מאמר שיטה

טכניקת חלון גולגולת כרונית להקלטות חוזרות ונשנות בקליפת המוח במהלך הרדמה בחזירים

DOI:

10.3791/67931

⸱

6 ביוני 2025

 ,  ,  ,  , 
1Center for Neuroplasticity and Pain, Department of health, science and technology, Aalborg University, 2Department of Cardiovascular Surgery, Department of Clinical Medicine, Aalborg University Hospital

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מציג שיטה ניתנת להרחבה, אמינה וניתנת לשחזור עבור הקלטות קליפת המוח הכרוניות החוזרות ונשנות במודל חזיר. לשיטה יישומים בתחומים שונים של מדעי המוח, כולל חקר כאב ואבחון מחלות נוירולוגיות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקלטות קליפת המוח חיוניות לחילוץ אותות עצביים כדי ליידע יישומים שונים, כולל ממשקי מוח-מחשב ואבחון מחלות. כל יישום מציב דרישות ספציפיות לטכניקת ההקלטה, ולעתים קרובות נבחרים פתרונות פולשניים להקלטות ארוכות טווח. עם זאת, שיטות הקלטה פולשניות מאותגרות על ידי כשל במכשיר ותגובות רקמות שליליות, הפוגעות באיכות האות לטווח הארוך.

כדי לשפר את האמינות והאיכות של הקלטות כרוניות בקליפת המוח תוך מזעור סיכונים הקשורים לכשל במכשיר ותגובות רקמות, פיתחנו טכניקת חלון גולגולת. בפרוטוקול זה, אנו מדווחים על שיטות להשתלה וגישה לחלון גולגולת בחזירים צעירים, מה שמקל על מיקום מערך אלקטרוקורטיקוגרפיה זמנית (ECoG) על הדורה מאטר. אנו מתארים עוד כיצד ניתן להקליט אותות קליפת המוח באמצעות טכניקת חלון הגולגולת. ניתן לחזור על גישה לחלון הגולגולת מספר פעמים, אך מומלץ לפחות שבועיים בין ניתוחי השתלה לגישה כדי להקל על ההחלמה וריפוי הרקמות.

גישת חלון הגולגולת הצליחה למזער מצבי כשל אלקטרודות נפוצים ותגובות רקמות, וכתוצאה מכך הקלטות קליפת המוח יציבות ואמינות לאורך זמן. רשמנו פוטנציאלים הקשורים לאירועים (ERP) מקליפת המוח הסומטוסנסורית הראשונית כדוגמה. השיטה סיפקה הקלטות אמינות ביותר, שאפשרו גם להעריך את השפעת ההתערבות (גירוי בתדר גבוה) על ה-ERP. היעדר כשלים משמעותיים במכשירים והמספר המופחת של אלקטרודות בשימוש (שתי אלקטרודות, 43 מפגשי הקלטה, 16 בעלי חיים) מרמזים על כלכלת מחקר משופרת. בעוד שנדרשת גישה כירורגית קלה למיקום אלקטרודות, השיטה מציעה יתרונות כמו סיכון מופחת לזיהום ושיפור רווחת בעלי החיים.

מחקר זה מציג שיטה ניתנת להרחבה, אמינה וניתנת לשחזור עבור הקלטות קליפת המוח הכרוניות, עם יישומים פוטנציאליים בתחומים שונים של מדעי המוח, כולל חקר כאב ואבחון מחלות נוירולוגיות. התאמות עתידיות עשויות להרחיב את השימוש בו למינים אחרים ולשיטות הקלטה, כגון הקלטות תוך-קורטיקליות וטכניקות הדמיה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באופן כללי, מטרת ההקלטות בקליפת המוח היא לחלץ מידע מהאיתות העצבי במוח. ניתן להשתמש במידע זה בדרכים שונות - שליטה במכשיר חיצוני, תקשורת, אבחון מחלות או שיקום 1,2,3,4. כל יישום מציב דרישות ייחודיות לתוכן המידע ולרזולוציה המרחבית הנדרשת ולכמות הפולשניות הנחשבת מקובלת. לכן, פתרונות הקלטה עם מגוון פולשניות ורזולוציה מרחבית פותחו מאז גילוי האלקטרואנצפלוגרמה בשנת 19295.

באופן כללי, ניתן לחלק אותם לאלקטרואנצפלוגרפיה (EEG), אלקטרוקורטיקוגרפיה (ECoG) והקלטות תוך-קורטיקליות. EEG היא שיטת הקלטה לא פולשנית הלוכדת תנודות עצביות ופוטנציאלים הקשורים לאירועים (ERP) מכל המוח. עם זאת, יכולתו להגדיר את מקורות הפעילות מוגבלת בשל הרזולוציה המרחבית הנמוכה שלו. ECoG היא שיטה פולשנית יותר שבה אלקטרודות ממוקמות באופן אפי או תת-דורלי, בדרך כלל מכסות חלק קטן יותר של קליפת המוח. יש לו רזולוציה מרחבית גבוהה יותר והוא יכול להקליט ERP ופוטנציאל שדה מקומי על פני השטח (LFP). לכן, הוא יכול למקם את מקור הפעילות המוחית בצורה מדויקת יותר, מה שהופך אותו למועיל, למשל, בזיהוי מקור האפילפסיה המוקדית. ההקלטה התוך-קורטיקלית היא שיטת ההקלטה הפולשנית ביותר ויכולה לתעד פעילות זינוק מנוירונים בודדים הממוקמים שטחיים או עמוקים בתוך המוח ו-LFP מנפח הנוירונים סביב האלקטרודות. לאותות אלה יש רזולוציה מרחבית גבוהה מאוד ותכולת מידע אך הם מיוצרים על ידי תת-קבוצה מוגבלת של נוירונים (1-10 נוירונים לכל ערוץ)6.

