הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

התפתחות תרביות ראשוניות של תאי אפיתל צינוריים בכליה אנושית בחד-שכבות ובתנאים תלת מימדיים

905 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67920

⸱

13 ביוני 2025

 ,  ,  ,  , 
1Laboratorio de Fisiología Renal, Departamento de Ciencias Fisiológicas, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad de Buenos Aires (UBA), 2Instituto de Fisiología y Biofísica Bernardo Houssay (IFIBIO Houssay), Universidad de Buenos Aires – Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (CONICET), 3Servicio de Nefrología, Hospital General de Niños Pedro de Elizalde, 4Laboratorio de Fisiopatogenia, Departamento de Ciencias Fisiológicas, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים להשגת תרביות ראשוניות של תאי אפיתל צינוריים כלייתיים אנושיים (HRTEC) מקליפת הכליה לפיתוח חד-שכבות ותרביות תלת מימדיות על מטריצה חוץ-תאית (3D-HRTEC).

תקציר

תרביות ראשוניות של תאי אפיתל צינוריים של כליה אנושית (HRTEC) מבודדות מכליות שהוסרו מחולים ילדים שעוברים כריתת כליה שצוינה על ידי היחידה לנפרולוגיה ילדים של בית החולים הכללי לרפואת ילדים פדרו דה אליזלדה, בואנוס איירס, ארגנטינה. מבחינה מקרוסקופית, קליפת הכליה הרגילה מנותחת ממדולה הכליה ונחתכת לשברים. לאחר מכן מתעכלים שברי קליפת המוח בתמיסה של האנק בתוספת 0.1% קולגנאז מסוג 1 ומסוננים דרך רשת בגודל נקבוביות של 70 מיקרומטר כדי להפריד את צינורות הכליה מהגלומרולים. צינורות הכליה עוברים עיכול שני עם קולגנאז כדי לבודד תאי אפיתל. לבסוף, עיכול האנזים נעצר, ותאי האפיתל גדלים בצלוחיות המכילות RPMI 1640 עם תוספים מתחת ל-5% CO2ב-37 מעלות צלזיוס עד למפגש. ניתן לגדל תאי HRTEC כחד-שכבות על צלחות של 96 בארות, כיסויי זכוכית לתוך צלחות של 24 בארות, או מחזיקי תרבית תאים מצופים בקולגן. כמו כן, תרביות תאי אפיתל צינורי כליה אנושיים תלת מימדיים (3D-HRTEC) מתקבלות מתאי HRTEC שנזרעו על מטריצת קרום מרתף (BM). מנוטרים צבירת תאים והיווצרות מבני צורה צינורית. השתמשנו בתרביות ראשוניות של HRTEC במשך שנים רבות כדי לחקור את הפעולה הציטוטוקסית הנגרמת על ידי רעלן שיגה בכליה של הילדים, מה שמוביל לשינויים פתופיזיולוגיים וכתוצאה מכך לתסמונת אורמית המוליטית (HUS). ניתן להשתמש גם בתרבויות HRTEC וגם בתרביות 3D-HRTEC כדי להעריך את ההשפעות של רעלים שונים, תרופות סינתטיות, גורמים ביולוגיים, הורמונים וכו', במיוחד על אפיתל הצינורית הפרוקסימלי של הכליה האנושית.

מבוא

בקבוצה שלנו, תרביות ראשוניות של תאי אפיתל צינוריים של הכליה האנושית (HRTEC) שפותחו בשכבות חד-שכבתיות ובתנאים תלת מימדיים (3D-HRTEC) שימשו לחקר כליות הילדים את הפעולה הציטוטוקסית של רעלן שיגה מסוג 2 (Stx2) הנגרמת לאחר זיהום במערכת העיכול ב-Escherichia coli (STEC) המייצר רעלן שיגה.

