הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בדיקת ביופילם עבור Clostridioides difficile עם יישומים לגילוי תרופות

986 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67913

⸱

8 ביולי 2025

 ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology and The South Texas Center for Emerging Infectious Diseases (STCEID), The University of Texas at San Antonio

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

ביופילמים של הפתוגן החיידקי Clostridioides difficile ומשמעותם במחלות אינם מובנים היטב. ממצאים אחרונים הצביעו על תפקיד בהישנות המחלה, והדגישו את חשיבותם. כאן, אנו מתארים את ההתאמה של בדיקת ביופילם יחד עם קריאה מטבולית עם יישומים לגילוי תרופות כנגד ביופילמים.

תקציר

קלוסטרידיואידס דיפיצילה הוא פתוגן חיידקי במערכת העיכול המסוגל לנצל את סביבת המיקרוביוטה הדיסביוטית כדי להתרבות, להפריש רעלנים ולפגוע באפיתל המעי. תת-קבוצה של חולי זיהום קלוסטרידיום דיפיצילה (CDI) יחוו כישלון בטיפול באנטיביוטיקה (15%-30%) או בהשתלת מיקרוביוטה צואתית (FMT) (<10%). לכן, יש חשיבות קריטית לפיתוח התערבויות טיפוליות נוספות. תפקידם של ביופילמים של קלוסטרידיום דיפיצילה בהישנות אינו ברור. עם זאת, ביופילמים באורגניזמים אחרים אחראים למחלה כרונית והתקפית, מה שמרמז על כך שזה יכול להיות המקרה גם ב-CDI חוזר. אנו משערים כי ביופילמים של קלוסטרידיום דיפיצילה מהווים מטרה טיפולית רבת ערך. מטרת הפרוטוקול המוצג כאן היא להתאים בדיקת היווצרות ביופילם לזיהוי תרכובות הניתנות למיקום מחדש עם פעילות כנגד ביופילמים מבוססים של קלוסטרידיום דיפיצילה . הפרוטוקול משכלל בדיקה חזקה וניתנת לשחזור ליצירת ביופילמים, מצמיד אותה לבדיקה מטבולית ומיישם אותה לגילוי תרופות. פרוטוקול זה מתאר את בדיקת היווצרות הביופילם, קריאות ביומסה ופעילות מטבולית, בדיקת רגישות לתרופות, סינון תרופות של ספריית מיקום מחדש ותוצאות מייצגות.

מבוא

קלוסטרידיואידס דיפיצילה הוא פתוגן חיידקי אנאירובי יוצר נבגים המסוגל לגרום נזק חמור למערכת העיכול האנושית (GI) על ידי ייצור רעלים. קלוסטרידיום דיפיצילה אחראי לכמעט חצי מיליון מקרים בשנה, עם ~30,000 מקרי מוות (CDC, 2015). הטיפול בזיהום קלוסטרידיום דיפיצילה (CDI) מוסיף עלות משמעותית למערכת הבריאות המתוחה ממילא (~4.8 מיליארד דולר)1,2,3. האנשים בסיכון הגבוה ביותר הם אלה עם דיכוי חיסוני, חשיפה לאנטיביוטיקה ו/או קשישים, כל האוכלוסיות שממשיכות להתרחב באופן משמעותי הן בארה"ב והן ברחבי העולם 4,5,6,7.

קלוסטרידיום דיפיצילה תלוי מאוד במצב המיקרוביוטה של מערכת העיכול המארח, וככזה, טיפול אנטיביוטי הוא גורם נטייה מרכזי ל-CDI. זיהוי מבודדים קליניים עמידים לאנטיביוטיקה של קלוסטרידיום דיפיצילה מסבך עוד יותר את הטיפול 8,9,10. יתר על כן, בין 15% ל-30% מהחולים שטופלו באנטיביוטיקה ל-CDI ייכשלו בטיפול הראשוני 5,11,12,13,14,15,16. ברגע שמטופל חווה אפיזודה חוזרת, הסבירות לאפיזודות חוזרות עולה ל-45%-64% (דרגנוע הישנות ומלווה בסיכון מוגבר לכישלונות טיפול נוספים16,17. חשוב לציין, שרוב מקרי ההישנות של CDI נגרמים על ידי הזן המקורי שיצר את האפיזודה הראשונה של ההדבקה בפונדקאי18,19, מה שמרמז על המשך קולוניזציה על ידי קלוסטרידיום דיפיצילה גם לאחר טיפול מוצלח. בעוד שנבגים הוכחו כממשיכים להתקיים במערכת העיכול ומובילים להישנות במודלים ex vivo ועכברים20, ביופילמים של C. difficile ותפקידם במחלות והישנות אינם נחקרים. ביופילמים הם קהילות מיקרוביאליות המוגנות על ידי מטריצה חוץ-תאית המיוצרת בעצמה, מאפיין שהופך אותם לסרבנים מאוד לעלבונות סביבתיים כגון טיפול אנטיביוטי ותגובות חיסוניות21. יתר על כן, היווצרות ביופילם היא גורם אלימות משמעותי 22,23,24,25 ובזיהומים חיידקיים, כגון אלה הנגרמים על ידי Staphylococcus aureus ו-Pseudomonas aeruginosa, ביופילמים הם המפתח להישנות וביטויים כרוניים26,27. לאחרונה, ביופילמים של קלוסטרידיום דיפיצילה הוצעו כמאגר לזיהומים חוזרים 28,29,30 ולכן מייצגים יעד בעל ערך גבוה לטיפול ו/או מניעה של הישנות CDI.