כדי לחלץ מידע מהמוח לתקופות ממושכות (חודשים-שנים), הממשק חייב להיות יציב ואמין כדי שהאותות הנרכשים ימשיכו לייצג את אותו מידע לאורך כל התקופה. הקלטות EEG דורשות החלפות אלקטרודות תכופות, מה שהופך את האמינות שלהן למשתנה מנמוכה מאוד לגבוהה מאוד 7,8,9,10. לכן, שיטות ECoG ושיטות תוך-קליפתיות נבחרות לעתים קרובות להקלטות ממושכות. עם זאת, שתי השיטות הללו דורשות שמצב האלקטרודה ההקלטה, כמו גם הרקמה, חייב להישאר יציב לאורך זמן. בעוד שהאלקטרודה בדרך כלל נשארת באותו מיקום, ממשק האלקטרודה-רקמה עשוי להשתנות עקב תגובות רקמה או מצבי כשל אלקטרודה 11,12,13,14. תגובות רקמות כוללות מוות עצבי, דימום, זיהום ביולוגי, תגובה לגוף זר, גליוזיס, אנקפסולציה, זיהום, דלקת קרום המוח ושחול קרום המוח15. תגובות אלו פוגעות ביכולות ההקלטה של האלקטרודות12,13. מצבי כשל נפוצים באלקטרודות הם דלמינציה או דליפה בחלקים המבודדים, דלמינציה או סדקים של ציפוי משטח האלקטרודה, נזק לחוטים ופריקת אלקטרודה11,12.

כדי להתגבר על מצבי כשל באלקטרודות, שקלנו את הכדאיות של פתרון מיקום אלקטרודות זמני הנותן מענה גם לרבים מהאתגרים הקשורים לתגובות רקמות, כלומר מוות עצבי, תגובה לגוף זר, גליוזיס, אנקפסולציה ושחול קרום המוח. יתר על כן, מיקום עקבי של אלקטרודות היה דרישה להשגת הקלטות עצביות אמינות וניתנות לשחזור. מכיוון שהאלקטרודה הוצבה אפידורלית במרחק של כמה מילימטרים לרקמת העצבים, תנועת האלקטרודה לא תעלה על 1 מ"מ. חלון הגולגולת תוכנן במידות כדי למנוע תנועה מוגזמת בין מיקומי האלקטרודות. עם התפתחות טכניקת חלון הגולגולת, אנו שואפים לשפר את אמינות ואיכות האות לטווח הארוך ולהסיר את הסיכון לכשל באלקטרודה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה אושר על ידי מינהל הווטרינריה והמזון הדני תחת משרד המזון, החקלאות והדיג של דנמרק (מספר פרוטוקול 2020-15-0201-00514). בסך הכל עברו 16 חזירות מקומיות את ההליכים. בעלי החיים שקלו כ-20 ק"ג עם הגעתם למתקן, כלומר הם היו בני חודשיים בערך. הם שקלו כ-30 ק"ג בעת ההשתלה ו-40-60 ק"ג בסוף המחקר. ההליכים מורכבים מניתוח השתלה, ניתוח גישה וניתוחים סופניים (איור 1).

figure-protocol-1
איור 1: ציר הזמן של הליכי הניסוי. ניתן לחזור על ניתוח הגישה (שלב II) מספר פעמים. מומלץ לבצע הפרדה של שבועיים לפחות בין ניתוחים להחלמה וריפוי פצעים בין ניתוחים. קיצור: ERP = פוטנציאל הקשור לאירוע. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

1. ניתוח השתלה (שלב I)

הערה: חלון גולגולת של חומצה פולילקטית (PLA) מודפס בתלת מימד (איור 2) מושתל כדי להקל על הקלטות חוזרות ונשנות מקליפת המוח הסומטוסנסורית הראשונית של החזיר. נרשמים ERPs עקב גירוי חשמלי של העצב האולנרי. הניתוח וסגירת הפצע מבוצעים כך שניתן יהיה לגשת לחלון הגולגולת ולסגור אותו לאחר מכן.

figure-protocol-2
איור 2: עיצוב חלון גולגולת. (A) מבט מהצד של חלון הגולגולת המציין את גובה הקירות ואת הבסיס המהודק לגולגולת. (B) מבט למעלה המציין את קוטר האלמנה הגולגולתית, חורי הברגים, חלל המכסה והחלון. מכסה חלון הגולגולת הוא גליל בקוטר 22 מ"מ בגובה 1 מ"מ המתאים במדויק לחלל המכסה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

