת כימות ישיר של עוצמת הקרינה של אותות SNP-FISH בודדים. לפיכך, איננו ממליצים לבצע הערכות כמותיות של עוצמת אות FISH בין דגימות או את העוצמה היחסית של אותות rDNA X ו-Y בתוך תא בודד. המקור לחוסר עקביות זה בעוצמת הקרינה אינו ברור, אם כי ייתכן שהוא נובע מקשירה לא יעילה של בדיקות מוסוות שאינן נקשרות לכל ה-rRNA המטרה.

figure-results-1
איור 1: דיאגרמה של שיטת SNP-FISH. (A) בדיקות אוליגונוקלאוטידים אנטיסנס מסורתיות של FISH מגיבות עם RNA שאינו מטרה הנבדלים זה מזה בנוקלאוטיד אחד בלבד. (B) שיטת SNP-FISH משתמשת באוליגו-נוקלאוטיד מסכה משלימה הקשור לאזור 3' של בדיקת האוליגו-נוקלאוטיד. המסכה משאירה רק 10 נוקלאוטידים חופשיים להיקשר לרצף המטרה. אזור בדיקה ללא מסיכה אינו נקשר ביציבות לרצפים שאינם מטרה הנבדלים בנוקלאוטיד אחד או יותר. המסכה מתנתקת מהגשושית לאחר שהגשושית נקשרת למטרה, ומאפשרת קשירה יציבה בין הגשושית למטרה. (C) בדיקות SNP מזווגות עם תוויות שונות בשילוב עם מסכה משותפת קושרות באופן ספציפי מטרות הנבדלות בנוקלאוטיד בודד ללא תגובה צולבת. (D) ניתן לאגד בדיקות מרובות יחד כדי לסמן באופן ספציפי הפלוטיפים מובחנים של rRNA. ארבעה הבדלים ב-SNP אופיינו בין מיקומי X ו-Y rDNA בזן y1w1 Drosophila melanogaster . SNP אחד ב-18S rRNA, אחד ב-28S rRNA, ושניים בחלק ה-ITS1 של ה-pre-rRNA. מוצגים הפלוטיפים rRNA ספציפיים ל-X ו-Y המשמשים עבור SNP-FISH. בדיקות המכוונות לגרסאות X rDNA בארבעת ה-SNPs של rRNA מצומדות לפלואורופור נפוץ (ירוק), ובדיקות המכוונות לגרסאות Y rDNA מצומדות לפלואורופור אחר (מג'נטה). מסכה משותפת משמשת לכל SNP (ארבעה בסך הכל). קשירת בדיקה ספציפית ל-SNP בכל מיקום SNP ב-rRNA יכולה לתייג באופן ספציפי rRNA ממיקומי ה-rDNA X ו-Y עם עד ארבע בדיקות אוליגונוקלאוטידים של FISH. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: דוגמאות לתוצאות ריצוף rDNA SNP הומוזיגוטיות והטרוזיגוטיות. דוגמה לרצף כרומטוגרמות מריצוף 18S SNP של DNA מדגימות (A) נקבה ו-(B) זכר. מיקום SNP 18S מסומן בכוכבית (*). אות התימין היחיד (T) עבור מיקום ה-SNP בדגימה הנשית מצביע על תימין במיקום SNP במיקום ה-rDNA של כרומוזום X. האות הכפול במיקום SNP המפוצל בין תימין לציטוזין (C) בדגימה הגברית מצביע על ציטוזין במיקום SNP בלוקוס rDNA של כרומוזום Y (מוסק על ידי ידיעה שתימין נמצא במיקום כרומוזום X). תוצאות הריצוף נצפו באמצעות ApE - תוכנת עורך פלסמיד19. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: דוגמאות לתוצאות SNP-FISH באשך Drosophila באמצעות שתי ערכות בדיקה SNP-FISH בלבד. דוגמאות SNP FISH באשך של בעלי חיים עם (A) גם X וגם Y rDNA, (B) רק Y rDNA, או (C) רק X rDNA. דוגמאות אלה השתמשו רק בערכות בדיקה המתייגות את שני ה-SNPs של ITS1 rRNA, מה שמדגים כי דגי rRNA SNP עובדים עם שני SNPs מטרה בלבד. תאי נבט מזוהים על ידי הגרעין העגול