המודלים הנוכחיים לחקר ביופילמים של קלוסטרידיום דיפיצילה כוללים מודלים של ביופילם מושבה31,32, מיקרו-תסיסה33, מודלים של מעיים כימוסטטים34,35 ומערכות תרבית נוזלית המשתמשות בצלוחיות או צלחות באר36,37. כל המודלים הללו הניבו מידע מרכזי על ביופילמים של קלוסטרידיום דיפיצילה בשלבי התפתחות שונים ובסביבות שונות. אולם חלק מהמודלים האלה (כלומר, מיקרו-תסיסות, מודלים של מעיים כימוסטטים, ביופילמים של מושבות) אינם מתאימים למאמצי גילוי תרופות. עד כה, רוב המחקרים הכוללים מאמצי גילוי תרופות התמקדו באורח החיים הפלנקטוניים של קלוסטרידיום דיפיצילה 38,39,40,41. לכן, הפרוטוקול המתואר כאן נועד להתאים, לתקנן ולאמת את מודל הביופילם הקיים של 96 בארות במטרה לפתח פלטפורמה לסינון ספריות לזיהוי מולקולות הניתנות למיקום מחדש עם יכולת להרוג ביופילמים מבוססים (בני 24 שעות). אימות הפרוטוקול בוצע על ידי השוואת יכולות היווצרות ביופילם בין זן מותאם מעבדה (630 Δerm) לבין מבודד קליני מגיפה (זן UK1 שבודד במהלך התפרצות בשנת 2006 בבית החולים סטוק-מנדוויל בבריטניה42). היווצרות הביופילם כומתה באמצעות מבחן סגול קריסטל קלאסי למדידת ביומסה ובדיקה מטבולית למדידת הכדאיות של הביופילמים. זוהו הבדלים משמעותיים ביכולות היווצרות הביופילם בין הזנים, מה שמרמז על השלכות קליניות פוטנציאליות. יתר על כן, הבדיקה שימשה לקביעת פרופילי רגישות לאנטיביוטיקה של ביופילמים מבוססים. לבסוף, כהוכחה לרעיון, תיבת עדיפות הבריאות הגלובלית של Medicines for Malaria Venture (MMV), ארגון ללא מטרות רווח המתמקד בגילוי טיפולים חדשים נגד מחלות מוזנחות כמו מלריה, נבדקה כדי לזהות תרכובות בעלות פעילות נגד ביופילמים מבוססים של C. difficile. הפרוטוקול המתואר כאן מתאים ומאמת בדיקת ביופילם קלאסית לשימוש כפלטפורמה לסינון תרופות המכוונת לביופילם בוגרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת תאים לבדיקת הביופילם

זהירות: קלוסטרידיואידס דיפיצילה הוא פתוגן אנושי ודורש בלימת BSL-2.

הערה: נבגים ששימשו למחקר זה נרכשו מד"ר קרול קומאמוטו מבית הספר לרפואה של אוניברסיטת טאפטס. מלאי נבגי C. difficile הוכנו כמתואר קודם לכן 43,44,45. לאחר מכן נבגים מסומנים כנפחים של 10 מיקרוליטר לתוך צינורות PCR לפיזור צלחות. יש להפחית מראש את כל המדיה ותמיסת המלח של מאגר פוספט (PBS) הנדרשים לניסוי בתא האנאירובי 24 שעות לפני השימוש. זה מושג על ידי שחרור מכסה הבקבוק המכיל את המדיה או PBS בתוך החדר.