  1. השתלת חלון גולגולת
    1. הכנה לניתוח
      הערה: מעבד הנתונים (RZ2), תחנת העבודה (WS8) והמחשב מופעלים לפני תחילת הניתוח. הערות ניתוח נלקחות על גיליון אלקטרוני לפחות כל 15 דקות על ידי חוקר לא סטרילי כדי לתעד סימנים חיוניים (דופק, spO2, CO 2 בסוף הגאות, טמפרטורת הליבה), רמות ההרדמה (קצב עירוי פרופופול, קצב עירוי פנטניל, אחוז סבופלורן), שלב הניתוח וכל אי סדרים.
      1. הרגיעו את בעל החיים באמצעות הזרקה תוך שרירית של 5-7 מ"ל תערובת זולטיל (1 מ"ל הכיל 8.3 מ"ג טילטמין, 8.3 מ"ג זולאזפאם, 8.3 מ"ג קסילאצין ו-1.7 מ"ג בוטופנול).
        הערה: במחקר הספציפי הזה, קטמין הושמט מתערובת הזולטיל כדי למנוע חסימת קולטני NMDA.
      2. הובלת בעל החיים לחדר הניתוח. החדרו את החיה וחברו אותה למכונת הנשמה מכנית.
      3. הנח קטטר לוורידי האוזן כדי לתת פרופופול, פנטניל ותמיסת מלח.
      4. מתן הרדמה כירורגית: סבופלורן 1-2%, פרופופול (10 מ"ג/מ"ל מוזרק ב-8 מ"ג-1∙h-1), פנטניל (50 מיקרוגרם/מ"ל מוזרק ב-20 מיקרוגרם∙ק"ג-1∙h-1).
      5. סמן את מקום החתך באמצעות טוש סטרילי לפני עטיפה סטרילית. זהה את נקודת הברגמה על ידי ציור קווים ישרים בין כל אוזן לעין הנגדית; נקודת ברגמה נמצאת במפגש של הקווים האלה (איור 3A). ודא שהחתך מעט לרוחב קו האמצע בצד הנגדי לגפה הקדמית המגורה.
      6. הנח את לוחית המתכת מתחת לווילונות והקפד על מיקום ויציבות נכונים לפני תחילת הניתוח.
    2. גישה לגולגולת
      הערה: בחלק זה ובחלקים הבאים של הפרוטוקול, כל ההליכים מבוצעים על ידי מנתח סטרילי אלא אם צוין אחרת.
      1. בצע את החתך הראשוני בדרמיס בעזרת אזמל מעט לרוחב קו האמצע, כפי שמסומן בשלב 1.1.1.5. המשך את החתך דרך העור בעזרת צריבה
        הערה: אין להאריך את החתך יותר מדי קדימה כדי להימנע מהסינוסים הקדמיים הגדולים של החזיר. אם יש צורך בשטח נוסף, הרחב את החתך בצד האחורי.
      2. הנח את המחזיר והחזק את העור באמצעות מלקחיים וחתוך את רקמת החיבור האווסקולרית בין הפריאוסטאום לתת-העור (איור 3B) כדי לספק גמישות רבה יותר לעור ולהקל על התפירה בשלב 1.4. התאם את המחזיר לגמישות שהושגה.
      3. חותכים את הפריאוסטאום ומשחררים אותו מהגולגולת באמצעות מעלית פריוסטאום. החזק את הפריאוסטאום בצד באמצעות המפרק.
    3. גישה לדורה
      1. קדחו חור בקוטר 10 מ"מ קדמי לקו התפר הסגיטלי ולרוחב לתפר קו האמצע (איור 3C). התחל בקוטר של 15 מ"מ כדי להשיג חור בקוטר 10 מ"מ ברמת הדורה מכיוון שהמקדח המעוגל יגרום לחור מחודד מעט.
      2. התאם את חלון הגולגולת לחור מוקדם כדי להבטיח התאמה טובה.
      3. עבור למקדחה קטנה יותר כאשר הדורה נראית לעין כדי להשיג את הרוחב המרבי של החור ברמת הדורה. גזור את הקצוות באמצעות Rongeurs.
    4. השתלת חלון גולגולת
      1. ודא שחלון הגולגולת נכנס לתחתית החור ועד לתחתית החור והחליט על עומקו. למרות שזה תלוי בבעלי חיים, ודא שדפנות חלון הגולגולת יגיעו לדורה להתאמה טובה אך לא יפעילו לחץ על המוח בשום מקום.
      2. סמן את חורי הברגים באמצעות המקדחה הידנית תוך החזקת חלון הגולגולת במקומו.
      3. הסר את חלון הגולגולת וקדח את החורים בעומק של 4 מ"מ לפחות. חודר לגולגולת כדי שאחד הברגים ישתמש בו כקרקע/התייחסות להקלטות קליפת המוח.
      4. הנח את חלון הגולגולת (איור 3), והסר את המחט מערכת עירוי הפרפר. מדוד את עומק חורי הברגים דרך חלון הגולגולת באמצעות הפרפר הבוטה. הכנס והדק בורג באורך תואם לתוך החור.
        הערה: בורג ארוך מדי לא יצליח להדק את מכסה חלון הגולגולת ביעילות.
      5. הנח מחבר U מתחת לבורג אחד שמחורר את הגולגולת ונוגע בדורה.
        הערה: חשוב שאורכו של בורג זה יהיה גדול מעובי הגולגולת כדי שעצם שצומחת מחדש לא תמנע מגע עם הדורה.
  2. השתלת חוט היקפי
    הערה: הליך זה יכול להיעשות במקביל להשתלת חלון גולגולת. זהו הליך סטרילי. כדי למנוע זיהום של אתר הניתוח או אתר הגולגולת, יש ללבוש לבוש סטרילי.
    1. השתלת חוטים ליד העצב האולנרי
      1. הפעל גירוי חשמלי ב-5 mA על העור על ידי נגיעה בעור בחלק הדיסטלי האחורי של הגפה הקדמית עם שתי מחטים (לא חודרות) או פיסת מתכת סטרילית אחרת המופרדת ב-2 ס"מ. חפש כיפוף פרסה ברור, המעיד על כך שהעצב עובר בין שתי הנקודות הללו.
        הערה: ייתכן שיהיה צורך לסובב את הגפה לאחור כדי שיהיה קל יותר לגשת לחלק האחורי.
      2. הכנס את שתי המחטים בניצב למהלך העצב במרחק של כ -2 ס"מ זה מזה. חודרים שוב את העור כ-3 ס"מ מנקודת ההחדרה (איור 4A).
      3. אמת את המיקום באמצעות גירוי בדיקה המופעל על המחטים ב-2 mA; ודא שתנועה ברורה של הפרסה נראית לעין.
      4. העבירו את חוטי הקונר דרך המחטים והוציאו את המחטים, והשאירו את חוטי הקונר חלקית מתחת לעור. ודא שהחלק הלא-מבודד באמצע החוט נמצא מתחת לעור עבור שני החוטים (איור 4B).
        הערה: אם הגפה סובבה לאחור, סובב אותה בזהירות קדימה.
      5. חבר כל מחבר תנין לקצה מבודד של שני חוטי הקונר.
    2. קביעת סף מוטורי
      1. מצא את סף המנוע בשיטת למעלה-למטה16,17; התחל ב-100 μA, גדל בצעדים של 50 μA, תוך התבוננות ותחושה לתגובה מוטורית באזור הפרסה. סף מתחת ל-1 mA הוא בדרך כלל אפשרי.
      2. תכנת את ה-STG לספק 100 גירויים סימטריים דו-פאזיים מלבניים עם רוחב פולס של 200 מיקרון ב-2x הסף המוטורי ואחריו 100 גירויים ב-10x הסף המוטורי.
  3. הקלטת אותות קליפת המוח
    1. בקש מחוקר לא סטרילי להביא את המגבר המקדים למקומו ולחבר אותו למעבד הנתונים (RZ2) באמצעות כבלי סיבים אופטיים.
    2. הפחת את הסבופלורן ל-0.5-1% (מחצית מרמתו הניתוחית) ועקוב אחר קצב הלב,CO2 שפג תוקפו ולחץ הדם (אם זמין) כדי להבטיח עומק הרדמה הולם ויציב. יש להגדיל את הכמות של פרופופול ופנטניל לפי הצורך.