Stx1 ו-Stx2 (Stxs) הם גורמי האלימות העיקריים של STEC המסוגלים לגרום לתסמונת אורמית המוליטית (HUS) לאחר שלשול1. HUS הוא סיבוך מערכתי המשפיע על כ-5-10% מהילדים הנגועים ב-STEC ומורכב מאנמיה המוליטית, טרומבוציטופניה ופגיעה כלייתית חריפה בילדים (AKI), הדורש טיפול תומך2. בארגנטינה, STEC-HUS היא מחלה אנדמית עם שכיחות שנתית של 6.52 מקרים לכל 100,000 ילדים מתחת לגיל 5 (הגבוהה ביותר בעולם), המייצגת את אחד הגורמים המובילים לפגיעה כלייתית חריפה3. למרות שהתמותה היא פחות מ-4%3, כ-50% מהחולים מפתחים המשך כלייתי, המהווים את הגורם השני בשכיחותו להשתלת כליה בארצנו 4,5.

לפני ההפנמה והפעלת פעולתו הציטוטוקסית, Stx2 נקשר במיוחד לקולטן הגליקוליפיד גלובוטריאוסילסרמיד (Gb3) המתבטא על פני התא של איברי המטרה6. הכליה היא האיבר העיקרי שנפגע על ידי Stxs עקב נוכחותם של תאים רגישים ל-Stx, המבטאים כמויות גבוהות של קולטני Gb3 פעילים ביולוגית בתאי אפיתל ואנדותל כליה 7,8.

עבודות קודמות שבוצעו ב-HRTEC בתרבית חד-שכבתית הראו כי Stx2 עיכב סינתזת חלבון, הפחית את כדאיות התאים והתפשטות התאים, וגרם לאפופטוזיס ונמק 9,10,11,12. יתר על כן, החשיפה של 3D-HRTEC ל-Stx2 עיכבה את נדידת התאים והתפתחות מבנים צינוריים עם מאפיינים של צינוריות פרוקסימליות כליות12,13.

התרביות העיקריות של תרביות HRTEC ו-3D-HRTEC שימשו גם להערכת השפעת האסטרדיול על התפשטות התאים על ידי מדידת השילוב של 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) ב-DNA של תאים בשלב S של מחזור התא14.

כדי לבודד את תאי האפיתל, אנו מתחילים משברי כליה המתקבלים מכריתת כליה בילדים המיועדים לתיקון מצבים אורולוגיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ועדת האתיקה של בית החולים הכללי דה ניניוס פדרו דה אליזלדה אישרה את השימוש ברקמות כליה אנושיות לפיתוח תרביות תאים ראשוניות למטרות מחקר. הושגה הסכמה מדעת בכתב מקרובי המשפחה או האפוטרופוסים מטעם הילדים לשימוש בדגימות כליה למחקר.

הערה: התרביות העיקריות של תאי אפיתל צינוריים בכליה אנושית (HRTEC) נגזרות מחולים ילדים העוברים כריתת כליה, המיועדת לתיקון מצבים אורולוגיים או כריתת גידול, בבית החולים הכללי לרפואת ילדים פדרו דה אליזלדה בבואנוס איירס, ארגנטינה.

1. פיתוח תרביות ראשוניות של תאי אפיתל צינוריים בכליה אנושית (HRTEC)

הערה: שברי הכליה בקליפת המוח מנותחים מכליות שהוסרו מחולים ילדים שעברו כריתת כליה בבית החולים. התרבות העיקרית של HRTEC מבוצעת על פי השיטה שתוארה קודם לכן11.

הפרוטוקול מתואר בשלבים הבאים:

  1. שמור את שבר הכליה בקירור בתמיסת מלח סטרילית עם פוספט (PBS) או בתמיסת מלח מאוזן של הנקס (Hanks) עד לעיבודו במעבדה.
  2. נתח את קפסולת הכליה בעזרת מלקחיים. הפרד את קליפת הכליה מהמדולה וחתך אותה לשברים קטנים של כ -1 מ"מ.
  3. כדי לבצע את העיכול, הניחו את שברי הכליות בתמיסת הנקס סטרילית ללא Ca2+ ו- Mg2+, בתוספת 0.1% קולגנאז מסוג I.
    1. דגרו את שברי הכליה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם טלטול.
  4. כדי לעצור את העיכול, הוסף נפח אחד של PBS המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS) ושטוף את הדגימה שלוש פעמים על ידי צנטריפוגה ב-160 × גרם למשך 10 דקות כל אחת, בצנטריפוגה מקוררת ב-4 מעלות צלזיוס. בכל צנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה באותה תמיסה.
  5. העבירו את תוצר העיכול דרך רשת נקבוביות של 70 מיקרומטר כדי לסנן את הצינורות ולהשליך את הגלומרולים שנותרו במסנן.
  6. צנטריפוגה את הצינוריות המסוננות ב-160 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, השליכו את הסופרנטנט ותלו מחדש את הגלולה בתמיסת הנקס סטרילית, ללא Ca2+ ו-Mg2+, בתוספת 0.2% קולגנאז מסוג I.
    1. דגרו את הדגימה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור.
  7. כדי לעצור את העיכול, הוסף נפח אחד של PBS המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS).
    1. שטפו את הדגימה שלוש פעמים על ידי צנטריפוגה בחום של 160 × גרם, 10 דקות כל אחת, בצנטריפוגה מקוררת ב-4 מעלות צלזיוס. בכל צנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה באותה תמיסה.
  8. לאחר הצנטריפוגה האחרונה, יש להשעות מחדש את גלולת התא ב-5 מ"ל של תרבית שלמה (RPMI 1640 בתוספת 5% FBS, L-גלוטמין [2 מילימול / ליטר], פניצילין [100 U / מ"ל], סטרפטומיצין [100 מיקרוגרם / מ"ל] ותוסף צמיחת תאי אנדותל [ECGS, 1%]).
    1. זרע את תרחיף התאים בבקבוק תרבית בגודל 25 ס"מ2 עם מכסה מאוורר.
    2. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה ו-5% CO2.
  9. למחרת יש לשטוף את תרבית התאים 3 פעמים, להשליך את הנוזל מהבקבוק, להוסיף 5 מ"ל PBS כל אחד ולהוסיף 5 מ"ל של מדיום תרבית שלם לבקבוק. שטיפות אלו מסלקות כדוריות דם אדומות ושברים צינוריים שלא עוכלו במלואם ולא חוברו לבקבוק התרבית.
  10. דגרו את תאי האפיתל בחממת תרבית התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ואפשרו להם לצמוח בשכבה אחת עד למפגש.
  11. החלף את המדיום במדיום תרבית שלם טרי כל 3 ימים והתבונן בתרבית התאים מדי יום תחת מיקרוסקופ הפוך.

2. פיתוח תרביות HRTEC תלת מימדיות (3D-HRTEC)

הערה: סעיף זה מספק את השלבים לפיתוח תרבויות תלת מימדיות (3D-HRTEC). תרביות 3D-HRTEC מבוצעות על פי השיטה שתוארה קודם לכן12.

  1. השתמש במטריצת BM מסרקומה של עכברי אנגלברת-הולם-נחיל. מטריצת BM זו מועברת קפואה, ובמצב זה היא נשארת מוצקה. הפשירו את תמיסת מטריצת ה-BM למשך הלילה באמבט קרח במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, כפי שצוין על ידי היצרן.
  2. מצננים את הקצוות במקפיא לפני הנחת מטריצת ה-BM ומשאירים את הצלחת מרובת הבארות על קרח כדי למנוע התמצקות של המטריצה במהלך התהליך.
  3. קח כמות של מטריצת BM נוזלית (150 מ"ל/ס"מ2) והנח אותה בכל באר של הצלחת כדי לכסות את תחתית הבאר. דגרו את הצלחת בחממת התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי להפוך את מטריצת ה-BM למצב ג'ל.
  4. בינתיים, כדי לנתק תרביות ראשוניות של HRTEC קונפלונטיות, השליכו את מדיום התרבית מהבקבוק והוסיפו 1 מ"ל של 0.25% טריפסין ו-0.02% תמיסת EDTA.
    1. מורחים את הנוזל על כל שטח הבקבוק ודוגרים במשך 5 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס בחממת תרבית התאים.
    2. התבונן במיקרוסקופ הפוך אם כל התאים התנתקו.
  5. השעו מחדש את התאים ב-10 מ"ל של מדיום תרבית או PBS, העבירו אותם לצינור של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-160 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    1. יש להשליך את הסופרנטנט ולהשעות מחדש את גלולת התא בתרבית שלמה המכילה את אותם תוספים המשמשים לתרביות ראשוניות של HRTEC.
    2. ספרו את מספר התאים בתא נויבאואר.
  6. זרע 4 × 104 תאים/150 מיקרוליטר לבאר על מטריצת BM. דגרו את תרבית התאים במשך מספר ימים בחממת תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, באווירה לחה ו-5% CO2.
  7. החלף את המדיום כל יומיים במדיום טרי.
  8. עקוב אחר צבירת תאים והיווצרות מבנים בעלי צורה צינורית תחת מיקרוסקופ אופטי הפוך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תרביות ראשוניות של HRTEC קונפלואנט הראו מורפולוגיה דומה שנצפתה במיקרוסקופ אור (איור 1). התאים אופיינו באימונופלואורסצנציה כפי שתואר בפרסומים הקודמים שלנו באמצעות נוגדנים נגד אקוופורין 1 (AQP1) ו-PECAM CD31 9,12,13. מחקרי אימונופלואורסצנציה הראו כי יותר מ-90% מה-HRTEC היו חיוביים ל-AQP1, מה שמוכיח שמקורם בצינורית הפרוקסימלית של הכליה האנושית. חוץ מזה, אף אחד מהתאים לא היה חיובי לנוגדנים האנדותליים PE...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