  1. יש להפחית מראש צלחת אגר עירוי לב למוח בתוספת 0.1% (w/v) טאורוכולט ו-0.1% (w/v) L-ציסטאין (BHIS) בתא האנאירובי, רצוי למשך לילה או למשך 3 שעות לפחות כדי לאפשר הפחתה מלאה. הגדר את הטמפרטורה של החדר האנאירובי ל-37 מעלות צלזיוס.
  2. מחממים את צינור ה-PCR המכיל 10 מיקרוליטר נבגים למשך 20 דקות ב-70 מעלות צלזיוס. ניתן לעשות זאת באמבט מים או במחזור תרמי.
  3. הכניסו נבגים לתא האנאירובי, ערבבו על ידי פיפטינג עדין של 5x-6x, ופיפטה 10 מיקרוליטר על צלחת ה-BHIS המופחתת מראש. בצע רצף של ארבעה רבעים כפי שתואר קודם לכן46, ודגר את הצלחת למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס (טמפרטורת החדר האנאירובי).
  4. לאחר 24 שעות של צמיחה, מושבות מבודדות אמורות להיות גלויות. בחר מושבה בודדת ובעזרת לולאה חד פעמית העביר לצינור המכיל 10 מ"ל נוזל BIS. דגירה למשך הלילה (14-18 שעות).
  5. קבע את צפיפות התאים על ידי דילול סדרתי של תרבית הלילה בתא.
    1. בצע דילול פי 10 של תרבית הלילה. הדילול של 103 מניב דגימה הניתנת לספירה עבור כל אחד מהזנים המשמשים בפרוטוקול זה. עם זאת, סטנדרטיזציה של שלב זה עשויה להידרש עבור מבודדים קליניים עם הבדלי גדילה.
    2. הוציאו את הצינורות מהתא האנאירובי, הניחו 10 מיקרוליטר מכל דגימה בהמוציטומטר, וספרו באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר כמתואר על ידי יצרן ההמוציטומטר.
    3. עקוב אחר הוראות היצרן כדי לקבוע את ריכוז התאים לאחר הספירה.

2. היווצרות ביופילם

הערה: בעוד שפרוטוקול זה ניתן להתאמה לגדלים שונים של בארות, הוא עבר אופטימיזציה לפלטפורמה של 96 בארות. אם גודל הבאר ישתנה, יהיה צורך להתאים את ריכוז התאים על סמך שטח הפנים של הבאר.

  1. לאחר קביעת ריכוז התאים מתרבית הלילה, התאם את ריכוז התאים ל-1 x 107 תאים/מ"ל ב-BHIS (בתוספת 10% (w/v) L-cysteine ו-0.1M גלוקוז).
    הערה: תוסף גלוקוז של 0.1M הוכח בעבר כמגביר את היווצרות הביופילם על ידי C. difficile 630 Δerm זן47. עבור פרוטוקול זה, הריכוז של 1 x 107 תאים/מ"ל נבחר לאחר בדיקת ריכוזים התחלתיים מובהקים (איור 1). עדיין ניתן להשיג היווצרות חזקה של ביופילם ללא תוספת גלוקוז.
  2. הוצא 100 מיקרוליטר של תאים לבארות של צלחת מיקרוטיטר של 96 בארות (תחתית שטוחה ותרבית רקמה מטופלת), והשאיר עמודות בקרה (תאים בלבד) ועמודות ריקות (מדיה בלבד). דגירה למשך 24 שעות בתא האנאירובי (37 מעלות צלזיוס).
    1. אם אידוי המדיה הופך לבעיה, הנח לוחות ביופילם הרחק מכל יחידת חימום. לחלופין, הניחו ביופילמים בתוך מיכל נוסף או כסו בממברנות צלחת חדירות של 96 בארות.
  3. הסר בעדינות את המדיה מכל הבארות, החל מהריק. זה יסיר תאים שאינם נדבקים וישאיר אחריו ביופילם. שלב זה הוא קריטי מכיוון שרק תאים בתוך הביופילם מעניינים.
  4. שטפו בעדינות את הביופילמים פעמיים עם 200 מיקרוליטר של PBS מופחת מראש. כדי לבצע שטיפה זו בעדינות, הטה מעט את צלחת 96 הבארות, הכנס את קצות הפיפטה אל דופן הבאר, החלק את הקצוות קרוב לתחתית הבאר מבלי לגרד את התחתית ושאף לאט. אם PBS נשאר בתחתית, חזור על התהליך שוב. בשלב זה ניתן להסיר תאים שאינם נדבקים, וזה נורמלי. הסר את ה-PBS לפני הוצאת הצלחת מהתא האנאירובי.
  5. בשלב זה, השתמשו בביופילמים עבור: מדידות ביומסה (ראו שלב 3); מדידות פעילות מטבולית (ראה שלב 4); מבחני רגישות לתרופות וסינון תרופות (ראה שלב 5).
    הערה: פרוטוקול זה אושר עבור זן 630 Δerm המותאם במעבדה וזן המגיפה UK1. מבודדים וזנים קליניים מובהקים עשויים להפגין יכולות חלשות ליצירת ביופילם. כדי למזער את ההפרעה לביופילם, יש לשטוף עם PBS 1x במקום 2x ולהפחית את נפח הכביסה ל-100 מיקרוליטר.