הגדול שלהם, ותאים סומטיים על ידי הגרעין הקטן והפחות עגול שלהם. תאי גזע של קו הנבט מזוהים על ידי מיקומם ישירות ליד הרכזת הסומטית, המסומנת בכוכבית (*). תאי נבט המתעתקים rDNA הן מאתרי ה-X והן מ-Y rDNA מזוהים על ידי אותות FISH גרעיניים X ו-Y (עיגולים מנוקדים לבנים, A-A'). לתאי נבט המתעתקים DNA רק ממיקום Y rDNA יש רק אות FISH גרעיני Y (עיגול מקווקו צהוב). תאים סומטיים המבטאים Y בלבד מסומנים בחץ אדום. ניתן לצפות בתיוג משותף מלאכותי של מיקומי X ו-Y rDNA במרכז הסומטי (חץ צהוב). סרגל קנה המידה הוא 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: רצף rRNA של מיקום כרומוזום X. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים שיטה לשימוש ב-SNP-FISH כדי להבחין בין תעתיקי 45S rRNA שמקורם במיקומי ה-rDNA של כרומוזום X ו-Y ברקמות Drosophila melanogaster . השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה הוא הגנוטיפ המדויק של 45S SNPs שישמשו כמטרות SNP-FISH. אנו מספקים פריימרים ופרוטוקול לגנוטיפ ארבעה SNPs ידועים של Drosophila 45S, אך שיטות ריצוף אחרות עשויות לחשוף SNPs חדשים שיכולים לשמש לחלופין לבדיקה. לא ניתן להשתמש בכל עמדות SNP שנמצאו זהות בין אתרי rDNA של כרומוזום X ו-Y (כלומר, יש שיא ריצוף יחיד בדגימות DNA זכריות) עבור SNP FISH. חלק ממיקומי ה-SNP עשויים להימצא הטרוגניים בתוך לוקוס rDNA יחיד (כלומר, תוצאות הריצוף אינן נותנות וריאנט SNP יחיד עבור דגימות XX או רק שיא ריצוף שני מינורי מאוד בדגימות XY). SNPs הטרוגניים בתוך לוקוס rDNA יחיד גם אינם מתאימים לבדיקה זו מכיוון שאחת הגרסאות תהיה משותפת בין שני מיקומי ה-rDNA, מה שהופך את השעתוק מלוקוס יחיד או ממספר מיקומים לבלתי ניתן להבחנה. יתר על כן, עקב אחסון זרע נקבי20, DNA מבודד מנקבות מזווגות עשוי להכיל rDNA של כרומוזום Y. לפיכך, זה קריטי שנקבות לא מזווגות ישמשו לניתוח ריצוף XX. חשוב לציין, שיטה זו דורשת לפחות שני SNPs ספציפיים לכרומוזום כדי לאפשר לפחות שני בדיקות ספציפיות למיקום לקשור כל מולקולת rRNA לזיהוי, ולהגביל את היישום שלה למיקומי rDNA עם לפחות שני SNPs מבחינים ביניהם. הזמינות של יותר SNPs מאפשרת ליותר בדיקות לקשור כל rRNA ויכולה לספק יעילות אות גדולה יותר. מעניין לציין ששיטה זו מסמנת רק rRNA בגרעין, למרות שני זוגות בדיקה המכוונים ל-SNPs ב-18S ו-28S rRNAs המיוצאים לציטופלזמה (rRNA המכיל את שני אתרי המטרה של ITS1 קיים רק בגרעין). היעדר אות FISH ציטופלזמי מרמז על שתי אפשרויות לא בלעדיות: 1) בדיקות 18S ו-28S לבדן אינן מספיקות לאיתור rRNA ציטופלזמי, אולי מכיוון ש-rRNA מפוזר יותר ברחבי הציטופלזמה מאשר בגרעין, או 2) יש יעילות קשירת בדיקה נמוכה יותר ל-rRNAs המשולבים בתת-היחידות הריבוזומליות הבוגרות מאשר ל-45S rRNA הלא מעובד. SNPs נוספים בתוך 18S ו-28S rRNAs עשויים לאפשר זיהוי FISH רגיש ל-SNP של rRNAs ציטופלזמיים.