יש לבצע תרביות ראשוניות באותו יום של כריתת הכליה. ניתן להשתמש בתרביות ראשוניות של HRTEC בין 1-5 מעברים כדי להבטיח את היציבות המורפוגנטית של התאים. לאחר המעבר החמישי, התאים מתחילים לשנות את המורפולוגיה שלהם, מראים מראה דמוי פיברובלסטים או עלייה בוואקואולים, ויכולים להיות שקטים.

אם משתמשים בשבר כליה גדול יותר, ה-DNA המשתחרר על ידי ליזיס תאים לאחר העיכול עלול להפריע לתהליך הכביסה. במקרה זה, מומלץ להשתמש בנפח גדול יותר של תמיסת עיכול וכביסה. יתר על כן, ניתן להוסיף...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

אנו אסירי תודה לצוות אורולוגי ילדים ב-"Sección de Cirugía Pediátrica, Hospital General de Pediatría Pedro de Elizalde", בואנוס איירס, ארגנטינה, על מתן דגימות כליה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ל-C. Silberstein מאוניברסיטת בואנוס איירס (UBACYT20020190100072BA) ול-C Ibarra ו-C Silberstein מהמועצה הלאומית למחקר מדעי וטכני (CONICET: PUE 0041). עבודה זו נתמכה באופן חלקי על ידי Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED) (באמצעות Red STEC/SUH Nº 224RT0152).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קולגנאז סוג Iסיגמא מרק, סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב637958
תוסף צמיחת תאי אנדותלסיגמא מרק, סנט לואיס, מיזורי, ארה"בE2759
מטריצת קרום בסיס מטריג'לBD Biosciences, ארה"ב; סיגמא מרק, סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב356234
70 μ מסנן רשת נקבוביות MBD Bioscience, MA, ארה"בcss010070
RPMI 1640 בינוני עם L-גלוטמין סיגמא מרק, סנט לואיס, מיזורי, ארה"בR8758-500 מ"ל
הנקס תמיסת מלח מאוזנת  ללא Ca2+ ו-Mg2+Gibco Invitrogen, ניו יורק, ארה"ב14175046
פתרון Trypsin-EDTAסיגמא מרק, סנט לואיס, מיזורי, ארה"בT4049