3. מדידת ביומסה של ביופילם באמצעות מבחן סגול קריסטל

הערה: צביעת סגול קריסטל התבססה על פרוטוקול48 שתואר קודם לכן.

  1. לאחר שטיפת הביופילמים בתא האנאירובי (ראה שלב 2.4), הסר את הצלחת והעביר אותה למכסה אדים כימי.
  2. כדי לתקן את הביופילמים, הוסף בעדינות 150 מיקרוליטר מתנול לכל באר. מכסים את הצלחת במכסה למשך 10 דקות.
  3. הסר מתנול ואפשר לבארות להתייבש לחלוטין כשהמכסה הוסר. זה אמור לקחת בין 30 דקות ל-45 דקות.
  4. הוסף 100 מיקרוליטר של 0.3% סגול קריסטל לכל הבארות והכתים למשך 10 דקות. הסר את סגול הקריסטל בזהירות כדי למנוע כתמים של שפת הבאר והקירות, מכיוון שהדבר יכול להשפיע על הקריאה.
  5. הניחו לצלחת להתייבש כשהמכסה הוסר. זה אמור לקחת בין 30 דקות ל-45 דקות.
  6. שטפו את הבארות פי 3 עם 200 מיקרוליטר מים מזוקקים והניחו לצלחת להתייבש לחלוטין. זה אמור לקחת 30 עד 45 דקות.
  7. לאחר הייבוש, השתמשו במיקרוסקופ שדה בהיר כדי לדמות את הביופילמים (איור 2A). בעוד ששלב זה הוא אופציונלי, הוא מאפשר התבוננות יסודית יותר בתאים בביופילם.
    1. הנח את צלחת 96 הבארות על מיקרוסקופ שדה בהיר הפוך עם מתאם צלחת. זהה בארות מייצגות עבור כל זן שנבדק.
    2. צלם תמונות עבור כל באר בהגדלה הרצויה. התמונות המוצגות בפרוטוקול זה צולמו בהגדלה של פי 40.
  8. לאחר רכישת התמונות הרצויות, העבירו את הצלחת בחזרה למכסה אדים כימי להסרת צבעים.
  9. כדי להסיר את הצבע מהביופילם, הוסיפו 150 מיקרוליטר של 33% חומצה אצטית והניחו על שייקר במהירות בינונית למשך 10 דקות.
  10. מוציאים 90 מיקרוליטר מכל באר ומעבירים לצלחת חדשה עם תחתית שטוחה של 96 בארות. קרא ספיגה ב-595 ננומטר באמצעות קורא לוחות (איור 2B).