    3. בקש מחוקר לא סטרילי לחבר את ה-headstage למגבר המקדים (SI8) ולהניח את headstage (ZIF-clip) במחזיק headstage, המותקן על המיקרומניפולטור של המעמד המגנטי.
    4. הנח את העטיפה הסטרילית סביב המיקרומניפולטור והצמד את החלק הדביק לראש ה-stage ולמחזיק headstage (איור 5A).
    5. בקש מחוקר לא סטרילי לאבטח את המיקרומניפולטור באמצעות המעמד המגנטי, לטבול את האלקטרודה μECoG באלכוהול ולהניח אותה בראש הבמה (ZIF-clip).
      הערה: הניחו לאלקטרודה להתייבש לפני הנחתה על הדורה. הקפד לגעת רק בווילון הסטרילי המכסה את הבמה הראש, מכיוון שהאלקטרודה μECoG אינה סטרילית.
    6. הבא את ה-μECoG למקומו באמצעות המיקרומניפולטור והדרכה עם צמר גפן. חבר את חוטי ההארקה של ה-μECoG לבורג ההארקה באמצעות מחבר תנין.
    7. הפחת את הסבופלורן ל-0%, עקוב אחר קצב הלב, CO2 שפג תוקפו ולחץ הדם (אם זמין) כדי להבטיח עומק הרדמה הולם ויציב, הגדל את הפרופופול והפנטניל לפי הצורך.
    8. תצוגה מקדימה של האותות בסינפסה; תחום האותות הטיפוסי הוא עד ±100 μV.
      1. אם האות נראה כמו קו מודגש (המעיד על רעש קו), בקש מאדם סטרילי לבצע את הפעולות הבאות: חקור את מעגלי ההארקה ושמור על בורג ההארקה והחיבורים יבשים ומבודדים מרקמות סמוכות. בדוק אם כבלים אחרים מבודדים מגוף החזיר וממכשירי הניתוח. אם לא, השתמש בגזה סטרילית כדי לבודד כבלים מהגוף או ממכשירים כירורגיים.
      2. אם משרעת האות גדולה מ-±100 μV (מעיד על חפצי תנועה), ודא שהאלקטרודה תלויה ונחה על המוח ושהכבלים אינם זזים כאשר החזיר נע עקב אוורור או גירוי חשמלי של העצב האולנרי.
      3. אם משרעת האות קטנה מ-±-20 mV (מעיד על מגע לקוי או הרדמה עמוקה), ודא שה-μECoG מונח על המוח והדורה והאלקטרודה לחות; במידת הצורך, טפטפו מעט מי מלח על האלקטרודה. ודא שהסבופלורן כבוי והפחית את קצב העירוי של פרופופול (ואולי פנטניל). בצע גירוי בדיקה ובדוק אם תגובות מעוררות נראות לעין. ודא שהחלק הלא מבודד של החוט ההיקפי נמצא כולו מתחת לעור.
        הערה: בדרך כלל ניתן להבחין בתגובות מעוררות בסריקות בודדות באינטרנט, אך ניתן גם להעריך זאת במצב לא מקוון, תוך שימוש בממוצע של 5-10 גירויים. אם שיא נראה בזמן ההדק, זהו חפץ גירוי. חפץ הגירוי יפריע לניתוח הנתונים.
    9. הניחו גזה סטרילית על האלקטרודה כדי לשמור על מגע טוב עם הרקמות. טפטפו מי מלח בטמפרטורת הגוף על הגזה כדי למנוע ייבוש של הרקמה.
      הערה: מכיוון שההקלטות הללו הן אפידורליות, הטמפרטורה המדויקת אינה חיונית. בהקלטות תת-דוראליות, זה קריטי יותר.
    10. אפשר לאלקטרודה להתייצב (30 דקות) ולתעד את מיקום האלקטרודה ואת הגדרת מחבר ההארקה כדי להבטיח הקלטות עוקבות דומות (איור 5B-D). התחל להקליט והמתן 30 שניות לפני שתתחיל את תוכנית הגירוי כל 10 דקות.
      הערה: בדוק באופן קבוע בין ההקלטות שהגזה על האלקטרודה נשארת לחות וטפטף מי מלח בטמפרטורת הגוף במידת הצורך.
    11. בצע התערבות לאחר שלושה סבבים של גירוי (כדי לשמש כבסיס לפני ההתערבות). חזור על הגירוי במשך תשעה סיבובים נוספים.
      הערה: המשך לבדוק באופן קבוע בין ההקלטות שהגזה על האלקטרודה נשארת לחות ולטפטף מי מלח במידת הצורך.
  4. סגירת אתר השתל
    1. הסר את הגזה מהאלקטרודה והסר את האלקטרודה באמצעות המיקרומניפולטור תוך הנחיית אותה בעדינות עם צמר גפן.
    2. בקש מחוקר לא סטרילי להסיר ולאחסן את המיקרומניפולטור, האלקטרודה, הבמה הראשית והמגבר המקדים ולנקות את האלקטרודה לפי הוראות היצרן באמצעות שטיפה מהירה במים נטולי יונים כדי להסיר שאריות רקמות. השרו את האלקטרודה עד 4 שעות במנקה עדשות כדי להסיר רקמות וחלבונים משטח האלקטרודה, ולאחר מכן שטיפה שנייה במים נטולי יונים כדי להסיר את מנקה העדשות משטח האלקטרודה. לפני אחסונו, טבלו את האלקטרודה באלכוהול איזופרופיל.
    3. הנח את מכסה חלון הגולגולת כדי לסגור את חלון הגולגולת, וודא שהוא מתאים במדויק לחלון הגולגולת. זה לא דורש הידוק נוסף; לחץ מהעור על השתל ישמור אותו במקומו.
    4. הניחו את השקית האנטיביוטית על גבי מכסה חלון הגולגולת וסגרו את העור תת-עורי עם תפרים בודדים הניתנים לספיגה באמצעות טכניקת תפר המזרן האנכי הקבור (איור 6A). הניחו תפרים במרחק של 5-10 מ"מ, מה שמאפשר מקום למקם את התפרים העוריים. אין לקשור את שלושת התפרים האחרונים לאחר הנחתם. במקום זאת, קשרו את שלושת התפרים הללו כאשר כל התפרים מונחים.
      הערה: קשירת שלושת התפרים האחרונים לאחר הנחת שלושתם מבטיחה שיש מספיק מקום להניח את התפרים האחרונים.
    5. הנח תפרים תוך עוריים רציפים בצורה רציפה בעור. התחל את התפר התוך-עורי 1-2 ס"מ לרוחב לאתר החתך ותעלה מתחת לעור לשכבת העור אך מתחת לפני השטח שלו (איור 6B) כדי למנוע גירוד והתרופפות יתר של התפרים. קושרים קשר בקצה הצדדי של התפר.
      הערה: ניתן לכבות פרופופול ופנטניל במהלך הליך זה, מכיוון שיש להם מספר דקות של זמן התעוררות.
    6. הנח את התפר הרציף בין התפרים התת עוריים עד שמגיעים לצד השני של החתך.
      הערה: חשוב שהתפר ייצא בדרמיס אך לא ינקב את העור כך שהחיה תהיה פחות מסוגלת לשרוט את התפרים.
    7. מנהרה של התפר 1-2 ס"מ לרוחב החתך לאתר יציאה רוחבי וקשר קשר (איור 6B). מרחו דבק רקמות על מקום החתך.
  5. החזרת בעלי חיים למכלאה הביתית
    1. הסר את הווילונות הסטריליים מהחיה, וגמל את החיה ממכונת ההנשמה ברגע שנצפתה תנועה.
    2. העבירו את החיה לדיר הביתי ושמרו אותה מופרדת מחבר העט למשך לילה אחד.
      הערה: חזירים מופרדים לאחר הניתוח, מכיוון שזה נורמלי שהם מנסים באלימות להעיר את חבר העט, וכתוצאה מכך פצעי נשיכה. חזירים צריכים להיות מסוגלים לבוא במגע עם החוטם.

