פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש בשיטה האנליטית של MEDUSA כדי לכמת את השפעת ויסות המוות של כל נוקאאוט של גן. הוא כולל הוראות לקביעת תנאי ניסוי המייעלים את הרגישות והדרכה שלב אחר שלב לביצוע הניתוח.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
MEDUSA לזיהוי גנים מווסתים למוות בנתוני פרופיל כימו-גנטי
במאמר זה
סיכום
תקציר
ניתן להשתמש בסריקה שיטתית של הפרעות גנטיות של רווח או אובדן תפקוד כדי לאפיין את התלות הגנטית ומנגנוני הוויסות עבור כל תהליך תאי מעניין. ניסויים אלה כוללים בדרך כלל פרופיל ממאגר של הפרעות בגן בודד וכיצד כל הפרעה גנטית משפיעה על הכושר היחסי של התא. כאשר מיושמים בהקשר של מחקרי יעילות תרופות, המכונים לעתים קרובות פרופיל כימו-גנטי, שיטות אלה אמורות להיות יעילות בזיהוי מנגנוני הפעולה של התרופות. למרבה הצער, מחקרי פרופיל כימו-גנטי מבוססי כושר אינם יעילים בזיהוי כל המרכיבים של תגובה לתרופה. לדוגמה, מחקרים אלה בדרך כלל אינם מצליחים לזהות אילו גנים מווסתים מוות תאי הנגרם על ידי תרופות. מספר נושאים תורמים לטשטוש ויסות המוות במסכים מבוססי כושר, כולל ההשפעות המבלבלות של שינויים בקצב ההתפשטות, שונות בתיאום המושרה על ידי תרופות בין גדילה למוות, ובמקרים מסוימים, חוסר היכולת להפריד DNA מתאים חיים ומתים. MEDUSA היא שיטה אנליטית לזיהוי גנים מווסתים למוות בנתוני פרופיל כימו-גנטי קונבנציונלי. זה עובד על ידי שימוש בסימולציות חישוביות כדי להעריך את שיעורי הצמיחה והתמותה שיצרו פרופיל כושר נצפה במקום לדרג את הכושר עצמו. שימוש יעיל בשיטה תלוי בטיטרציה אופטימלית של תנאי הניסוי, כולל מינון התרופה, גודל האוכלוסייה ההתחלתי ואורך הבדיקה. כתב יד זה יתאר כיצד להגדיר מחקר פרופיל כימו-גנטי לניתוח מבוסס MEDUSA, ונדגים כיצד להשתמש בשיטה כדי לכמת את שיעורי התמותה בנתוני פרופיל כימו-גנטי.
מבוא
בפרופיל כימו-גנטי, הפרעות גנטיות שיטתיות משמשות להבנת התרומה של כל גן לתגובה נתונה לתרופה 1,2,3. ניסויים אלה הם בעלי ערך ויכולים לחשוף תובנות חשובות לגבי תגובות לתרופות, כולל יעד הקישור של התרופה ומנגנוני זרם/פליטת תרופות. עם זאת, מכיוון שניסויים אלה מבוצעים בדרך כלל בצורה מאוגדת המעריכה את כל הגנים בו זמנית, הפקת תובנות מכניסטיות מנתוני פרופיל כימו-גנטי יכולה להיות מאתגרת.