4. מדידת כדאיות ביופילם באמצעות הצבע המטבולי PrestoBlue

  1. בצע את מדידת הפעילות המטבולית בהתאם לפרוטוקול היצרן לבדיקה עם שינויים מרכזיים. מחממים את קורא הצלחות ל-37 מעלות צלזיוס לפני הכנת הביופילמים לבדיקה. מומלץ קורא צלחות המסוגל למדוד פלואורסצנטיות.
    הערה: לחלופין, ניתן לקרוא את הפעילות המטבולית ב-OD600; עם זאת, לא מצאנו גישה זו רגישה מספיק לבדיקות אלה. מומלץ למשתמשים לעיין בפרוטוקול היצרן ולתקן במידת הצורך.
  2. לאחר שטיפת הביופילמים עם PBS בתא האנאירובי כמתואר לעיל (ראה שלב 2.4), הסר את הצלחת מהתא.
  3. יחד עם הצלחת, יש להסיר 9 מ"ל של BHIS מופחת מראש (בתוספת 10% (w/v) L-ציסטאין ו-0.1 M גלוקוז).
  4. הוסף במהירות 1 מ"ל של מגיב PrestoBlue ל-9 מ"ל של BHIS ומערבולת מופחתים מראש. אל תפחית מראש את המגיב מכיוון שהדבר יכול להשפיע על צבע המגיב (ראה דיון).
  5. מוסיפים 100 מיקרוליטר של תערובת BHIS-PrestoBlue לכל באר. הנח את הצלחת בקורא צלחות עם ההגדרות הבאות: טמפרטורה ב-37 מעלות צלזיוס, סוג הבדיקה כקינטי; זמן קריאה כ -30 דקות; תדירות קריאה כל 2 דקות; עוצמת הקרינה בהתאם לסוג קורא הצלחות הזמין. המדידות המתוארות בפרוטוקול זה בוצעו באמצעות אורכי גל עירור/פליטה של 560 ננומטר/590 ננומטר, בהתאמה.
  6. לאחר הקריאה, השליכו את הצלחות.
  7. לאחר קבלת ערכי הקרינה מקריאות הצלחת, השתמש בבארות ריקות (מדיה בלבד) כדי להפחית את הרעש מכל בארות הדגימה. לאחר מכן, חלקו את בארות הביופילם שטופלו בכל תרכובת בבאר הבקרה המכילה ביופילם לא מטופל (100%) כדי להשיג פעילות מטבולית.

5. הוספת תרופות לביופילמים

הערה: ניתן לשנות את ההגדרה המתוארת להלן עבור בדיקות רגישות לתרופות ובדיקת תרופות בריכוז קבוע. עבור שתי השיטות המתוארות להלן, מומלצת בדיקת PrestoBlue.

  1. קביעת ריכוזים מעכבים מינימליים (MIC) של אנטיביוטיקה מובחנת
    הערה: ביופילמים מטופלים במשך תקופה של 48 שעות, מה שמגדיל את הסיכוי לזיהום. יש חשיבות גבוהה לעבד תחילה בארות ריקות ולעקוב אחר נהלים אספטיים. ערכי MIC שדווחו בספרות עבור זנים אחרים של קלוסטרידיום דיפיצילה ומבחני תגובת מינון בדיקה שימשו כדי ליידע על ריכוזי אנטיביוטיקה התחלתיים עבור מבחני ה-MIC המוצגים בפרוטוקול זה. גישה זו תהיה שימושית לקביעת ריכוזי אנטיביוטיקה התחלתיים בעבודה עם מבודדים קליניים.
    1. שטפו את הביופילמים הבוגרים (בני 24 שעות) עם PBS בתא האנאירובי כמתואר לעיל (ראה שלב 2.4).
    2. הוסף 200 מיקרוליטר של חומר BHIS מופחת מראש (בתוספת 10% (w/v) L-ציסטאין ו-0.1M גלוקוז) המכיל דילולים כפולים של אנטיביוטיקת הבדיקה לכל באר מלבד עמודות הבקרה (תאים בלבד) והעמודות הריקות (מדיה בלבד) בצלחת.
    3. דגירה למשך 24 שעות נוספות. במחקר זה נעשה שימוש בוונקומיצין (ריכוז התחלתי של 200 מיקרוגרם/מ"ל), מטרונידזול (ריכוז התחלתי של 16 מיקרוגרם/מ"ל) ופידקסומיצין (ריכוז התחלתי של 4 מיקרוגרם/מ"ל) כדי לאמת את הבדיקה. ערכי MIC מדווחים בטבלה 1.
    4. כדי למנוע ייבוש צלחות, הרחק מיחידת החימום בתא האנרובי או השתמש בקרום חדיר לגז.
      הערה: לחלופין, ניתן להשתמש ב-PBS מופחת מראש או בחפיר מדיה (300 מיקרוליטר) על הבארות החיצוניות של הצלחת.
    5. לאחר 24 שעות של דגירה עם התרופות, הסר את המדיה ושטוף בעדינות את הביופילמים פי 1 עם PBS. עבד ביופילמים באמצעות בדיקת סגול קריסטל או בדיקת PrestoBlue.
  2. סינון ספריות תרופות
    1. שטפו את הביופילמים הבוגרים (בני 24 שעות) עם PBS בתא האנאירובי כמתואר לעיל (ראה שלב 2.4).
    2. הוסף 200 מיקרוליטר של מדיה המכילה ריכוז קבוע של תרכובות ספריית תרופות לכל באר מלבד עמודות הבקרה (תאים במדיה ללא אנטיביוטיקה) ועמודות ריקות (מדיה ללא אנטיביוטיקה) בצלחת. דגירה למשך 24 שעות נוספות. כדי למנוע ייבוש צלחות, הרחק מיחידת החימום בתא האנרוביק.
    3. לאחר 24 שעות של דגירה עם התרופות, הסר את המדיה ושטוף בעדינות את הביופילמים פי 1 עם PBS. עבד ביופילמים באמצעות בדיקת סגול קריסטל או הבדיקה המטבולית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מטרת הפרוטוקול המתואר לעיל היא להתאים ולאמת את מודל היווצרות הביופילם של 96 בארות כפלטפורמה לסינון תרופות לזיהוי תרכובות הניתנות למיקום מחדש עם פעילות כנגד ביופילמים מבוססים של C. difficile. נקבעה ההשפעה של צפיפות תאים מובחנת (10,4, 10,5, 10,6 ו-107 תאים/מ"ל) על היווצרות ביופילם, והיווצרות הביופילם כומתה על ידי צביעת סגול קריסטל כפי שתואר קודם לכן48. הממצאים ממחקרים אלה מצביעים על כך שהיווצרות ביופילם על ידי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