figure-protocol-3
איור 3: השתלת חלון הגולגולת. (A) המיקום הצפוי של נקודת הברגמה מזוהה ומסומן על החזיר לפני העטיפה הסטרילית, מאחר שקשה להבחין בכך לאחר מכן. (B) אחרי חתך העור, תת-העור של כלי הדם משוחרר באמצעות מספריים. (C) נקדח חור בקוטר 15 מ"מ בגולגולת, והקצוות מוסרים באמצעות רונג'ורים. קווי התפרים העטרתיים והסגיטליים מודגשים. (D) חלון הגולגולת מושתל ומהודק באמצעות ברגים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-4
איור 4: השתלת חוטים היקפיים. (A) שתי מחטי 23 G ממוקמות בעור וחוטי הקונר מוחדרים דרכן. (B) המחטים מוסרות, והחוטים נשארים בעור מחוברים לממריץ באמצעות אטבי תנין. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-5
איור 5: מערך הקלטה קליפת המוח. (A) מערך האלקטרודות ממוקם על הדורה, ומחזיק הבמה הראשית והמיקרומניפולטור נמצאים בשרוול סטרילי במהלך ניתוח השתלה, שבו החתך ארוך ורוחבי יותר. (B) תקריב של ה-μECoG במערך ההקלטה במהלך ניתוח גישה, שבו החתך הוא מדיאלי יותר. (ג) מערך ההארקה, שבו כל חוטי ההארקה והייחוס ב-ECoG מקוצרים ומחוברים דרך מחבר ה-U לבורג הפרי-גולגולתי. (ד) תקריב של הבמה הראשית ומחזיק הבמה הראשית במהלך ניתוח גישה. ה- μECoG ממוקם על הדורה. קיצורים: ECoG = אלקטרוקורטיקוגרפיה; μECoG = microECoG. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-6
איור 6: טכניקת תפירה. (A) סכמטי של טכניקת המזרן האנכי הקבור התת עורי. (B) סכמטי של טכניקת התפר התוך-עורי הרציף. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