מנגנוני הבקרה והתלות הגנטית למוות תאים הנגרם על ידי תרופות נוטים להיות מאתגרים לפתרון בנתוני פרופיל כימו-גנטי. ישנן מספר סיבות לבעיה זו, אך רבו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. אופטימיזציה של מינון התרופה כדי לגרום למוות תאי
הערה: הפרוטוקול שלהלן מיועד לאופטימיזציה של שילוב אחד של קו תאים, תרופה ומינון באמצעות בדיקת FLICK 7,8. הנתונים לדוגמה לפרוטוקול זה מתארים את האופטימיזציה וההקרנה של 5 מיקרומטר אטופוסיד בתאי U2OS, אך ניתן ליישם את אותם שלבי אופטימיזציה על כל שילוב רצוי אחר של קו תאים ותרופה/מינון. פרוטוקול זה אינו דורש איסוף או ניתוח של תאים מתים. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה עבור תרביות תרחיף, בתנאי שתאים מתים מוסרים. עבור תרביות תרחיף, ניתן למיין/להפריד תאים מתים באמצעות סמן כדאיות או סמן ספציפי למוות ת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באמצעות פרוטוקול זה, חקרנו את התלות הגנטית של מוות המושרה על ידי אטופוסיד בתאי U2OS. אטופוסיד היא כימותרפיה נפוצה הפוגעת ב-DNA15. ניסוי פרופיל כימו-גנטי זה בוצע באמצעות ספריית GeCKOv216 ב-Cas9 המבטאת תאי U2OS5. בניסויים מסוג זה, תפקוד הגנים מוסק בדרך כלל מהשפע היחסי של שיבוט נוקאאוט נתון כאשר משווים אוכלוסיות שטופלו בתרופות לעומת אוכלוסיות שלא טופלו (איור 1A-B). עם זאת, לא ניתן להשוות ישירות את ספירת תאי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בפרוטוקול זה, אנו מתארים את השימוש בשיטה האנליטית של MEDUSA לכימות נתוני פרופיל כימו-גנטי כדי להעריך כיצד הפרעות גנטיות משנות את שיעורי הגדילה והתמותה הנגרמות על ידי תרופות. מכיוון שהתוצר העיקרי של ניסוי פרופיל כימו-גנטי קשור לגודל האוכלוסייה, לא לשיעורים, השיעורים הבסיסיים מוסקים באמצעות סימולציות. לפיכך, השלבים הקריטיים בשיטה הם פרמטריזציה ניסויית מדויקת של קינטיקה של תגובה לתרופות, הכוללת את קצב התפשטות התאים הלא מטופלים, זמן הופעת המוות הנגרם על ידי תרופה, שיעור התמותה הנגרם על ידי ת.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.
תודות
אנו מודים לכל חברי מעבדת לי, בעבר ובהווה, על תרומתם לנקודת המבט של המעבדה שלנו על הערכת תגובות לתרופות. עבודה זו נתמכה על ידי מימון MJL ו-MEH מהמכונים הלאומיים לבריאות (U01CA265709, R21CA294000 ו-R35GM152194 ל-MJL, ו-F31CA268847 ל-MEH), מימון MJL מקרן ג'יין קוסקינס טד ג'ובניס.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 100 מ"מ פישרברנד TC כלים | פישר FB012924 | מדעי לגידול תאים ואופטימיזציה של גודל האוכלוסייה | |
| 150 מ"מ פישרברנד TC כלים | פישר סיינטיפיק | FB012925 | לגידול תאים ואופטימיזציה של גודל האוכלוסייה |
| DESeq2 | R חבילה | v1.44.0 | לחישוב קיפול-שינוי |
| DMEM | קורנינג | 10017CV | לזריעה וסימום תאים |
| DMSO | Fisher Scientific | MT-25950CQC | לזריעה וסימום תאים |
| פישרברנד 96-Well, טיפול בתרבית תאים, בצורת U-תחתית Microplate | Fisher Scientific | FB012932 | לזריעה וסימום תאים (צלחת סיכה) |
| Greiner Bio-One CELLSTAR μ שקוף 96 בארות, מטופל בתרבית תאים, גריינר מיקרופלייט תחתון שטוח | 655090 | לזריעה וסימום תאים | |
| MATLAB | Mathworks | R2024a | FLICK, GRADE ו-MEDUSA |
| Microplate Tecan | Spark | למדידות תאים מתים | |
| Sytox Green | Thermo Fisher | Scientific S7020 | למדידות תאים מתים |
| ספריית TKOV3 CRISPR | Addgene | 125517 | לביצוע מסך CRISPR |
| Triton-X 100 | Thermo Fisher Scientific | J66624-AP | לחדירה לתאים |
| טריפן כחול | MT25900CI קורנינג | למדידת תאים חיים/מתים |
מקורות
- Przybyla, L., Gilbert, L. A. A new era in functional genomics screens. Nat Rev Genet. 23 (2), 89-103 (2021).
- Colic, M., Hart, T. Chemogenetic interactions in human cancer cells. Comput Struct Biotechnol J. 17, 1318-1325 (2019).
- Colic, M., Hart, T.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