שיטות אחרות להערכת שעתוק rRNA ספציפי ללוקוס כוללות גישות ריצוף rRNA המבדילות את הביטוי של וריאנטים של rRNA המוקצים למיקומים ספציפיים6. באופן דומה, qPCR יכול להעריך באופן דיפרנציאלי את הביטוי של וריאנטים של rRNA שהם מובחנים מספיק כדי לאפשר זיהוי ייחודי 5,21, אם כי לא ברור אם ההשתקה של וריאנטים אלה מייצגת השתקה של מיקום rDNA שלם. בעוד ששיטות אלו יכולות להיות יעילות בכימות הביטוי של וריאנטים ספציפיים של rRNA, לא ניתן לעשות אותן ברזולוציה של תא בודד. ההטרוגניות של השתקת rDNA של כרומוזום X ברקמות דרוזופילה מצביעה על כך שיש שונות חזקה בין תא לתא בשעתוק לוקוס rDNA17 ומדגישה את הצורך בטכניקות שיכולות להסביר שונות זו. תכונות הדמיה הקשורות לשעתוק פעיל במיקומי rDNA, כגון וריאנט היסטון H3.310 או גורם השעתוק Pol I UBF22, שימשו לזיהוי שעתוק rRNA ספציפי ללוקוס ברזולוציה של תא בודד. עם זאת, שתי השיטות הללו דורשות כרומוזומים מעובים של תאים מיטוטיים על מנת להבחין בשעתוק המתרחש בכל מיקום rDNA מסוים. בתאי דרוזופילה, ניתן לזהות מיקומי rDNA בכרומוזומי X ו-Y על ידי צורת כרומוזום10, אך זיהוי של מיקומי rDNA פעילים בתאים אנושיים דורש גם צביעה משותפת עם תוויות ספציפיות לכרומוזום22. שיטת SNP-FISH אינה דורשת תיוג משותף ספציפי לכרומוזום או תיוג של סמני שעתוק וניתן להעריך אותה בכל שלב של מחזור התא או תאים פוסט-מיטוטיים, מה שמספק גמישות לשימוש ברקמות מגוונות ובתנאי ניסוי.