היווצרות ביופילם של קלוסטרידיום דיפיצילה והתפקיד שהיא ממלאת במחלה אינם מובנים היטב. ממצאים אחרונים מצביעים על תפקיד לביופילם בהישנות המחלה28,34. היווצרות ביופילם היא גורם אלימות משמעותי 22,23,24,25 ובזיהומים חיידקיים, כמו אלה הנגרמים על ידי Staphylococcus aureus ו-Pseudomonas aeru...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין קונפליקטים לחשוף.

תודות

J.A.R. עיצב את המחקר והפרוטוקול וכתב את כתב היד. א.ש. ופ.ז. ערכו את הניסויים ועזרו לחדד את הפרוטוקול. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות סטארט-אפ מאוניברסיטת טקסס בסן אנטוניו (UTSA) ל-J.A.R., ו-A.S. נתמכה על ידי תוכנית UTSA MARC (T34GM145507). המחברים מבקשים להודות ל-Medicines for Malaria Venture (MMV, שוויץ) על שסיפקה את ספריית תיבת העדיפות הגלובלית לבריאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומצה אצטית SAF-CT ACS 500 מ"לפישר סיינטיפיקA38S500
אגר בקטריולוגי GR 1 ק"גפישר סיינטיפיקAC443570010
BioTek Synergy H1 קורא צלחותפישר סיינטיפיקBTH1 מ"ג
תמצית שמרים בקבוק 500 גרםפישר סיינטיפיקDF0127179
מוח עירוי לב מרקפישר סיינטיפיק
CM1135R קריסטל סגול USP כיתה 100GVWR97061-850לצביעה ביופילמים לבדיקות ביומסה
צלחת TC CytoOne 96-well, תחתית שטוחה, שקופה, עטופה במכסים, 50/מארזUSA ScientificCC7682-7596
D-(+)-גלוקוז,נטול מים פישר סיינטיפיק50712744
דימתיל סולפוקסיד לביולוגיה מולקולרית (DMSO)Millipore SigmaD8418-250 מ"ל
FIDAXOMICIN 250 מ"גפישר סיינטיפיקAC468312500
L-ציסטאין 98+% 1 ק"גפישר סיינטיפיקAAA104350Bעבור קלוסטרידיום דיפיצילה מדיה
מתנול 99.8 אקרוזיאל 1LTפישר סיינטיפיקAC364390010
מטרונידזול, 99% 5GRפישר סיינטיפיקAC210340050
פוספט מאגר מלח (PBS) 10XFisher ScientificBP3991
PrestoBlue Cell ReagentReagent Fisher ScientificA13262
SILVERSEAL OPAQUE ADHES 100/CSFisher Scientific7000379משמש לאיטום צלחות תרופות לאם ולבת לפני האחסון
נתרן טאורוכולט 100MG VWR100291-598
VANCOMYCINפישר BP29581
מדעי