2. ניתוח גישה (שלב II)

הערה: לאחר 2-4 שבועות, חלון הגולגולת נפתח לביצוע הקלטות מעקב של אותות קליפת המוח מה-S1. הניתוח וסגירת הפצע מבוצעים שוב באופן שניתן לגשת לחלון הגולגולת ולסגור אותו שוב.

  1. הכנה לניתוח
    הערה: שלבים 2.1.1-2.1.6 דומים לשלבים 1.1.1.1-1.1.1.6.
    1. הרגיעו את בעל החיים באמצעות תערובת זולטיל (5 מ"ל זולטיל [טילטמין 25 מ"ג/מ"ל וזולאזפם 25 מ"ג/מ"ל), 6.25 מ"ל קסילזין (20 מ"ג/מ"ל) ו-2.5 מ"ל בוטאורפנול (10 מ"ג/מ"ל)).
      הערה: במחקר הספציפי הזה, קטמין הושמט מתערובת הזולטיל כדי למנוע חסימה של קולטני NMDA.
    2. העבר את בעל החיים לחדר הניתוח והחדיר ואוורר אותו.
    3. הנח קטטר לווריד האוזן. יש לתת פרופופול, פנטניל ותמיסת מלח דרך הצנתר.
    4. מתן הרדמה כירורגית: סבופלורן 1-2%, פרופופול (10 מ"ג/מ"ל מוזרק ב-8 מ"ג-1∙h-1), פנטניל (50 מיקרוגרם/מ"ל מוזרק ב-20 מיקרוגרם∙ק"ג-1∙h-1).
    5. במידת הצורך, סמנו את מקום החתך באמצעות טוש סטרילי לפני הכיסוי הסטרילי. זהה את נקודת הברגמה על ידי ציור קווים ישרים בין כל אוזן לעין הנגדית; ברגמה נמצאת בצומת של הקווים האלה (איור 3A).
      הערה: החתך הראשוני בדרך כלל עדיין נראה לעין. יש למקם את החתך החדש לפחות 30 מ"מ מהחתך הראשוני כדי למנוע את רוב רקמת הצלקת ולהקל על סגירת הפצע.
    6. הנח את לוחית המתכת מתחת לווילונות והקפד על מיקום ויציבות נכונים לפני תחילת הניתוח.
  2. גישה לחלון הגולגולת
    הערה: שלבים 2.2.1-2.2.3 דומים לשלבים 1.1.2.1-1.1.2.3.
    1. בצע את החתך הראשוני בדרמיס בעזרת אזמל מעט לרוחב קו האמצע כפי שמסומן בשלב 2.1.5. המשך את החתך דרך העור בעזרת צריבה
      הערה: במקרה של ניסוי סופי, ניתן לבצע את החתך באותו מיקום כמו החתך המקורי.
    2. הנח את המחזיר והחזק את העור באמצעות מלקחיים וחתוך את רקמת החיבור האווסקולרית בין הפריאוסטאום לתת-העור (איור 3B) כדי לספק גמישות רבה יותר לעור ולהקל על התפירה בשלב 1.4. התאם את המחזיר לגמישות שהושגה.
      הערה: אם זהו ניסוי סופי, ניתן להשמיט שלב זה.
    3. חתכו את הפריאוסטאום ושחררו אותו מהגולגולת באמצעות מעלית הפריאוסטאום. החזק את הפריאוסטאום בצד באמצעות המפרק.
    4. הסר את מכסה חלון הגולגולת והסר כל חיבור מהפתח בתנועות מעגליות עדינות עם צמר גפן עד שמגיעים לדורה.
  3. השתלת חוט היקפי
    1. חזור על שלב 1.2.
  4. הקלטת אותות קליפת המוח
    1. חזור על שלב 1.3.
  5. סגירת אתר השתל
    1. חזור על שלב 1.4.
      הערה: אם זהו ניסוי סופי, ניתן להשמיט שלב זה.

3. ניתוח סופני (שלב III)

הערה: לאחר 2-4 שבועות, חלון הגולגולת נפתח לביצוע הקלטות מעקב של אותות קליפת המוח מה-S1. שלבים 2.2-2.5 חוזרים על עצמם, כמתואר לעיל, ואחריהם שלב 3.1.