ניתן לשנות שיטת rNA SNP-FISH זו לשימוש עם SNPs אחרים המבדילים בין Drosophila rRNAs או פוטנציאלית להיות מיושמת על SNPs המבדילים בין מיקומי rDNA באורגניזמים אחרים. יישום שיטה זו על אורגניזמים עם יותר משני מיקומי rDNA ידרוש מלוקוס להיות בעל הפלוטיפ ייחודי של וריאנט rDNA המכיל לפחות שני SNPs שאינם קיימים באף לוקוס rDNA אחר והמשותפים לכל עותקי 45S באותו מקום. דרישה זו פירושה שהשיטה תוכל לציין שעתוק רק ממיקום ספציפי אחד בהשוואה לכל האחרים (כלומר, SNPs rRNA ממיקום 1 בהשוואה ל-SNPs המשותפים ללוקוס 2 ו-3). עם זאת, אם לכל לוקוס rDNA יש הפלוטיפ תואם, ניתן לשלב מספר ניסויים כדי להעריך בנפרד את השעתוק של כל לוקוס אחד בכל פעם. המחמירה הנמוכה יחסית של טמפרטורת ההכלאה (37 מעלות צלזיוס) המשמשת בפרוטוקול זה מאפשרת קשירת בדיקה חזקה, במיוחד בהתחשב בחלק הקצר והחשוף של הגשושית, אם כי הכלאה בטמפרטורות גבוהות יותר (50-75 מעלות צלזיוס) הוכחה כמשפרת את האות של כמה בדיקות FISH23. טמפרטורות הכלאה גבוהות יותר עשויות לשפר את תזוזה של גדיל המסכה ולהגביר את קשירת הבדיקה, אך טמפרטורות גבוהות מדי עלולות לערער את יציבות קשירת מסכת הבדיקה ולאבד את הספציפיות של SNP. מסיבה זו, איננו מצפים ש-SNP-FISH יסמן באופן ספציפי DNA מכיוון שהטמפרטורות הדרושות להמסת מטרות DNA דו-גדיליות כדי לאפשר קשירת בדיקה יערערו גם את קשירת מסכת הבדיקה ויבטלו את ספציפיות המטרה הרגישה ל-SNP. ובכל זאת, אופטימיזציה של טמפרטורת ההכלאה עבור בדיקות SNP חדשות של rRNA עשויה להגדיל את האות, במיוחד כאשר רק שני אתרי SNP זמינים. אובדן השתקת rDNA של כרומוזום X קשור להפחתת מספר עותקי rDNA בדרוזופילה13, ולכן פיתוח מבחני SNP-FISH לאפיון שעתוק rRNA ספציפי ללוקוס במערכות אחרות עשוי לשמש כלי שימושי להערכת שלמות ה-rDNA ותפקוד הריבוזום. יתר על כן, שיטה זו שונתה לשימוש עם וריאנט מחיקה בדרוזופילה, וגרסת rRNA מבנית יחידה זו התאימה לזיהוי (אולי בשל זיקה גדולה יותר לקשירת מטרה ללא מסיכת בדיקה)17. השימוש בגרסאות rRNA מבניות בשילוב עם גרסאות SNP מרחיב את פוטנציאל היישום במערכות אחרות. מכיוון שהמנגנונים המווסתים את שעתוק לוקוס ה-rDNA עדיין לא ברורים ברובם, הגמישות ויכולת ההסתגלות הפוטנציאלית של rRNA SNP-FISH למערכות אחרות הופכות אותו לכלי רב עוצמה למחקרים עתידיים לחקר שעתוק rRNA.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה, למרכז המניות של קיוטו דרוזופילה ול-FlyBase על המשאבים שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות סטארט-אפ שסופקו על ידי המחלקה לביוכימיה וביולוגיה של התא באוניברסיטת סטוני ברוק ובית הספר לרפואה של רנסנס (JON).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PTC Tempo 96 Thermal CyclerBio Rad12015382ניתן להשתמש בכל מחזורי תרמי
0.2 מ"ל 8 רצועות צינורות PCR שטוחיםVWR89133-912ניתן להשתמש בכל צינורות תואמים
1 kb סולם DNANEBN3232Sלשימוש בעת בדיקת רצף PCR גודל אמפליקון על ידי אלקטרופורזה ג'ל
1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה מדורגיםארה"ב מדעי1615-5510כל שפופרת ללא RNase מוסמכת תעשה
2 מ"מ dNTP MixThermoFisher ScientificR0241
50x TAE BufferBio Rad1610743משמש לאלקטרופורזה של ג'ל. ניתן להשתמש בכל מאגר TAE.