מקורות

  1. Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin Infect Dis. 55 (Suppl 2), S88-S92 (2012).
  2. Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States. N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).
  3. Sheitoyan-Pesant, C., et al. Clinical and healthcare burden of multiple recurrences of Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 62 (5), 574-580 (2016).
  4. Abou Chakra, C. N., Pepin, J., Sirard, S., Valiquette, L. Risk factors for recurrence, complications and mortality in Clostridium difficile infection: A systematic review. PLoS One. 9 (6), e98400(2014).
  5. Aslam, S., Hamill, R. J., Musher, D. M. Treatment of Clostridium difficile-associated disease: Old therapies and new strategies. Lancet Infect Dis. 5 (9), 549-557 (2005).
  6. Brown, K. A., Khanafer, N., Daneman, N., Fisman, D. N. Meta-analysis of antibiotics and the risk of community-associated Clostridium difficile infection. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2326-2332 (2013).
  7. Dicks, L. M. T., Mikkelsen, L. S., Brandsborg, E., Marcotte, H. Clostridium difficile, the difficult "kloster" fuelled by antibiotics. Curr Microbiol. 76 (6), 774-782 (2019).
  8. Sholeh, M., et al. Antimicrobial resistance in Clostridioides (Clostridium) difficile derived from humans: A systematic review and meta-analysis. Antimicrob Resist Infect Control. 9 (1), 158(2020).
  9. Peng, Z., et al. Update on antimicrobial resistance in Clostridium difficile: Resistance mechanisms and antimicrobial susceptibility testing. J Clin Microbiol. 55 (7), 1998-2008 (2017).
  10. Dilnessa, T., Getaneh, A., Hailu, W., Moges, F., Gelaw, B. Prevalence and antimicrobial resistance pattern of Clostridium difficile among hospitalized diarrheal patients: A systematic review and meta-analysis. PLoS One. 17 (1), e0262597(2022).
  11. Hopkins, R. J., Wilson, R. B. Treatment of recurrent Clostridium difficile colitis: A narrative review. Gastroenterol Rep (Oxf). 6 (1), 21-28 (2018).
  12. Bartlett, J. G. Treatment of antibiotic-associated pseudomembranous colitis. Rev Infect Dis. 6 (Suppl 1), S235-S241 (1984).
  13. Merino, E., Salavert, M. Treatment of Clostridioides difficile infection: From guidelines to clinical practice. Rev Esp Quimioter. 35 (Suppl 3), 97-101 (2022).
  14. Pepin, J., et al. Increasing risk of relapse after treatment of Clostridium difficile colitis in Quebec, Canada. Clin Infect Dis. 40 (11), 1591-1597 (2005).
  15. Cornely, O. A., Miller, M. A., Louie, T. J., Crook, D. W., Gorbach, S. L. Treatment of first recurrence of Clostridium difficile infection: Fidaxomicin versus vancomycin. Clin Infect Dis. 55 (Suppl 2), S154-S161 (2012).
  16. Mcfarland, L. V., Elmer, G. W., Surawicz, C. M. Breaking the cycle: Treatment strategies for 163 cases of recurrent Clostridium difficile disease. Am J Gastroenterol. 97 (7), 1769-1775 (2002).
  17. Mcfarland, L. V., et al. A randomized placebo-controlled trial of Saccharomyces boulardii in combination with standard antibiotics for Clostridium difficile disease. JAMA. 271 (24), 1913-1918 (1994).
  18. Kamboj, M., et al. Relapse versus reinfection: Surveillance of Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 53 (10), 1003-1006 (2011).
  19. Figueroa, I., et al. Relapse versus reinfection: Recurrent Clostridium difficile infection following treatment with fidaxomicin or vancomycin. Clin Infect Dis. 55 (Suppl 2), S104-S109 (2012).
  20. Castro-Cordova, P., et al. Entry of spores into intestinal epithelial cells contributes to recurrence of Clostridioides difficile infection (vol 12, 1140, 2021). Nat Commu. 13 (1), 2456(2021).
  21. Orazi, G., O'toole, G. A. "It takes a village": Mechanisms underlying antimicrobial recalcitrance of polymicrobial biofilms. J Bacteriol. 202 (1), e00530-e00619 (2019).
  22. Costerton, J. W., et al. Bacterial biofilms in nature and disease. Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).
  23. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
  24. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 167-193 (2002).
  25. Donlan, R. M. Biofilms: Microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
  26. Scherr, T. D., Heim, C. E., Morrison, J. M., Kielian, T. Hiding in plain sight: Interplay between Staphylococcal biofilms and host immunity. Front Immunol. 5, 37(2014).