  1. המתת חסד
    הערה: יש לשטוף את הצינור של קטטר וריד האוזן במי מלח כדי למנוע חמצון של הברביטוראט.
    1. שטפו את קטטר וריד האוזן במי מלח.
    2. חבר מזרק עם מנת יתר של פנטוברביטל (10 מ"ל, 400 מ"ג/מ"ל) והזריק את הפנטוברביטל דרך קטטר וריד האוזן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות טכניקת חלון הגולגולת, אותות קליפת המוח נרשמו ב-43 מפגשים ב-16 בעלי חיים. בעלי חיים החלימו כראוי לאחר הניתוח ושוכנו בזוגות לאורך כל המחקר והיו במעקב יומיומי באמצעות תוכנית הרווחה בטבלה משלימה S1. כל בעלי החיים קיבלו ציון 0 בכל עת, מה שמעיד על רווחה מצוינת. איור 7 מראה שהחלונות אכן הוצבו מעל אזור S1 של קליפת המוח החזירית. בדרך כלל נצפו צלקות מסוימות על הדורה in vivo ואחרי המוות (איור 7A), אולם בדיקה שלאחר המוות גילתה שהיא מעולם לא השפיעה על רק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המשמעות של פיתוח טכניקה זו טמונה בהסרת מצבי כשל באלקטרודות, הפחתת תגובות רקמות ובכך שיפור האמינות של טכניקות הקלטה פולשניות בקליפת המוח. לא התרחשו מצבי כשל באלקטרודות במהלך המחקר, ובסך הכל נעשה שימוש בשני מערכי ECoG במהלך המחקר, כולל 16 בעלי חיים ו-43 מפגשי הקלטה. יש לכך השפעה חיובית נוספת על כלכלת המחקר. באמצעות שיטות מסורתיות מושתלות במלואן 12,26,27, יידרשו לפחות 16 מערכי ECoG בהנחה שלא מתרחשים כשלים במכשיר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות למטפלים ולטכנאים בחיות המעבדה בבית החולים האוניברסיטאי אלבורג. המרכז לנוירופלסטיות וכאב (CNAP) נתמך על ידי קרן המחקר הלאומית הדנית (DNRF121). איור 6 ואיור 8 נוצרו ב-BioRender.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
השתלת חלון גולגולת
אזמלחד פעמי, להב 10
פינצטה
גזה
צריבה
מעלית פריוסטאוםשטוח, רוחב 10 מ"מ
מפסק Weitlaner3x4 שיניים, קהה, 16.5 ס"מ
מערכת מקדחה כירורגית Midas Rex Legend EHSMedtronic Powered Surgical Solutions, פורט וורת', ארה"ב
Legend Ball מקדחים משובחים Medtronic Powered Surgical Solutions, פורט וורת', ארה"ב7BA40F-MN ו-7BA60F-MNMedNext סוג 4 ו-6 מ"מ קוטר ראש
כיסוי סטרילי למקדחה
מזרק5 מ"ל
מלוחים
שאיבה
סרגל
ניצני כותנה
רונגורלסת ישרה, 15 ס"מ, גודל סיביות 3 x 20 מ"מ
מקדחה ידנית וידית 2.5 מ"מ
סט עירוי פרפרים
שישה ברגי M3 באורך 6-14 מ"מ
מברג 
שלושה גדלים של חלון גולגולת מודפס בתלת מימד (עומק 4, 5 ו-6 מ"מ) וכובע
מחבר בצורת U מבודד
מחבר תנין
ספוג אנטיביוטי נספג Genta-coll
תפר נספג VYCRIL אתיקון2-0 גוף עגול 26 מ"מ
תפר מונוקריל שאינו נספגאתיקון3-0 חיתוך הפוך 24 מ"מ
מחזיק מחט
מספריים
דבק רקמות דבק מקומילאויקוסאן
השתלת חוט היקפי
שני חוטי Cooner לא מבודדים חלקית
הערה: 1-2 ס"מ מהחוטים אינם מבודדים באמצע ובאחד הקצוות
שתי מחטים בגודל 23
גזה
ממריץ הניתן לתכנות הנשלט על ידי מחשב המריץ MC_stimulusמערכות רב ערוציות, רויטלינגן, גרמניהSTG4008
שני מחברי תנין
הקלטות קליפת המוח
לוחית מתכת למיקרומניפולטור המגנטי 
מעמד מיקרומניפולטור מגנטי
מיקרומניפולטור
מעמד לבמה
במת ראש קליפ ZIF 32 ערוציםTDT, אלצ'ואה, פלורידה, ארה"ב
מיקרו-אלקטרוקורטיקוגרפיה 32 ערוצים (ומיקרו; ECoG) מערך Neuronexus, אן ארבור, ארה"בE32-1000-30-200
ציוד הקלטה TDT כולל מגבר מקדים SI8, מעבד נתונים RZ2 ותחנת עבודה WS8 TDT, אלצ'ואה, פלורידה, ארה"ב
הרדמה & משככי כאבים
זולטיל 50 וטרינרVirbac, Carros, צרפת
רומפון (Zxylacin)אלנקו בריאות בעלי חיים מונהיים; גרמניה
טורבוגזי (בוטאורפנול)Intervet International, Boxmeer, הולנדכיום משתמשים בתכשיר אחר (דולורקס)
קטמינולIntervet International, Boxmeer, הולנד
פרופופולBaxter Holding, אוטרכט, הולנד
פנטנילב. בראון, מלסונגן, גרמניה
מטקאםBorhringer Ingelheim Vetmedica, Ingelheim, גרמניה
נורומוקסScanvet Animal Health, פרדנסבורג, דנמרק
פנטוברבLeVet, Oudewater, הולנד