5M NaClניתן להשתמש או להכין כל NaCl מכל מקור
AgaroseVWR97064-250ניתן להשתמש בכל Agarose
ApE - תוכנת עורך פלסמידN/AN/A
https://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ לקניתן להשתמש בכל לק מכל קמעונאי ניתן להשתמש
בזכוכית כיסוי, עובי מס' 1תומאס סיינטיפיק6672A38
פורממיד פישר דה-יוניםמדעיNC9569627
דקסטרן סולפט נתרןסיגמא אולדריץ'D8906-10G
DreamTaq Green PCR Master MixThermoFisher ScientificK1081
Dumont #5 מלקחייםFine ScienceTools 11252-20משמש לניתוח דגימות
EDTA (0.5M), Ph 8.0ThermoFisher ScientificR1021ניתן להשתמש בכל מוצר דומה
אתנולVWR89125-172ניתן להשתמש בכל אתנול 200 הוכחה. משמש לדילול ל-70% אתנול לחדירה וניקוי לתנאים נטולי רנאז
אתידיום ברומידThermoFisher Scientific15585011
מערכת אלקטרופורזה מיני ג'ל אופקיתFisher Scientific14-955-170ניתן להשתמש בכל מערכת אלקטרופורזה של ג'ל
KimwipesFisher Scientific06-666
מיקרו-בדיקה מכתים צלחתאלקטרון מדעי המיקרוסקופיה71564משמש לניתוח דגימות
שייקר תזונתיסיגמא אולדריץ'BMSB3D1020ניתן להשתמש בכל שייקר תזונתי
Parafilm USA Scientific3023-4526
מי מלח חוצץ פוספט (10X) pH 7.4, RNase ללאLife TechnologiesAM9624
פירס 16% פורמלדהיד (w/v), טכנולוגיות חיים ללא מתנול28908
דיוק טכנולוגיות חיים לאמבט מים לשימוש כלליTSGP02ניתן להשתמש בכל אמבט מים
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704ניתן להשתמש בכל ערכת מיצוי ג'ל
Recombinant Proteinase K Solution (20 מ"ג/מ"ל)InvitrogenAM2546ניתן להשתמש בכל מוצר דומה ללא
Rnase UltraPure BSAThermoFisher ScientificAM2618
S. cerevisiae tRNASigma AldrichR8759
SSC (20X), ללא RNaseFisher ScientificAM9763
Triton-X 100Life TechnologiesA16046.AE
UltaPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5ThermoFisher Scientific15567027להשתמש
בכל מוצר דומהטכנולוגיות חיים במים מזוקקים ללא DNase/RNase UltraPure10977023
קומפלקס ריבונוקלאוזיד ונדילNEBS1402S
VECTASHIELD מדיית הרכבה עם DAPIVector LaboratoriesH-1200-10
שקופית מיקרוסקופ סופרפרוסט VWR48311-601
y[1]w[1] קו Drosophila melanogasterמרכז מניות בלומינגטון דרוזופילה1495
Zeiss LSM 980 מיקרוסקופ קונפוקלימיקרוסקופניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ קונפוקלי עם פליטה וזיהוי תואמים ניתן להשתמש
במיקרוסקופ סטריאו Zeiss Stemi 2000-C ומקור אורמיקרוסקופ מרכזי455053להשתמש בכל מיקרוסקופ סטרומיקרוסקופ
שקוף ניתן צייס ניתן

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baßler, J., Hurt, E. Eurokaryotic ribosome assembly. Ann Rev Biochem. 88 (1), 1-26 (2018).
  2. Hall, A. N., Morton, E., Queitsch, C. First discovered, long out of sight, finally visible: ribosomal DNA. Trend Genet. 38 (6), 587-597 (2022).
  3. Srivastava, R., Srivastava, R., Ahn, S. H. The epigenetic pathways to ribosomal DNA silencing. Microbiol Mol Biol Rev. 80 (3), 545-563 (2016).
  4. Kuo, B. A., Gonzalez, I. L., Gillespie, D. A., Sylvester, J. E. Human ribosomal RNA variants from a single individual and their expression in different tissues. Nucl Acid Res. 24 (23), 4817-4824 (1996).
  5. Tseng, H., et al. Mouse ribosomal RNA genes contain multiple differentially regulated variants. PLoS ONE. 3 (3), e1843(2008).