  27. Thomsen, K., et al. Animal models of chronic and recurrent Pseudomonas aeruginosa lung infection: Significance of macrolide treatment. Apmis. 130 (7), 458-476 (2022).
  28. Normington, C., et al. Biofilms harbour Clostridioides difficile, serving as a reservoir for recurrent infection. NPJ Biofilms Microbiomes. 7 (1), 16(2021).
  29. Frost, L. R., Cheng, J. K. J., Unnikrishnan, M. Clostridioides difficile biofilms: A mechanism of persistence in the gut. PLoS Pathog. 17 (3), e1009348(2021).
  30. Meza-Torres, J., Auria, E., Dupuy, B., Tremblay, Y. D. N. Wolf in sheep's clothing: Clostridioides difficile biofilm as a reservoir for recurrent infections. Microorganisms. 9 (9), 1922(2021).
  31. James, G. A., et al. Analysis of Clostridium difficile biofilms: Imaging and antimicrobial treatment. J Antimicrob Chemother. 73 (1), 102-108 (2018).
  32. Brauer, M., et al. What's a biofilm?-how the choice of the biofilm model impacts the protein inventory of Clostridioides difficile. Front Microbiol. 12, 682111(2021).
  33. Poquet, I., et al. Clostridium difficile biofilm: Remodeling metabolism and cell surface to build a sparse and heterogeneously aggregated architecture. Front Microbiol. 9, 2084(2018).
  34. Crowther, G. S., et al. Comparison of planktonic and biofilm-associated communities of Clostridium difficile and indigenous gut microbiota in a triple-stage chemostat gut model. J Antimicrob Chemother. 69 (8), 2137-2147 (2014).
  35. Crowther, G. S., et al. Development and validation of a chemostat gut model to study both planktonic and biofilm modes of growth of Clostridium difficile and human microbiota. PLoS One. 9 (2), e88396(2014).
  36. Dawson, L. F., Valiente, E., Faulds-Pain, A., Donahue, E. H., Wren, B. W. Characterisation of Clostridium difficile biofilm formation, a role for spo0a. PLoS One. 7 (12), e50527(2012).
  37. Dubois, T., et al. A microbiota-generated bile salt induces biofilm formation in Clostridium difficile. NPJ Biofilms Microbiomes. 5 (1), 14(2019).
  38. Abdelkhalek, A., Mohammad, H., Mayhoub, A. S., Seleem, M. N. Screening for potent and selective anticlostridial leads among fda-approved drugs. J Antibiot (Tokyo). 73 (6), 392-409 (2020).
  39. Chen, J., Lu, Y., Du, Y., Wang, H., Wu, Q. Recent development of small-molecular inhibitors against Clostridioides difficile infection. Bioorg Chem. 125, 105843(2022).
  40. Katzianer, D. S., Yano, T., Rubin, H., Zhu, J. A high-throughput small-molecule screen to identify a novel chemical inhibitor of Clostridium difficile. Int J Antimicrob Agents. 44 (1), 69-73 (2014).
  41. Pal, R., Dai, M., Seleem, M. N. High-throughput screening identifies a novel natural product-inspired scaffold capable of inhibiting Clostridioides difficile in vitro. Sci Rep. 11 (1), 10913(2021).
  42. Sun, X., et al. Mouse relapse model of Clostridium difficile infection. Infect Immun. 79 (7), 2856-2864 (2011).
  43. Edwards, A. N., Mcbride, S. M. Isolating and purifying Clostridium difficile spores. Methods Mol Biol. 1476, 117-128 (2016).
  44. Romo, J. A., Kumamoto, C. A. Characterization of the effects of Candida gastrointestinal colonization on Clostridioides difficile infection in a murine model. Methods Mol Biol. 2542, 271-285 (2022).
  45. Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr Protoc Microbiol. Chapter 9 (Unit9A), 1(2009).
  46. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: Plating methods. J Vis Exp. (63), e3064(2012).
  47. Dapa, T., Unnikrishnan, M. Biofilm formation by Clostridium difficile. Gut Microbes. 4 (5), 397-402 (2013).
  48. O'toole, G. A. Microtiter dish biofilm formation assay. J Vis Exp. (47), e2437(2011).
  49. Ethapa, T., et al. Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile. J Bacteriol. 195 (3), 545-555 (2013).
  50. Morais, M., et al. Comparative biofilm-forming ability between Clostridioides difficile strains isolated in Latin America and the epidemic nap1/027 strain. Front Cell Infect Microbiol. 12, 1033698(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

היווצרות ביופילםבדיקה מטבוליתרגישות לתרופותקריאת מסה ביולוגית (Biomass)סריקת תרופותזיהום חוזרמטרה טיפולית

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.