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mitchell, P., et al. Assessment of safety of a fully implanted endovascular brain-computer interface for severe paralysis in 4 patients: the Stentrode with thought-controlled digital switch (switch) study. JAMA Neurol. 80 (3), 270(2023).
  2. Steinmetz, N. A., et al. Neuropixels 2.0: a miniaturized high-density probe for stable, long-term brain recordings. Science. 372 (6539), eabf4588(2021).
  3. Neuralink's first-in-human clinical trial is open for recruitment. , Neuralink. https://neuralink.com/blog/first-clinical-trial-open-for-recruitment/ (2023).
  4. Duun-Henriksen, J., et al. A new era in electroencephalographic monitoring? Subscalp devices for ultra-long-term recordings. Epilepsia. 61 (9), 1805-1817 (2020).
  5. Szostak, K. M., Grand, L., Constandinou, T. G. Neural interfaces for intracortical recording: requirements, fabrication methods, and characteristics. Front Neurosci. 11, 665(2017).
  6. Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents EEG, ECoG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
  7. Morand-Beaulieu, S., Perrault, M. -A., Lavoie, M. E. Test-retest reliability of event-related potentials across three tasks. Journal of Psychophysiology. 36 (2), 100-117 (2022).
  8. Ip, C. -T., et al. Pre-intervention test-retest reliability of EEG and ERP over four recording intervals. Int J Psychophysiol. 134, 30-43 (2018).
  9. Qin, H., Ding, L., Duan, W., Lei, X. Test-retest reliability of EEG: a comparison across multiple resting-state and task-state experiments. Xin Li Xue Bao. 55 (10), 1587(2023).
  10. Höller, Y., et al. Reliability of EEG measures of interaction: a paradigm shift is needed to fight the reproducibility crisis. Front Hum Neurosci. 11, 441(2017).
  11. Colachis, S. C., et al. Long-term intracortical microelectrode array performance in a human: a 5 year retrospective analysis. J Neural Eng. 18 (4), 0460d7(2021).
  12. Barrese, J. C., et al. Failure mode analysis of silicon-based intracortical microelectrode arrays in non-human primates. J Neural Eng. 10 (6), 066014(2013).
  13. Szymanski, L. J., et al. Neuropathological effects of chronically implanted, intracortical microelectrodes in a tetraplegic patient. J Neural Eng. 18 (4), 0460b9(2021).
  14. Meijs, S., et al. Influence of fibrous encapsulation on electro-chemical properties of TiN electrodes. Med Eng Phys. 38 (5), 468-476 (2016).
  15. Kim, A., et al. Investigating immunomodulatory biomaterials for preventing the foreign body response. Bioengineering. 10 (12), 1411(2023).
  16. Janjua, T. A. M., et al. The effect of peripheral high-frequency electrical stimulation on the primary somatosensory cortex in pigs. IBRO Neurosci Rep. 11, 112-118 (2021).
  17. Meijs, S., Andreis, F. R., Janjua, T. A. M., Graven-Nielsen, T., Jensen, W. High-frequency electrical stimulation increases cortical excitability and mechanical sensitivity in a chronic large animal model. Pain. 166 (2), e18-e26 (2025).
  18. Branco, M. P., Geukes, S. H., Aarnoutse, E. J., Ramsey, N. F., Vansteensel, M. J. Nine decades of electrocorticography: a comparison between epidural and subdural recordings. Eur J Neurosci. 57 (8), 1260-1288 (2023).
  19. Meijs, S., Andreis, F. R., Janjua, T. A. M., Jensen, W. Reliability of a cranial window for chronic epidural recordings from the pig primary somatosensory cortex. Annu Int Conf IEEE Eng Med Biol Soc. 2024, 1-4 (2024).
  20. García, A., Calleja, J., Antolín, F. M., Berciano, J. Peripheral motor and sensory nerve conduction studies in normal infants and children. Clin Neurophysiol. 111 (3), 513-520 (2000).
  21. Thomas, J. E., Lambert, E. H. Ulnar nerve conduction velocity and H-reflex in infants and children. J Appl Physiol. 15 (1), 1-9 (1960).
  22. Liu, X. -G., Sandkühler, J. Characterization of long-term potentiation of C-fiber-evoked potentials in spinal dorsal horn of adult rat: essential role of NK1 and NK2 receptors. J Neurophysiol. 78 (4), 1973-1982 (1997).
  23. Sandkühler, J., Liu, X. Induction of long-term potentiation at spinal synapses by noxious stimulation or nerve injury: LTP in spinal cord induced by noxious stimulation. Eur J Neurosci. 10 (7), 2476-2480 (1998).
  24. van den Broeke, E. N., et al. The effect of high-frequency conditioning stimulation of human skin on reported pain intensity and event-related potentials. J Neurophysiol. 108 (8), 2276-2281 (2012).
  25. van den Broeke, E. N., Lambert, J., Huang, G., Mouraux, A. Central sensitization of mechanical nociceptive pathways is associated with a long-lasting increase of pinprick-evoked brain potentials. Front Hum Neurosci. 10, 531(2016).
  26. Fallegger, F., Trouillet, A., Lacour, S. P. Subdural soft electrocorticography (ECoG) array implantation and long-term cortical recording in minipigs. J Vis Exp. (193), e64997(2023).
  27. Palma, M., et al. Chronic recording of cortical activity underlying vocalization in awake minipigs. J Neurosci Methods. 366, 109427(2022).
  28. Salatino, J. W., Ludwig, K. A., Kozai, T. D. Y., Purcell, E. K. Glial responses to implanted electrodes in the brain. Nat Biomed Eng. 1 (11), 862-877 (2017).
  29. Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. J Neurosci Methods. 148 (1), 1-18 (2005).
  30. Meijs, S., et al. Biofouling resistance of boron-doped diamond neural stimulation electrodes is superior to titanium nitride electrodes in vivo. J Neural Eng. 13 (5), 056011(2016).
  31. Cramer, S. W., et al. Through the looking glass: a review of cranial window technology for optical access to the brain. J Neurosci Methods. 354, 109100(2021).
  32. O'Sullivan, K. P., Orazem, M. E., Otto, K. J., Butson, C. R., Baker, J. L. Electrical rejuvenation of chronically implanted macroelectrodes in nonhuman primates. J Neural Eng. 21 (3), 036056(2024).
  33. Holdgraf, C., et al. iEEG-BIDS, extending the Brain Imaging Data Structure specification to human intracranial electrophysiology. Sci Data. 6 (1), 102(2019).
  34. Mercier, M. R., et al. Advances in human intracranial electroencephalography research, guidelines and good practices. Neuroimage. 260, 119438(2022).
  35. Löscher, W., Worrell, G. A. Novel subscalp and intracranial devices to wirelessly record and analyze continuous EEG in unsedated, behaving dogs in their natural environments: a new paradigm in canine epilepsy research. Front Vet Sci. 9, 1014269(2022).
  36. Waziri, A., et al. Intracortical electroencephalography in acute brain injury. Ann Neurol. 66 (3), 366-377 (2009).
  37. Hartings, J. A., et al. Prognostic value of spreading depolarizations in patients with severe traumatic brain injury. JAMA Neurol. 77 (4), 489(2020).
  38. Takara, S., Kida, H., Inoue, T. Development of implantable devices for epilepsy: research with cats, dogs, and macaques in biomedical engineering. Advanced Robotics. 38 (14), 983-1007 (2024).
  39. Gierthmuehlen, M., et al. Mapping of sheep sensory cortex with a novel microelectrocorticography grid. J Comp Neurol. 522 (16), 3590-3608 (2014).
  40. Thielen, B., Meng, E. A comparison of insertion methods for surgical placement of penetrating neural interfaces. J Neural Eng. 18 (4), 041003(2021).
  41. MaassenVanDenBrink, A., Chan, K. Y. Neurovascular pharmacology of migraine. Eur J Pharmacol. 585 (2-3), 313-319 (2008).
  42. Costine-Bartell, B. A., et al. 2-photon imaging of fluorescent proteins in living swine. Sci Rep. 13 (1), 14158(2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Dura Mater

מאמרים קשורים