  6. Locati, M. D., et al. Expression of distinct maternal and somatic 5.8S, 18S, and 28S rRNA types during zebrafish development. RNA. 23 (8), 1188-1199 (2017).
  7. Roussel, P., André, C., Comai, L., Hernandez-Verdun, D. The rDNA transcription machinery is assembled during mitosis in active NORs and absent in inactive NORs. J Cell Biol. 133 (2), 235-246 (1996).
  8. Pontes, O., et al. Postembryonic establishment of megabase-scale gene silencing in nucleolar dominance. PLoS ONE. 2 (11), e1157(2007).
  9. Earley, K. W., et al. Mechanisms of HDA6-mediated rRNA gene silencing: suppression of intergenic Pol II transcription and differential effects on maintenance versus siRNA-directed cytosine methylation. Gene Dev. 24 (11), 1119-1132 (2010).
  10. Greil, F., Ahmad, K. Nucleolar dominance of the Y chromosome in Drosophila melanogaster. Genetics. 191 (4), 1119-1128 (2012).
  11. Preuss, S., Pikaard, C. S. rRNA gene silencing and nucleolar dominance: Insights into a chromosome-scale epigenetic on/off switch. Biochim Biophys Acta. 1769 (5-6), 383-392 (2007).
  12. Sharifi, S., Bierhoff, H. Regulation of RNA pPolymerase I transcription in development, disease, and aging. Ann Rev Biochem. 87 (1), 1-23 (2018).
  13. Lu, K. L., Nelson, J. O., Watase, G. J., Warsinger-Pepe, N., Yamashita, Y. M. Transgenerational dynamics of rDNA copy number in Drosophila male germline stem cells. eLife. 7, e32421(2018).
  14. Nurk, S., et al. The complete sequence of a human genome. Science. 376 (6588), 44-53 (2022).
  15. Ritossa, F. M. Unstable redundancy of genes for ribosomal RNA. Proc Natl Acad Sci. 60 (2), 509-516 (1968).
  16. Nelson, J. O., Slicko, A., Yamashita, Y. M. The retrotransposon R2 maintains Drosophila ribosomal DNA repeats. Proc Natl Acad Sci. 120 (23), e2221613120(2023).
  17. Warsinger-Pepe, N., Li, D., Yamashita, Y. M. Regulation of nucleolar dominance in Drosophila melanogaster. Genetics. 214 (4), (2020).
  18. Levesque, M. J., Ginart, P., Wei, Y., Raj, A. Visualizing SNVs to quantify allele-specific expression in single cells. Nat Meth. 10 (9), 865-867 (2013).
  19. Davis, M. W., Jorgensen, E. M. ApE, a plasmid editor: A freely available DNA manipulation and visualization program. Front Bioinfo. 2, 818619(2022).
  20. Qazi, M. C. B., Heifetz, Y., Wolfner, M. F. The developments between gametogenesis and fertilization: ovulation and female sperm storage in Drosophila melanogaster. Dev Biol. 256 (2), 195-211 (2003).
  21. Rogers, M. J., et al. Structural features of the large subunit rRNA expressed in Plasmodium falciparum sporozoites that distinguish it from the asexually expressed subunit rRNA. RNA. 2 (2), 134-145 (1996).
  22. Potapova, T., et al. Epigenetic control and inheritance of rDNA arrays. bioRxiv. , (2024).
  23. Tang, Y. Z., Gin, K. Y. H., Lim, T. H. High-temperature fluorescent in situ hybridization for detecting Escherichia coli in seawater samples, using rRNA-targeted oligonucleotide probes and flow cytometry. Appl Environ Microbiol. 71 (12), 8157-8164 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

SNP FISH DetectionRibosomal RNA TranscriptionDrosophila MelanogasterrDNA LociSingle Nucleotide PolymorphismLocus Specific rRNAFluorescence In Situ HybridizationGerm Cell NucleolusChromosome Specific TranscriptionTestes Dissection

Related Articles