מקורות

  1. Rivas, M., Chinen, I., Miliwebsky, E., Masana, M. Risk factors for Shiga toxin-producing Escherichia coli-associated human diseases. Microbiol Spectr. 2 (5), (2014).
  2. Gianantonio, C. A., Vitacco, M., Mendilaharzu, F., Gallo, G. E., Sojo, E. T. The hemolytic-uremic syndrome. Nephron. 11 (2), 174-192 (1973).
  3. Alconcher, L. F., et al. Hemolytic uremic syndrome associated with Shiga toxin-producing Escherichia coli infection in Argentina: update of serotypes and genotypes and their relationship with severity of the disease. Pediatr Nephrol. 36 (9), 2811-2817 (2021).
  4. Alconcher, L. F., Lucarelli, L. I., Bronfen, S., Meni Battaglia, L., Balestracci, A. Dynamic evolution of kidney function in patients with STEC-hemolytic uremic syndrome followed for more than 15 years: unexpected changes. Pediatr Nephrol. 40 (1), 143-150 (2025).
  5. Monteverde, M. L., et al. A decrease in the incidence of Shiga toxin-related hemolytic uremic syndrome as a cause of kidney transplantation at an Argentine Referral Center. Pediatr Transplant. 27 (4), e14489(2023).
  6. Sandvig, K., van Deurs, B. Entry of ricin and Shiga toxin into cells: molecular mechanisms and medical perspectives. EMBO J. 19 (22), 5943-5950 (2000).
  7. Obrig, T. G. Escherichia coli Shiga toxin mechanisms of action in renal disease. Toxins (Basel). 2 (12), 2769-2794 (2010).
  8. Karpman, D., et al. Apoptosis of renal cortical cells in the hemolytic-uremic syndrome: in vivo and in vitro studies. Infect Immun. 66 (2), 636-644 (1998).
  9. Pistone Creydt, v, Silberstein, C., Zotta, E., Ibarra, C. Cytotoxic effect of Shiga toxin-2 holotoxin and its B subunit on human renal tubular epithelial cells. Microbes Infect. 8, 410-419 (2006).
  10. Silberstein, C., Pistone Creydt, V., Gerhardt, E., Nuñez, P., Ibarra, C. Inhibition of water absorption in human proximal tubular epithelial cells in response to Shiga toxin-2. Pediatr Nephrol. 23, 1981-1990 (2008).
  11. Márquez, L. B., et al. Effects of Escherichia coli subtilase cytotoxin and Shiga toxin 2 on primary cultures of human renal tubular epithelial cells. PLoS One. 9, e87022(2014).
  12. Márquez, L. B., Araoz, A., Repetto, H. A., Ibarra, F. R., Silberstein, C. Effects of Shiga toxin 2 on cellular regeneration mechanisms in primary and three-dimensional cultures of human renal tubular epithelial cells. Microb Pathog. 99, 87-94 (2016).
  13. Sánchez, D. S., et al. Eliglustat prevents Shiga toxin 2 cytotoxic effects in human renal tubular epithelial cells. Pediatr Res. 91 (5), 1121-1129 (2022).
  14. Sánchez, D. S., et al. Estradiol stimulates cell proliferation through classic estrogen receptors and GPER-1 in human renal tubular epithelial cell primary cultures. Biochem Biophys Res Commun. 512, 170-175 (2019).
  15. Fernandez Miyakawa, M., Zabal, O., Silberstein, C. Clostridium perfringens epsilon toxin is cytotoxic for human renal tubular epithelial cells. Hum Exp Toxicol. 30, 275-282 (2011).
  16. Chen, J., et al. Cooperative application of transcriptomics and ceRNA hypothesis: ln cRNA-00742/miR-116 targets CD74 to mediate vanadium-induced mitochondrial apoptosis in duck liver. J Hazard Mater. 480, 135904(2024).
  17. Chen, J., et al. Copper toxicity in the liver of broiler chicken: insights from metabolomics and AMPK-mTOR mediated autophagy perspective. Poult Sci. 103 (9), 104011(2024).
  18. Zhang, T., et al. Role of Caveolin-1 on the molybdenum and cadmium exposure induces pulmonary ferroptosis and fibrosis in the sheep. Environ Pollut. 334, 122207(2023).
  19. Fujiki, K., et al. Blockage of Akt activation suppresses cadmium-induced renal tubular cellular damages through aggrephagy in HK-2 cells. Sci Rep. 14, 14552(2024).
  20. Joun, J. I. H., et al. Antioxidative effects of molybdenum and its association with reduced prevalence of hyperuricemia in the adult population. PLoS One. 19 (8), e0306025(2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

התפתחות תרביות ראשוניות של תאי אפיתל צינוריים בכליה אנושית בחד-שכבות ובתנאים תלת מימדיים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.